Nieru hepcidīna/feroportīna ass kontrolē dzelzs reabsorbciju un nosaka nieru un sistēmiskās dzelzs pārslodzes apjomu

Kontaktpersona: emily.li@wecistanche.com

Gorans Mohammads1, Atēna Matakidu2, Pīters A. Robinss1 un Samira Lakhal-Littleton1

ATSLĒGVĀRDI:feroportīns; hemohromatoze; hepcidīns; dzelzs; dzelzs pārslodze;nierukanāliņi

Ferroportīns (FPN) ir vienīgais zināmais zīdītāju dzelzs eksporta proteīns. Tas veicina dzelzs izdalīšanos asinsritē no divpadsmitpirkstu zarnas enterocītiem un liesas retikuloendotēlija makrofāgiem, attiecīgajām dzelzs uzsūkšanās un pārstrādes vietām.1,2 FPN mediētu dzelzs izdalīšanos antagonizē hormons hepcidīns, kas pazīstams arī kā hepcidīna antimikrobiālais peptīds (HAMP). Galvenokārt ražots aknās, hepcidīns saistās ar FPN un izraisa tā internalizāciju, tādējādi ierobežojot dzelzs izdalīšanos asinsritē un tā pieejamību perifērajos audos.3,4 Tādējādi HAMP/FPN ass darbojas uzsūkšanās un pārstrādes vietās, lai kontrolētu sistēmisku. dzelzs homeostāze.

Nieres ir dzelzs reabsorbcijas vieta. Gan ar transferīnu nesaistītā, gan ar transferīnu saistītā dzelzs var šķērsot glomerulāro fifiltrātu.5 Lielākā daļa šīs dzelzs tiek uzņemta atpakaļ cauruļveida epitēlijā. Šajā atpakaļsaistīšanā ir iesaistīti vairāki transportētāji, tostarp multiligandu megalīna-kubilīna receptoru komplekss, transferīna receptors 1, divvērtīgā metāla transportētājs 1, cinka transportētājs ZIP8 un cinka transportētājs ZIP14.5–10.

Reiznieruepitēlija, dzelzs atkal uzsūcas apritē. FPN ir daudznieresun tas ir saistīts ar dzelzs reabsorbciju.11–14 Tomēr joprojām nav zināms, vai normālos fizioloģiskos apstākļos nieru FPN regulē arī endogēns HAMP, un, ja tā, vai šāda regulēšana ir svarīga sistēmiskai un/vai nieru dzelzs homeostāzei.

Lai risinātu šos jautājumus, mēs izveidojām jaunu peles modeli ar inducējamunierukanāliņu– specifiska fpnC326Y ievadīšana, kas kodē pret HAMP rezistentu FPNC326Y proteīnu. Turklāt, lai apstiprinātu iepriekš ziņoto FPN lomu dzelzs reabsorbcijā, mēs arī izveidojām peles modeli ar inducējamu.nierukanāliņu– specifiska fpn gēna dzēšana. Mūsu rezultāti parāda, ka endogēnais HAMP tieši regulē FPN mediētu dzelzs uzsūkšanos un ka šis regulējums ir svarīgs abiemnieruun sistēmiskā dzelzs homeostāze, jo īpaši gadījumos, kad ir pārmērīga dzelzs pieejamība.

Šis pētījums ir pirmais, kurā tika izmantotas peles, kurām ir specifisks HAMP reakcijas zudums, lai formāli noteiktunozīminonieruHAMP/FPN ass. Tas sniedz jaunu ieskatu par dzelzs reabsorbcijas lomu, nosakot nieru un ārpusnieru dzelzs pārslodzes pakāpi hemohromatozes apstākļos.

METODES

Peles

Visas procedūras ar dzīvniekiem atbilda Apvienotās Karalistes 1986. gada likumam par dzīvniekiem mājas apstākļos (zinātniskās procedūras), un tās apstiprināja Oksfordas Universitātes Medicīnas zinātņu nodaļas ētiskās pārbaudes komiteja.

Nosacītās fpnflfl un fpnC326Yflfl alēles tika ģenerētas, kā aprakstīts iepriekš.15,16

Peles, kas satur Pax8.CreERT2þ transgēnu, bija dāvana no Dr. Athena Matakidou no Kembridžas Universitātes Vēža izpētes institūta Apvienotās Karalistes Kembridžas institūta. Šīs peles tika izveidotas, kā aprakstīts iepriekš.17 Visas peles atradās uz C57BL/6 fona.

Diētas

Ja vien nav norādīts citādi, dzīvniekiem tika nodrošināta standarta grauzēju ēda, kas satur 200 miljondaļas (ppm) dzelzs. Eksperimentos ar dzelzi, pelēm tika dota diēta ar dzelzi (5000-ppm dzelzs; Teklad TD.140464) vai atbilstoša kontroles diēta (200- ppm dzelzs; Teklad TD.08713) no atšķiršanas 3 gadus. mēnešus.

Dzelzs kvantitatīvais noteikšana un dzelzs indeksi 

Dzelzs un feritīna līmenis serumā tika noteikts, izmantojot ABXPentra sistēmu (Horiba Medical). Hemoglobīna vērtības tika noteiktas ar HemoCue Hb 201 Hemoglobin Microcuvettes. Eritroferrona līmenis serumā tika noteikts ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu (Intrinsic Lifesciences). Kopējā elementārā dzelzs noteikšana audos tika veikta ar induktīvi saistītās plazmas masas spektrometriju, kā aprakstīts iepriekš.15,16,18 Kalibrēšana tika veikta, izmantojot standarta pievienošanas procesu, kur tapas 0 ng/g, 0,5 ng/ Atlasītā parauga atkārtojumiem tika pievienots g, 1 ng/g, 10 ng/g, 20 ng/g un 100 ng/g dzelzs. Ārējais dzelzs standarts (High Purity Standards ICP-MS-68-A Solution) tika atšķaidīts un izmērīts, lai apstiprinātu kalibrēšanas derīgumu. Rodijs tika pievienots arī katram tukšajam paraugam, standartam un paraugam kā iekšējam standartam koncentrācijā 1 ng/g. Lai noteiktu urīna dzelzs daudzumu, urīns tika savākts no pelēm 24 stundu laikā un tika pakļauts induktīvi savienotai plazmas masas spektrometrijai. Kreatinīna līmenis tajos pašos paraugos tika mērīts, izmantojot kolorimetrisko kreatinīna testa komplektu (Abcam; ab65340), un dzelzs vērtības tika normalizētas līdz kreatinīna koncentrācijai.

