Nieru epitēlija mērķtiecīga mitohondriju transkripcijas faktora A trūkums izraisa progresējošu mitohondriju samazināšanos, kas saistīta ar smagu cistisko slimību
Mar 23, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Kens Iši, Hanako Kobajaši, Kensei Taguči un citi.
IEVADS
Mitohondriju (mt) disfunkcija ir labi atpazīstama bieži sastopamu nieru slimību patoloģiska iezīme un var izraisīt šūnu bojājumus, iekaisumu un fibrozi. Nierēs cauruļveida epitēlija šūnas ir ļoti atkarīgas no adenozīna trifosfāta (ATP), kas rodas oksidatīvās fosforilēšanas (OXPHOS) rezultātā, jo tās veic vairākas enerģiju patērējošas epitēlija transportēšanas funkcijas. Tāpēc efektīvas mt ATP ražošanas uzturēšana ir būtiska normālai nieru darbībai un sistēmiskai elektrolītu homeostāzei. Turklāt nesenie pierādījumi liecina, ka mitohondrijiem ir liela nozīme gēnu regulēšanā, šūnu signalizācijā un šūnu diferenciācijā, veidojot starpmetabolītus un reaktīvās skābekļa sugas (ROS).2 Neskatoties uz šiem sasniegumiem, mt signālu loma ir patoģenēzē. bieži sastopamās nieru slimības nav labi saprotamas.
Lai izpētītu mt funkciju nieru homeostāzē un patoģenēzē, mēsmērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A(TFAM). TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ir kodolā kodēts faktors, kas ir būtisks mt funkcijai, mt kopiju skaita uzturēšanai un mt DNS strukturālajai stabilitātei, jo tas regulē mt genoma replikāciju un transkripciju, saliekot promotora DNS.3 Zīdītāju mt DNS satur 37 gēnus, no kuriem 13 kodē elpošanas ķēdes kompleksa olbaltumvielu apakšvienības, 22 kodē pārneses RNS un 2 ribosomu RNS. TādējādiTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ir tieši iesaistīts mt elektronu transportēšanas un ATP sintēzes regulēšanā, izmantojot tādu gēnu transkripciju kā mitohondriāli kodētais citohroms b (MT-CYB), mitohondriāli kodēta citohroma c oksidāzes 1. apakšvienība (MT-CO1) un mitohondriāli kodēta ATP membrānas sintāzes subvienība. 6 (MT-ATP6).3BezTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A), šūnas zaudē spēju ražot ATP, izmantojot OXPHOS, nevar radīt ievērojamu daudzumu mt ROS un pakāpeniski iztukšojas no mitohondrijiem. - Ģenētiskie pētījumi ir parādījuši, kaTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ir būtiska normālai embrioģenēzei, jo ir globāla homozigotaTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija izraisīja intrauterīnu letalitāti līdz 10.5. embrija dienai, savukārt heterozigota deficīts, lai gan tas samazināja mt kopiju skaitu par -40 procentiem un izraisīja elpošanas ķēdes deficītu, neizraisīja embrionālo letalitāti. Tādējādi ģenētiskā mērķēšana uzTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A) ir noderīga eksperimentāla stratēģija, lai pārbaudītu progresējošas mt disfunkcijas lomu šūnu diferenciācijā un audu homeostāzē. Šūnu tipam raksturīga nosacīta inaktivācijaTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ierosināja, ka OXPHOS un/vai mt ROS ģenerēšana ir būtiska šūnu diferenciācijai, funkcijai un normālai fizioloģijai.{0}}o
Primārie mt traucējumi kodola vai mt gēna mutāciju dēļ var izpausties ar nieru slimību, kas visbiežāk izpaužas kā tubulointersticiāls ievainojums vai izolēta kanāliņu disfunkcija.1,12 Lai gan tie ir saistīti ar noteiktu cilvēku slimību, piemēram, neirodeģeneratīvu traucējumu, patoģenēzi, specifiskas TFAM mutācijas.(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)nav ziņots par nieru slimību izraisīšanu. Pavisam nesen samazinātsTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)izpausme ir saistīta ar hronisku nieru slimību. Mt integritātes zudums sakarā arTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija izraisīja tubulointersticiālu slimību un nieru mazspēju pelēm, kas daļēji bija saistīta ar mt DNS stresa izraisītas cikliskās GMP-AMP sintāzes (cGAS) - interferona gēnu (STING) atkarīgo iekaisuma reakciju stimulatora aktivāciju.