Imūnhistoķīmija 

Fluorescences imūnkrāsošana tika veikta ar formalīnu fiksētās, parafīnā iegultās audu sekcijās, izmantojot FPN antivielu (Novus Biologicals; NBP1-21502) 1:100 un Pro-Hepcidin(AA 39-59) antivielu 1:50. (Antivielas tiešsaistē; ABIN350367). FPN un hepcidīna antivielu specifika tika apstiprināta, izmantojot attiecīgi Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ dzīvniekus un Hamp–/– dzīvniekus kā negatīvas kontroles (papildu attēls S1). Nieru segmentu marķieri tika identificēti, izmantojot akvaporīna-1 antivielu 1:200 (Biotechne; NB600- 749), akvaporīna-2 antivielu pie 1:200 (Biotechne; NBP1-70378), vai kalbindīna antiviela 1:100 (Abcam; ab82812). Sekundārās antivielas bija anti-trušu IgG Alexa Fluor-488 (Abcam; ab150073), pretēzeļa IgG Cy3 (Abcam; ab6949) un anti-peles IgG Alexa568 (Abcam; ab175473). Priekšmetstikliņi tika attēloti, izmantojot FV1000 Olympus mikroskopu.

cistanche var aizsargātnieresfunkciju

Western blotēšana

Audi tika ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī, sasmalcināti un pēc tam lizēti, izmantojot RIPA līzes bufersistēmu (Santa Cruz; sc{0}}), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Audu lizāti tika attīrīti, centrifugējot pie 15 000g 10 minūtes 4 C temperatūrā. Proteīna koncentrācija lizātos tika noteikta ar BCA proteīna testu (Pierce; 23225) un tika normalizēta līdz tādai pašai koncentrācijai katrai partijai. Pēc tam lizātus atšķaida nereducējošā Laemmli nātrija dodecilsulfāta parauga buferšķīdumā un karsēja 95 C temperatūrā 5 minūtes. Proteīns (30–50 mg) tika ielādēts Mini-PROTEAN TGX gēlos (Biorad; 4561096). Pēc elektroforēzes proteīns tika pārnests uz polivinilidēna diffluorīda membrānu, izmantojot sistēmu BioRad Translotter, un membrānas stundu bloķēja bloķējošā buferšķīdumā, kas satur 5 procentus liellopu seruma albumīna. Pēc tam membrānas nakti 4 C temperatūrā krāsoja ar trušu poliklonālo anti-peļu FPN antivielu (NBP1-21502; Novus Biologicals) 1:1000 vai ar mārrutku peroksidāzes konjugētu anti-b-aktīna antivielu (Proteintech; HRP{{18}). }) pie 1:5000. Bloti tika izstrādāti, izmantojot ECL primārās noteikšanas komplektu (RPN2232; VWR International). Signāla intensitātes tika kvantificētas ar ImageJ, un tika aprēķināta attiecība starp FPN un b-aktīna signāliem, lai iegūtu normalizētu intensitāti.

Ar diaminobenzidīnu (DAB) uzlabots Perls traips

Ar formalīnu fiksētas, parafīnā iestrādātas audu sekcijas tika deparafifētas, izmantojot ksilolu, un pēc tam rehidrētas etanolā. Pēc tam priekšmetstikliņus 1 stundu krāsoja ar 1% kālija fericianīdu 0,1 mol/L HCl buferšķīdumā. Endogēnā peroksidāzes aktivitāte tika apturēta, un pēc tam priekšmetstikliņi tika iekrāsoti ar DAB hromogēna substrātu un pretkrāsoti ar hematoksilīnu. Tie tika vizualizēti, izmantojot standarta spilgta lauka mikroskopu.

Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija

Gēnu ekspresija tika mērīta, izmantojot Applied Biosystems TaqMangene ekspresijas testa zondes Hamp un mājturības gēna baktīnam (Life Technologies). Interesējošā gēna sliekšņa cikla (CT) vērtība vispirms tika normalizēta, atņemot b-aktīna CT vērtību, lai iegūtu DCT vērtību. Lai iegūtu DDCT vērtības, testa paraugu DCT vērtības tika tālāk normalizētas līdz kontroles paraugu DCT vērtību vidējam rādītājam. Pēc tam relatīvie gēnu ekspresijas līmeņi tika aprēķināti kā 2–DDCT.

Statistika

Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. Pāru salīdzinājumi tika veikti, izmantojot Studenta t testu. Izmantojot dispersijas analīzi, tika veikti vairāki salīdzinājumi. Post hoc testos tika izmantota Bonferroni korekcija.

1. attēls|Hepcidīna/feroportīna (FPN) ass nieru kanāliņos kontrolē dzelzs reabsorbciju un ir svarīga nieru dzelzs homeostāzeipeļu mātītēm. a)Reprezentatīvi imunofluorescējošas krāsošanas attēli FPN, akvaporīna 1 (AQP1), akvaporīna 2 (AQP2) un Calbindin (CalD) savvaļas tipa peļu nierēs. Stieņi¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. Gala panelis, stienis¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (b) Western blot FPN innieressieviešu un vīriešu FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreER T2 þ pelēm un FpnC326Y flfl/flfl kontroles grupām 1 nedēļu pēc tamoksifēna terapijas. Signāla intensitātes kvantitatīvā noteikšana ir parādīta apakšējā panelī. (c) Western blot FPN noteikšanai Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ peļu un Fpnflfl/flfl kontroles mātīšu un tēviņu nierēs 1 nedēļu pēc tamoksifēna terapijas. Signāla intensitātes kvantitatīvā noteikšana ir parādīta apakšējā panelī. (d) Dzelzs līmenis nierēs sievietēm un vīriešiem FpnC326Y^flfl/^flfl,Pax8.CreERT2þ peles un FpnC326Yflfl/flfl kontroles 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (e) reprezentatīvi attēli ar diaminobenzidīnu (DAB) pastiprinātu Perls dzelzs traipu attiecīgo dzīvnieku nieru garozas reģionā 3 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. Stieņi ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. (f) Dzelzs līmenis nierēs Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ peļu un Fpnflfl/flfl kontroles grupās 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. (g) reprezentatīvi attēli ar DAB pastiprinātu Perls dzelzs traipu attiecīgo dzīvnieku nieru garozas reģionā 3 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. (Turpinājums)

1. attēls |(Turpinājums) Stieņi ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. (h) Dzelzs līmenis serumā FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peļu un FpnC326Yflfl/flfl kontroles mātītēm un tēviņiem 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (i) Dzelzs līmenis serumā mātītēm un tēviņiem Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peļu un Fpnflfl/flfl kontroles grupās 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" un="" ****p="">< 0,0001.="" b-akts,="" b-aktīns;="" turpinājums,="" kontrole;="" dapi,="" 40,="" 6-diamidino-2-fenilindols;="" ppm,="" daļas="" uz="" miljonu.="" lai="" optimizētu="" šī="" attēla="" skatīšanu,="" lūdzu,="" skatiet="" šī="" raksta="" tiešsaistes="" versiju="" vietnē="">

REZULTĀTI

Hepcidīna / FPN ass nieru kanāliņos kontrolē dzelzs reabsorbciju un ir svarīga nieru dzelzs homeostāzei peļu mātītēm

Vispirms mēs centāmies noteikt precīzu FPN izteiksmes vietunieres. Šim nolūkam mēs samaksājām peles nieres par FPN un segmentam specifiskiem marķieriem akvaporīnu 1 (proksimālu izliektu kanāliņu marķieris un Henlija tievu lejupejošu ekstremitāšu), akvaporīnu 2 (savākšanas kanālu un savienojošo kanāliņu marķieris) un kalbindīnu (marķieris). distālo vītņu kanāliņu un kortikālo savienojošo un savākšanas kanālu). Mēs noskaidrojām, ka FPN ir spēcīgi izteikts garozā, kolokalizējoties ar akvaporīnu 1 līdz proksimālajiem vītņotajiem kanāliņiem. Iekšējā medulā bija nedaudz FPN, kas ar akvaporīnu 2 kolokalizēja medulāros savākšanas kanālos. FPN kolokalizācija ar kalbindīnu nenotika (1.a attēls; lielāks panelis parādīts S2 papildu attēlā). Šie rezultāti apstiprina, ka FPN ir visizplatītākais garozas reģionā proksimālos izliektajos kanāliņos.

Lai noteiktu, vai nieru FPN regulē HAMP, mēs izmantojām peles ar Pax8.CreERT2þ knock-in transgēnu, kas virza ar tamoksifēnu inducējamu Cre rekombināzes ekspresiju, kontrolējot pārī savienoto kastes gēna 8 pax8 promotoru proksimālajās un distālajās kanāliņos un iekšā. savākšanas vadi.17 Mēs krustojām Pax8.CreERT2þ peles ar tām, kurām ir nosacīta ietriekšanās flfloxed alēle FpnC326Y, kas kodē pret hepcidīnu rezistentu FPN. Turklāt, lai apstiprinātu iepriekš ziņoto nieru FPN lomu dzelzs reabsorbcijā, mēs krustojām Pax8.CreERT2þ peles ar pelēm, kurām bija Fpnflfl/flfl alēle. Nedēļu pēc tamoksifēna terapijas, lai inducētu Pax8.CreERT2 transgēnu, FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ mātītēm un tēviņiem FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ peļu mātītēm un tēviņiem palielinājās nieru FPN līmenis, salīdzinot ar FpnC326Yflfl/flfl kontrolēm (1.b attēls), parādot, ka nieru FPN regulē FPN. endogēno HAMP normālos fizioloģiskos apstākļos un papildus apstiprinot Pax8.CreERT2þ transgēna efektivitāti. Un otrādi, Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peļu mātītēm un tēviņiem bija samazināts nieru FPN līmenis salīdzinājumā ar Fpnflfl/flfl kontroli, vēl vairāk apstiprinot Pax8.CreERT2þ transgēna efektivitāti (1.c attēls). Šī Pax8.CreERT2þ transgēna specifiku apstiprināja arī dzēšanas alēles (DFpn) klātbūtnenieresbet ne Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peles aknās vai liesā (papildu attēls S2A).

Pēc tam mēs nolēmām noteikt, vai nieru HAMP / FPN ass kontrolē dzelzs reabsorbciju. Šim nolūkam mēs izmērījām nieru un seruma dzelzs līmeni 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. Mēs atradām, ka nieru dzelzs

FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ mātītēm saturs bija zemāks nekā FpnC326Yflfl/flfl kontroles mātītēm visos laika punktos (1.d attēls). Dzelzs saturs nierēs vīriešiem neatšķīrās atkarībā no genotipa (1.d attēls). DAB uzlabotais Perla dzelzs traips arī apstiprināja dzelzs līmeņa samazināšanos FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ mātīšu proksimālajās kanāliņos (1.e attēls; lielāks panelis parādīts S2 papildu attēlā). Un otrādi, mēs atklājām, ka nierēs dzelzs saturs bija augstāks Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mātītēm nekā Fpnflfl/flfl kontroles mātītēm, sākot no 1 mēneša (1.f attēls). Dzelzs saturs nierēs vīriešiem neatšķīrās atkarībā no genotipa (1.f attēls). DAB uzlabotais Perls dzelzs traips arī apstiprināja dzelzs uzkrāšanos Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ mātīšu proksimālajās kanāliņos (1.g attēls; lielāks panelis parādīts S2 papildu attēlā).

Dzelzs līmenis serumā īslaicīgi palielinājās gan FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peļu tēviņiem, gan mātītēm, salīdzinot ar FpnC326Yflfl/flfl kontrolēm 1-mēneša laika punktā (1.h attēls). Savukārt dzelzs līmenis serumā bija pazemināts Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ mātītēm, salīdzinot ar Fpnflfl/flfl kontroles mātītēm 1-mēneša laika punktā, turpretim tas palika salīdzināms dažādu genotipu tēviņiem visos laika punktos (1.i attēls. ). Dzelzs līmeņa atjaunošanos serumā līdz līmenim, kas novērots kontroles dzīvniekiem 3 mēnešu vecumā, nevarēja saistīt ar normāla nieru FPN līmeņa atjaunošanos. Patiešām, Pax8.CreERT2 izraisītās izmaiņas nieru FPN līmenī joprojām saglabājās 3 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas (papildu attēls S2B un C). Pazemināts dzelzs saturs nierēs un paaugstināts dzelzs līmenis serumā FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mātītēm pierāda, ka no FPN atkarīgo dzelzs reabsorbciju proksimālajās kanāliņos normālos fizioloģiskos apstākļos regulē HAMP. Paaugstināts dzelzs saturs nierēs un pazemināts dzelzs līmenis serumā Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mātītēm apstiprina iepriekšējos konstatējumus, ka nieru FPN veicina dzelzs reabsorbciju. Turklāt normālos fizioloģiskos apstākļos šķiet, ka dzelzs reabsorbcijas kontrole ar nieru HAMP/FPN asi ir svarīgāka sievietēm nekā vīriešiem, vismaz C57BL/6 celmā.

Cistanche var uzlabot nieru darbību

Nieru HAMP/FPN ass veicina normālu sistēmisku dzelzs homeostāzi, bet nav būtiska tai normālas dzelzs pieejamības apstākļos.

Pēc tam mēs nolēmām noteikt nieru HAMP / FPN ass ieguldījumu sistēmiskā dzelzs homeostāzē. Mēs noskaidrojām, ka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mātītēm bija īslaicīgs feritīna līmeņa paaugstināšanās serumā (2.a attēls), dzelzs saturs aknās (2.b attēls) un liesas dzelzs saturs (2.c attēls) 1- mēneša laika punktā salīdzinot ar FpnC326Yflfl/flfl kontroles mātītēm. Viņu hemoglobīna līmenis visos laika punktos bija salīdzināms ar kontroles līmeni (2.d attēls). Neviens no šiem parametriem neatšķīrās starp FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ tēviņiem un viņu FpnC326Yflfl/flfl kontrolēm (2.a–d attēls). Eritroferrona līmenis neatšķīrās atkarībā no genotipa (papildu attēls 3A). Un otrādi, mēs atklājām, ka Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ mātītēm ir zemāks feritīna līmenis serumā 1- un 3-mēneša laika punktos (2.e attēls), zemāks aknu dzelzs saturs 3- un 6-mēneša laika punkti (2.f attēls) un zemāks liesas dzelzs saturs 1- un 3-mēneša laika punktos (2.g attēls), salīdzinot ar Fpnflfl/flfl kontroles mātītēm. Viņiem bija arī pārejošs un neliels hemoglobīna līmeņa samazinājums 3-mēneša laika punktā (2. attēls). Neviens no šiem parametriem neatšķīrās starp Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ tēviņiem un viņu Fpnflfl/flfl kontrolēm (2.e–h attēls). Eritroferrona līmenis arī netika mainīts atkarībā no genotipa (papildu attēls 3B). Šie dati kopā parāda, ka normālos fizioloģiskos apstākļos nieru HAMP/FPN ass veicina sistēmisko dzelzs līmeni, bet pati par sevi nav būtiska normālas sistēmiskas dzelzs homeostāzes uzturēšanai.