Šeit mēs ziņojam, ka pelēm ar nosacījumuTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A) inaktivācija ar sinusa okulis saistītās homeobox 2 (SIX2) ekspresējošās nefrona cilmes šūnās attīstās smaga cistiskā slimība un priekšlaicīgi mirst no nieru mazspējas kā jaunām juvenīlām pelēm.TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/-pelēm bija raksturīgi nefronu nobriešanas defekti, kas bija saistīti ar mt samazināšanos, OXPHOS samazināšanos un vielmaiņas pāreju uz glikolīziTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7-nieru epitēlijs. Ņemot vērā cistiskās slimības smagumuTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7-pelēm, mēs analizējām 2 policistiskās nieru slimības (PKD) peļu modeļus, kas radušies mutāciju rezultātā vai nu policistīnā-1 (Pkd1) vai cistīnā-1 (Cys1), kā arī cilvēka audi no pacientiem ar autosomāli dominējošu policistisku nieru slimību (ADPKD). Mēs to nosakāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ir disregulēts cistās gan no peļu, gan cilvēka PKD audiem. Kopumā mūsu pētījumi liecina, ka TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)disregulācija un mt samazināšanās ir raksturīgas nieru cistisko slimību pazīmes, un tām var būt nozīme to patoģenēzē.
REZULTĀTI
TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija SIX2 cilts šūnās izraisa smagu cistisku slimību, kas izraisa nieru mazspēju
Lai izpētītu mt funkciju nieru epitēlijā, mēs inaktivējāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)SEŠĀS{0}}izpaušanas cilmes šūnās, kas rada visus nefrona segmentus, izņemot savācējvadu (CD).15Šajā nolūkā mēs šķērsojāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)floksēta alēle ar baktēriju mākslīgo hromosomu transgēnām pelēm, kas ekspresē pastiprinātu zaļi fluorescējošu proteīnu/Cre rekombināzes saplūšanas proteīnu (eGFP/Cre) Six2 promotora transkripcijas kontrolē (attēls la)."Peles ir homozigotas pretTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)floxed alēle un heterozigota eGFP/Cre transgēnam (Seši2-eGFP/Cre plus ; T fam) turpmāk tiek saukti par sešiem2-Tfam-/- mutantiem. Sešas 2-Tfam-/- peles piedzima ar paredzamajām Mendeļa attiecībām, un tās nebija atšķiramas no Cre-littermate kontroles grupām, veicot vizuālu pārbaudi dzimšanas brīdī. Tomēr ķermeņa svara atšķirības starp sešiem2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A){{0}}mutantu un kre- metiena biedru kontroles kļuva redzamas pēcdzemdību dienā(P)14 (5,7±0,3 g mutantiem pret 7,5 ± 0,3 g kontrolēm, n{{11} } katrs, P=0.004; Papildu tabula S1). Seši2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A) pelēm mutantēm bija raksturīgas palielinātas nieres, salīdzinot ar kontroles grupām (nieru/ķermeņa svara attiecība 1,45 procenti ± 0,19 procenti mutantiem pret 0,60 procentiem ±0,02 procenti kontrolei). , n=4 katrs, P<0.001; figure="" lb,="" supplementary="" table="" s1)and="" died="" between="" age="" p20="" and="" p30(figure="" lb).="" juvenile="" lethality="" in="" the="" mutant="" cohort="" was="" associated="" with="" renal="" failure="" from="" severe="" cystic="" disease="" with="" blood="" urea="" nitrogen="" levels="" of="" 68.40±5.32="" mg/dl="" for="" mutant="" mice="" versus="" 16.8±2.0mg="" dl="" for="" controls(n="6" and="" 7,="" respectively;=""><0.0001; figure="" lb="" and="" c).="" furthermore,="">TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7- mutantiem attīstījās ievērojama albuminūrija (urīna albumīna/kreatinīna attiecība=362,4 ± 75,18 mg/g sešos2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)--mutanti pret 43,58±3,39 mg/g kontroles grupā attiecīgi pie P14, n=6 un 10;P<0.0001). this="" is="" consistent="" with="" the="" expression="" pattern="" of="" cre="" recombinase="" in="" six2="" nephron="" progenitor="" cells,="" which="" give="" rise="" to="" cap="" mesenchyme-derived="" renal="" tubules="" and="" podocytes.="" in="" contrast="" to="">TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-'mutanti, peles ar heterozigotāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)SIX2 priekšteču šūnu deficīts, kas parasti attīstījās, bija auglīgs un neattīstīja atklātu nieru slimību (papildu attēls S1).