2. attēls|Nieru hepcidīna pretmikrobu peptīda/feroportīna (FPN) ass veicina normālu sistēmisku darbību, bet nav būtiska.dzelzs homeostāze normālas dzelzs pieejamības apstākļos. (a–d)Sistēmiskie dzelzs indeksi mātītēm un tēviņiem FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ pelēm un FpnC326Yflfl/flfl kontroles grupām 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas, ieskaitot (a) seruma feritīnu, (b) aknu dzelzs saturu , (c) liesas dzelzs saturs un (d) hemoglobīns. (e–h) Sistēmiskie dzelzs indeksi mātītēm un tēviņiem Fpnflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ pelēm un Fpnflfl/flfl kontroles grupām 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas, ieskaitot (e) seruma feritīnu, ( f) aknu dzelzs saturs, g) liesas dzelzs saturs un h) hemoglobīns. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01="" un="" ***p="">< 0,001.="" ppm,="" daļas="" uz="">

3. attēls|Nieru hepcidīna pretmikrobu peptīda (HAMP)/feroportīna (FPN) ass nosaka nieru un sistēmiskās dzelzs pārslodzes lielumu pārmērīgas dzelzs pieejamības apstākļos. (a–f)Ekstrarenālie dzelzs indeksi mātītēm un tēviņiem FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ pelēm un FpnC326Yflfl/flfl kontroles nodrošināja vai nu kontroles čau diētu (200 daļas uz miljonu [ppm]), vai ar dzelzi bagātu diētu (5000 ppm) 3 mēnešus. (Turpinājums)

3. attēls |(Turpinājums) Indeksi ietver (a) dzelzs serumu, (b) seruma feritīnu, (c) liesas dzelzs saturu, (d) sirds dzelzs saturu, (e) plaušu dzelzs saturu un (f) aknu dzelzs saturu. g) Dzelzs saturs nierēs FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peļu un FpnC326Yflfl/flfl mātīšu un vīriešu dzimuma pelēm nodrošināja vai nu kontroles čau diētu (200 ppm) vaidzelzs pieslogotsdiēta (5000 ppm) 3 mēnešus. (h, i) reprezentatīvi attēli ar diaminobenzidīnu (DAB) pastiprinātu Perls dzelzs traipu aknās un atbilstošo dzīvnieku nieru kritiskajā reģionā. Stieņi ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. (j) Hamp gēna relatīvā ekspresija attiecīgo dzīvnieku aknās. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001,="" *****p="">< 0,00001="" un="" ******p="">< 0,000001.="" lai="" optimizētu="" šī="" attēla="" skatīšanu,="" lūdzu,="" skatiet="" šī="" raksta="" tiešsaistes="" versiju="" vietnē="">

Nieru HAMP/FPN ass nosaka nieru un sistēmiskās dzelzs pārslodzes lielumu pārmērīgas dzelzs pieejamības apstākļos 

Tālāk mēs nolēmām noteikt nieru HAMP / FPN ass lomu dzelzs pārslodzes iestatīšanā. Šim nolūkam FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ dzīvnieki un FpnC326Yflfl/flfl kontroles tika ierosināti ar tamoksifēnu un pēc tam nodrošināja vai nu kontroles čau diētu, kas satur 200 ppm dzelzs, vai ar dzelzi bagātu diētu, kas satur 5000 ppm dzelzs, 3 mēnešus. . Mēs noskaidrojām, ka dzelzs saturoša uztura nodrošināšana palielināja dzelzs, seruma feritīna un audu dzelzs saturu abu genotipu vīriešiem un sievietēm. Tomēr FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ dzīvniekiem bija lielāks dzelzs līmenis serumā (3.a attēls), seruma feritīna līmenis (3.b attēls) un dzelzs saturs liesā (3.c attēls), sirdī (3.d attēls), plaušās (3.e attēls). , un aknām (3.f attēls) nekā FpnC326Yflfl/flfl kontroles. Turpretim tiem bija mazāks dzelzs satura palielinājums nierēs (3.g attēls). Atšķirības starp genotipiem dzelzs slodzes pakāpē proksimālajās kanāliņos un aknās bija redzamas arī ar DAB uzlabotā Perls dzelzs traipā (3.h un i attēls; lielāki paneļi parādīti S4 papildu attēlā). Atbilstoši lielākai sistēmiskai dzelzs pārslodzei FpnC326Yflfl/flfl , Pax8.CreERT2þ dzīvniekiem arī bija lielāks aknu hamp gēna ekspresijas pieaugums, salīdzinot ar FpnC326Yflfl/flfl kontrolēm (3.j attēls). Hemoglobīna līmeni neietekmēja ne diēta, ne genotips, un saskaņā ar to arī eritroferrona līmenis serumā nemainījās (papildu attēls 4A un B). Šie atklājumi parāda, ka pārmērīgas dzelzs pieejamības apstākļos dzelzs reabsorbcijas kontrole ar nieru HAMP/FPN asi samazina sistēmisko dzelzs pārslodzi, vienlaikus palielinot nieru dzelzs pārslodzi.

Nieru HAMP/FPN ass nosaka audu dzelzs pārslodzes modeli hemohromatozes gadījumā 

Tālāk mēs nolēmām izpētīt nieru HAMP/FPN ass lomu iedzimtas hemohromatozes kontekstā, kas ir ģenētisks dzelzs pārslodzes stāvoklis, ko izraisa hepcidīna ražošanas vai hepcidīna reakcijas defekti.19 Šim nolūkam mēs izmantojām peles, kas radītas māja, kurā ir heterozigota visuresoša fpnC326Y alēles (Fpnwt/C326Y) pieslēgšanās. Mēs iepriekš bijām pierādījuši, ka šīm pelēm attīstās dzelzs pārslodzes fenotips, kas raksturīgs iedzimtai hemohromatozei.15,18 Mēs salīdzinājām audu modeli.dzelzs pārslodzešajās pelēs, ko novēroja savvaļas tipa pelēm, kuras 3 mēnešus baroja ar dzelzi bagātu diētu no atšķiršanas. Gan Fpnwt/C326Ymice, gan savvaļas tipa pelēm, kuras baroja ar dzelzs piesātinātu diētu, bija