1. attēls|Tfam inaktivācija SIX2 cilts šūnās izraisa smagu cistisku slimību un nieru mazspēju.(a) Shematisks attēls, kas ilustrē eksperimentālo pieeju un mērķa sekvenču atrašanās vietu Tfam floxed alēlē. Polimerāzes ķēdes reakcijas analīze kopējā genoma nieres DNS, kas izolēta no metiena biedru kontroles (Cre ) un sešām {{0}}dzimtēm pēcdzemdību dienā (P) 7; nerekombinējošā Tfam floxed alēle tiek apzīmēta ar 2-lox (2); rekombinētā alēle ar 1-lox, savvaļas tipa alēle ar wt; þ vai — norāda Six2-eGFP/Cre transgēna esamību vai neesamību. (b) Kreisie paneļi, Cre kontroles un sešu 2-Tfam peles 20 gadu vecuma nieru fotogrāfijas. Nieru svaru (KW) izsaka procentos no ķermeņa svara (BW) (n ¼ 4–14). Labie paneļi, urīnvielas slāpekļa (BUN) līmenis asinīs Cre metiena biedru kontroles (co) un Six{11}}Tfam pelēm P7 vecumā (n ¼ 7 un 6, attiecīgi) un Kaplan-Meier izdzīvošanas līknes Cre kontrolei un Six{ {16}}Tfam peles, salīdzinot ar log-rank testu (n ¼ 10–13). (c) Formalīnā fiksētu, parafīnā iestrādātu nieru sekciju reprezentatīvi attēli no Cre kontroles un sešām 2-Tfam pelēm P7 un P29 vecumā, iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E) un analizētas ar imūnhistoķīmiju, lai noteiktu gludo muskuļu aktīnu. (ACTA2) un klasteru diferenciācijas (CD) antigēns 31. Ciparu zīmes attēlo cistiskas struktūras, bet zvaigznītes – glomerulus. Stieņi ¼ 1 mm veseliem nieres šķērsgriezumiem, 100 mm lieljaudas H&E attēliem un 50 mm IHC attēliem. Dati ir izteikti kā vidējais SEM un tika analizēti ar 2-saites Stjudenta t-testu. ***P < 0,001.="" lai="" optimizētu="" šī="" attēla="" skatīšanu,="" lūdzu,="" skatiet="" šī="" raksta="" tiešsaistes="" versiju="">www.kidney-international.org.
cistanche vīriešu priekšrocības
Sešu analīze2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/-pelēm, kas arī izteica ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre reportiera alēli, kas šeit saukta par Six2-mT/mG;TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7 peles, norādot, ka lielākā daļa cistisko struktūruTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/-nieres (papildu attēls S3). Šie atklājumi saskan ar paaugstinātu fosforilētās ārpusšūnu signālu regulētās kināzes (p-ERK) un -katenīna līmeni sešās 2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- nieru audi (papildu attēls S3). Kopumā mūsu dati liecina, ka seši2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ nierēm piemīt molekulāras pazīmes, kas bieži ir saistītas ar nieru cistiskām slimībām.