palielināts dzelzs saturs aknās, sirdī un plaušās, salīdzinot ar to attiecīgajām kontrolēm (4.a un b attēls). Dzelzs saturs nierēs Fpnwt / C326Ypelēm bija normāls 3 mēnešu vecumā (4.a attēls) un palielinājās tikai par 32 procentiem salīdzinājumā ar kontroli 6 mēnešu vecumā (papildu attēls 5A). Turpretim savvaļas dzīvniekiem, kuriem bija dzelzs saturoša diēta, dzelzs saturs nierēs palielinājās par 260 procentiem, salīdzinot ar tiem, kas lietoja parasto diētu (4.b attēls). Relatīvās atšķirības nieru un aknu dzelzs pārslodzē starp diviem modeļiem bija redzamas arī DABenhanced Perls dzelzs traipā (4.c un d attēls; lielāki paneļi parādīti S5 papildu attēlā). Ārpusnieru dzelzs pārslodzes lielums bija salīdzināms starp diviem modeļiem, turpretim nieru pārslodzes apjoms bija ievērojami lielāks savvaļas dzīvniekiem, kas nodrošināja ar dzelzi bagātu uzturu, nekā Fpnwt / C326Y pelēm (4.e attēls). FPN tika palielināts garozā gan Fpnwt / C326Y pelēm, gan savvaļas tipa pelēm, nodrošinot diētu ar dzelzi (4.f un g attēls; lielāki paneļi ir parādīti S5 papildu attēlā). Rūpīgāk izpētot FPN ekspresijas vietu proksimālajās kanāliņos, atklājās, ka Fpnwt / C326Y pelēm tā lokalizējas intracelulāri, kā arī bazolaterālajā membrānā. Turpretim FPN, šķiet, galvenokārt lokalizējas citoplazmā, apikālajā membrānā, un pārsteidzoši, ka peļu kodols nodrošināja ar dzelzi bagātu uzturu (4.f un g attēls, apakšējie paneļi). FPN lokalizācijas modelis, kas izriet no dzelzs saturošas diētas nodrošināšanas, tika tālāk apstiprināts, izmantojot Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ dzīvniekus kā negatīvas kontroles (papildu attēls S5B). Šie novērojumi kopā ar iepriekšējo konstatējumu, ka FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ dzīvniekiem ir zemāka dzelzs slodze nierēs nekā kontrolēm pēc pārbaudes veikšanas.dzelzs pieslogotsdiētu, parādiet, ka HAMP iedarbības zudums uz nieru FPN aizsargānieresno dzelzs slodzes iedzimtas hemohromatozes apstākļos.

DISKUSIJA

Svarīgākais šī pētījuma secinājums ir tāds, ka endogēnais HAMP kontrolē FPN mediētu dzelzs reabsorbciju. Iepriekšējie pētījumi ziņoja par FPN regulēšanu ar eksogēnu HAMP kultivētās nieru šūnās un par apgrieztu saistību starp HAMP un FPN līmeninierespēc vienpusējas urīnvada oklūzijas.12,13 Tomēr šis ir pirmais pierādījums tam, ka šāds regulējums darbojas in vivo normālos fizioloģiskos apstākļos un veidā, kas ietekmē nieru un sistēmisko dzelzs homeostāzi. Īpaša šī pētījuma stiprā puse ir jaunu peļu izmantošana, kas izveidotas pašā uzņēmumā, lai radītu nierēm specifisku HAMP reakcijas zudumu. Šī pieeja ļauj pētīt nieru HAMP / FPN asi bez izmainītas sistēmiskās dzelzs homeostāzes mulsinošās ietekmes, kas citādi redzama visuresošos dzīvnieku modeļos.

4. attēls|Nieru hepcidīna pretmikrobu peptīds/ferroportīns (FPN) nosaka audu dzelzs pārslodzes modeli hemohromatozes gadījumā. a)Dzelzs līmenis nierēs, aknās, sirdī un plaušās Fpnwt/C326Y dzīvniekiem un Fpnwt/wt kontroles grupām 3 mēnešu vecumā. b) Dzelzs līmenisnieres, aknām, sirdi un plaušām savvaļas dzīvniekiem tika nodrošināta vai nu kontroles diēta (200 daļas uz miljonu [ppm]), vai ar dzelzi bagātu diētu (5{{4{{ 42}}}}00 ppm) no atšķiršanas 3 mēnešus. c) reprezentatīvi attēli ar diaminobenzidīnu (DAB) pastiprinātu Perls dzelzs traipu Fpnwt/C326Y dzīvnieku un Fpnwt/wt kontroles grupu nieru garozā un aknās 3 mēnešu vecumā. Stienis ¼ 200 mm, oriģinālais palielinājums10. (d) reprezentatīvi attēli ar DAB pastiprinātu Perls dzelzs traipu savvaļas tipa dzīvnieku nieru garozā un aknās nodrošināja vai nu kontroles čau diētu (200 ppm), vai ar dzelzi piesātinātu diētu (5000 ppm) pēc atšķiršanas 3 mēnešus. Stienis ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. e) audu dzelzs slodzes pakāpes salīdzinājums starp Fpnwt/C326Y dzīvniekiem un savvaļas tipa dzīvniekiem, kas baroti ar dzelzs piesātinātu barību. Katram dzīvniekam parādītās vērtības ir normalizētas atbilstoši attiecīgās kontroles grupas vidējam rādītājam. (f) Reprezentatīvi FPN imūnfluorescējošas krāsošanas attēli Fpnwt/C326Y dzīvnieku un Fpnwt/wt kontroles nieru garozā 3 mēnešu vecumā. Augšējais panelis, stieņi ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. Apakšējais panelis, stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (g) Reprezentatīvi attēli ar FPN imūnfluorescējošu krāsojumu savvaļas tipa dzīvnieku nieru garozā, nodrošinot vai nu kontroles barošanas diētu (200). ppm) vai ar dzelzi bagātu diētu (5000 ppm) no atšķiršanas 3 mēnešus. Augšējais panelis, stieņi ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. Apakšējais panelis, stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. Vērtības ir parādītas kā vidējais SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" un="" ****p="">< 0,0001.="" lai="" optimizētu="" šī="" attēla="" skatīšanu,="" lūdzu,="" skatiet="" šī="" raksta="" tiešsaistes="" versiju="" vietnē="">

Otrs svarīgais šī pētījuma atklājums ir tas, ka nieru HAMP/FPN nosaka gan nieru, gan sistēmiskās dzelzs pārslodzes lielumu (5. attēls). Patiešām, HAMP reakcijas zudums nieru kanāliņos palielināja aknu, liesas, sirds un plaušu dzelzs pārslodzes apjomu, vienlaikus samazinot nieru dzelzs pārslodzes apmēru pēc dzelzs saturošas diētas nodrošināšanas. Atbilstoši tam lielāka dzelzs pārslodze nierēs tika novērota pēc tam, kad savvaļas dzīvniekiem tika nodrošināta ar dzelzi bagāta diēta (kuriem nieru HAMP/FPN ass ir neskarta) nekā pelēm ar hemohromatozi (kurām ir arī nieru HAMP/FPN ass traucēta) (grafisks abstrakts). Šis atklājums var izskaidrot klīnisko novērojumu, kanieresnav bieži skarta pacientiem ar iedzimtu hemohromatozi.19

5. attēls|Nieru hepcidīna pretmikrobu peptīda (HAMP) / ferroportīna (FPN) ass loma dzelzs pārslodzes iestatīšanā.Dzelzs saturoša uztura nodrošināšana palielina dzelzs pieejamību serumā un dzelzs līmeni glomerulārā fifiltrātā un palielina hepcidīna (HAMP) ražošanu un izdalīšanos aknās. Paaugstināts HAMP līmenis serumā kavē dzelzs reabsorbciju, bloķējot FPN nieru kanāliņos. Dzelzs reabsorbcijas kavēšana izraisa dzelzs aizturi nierēs, vienlaikus samazinot sistēmisko dzelzs pieejamību un attiecīgi samazinot aknu dzelzs pārslodzi. FpnC3326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ pelēm HAMP reakcijas zudums nieru kanāliņos izraisa neregulētu dzelzs reabsorbciju. Tas savukārt novērš dzelzs aizturi nierēs, vienlaikus palielinot sistēmisko dzelzs pieejamību un pēc tam palielinot dzelzs pārslodzi aknās.