Nefronu nobriešana ir bojāta sešos{0}}TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/peles Jo var paiet pat vairākas nedēļas, pirms pelēm ir specifiskas audiemTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācijas attīstības patoloģiju, mēs pēc tam pārbaudījām nieru slimības attīstības gaitu sešos{0}}TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A){{0}}peles. Mēs savācām nieres no kontroles un mutācijas pelēm vecumā P0, P7 un P14 un novērtēšanai izmantojām histoloģiskās metodes, imūnfluorescences (IF) krāsošanu un gēnu ekspresijas analīzi veselos nieru ekstraktos. IF krāsošana ar SIX2 un E-kadherīnu P0 vecumā parādīja, ka nieres no kontroles un Sic{7}}TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- bija histoloģiski līdzīgi. Kortikālo nefrogēno zonu struktūru veidošanās, piemēram, SIX2 plus vāciņa mezenhīms, E-kadherīnu ekspresējošie urīnizvadkanāla galiņi un topošās nefronu struktūras, piemēram, nieru pūslīši un komata formas un S formas ķermeņi, netika bloķēti sešos{7} }TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7- nieres (2.a attēls). Šie histoloģiskie atklājumi atbilda nefrogēnos marķierus kodējošo gēnu ekspresijas līmeņiem. Six2, sapārotā 2. kastes (Pax2), LIM homeoboksa proteīna 1 (Lhx1) un spaltam līdzīgā transkripcijas faktora 1 (Sall) mRNS līmeņi būtiski neatšķīrās starp kontroles un sešiem 2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/peles kopējā nierēs homogenējas no P0 nierēm (2.b attēls). Tas liecināja par toTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija SIX2 nefronu proģenitoros būtiski neietekmēja nefrogēno struktūru veidošanos.
2. attēls|Six2-Tfam-7pelēm ir bojāta nefronu nobriešana.(a) Reprezentatīvi attēli ar formalīnā fiksētām, parafīnā iestrādātām sekcijām no Cre~ kontroles un Six2-Tfam-/nieres vecuma pēcdzemdību dienā (P) 0. Nieru sekcijas tika iekrāsotas ar toluidīna zilo krāsu un analizētas ar imunofluorescenci, lai noteiktu ar sinusa okulis saistīto homeobox 2 (SIX2) un E-kadherīna (ECAD) ekspresiju. Urēteriskie koki ir iezīmēti ar pārtrauktām baltām līnijām. Vāciņa mezenhīms (CM), komata formas korpuss (CSB), S formas korpuss (SSB) un urētera gals (UT) ir anotēti. (b) Kreisais panelis, attīstības marķieru relatīvie mRNS ekspresijas līmeņi ar kvantitatīvu polimerāzes ķēdes reakciju kopējos nieru homogenātos no sešiem 2-Tfam-/mutantiem PO vecumā, salīdzinot ar Cre metiena biedru kontroli (n =6 katrā). ). Labais panelis, relatīvā glomerulārā (glom) un nefrona segmentam specifiskā gēna ekspresija kopējos nieru homogenātos no sešiem 2-Tfam7 mutantiem P7 vecumā, salīdzinot ar Cre metiena biedru kontroli (n =4 katrā). PT, proksimālā kanāliņa; mTAL, resna augošā Henles ekstremitāte; DT, distālā kanāliņa; CD, savākšanas kanāls. (c) ar Alcian zilo/periodskābi Šifa (AB-PAS) iekrāsotas nieru sekcijas P0, P7 un P14 vecumā. Bultiņas norāda PAS pozitīvus kanāliņus ar otas apmali, zvaigznītes attēlo glomerulus un skaitļu zīmes attēlo cistiskās kanāliņus, joslas=100 um AB-PAS attēliem un 50 um toluidīna zilā krāsā iekrāsotiem attēliem un IF attēliem. Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM;2-attiecīgais Stjudenta t-tests;*P<><><0.001.agp1,aquaporin 1;agp2,aquaporin="" 2;lhx1,lim="" homeobox1;napi2a,="" sodium-phosphate="" cotransporter="" 2a;="" ncc,="" thiazide-sensitive="" sodium-chloride="" cotransporter;="" nkcc2,="" sodium-potassium-chloride="" cotransporter="" 2;pax2,="" paired="" box="" 2;="" sall1,="" spalt="" like="" transcription="" factor="" 1;="" scnn1a,="" epithelial="" sodium="" channel="" 1="" alpha="" subunit;="" trpv5,="" transient="" receptor="" potential="" cation="" channel="" subfamily="" v="" member="" 5;="" umod,="" uromodulin.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">www.kidney-international.org.
cistanche atsauksmes
Lai gan topošās nefrona struktūras veidošanās netika kavēta, krāsošana ar Alcian Blue/periodskābi-Šifa un lotosa tetragonolobusa lektīnu liecināja par nepilnīgu terminālo nefrona nobriešanu sešos2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A){{0}}peles P0 vecumā. Alcian zilā/periodiskā skābe-Schiff, kas krāso cauruļveida pamatnes membrānas un suku apmali, un lotosa tetragonolobusa lektīns, kas identificē specifiskus oligosaharīdus proksimālo kanāliņu šūnu otas robežās, tika samazināts mutantu nierēs. 2.c attēlā parādīta alcian zilā/periodiskās skābes-Šifa krāsošana laika punktos P0, P7 un P14. Lotosa tetragonolobusa lektīna histoķīmija un IF krāsošana Vilmsa audzēja 1 proteīnam P0, P7 un P14 laika punktos ir parādīta S4 papildu attēlā. PO vecumā relatīvais laukums, kas pozitīvi iekrāsojās ar lotosa tetragonolobusa lektīnu, bija 2,10 procenti ±0,51 procenti un 0,39 procenti ± 0,1 procents plkst. vecums P7 pret 6,25 procentiem ± 0,28 procentiem un 6,2 procentiem ±1,1 procentiem attiecīgi kontrolēm (n=3-4, P=0,0004 un 0,0007, attiecīgi; papildu attēls S4). Atbilstoši šiem histoloģiskajiem atklājumiem ir ievērojama gēnu ekspresijas samazināšanās, kas kodē glomerulāro un nefronu segmentam specifiskos marķierus podocīnu, nefrīnu, akvaporīnu 1 (Agp1), nātrija-fosfāta kotransportētāju 2a (NaPi2a), uromodulīnu, nātrija-kālija-hlorīda kotransporteri 2. (Nkcc2) un pret tiazīdiem jutīgu nātrija hlorīda kotransportieri (Ncc) in Six2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ peles (2.b attēls). Kopumā šie dati liecina, ka seši2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- nierēs pakāpeniski samazinās nobriedušu proksimālo nefronu segmentu un glomerulu skaits.