Lai gan gan hemohromatoze, gan uztura dzelzs pārslodze palielināja FPN nieru kanāliņos, šķiet, ka tie izraisīja dažādus lokalizācijas modeļus apikālajā, intracelulārajā vai bazolaterālajā nodalījumā. Līdzīgi novērojumi tika veikti žurkas divpadsmitpirkstu zarnā, kur tika konstatēts, ka dzelzs zonde maina FPN relatīvo sadalījumu starp šiem divpadsmitpirkstu zarnas enterocītu nodalījumiem.20 Viena no šo rezultātu interpretācijām ir tāda, ka dzelzs pārslodzes apstākļos palielinājās FPN translācija (starpnieks: dzelzs regulējošie proteīni) darbotos, lai uzturētu augstu kopējo FPN veidošanos nieru kanāliņu šūnā, savukārt palielināts HAMP līmenis serumā samazinātu FPN īpatsvaru, kas var lokalizēties bazolaterālajā membrānā. No šīs interpretācijas izriet, ka atšķirības starp iepriekšējiem ziņojumiem par FPN lokalizāciju proksimālajās kanāliņos varētu atspoguļot nieru kanāliņu dzelzs satura un seruma hepcidīna līmeņa atšķirības dažādos pētījumos izmantotajos dzīvnieku modeļos.5,11–14,21 Alternatīvi, šī atšķirība varētu atspoguļot nespecifiskas reaktivitātes pakāpi, par kuru ziņots iepriekš saistībā ar komerciālām FPN antivielām, tostarp šajā pētījumā izmantotajām antivielām.14 FPN apikālās lokalizācijas funkcionālā nozīme nieru kanāliņos joprojām ir neskaidra, un mēs nevarējām atklāt nekādas izmaiņas. dzelzs izdalīšanā ar urīnu pelēm ar dzelzi (papildu attēls 5C). Vēl viens interesants novērojums ir tāds, ka daži FPN bija lokalizēti ar dzelzi saturošu peļu nieru kanāliņos kodolā. Līdzīgus novērojumus veica citi ar dzelzi saturošiem makrofāgiem un žurku aknām. Pēdējā pētījumā konstatēts, ka kodola FPN ir iesaistīts kodoldzelzs aizturē kā daļa no akūtās fāzes reakcijas.22,23 Ir nepieciešami detalizēti pētījumi par FPN subcelulāro lokalizāciju dažādos dzelzs stāvokļos un dažādās patoloģijās, lai vēl vairāk uzlabotu mūsu izpratni par lomu. FPN nierēs.

Nieru HAMP regulējums un funkcija arī nav pilnībā izprotama. Mēs noskaidrojām, ka hamp gēna ekspresija nierēs tika palielināta savvaļas tipa dzīvniekiem pēc dzelzs saturošas diētas nodrošināšanas (papildu attēls 5E), bet palika nemainīga hemohromatozes pelēm (papildu attēls 5D) un tiem, kuriem bija nieru kanāliņi. specifisks FPN zudums vai nieru kanāliņu specifisks HAMP reakcijas zudums (papildu attēls S5F un G). Šie rezultāti neatbalsta domu, ka nieru hempa gēna ekspresiju lokāli regulē nieru dzelzs līmenis. Runājot par nieru HAMP funkciju, iepriekšējais pētījums par vienpusējas urīnvada oklūzijas modeli liecināja, ka tas ir iesaistīts nieru FPN kontrolē. Mēs noskaidrojām, ka nieru HAMP (konstatēts, izmantojot antivielu pret pro-HAMP peptīdu) ir kolokalizēts ar kalbindīnu (distālo izliektu kanāliņu un garozas savākšanas kanālu un savienojošo kanālu marķieri) (papildu attēls S5H). No otras puses, FPN ekspresija nekolokalizējas ar kalbindīnu pat pelēm, kurām ir nierēm specifisks HAMP reakcijas zudums (1.a attēls un papildu attēls S5I). Šie rezultāti neatbilst nieru HAMP autokrīnajai lomai nieru FPN regulēšanā. Neskatoties uz to, nieru HAMP var būt iesaistīts nieru FPN parakrīnajā regulēšanā. Nākotnē būtu interesanti izpētīt nieru HAMP parakrīnās funkcijas un kvantitatīvi noteikt nieru un aknu HAMP relatīvo ieguldījumu dzelzs reabsorbcijas kontrolē.

Vēl viens interesants novērojums no šī pētījuma ir tāds, ka normālas dzelzs pieejamības apstākļos nieru HAMP/FPN ass nav būtiska normālas sistēmiskas dzelzs homeostāzes uzturēšanai un tā vietā ir svarīgāka, lai regulētu dzelzs līmeni nierēs, vismaz mātītēm. C57BL/6 celms. Patiešām, lai gan novērotās nieru dzelzs līmeņa izmaiņas, ko izraisīja FPN vai HAMP reakcijas zudums nieru kanāliņos, bija pastāvīgas, sistēmisko dzelzs indeksu izmaiņas bija pārejošas. Sistēmiskās ietekmes pārejošais raksturs liecina par iesaistīšanās kompensācijas mehānismu(-iem). Viens no iespējamiem kompensācijas mehānismiem ir uztura dzelzs absorbcijas modulācija ar aknu HAMP palīdzību. Patiešām, mēs noskaidrojām, ka pelēm, kurām bija specifisks HAMP reakcijas zudums nierēs, aknu hamp gēna ekspresija palielinājās pēc dzelzs līmeņa paaugstināšanās serumā 1- mēneša laika punktā un saglabājās palielināta vēlākos laika punktos. Un otrādi, pelēm, kurām bija nierēm specifisks FPN zudums pēc dzelzs līmeņa samazināšanās serumā 1- mēneša laika punktā, aknu hempa gēna ekspresija tika nomākta, un vēlākos laika punktos tā palika nomākta (papildu attēls S6A un B). Turklāt paaugstināta aknu hepatīta gēna ekspresija pirmajā iestatījumā bija saistīta ar samazinātu zarnu FPN līmeni, turpretim samazinātu aknu hepatīta gēna ekspresiju otrajā iestatījumā pavadīja augstāks zarnu FPN (papildu attēls S6C un D). Šie rezultāti liecina, ka aknu HAMP iedarbība uz dzelzs uzsūkšanos ar uzturu ir aktīvs kompensācijas mehānisms, kas iesaistīts normālas sistēmiskas dzelzs homeostāzes uzturēšanā, saskaroties ar traucētu nieru dzelzs reabsorbciju.

Cistanche var atjaunot nieru darbību

Jāatzīmē, ka normālas dzelzs pieejamības apstākļos nieru HAMP/FPN ass, šķiet, ir svarīgāka peļu mātītēm nekā peļu tēviņiem, vismaz C57BL/6 celmā. Šo novērojumu nevarēja saistīt ar atšķirībām starp vīriešiem un sievietēm Pax8.CreERT2þ transgēna aktivitātē. Šajā peles celmā jau iepriekš ziņots par seksuālo dimorfismu transportētāju līmeņos un modeļos gar nefronu.24 Saskaņā ar to mēs konstatējām augstāku FPN bazālo ekspresiju.nieresmātīšu nekā vīriešu metiena biedru nierēs (papildu attēls S2D). Iepriekšējais pētījums, kurā tika izmantots cits Cre rekombināzes transgēns, ko virza konstitutīvi aktīvs Nestin promotors, lai dzēstu fpn visā nefronā, arī ziņoja par nieru dzelzs līmeņa paaugstināšanos un dzelzs un aknu dzelzs krājumu samazināšanos serumā. Tomēr šis pētījums tika veikts ar citu peles celmu (129/SvEvTac), un tajā netika analizēts fenotips atkarībā no dzimuma vai laika.14

hemohromatoze un citi dzelzs traucējumi.

ATKLĀŠANA

Visi autori nav paziņojuši par konkurējošām interesēm.

PATEICĪBA

SL-L saņēma Britu Sirds fonda starpposma pamatzinātņu pēcdoktorantūras stipendiju (FS/12/63/29895). GM finansēja aKidney Research UK projektsdotācija (RP_020_20160303), kas piešķirta SL-L.

AUTORU IEGULDĪJUMI

SL-L iecerētais pētījums. SL-L un GM veica eksperimentus. SL-L analizēja un interpretēja rezultātus. SL-L uzrakstīja manuskriptu. AM sniedza materiālus. PAR komentēja manuskriptu.

PAPILDU MATERIĀLS

Papildu fails (PDF)

S1 attēls. FPN un HAMP antivielu specifikas apstiprināšana. (A) Reprezentatīvi FPN imūnfluorescējošas krāsošanas attēli Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ dzīvnieku un Fpnflfl/flfl kontroles grupu nieru garozā 3 mēnešu vecumā. Augšējie paneļi, stienis ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. Apakšējie paneļi, stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (B) Reprezentatīvi HAMP imūnfluorescējošās krāsojuma attēli Hamp–/– dzīvnieku nieru garozā un savvaļas tipa kontroles 3 grādos. mēnešu vecumā. Augšējie paneļi, stienis ¼ 200 mm, oriģinālais palielinājums 10. Apakšējie paneļi, stienis ¼ 25 mm, oriģinālais palielinājums 60.

S2 attēls. Pax8.CreERT2þ darbības un specifikas apstiprinājums. (A) Fpnflfl/flfl un Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peļu genotipēšana, izmantojot genoma DNS, kas ekstrahēta no aknām, liesas unnieres1 nedēļu pēc tamoksifēna indukcijas. (B) Western blot FPN iekšānieressieviešu un vīriešu FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peles un FpnC326Y kontroles 3 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. Signāla intensitātes kvantitatīvā noteikšana, kas parādīta apakšējā panelī. (C) Western blot FPN noteikšanai Fpnflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peļu un Fpnflfl/flfl kontroles mātīšu un tēviņu nierēs 3 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. Signāla intensitātes kvantitatīvā noteikšana, kas parādīta apakšējā panelī. (D) Western blot FPN noteikšanai savvaļas tipa mātīšu un vīriešu kārtas metienu biedru nierēs 3 mēnešu vecumā. Signāla intensitātes kvantitatīvā noteikšana, kas parādīta apakšējā panelī. (E–G) Lielākas paneļu versijas attiecīgi 1.a, g un e attēlā. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. *P < 0.05,="" ***p=""><>

S3 attēls. Eritroferrona līmenis serumā nemainās FpnC326Yflfl/flfl Pax8.CreERT2þ un Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2 pelēm. (A) Eritroferrona līmenis serumā FpnC326Yflfl/flfl,Pax8.CreERT2þ peļu un FpnC326Yflfl/flfl mātīšu un tēviņu mātītēm un FpnC326Yflfl/flfl kontroles grupām 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (B) Eritroferrona līmenis serumā Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peles un Fpnflfl/flfl kontroles mātītēm un tēviņiem 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM.

S4 attēls. Hemoglobīna un eritroferrona līmenis serumā nemainās FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ ar dzelzi saturošu diētu. (A) Hemoglobīna līmenis mātītēm un tēviņiem FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ pelēm un FpnC326Yflfl/flfl kontroles grupām, kas barotas ar kontroles diētu (satur 200 ppm dzelzs) vai ar dzelzi saturošu diētu (satur 5000 ppm dzelzs) no 3 mēnešiem. . (B) Eritroferrona līmenis serumā FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ peļu un FpnC326Yflfl/flfl kontroles mātītēm un tēviņiem, kas baroti ar kontroles diētu (satur 200 ppm dzelzs) vaidzelzs piesātināta diēta(satur 5000 ppm dzelzs) no atšķiršanas 3 mēnešus. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. (C, D) Lielākas paneļu versijas attiecīgi 3.h un i attēlā.

S5 attēls. Nieru dzelzs apstrāde un nieres nomākta izpausme dažādos peles modeļos. (A) Dzelzs līmenis nierēs Fpnwt/C326Y dzīvniekiem un Fpnwt/wt kontroles grupām 6 mēnešu vecumā. (B) Reprezentatīvi attēli ar FPN un AQP1 imūnfluorescējošu krāsojumu nieru garozā Fpnflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ dzīvniekiem un Fpnflfl/flfl kontroles dzīvniekiem, kuri tika baroti ar dzelzi saturošu diētu, kas satur 5000 ppm pēc atšķiršanas 3 mēnešus. Stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (C) Dzelzs līmenis urīnā (normalizēts līdz urīna kreatinīnam) savvaļas dzīvniekiem, kas 3 mēnešus baroti ar dzelzi saturošu barību, kas satur 5000 ppm dzelzs, vai kontroles diētu, kas satur 200 ppm dzelzs. (D) Nieru hempa gēna ekspresija Fpnwt/C326Y dzīvniekiem un Fpnwt/wt kontrolēm 3 mēnešu vecumā. (E) Nieru hempas gēna ekspresija savvaļas tipa dzīvniekiem, kuri 3 mēnešus baroti ar dzelzi saturošu diētu, kas satur 5000 ppm dzelzs, vai kontroles diētu, kas satur 200 ppm dzelzs. (F) Nieru hamp gēna ekspresija mātītēm un tēviņiem FpnC326Yflflflfl,Pax8.CreERT2þ pelēm un FpnC326Yflflflfl kontrolei 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (G) Nieru hamp gēna ekspresija mātītēm un tēviņiem Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ pelēm un Fpnflfl/flfl kontrolēm 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna indukcijas. (H) HAMP un CalD imūnfluorescējošās krāsošanas reprezentatīvi attēli savvaļas tipa dzīvnieku nieru garozā 3 mēnešu vecumā. Stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (I) Reprezentatīvi attēli FPN un CalD imūnfluorescējošai krāsošanai FpnC326Yflfl/flfl ,Pax8.CreERT2þ dzīvnieku nieru garozā 1 mēneša vecumā. Stienis ¼ 25 mm, sākotnējais palielinājums 60. (J–M) Lielākas paneļu versijas attiecīgi 4.c, d, f un g attēlā. Vērtības tiek parādītas kā vidējā SEM. *P <>

S6 attēls. Aknu hamp gēna ekspresija un zarnu FPN līmeņi ir mainīti pelēm ar nieru kanāliņiem specifisku fpn izsitumu un pelēm ar nieru kanāliņu specifisku fpnC326Y knock-in. (A) Hamp mRNS relatīvā ekspresija mātīšu FpnC326Yflfl/flfl, Pax8.CreERT2þ peles un FpnC326Yflfl/flfl kontroles aknās 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (B) Hamp mRNS relatīvā ekspresija mātīšu Fpnflflfl, Pax8.CreERT2þ peles un Fpnflfl/flfl kontroles aknās 1 nedēļu, 1 mēnesi, 3 mēnešus un 6 mēnešus pēc tamoksifēna terapijas. (C) Reprezentatīvi attēli FPN imūnkrāsošanai mātīšu FpnC326Y flflflfl, Pax8.CreERT2þ peles un FpnC326Yflfl/flfl kontroles zarnās 1 mēnesi pēc tamoksifēna terapijas. Stienis ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. (D) Reprezentatīvi attēli FPN imūnkrāsošanai mātīšu Fpnflflflfl, Pax8.CreERT2þ peles un Fpnflfl/flfl kontroles zarnās 1 mēnesi pēc tamoksifēna terapijas. Stienis ¼ 200 mm, sākotnējais palielinājums 10. Vērtības ir parādītas kā vidējais SEM. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01="" un=""><>

Cistanche var atvieglot nieru infekciju

ATSAUCES

1. Donovan A, Lima CA, Pinkus JL u.c. Dzelzs eksportētājs ferroportīns/slc40a1 ir būtisks dzelzs homeostāzei. Šūnu Metab. 2005;1:191–200.

2. Ganz T. Šūnu dzelzs: feroportīns ir vienīgā izeja. Šūnu Metab. 2005; 1:155–157.

3. Nemeth E, Tuttle MS, Powelson J u.c. Hepcidīns regulē šūnu dzelzs izplūdi, saistoties ar feroportīnu un izraisot tā internalizāciju. Zinātne. 2004;306:2090–2093.

4. Qiao B, Sugianto P, Fung E u.c. Hepcidīna izraisīta feroportīna endocitoze ir atkarīga no feroportīna ubikvitinācijas. Šūnu Metab. 2012; 15:918–924.

5. Wareing M, Ferguson CJ, Green R u.c. Dzelzs transportēšanas nierēs raksturojums in vivo anestēzētām žurkām. J Physiol. 2000;524:581–586.

6. Christensen I, Birn H, Storm T u.c. Endocītiskie receptori nieru proksimālajā kanāliņā. Fizioloģija. 2012; 27:223–236.

7. Zhang D, Meyron-Holtz E, Rouault T. Nieru dzelzs metabolisms: transferīna dzelzs piegāde un dzelzs regulējošo proteīnu loma. J Am Soc Nephrol. 2007;18:401–406.

8. Canonne-Hergaux F, Gruenheid S, Ponka P, Gros P. Cellular and subcellular localization of the Nramp2 iron transporter in intestinal brush border and Regulation by dietary iron. Asinis. 1999; 93: 4406–4417.

9. Wang C, Jenkitkasemwong S, Duarte S u.c. ZIP8 ir dzelzs un cinka transportētājs, kura šūnu virsmas ekspresiju regulē šūnu dzelzs slodze. J Biol Chem. 2012;287:34032–34043.

10. Martines A, Masereeuw R, Tjalsma H, et al. Dzelzs metabolisms dzelzs izraisītu nieru bojājumu patoģenēzē. Nat Rev Nephrol. 2013; 9:385–398.

11. Wolff N, Liu W, Fenton R u.c. Ferroportīns 1 tiek ekspresēts bazolaterāli žurku nieru proksimālajās kanāliņu šūnās, un dzelzs pārpalikums palielina tā membrānu apriti. J Cell Mol Med. 2011;15:209–219.

12. Pan S, Qian ZM, Cui S u.c. Vietējais hepcidīns palielināja intracelulāro dzelzs pārslodzi, sadaloties ferroportīnam nierēs. Biochem Biophys Res Commun. 2020;522:322–327.

13. Moulouel B, Houamel D, Delaby C u.c. Hepcidīns regulē intrarenālo dzelzs apstrādi distālajā nefronā. Kidney Int. 2013;84:756–766.

14. Wang X, Zheng X, Zhang J u.c. Feroportīna fizioloģiskās funkcijas nieru dzelzs pārstrādes un išēmisku akūtu nieru bojājumu regulēšanā. Am J Physiol Renal Physiol. 2018;315:F1042–F1057.

15. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Chung YJ u.c. Hepcidīna būtiska šūnu autonomā loma sirds dzelzs homeostāzē. Elife. 2016;5: e19804.

16. Lakhal-Littleton S, Wolna M, Carr CA, et al. Sirds feroportīns regulē šūnu dzelzs homeostāzi un ir svarīgs sirds darbībai. Proc Natl Acad Sci US A. 2015;112:3164–3169.

17. Espana-Agusti J, Zou X, Wong K u.c. Pax8-CreERT2 transgēnās līnijas un Slc22a6-CreERT2 knock-in līnijas ģenerēšana un raksturojums inducējamai un specifiskai nieru kanāliņu epitēlija šūnu ģenētiskai manipulācijai. PLoS One. 2016;11:e0148055.

18. Lakhal-Littleton S, Crosby A, Frise M u.c. Intracelulārais dzelzs deficīts plaušu artēriju gludo muskuļu šūnās izraisa plaušu arteriālo hipertensiju pelēm. Proc Natl Acad Sci US A. 2019;116:13122–13130.

19. Camaschella C. Izpratne par dzelzs homeostāzi, izmantojot hemohromatozes un saistīto traucējumu ģenētisko analīzi. Asinis. 2005; 106: 3710–3717.

20. Núñez MT, Tapia V, Rojas A u.c. Dzelzs padeve nosaka zarnu dzelzs transportētāju DMT1 un feroportīna 1 apikālo/bazolaterālo membrānu sadalījumu. Am J Physiol Cell Physiol. 2010;298:C477–C485.

21. Veuthey T, D'Anna MC, Roque ME. Nieru loma dzelzs homeostāzē: prohepcdīna, ferroportīna un DMT1 ekspresija nierēs anēmiskām pelēm. Am J Physiol Renal Physiol. 2008;295:F1213–F1221.

22. Naz N, Malik I, Sheikh N u.c. Ferroportīns-1 ir "kodola" negatīvs akūtas fāzes proteīns žurku aknās: salīdzinājums ar citiem dzelzs transportēšanas proteīniem. Lab Invest. 2012; 92:842–856.

23. Aydemir F, Jenkitkasemwong S, Gulec S, Knutson MD. Dzelzs slodze palielina feroportīna heterogēnās kodola RNS un mRNS līmeni peles J774 makrofāgos. J Nutr. 2009; 139:434–438.

24. Veiras LC, Girardi ACC, Curry J u.c. Nieru transportētāju un elektrolītu homeostāzes seksuālais dimorfiskais modelis. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 3504–3517.