Tā kā Six{0}}eGFP/Cre darbības rezultātāTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-deficīts no mezenhīma iegūtiem nefrona segmentiem, mēs paredzējām, ka CD epitēlija šūnu nobriešana, kas ir iegūta no urīnizvadkanāla pumpuriem, netiks ietekmēta sešos gadījumos2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ nieres. Atbilstoši šim priekšstatam ir tāds, ka iekrāsošanās ar Dolichos biflorus aglutinīnu, kas reaģē ar N-acetil-D-galaktozi distālajā kanāliņā un CD, liecināja par Dolichos biflorus aglutinīna pozitīvo struktūru relatīvi pārspīlētu sešos gadījumos2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- nieres. P7 vecumā Dolichos biflorus aglutinīnam pozitīvi iekrāsotie apgabali veidoja 13,91 procentus ±0,9 procentus no mutantu kopējās platības, salīdzinot ar 1,93 procentiem ± 0,1 procentu kontrolei (n {{11}). }, P=0.0002; Papildu attēls S4). Nātrija kanāla epitēlija 1 alfa apakšvienības (Scnnla) vai akvaporīna 2 (Agp2), kas abi ir ekspresēti CD epitēlija šūnās, mRNS ekspresija netika būtiski samazināta salīdzinājumā ar vadīkla (2.b attēls). Pretstatā sešiem2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- nieres,TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija homeobox B7 (HOXB7) cilmes šūnās, kas rada CD epitēlija šūnas, kā rezultātā tiek zaudēta CD nefrona marķiera ekspresija un viegla cauruļveida dilatācija, bet ne cistoģenēze (papildu attēls S5). Kopumā mūsu dati liecina, ka zaudējumi noTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)funkcija SIX2 cilmes šūnās nebloķē topošo nefronu struktūru attīstību, bet kavē terminālo nefronu nobriešanu.
TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/-cistām trūkst kopējo nefrona segmentu marķieru
Raksturot histoģenētisko izcelsmiTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7nieru cistas, mēs veicām IF analīzesTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/kidneys at age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter(distal tubule), and aquaporin 2(CD). The majority of cysts with a maximal diameter of>50 um did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation(Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 um raksturoja uromodulīna intraluminālas nogulsnes, kas liecināja par izcelšanos no nefrona segmentiem, kas atrodas distālā attālumā no proksimālā kanāliņa un Henles lejupejošās cilpas (3.b attēls).
3. attēls ITfam-/cistas neizpauž kopīgus nefrona segmentam raksturīgos marķierus.(a)Representative images of formalin-fixed, paraffin-embedded kidney sections from Six2-mT/mG; Tfam-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2(AQP2)by immunofluorescence (IF). 4'6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 um. (b) reprezentatīvi attēli ar formalīnā fiksētām, parafīnā iestrādātām nieru sekcijām no Six2-mT/mG; Tfam-7peles P14 vecumā ar IF iekrāsotas uz eGFP un uromodulīnu. Zvaigznītes attēlo cistas ar intraluminālo uromodulīnu. Intraluminālā uromodulīna klātbūtne tika pārbaudīta cistās, kuru maksimālais diametrs bija vai nu 50-100 µm, vai cistās, kuru maksimālais diametrs pārsniedz 100 µm. Bāri =(a,b)100 um. Lai optimizētu šī attēla skatīšanu, lūdzu, skatiet šī raksta tiešsaistes versiju vietnē www nieru-international.org.
Progresējošas mt funkcijas un morfoloģijas anomālijasTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7-epitēlija šūnas
Raksturot vielmaiņas seku laika gaituTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)dzēšanu, mēs vispirms pārbaudījām mRNS līmeniTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)unTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)- regulēta mt-Col, mt-Cyb un mt-Atp6 inTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/-nieres PO, P7 un P14 vecumā. Kā gaidīts,TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A), mt-Col, mt-Cyb un nt-Atp6 mRNS līmenis tika ievērojami samazināts (4.a attēls). T fam -7- epitēlija šūnas, kas marķētas ar eGFP (sešas2- mT/mG; Tfam-7 peles), uzrādīja būtisku MT-CO1 proteīna ekspresijas samazināšanos (papildu attēls S7). Mt DNS kopiju skaits tika samazināts par 63 procentiem, kas atbilst mt izsīkumam, kas ir raksturīgaTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)deficīts (4.a attēls). Turpretim kodolgēnu, kas kodē nikotīnamīda adenīna dinukleotīdu: ubikinona oksidoreduktāzes kodola apakšvienību 3 (Ndufs3) un sukcināta dehidrogenāzes kompleksa flavoproteīna apakšvienību A (Sdha), ekspresija netika ietekmēta P0 vecumā, bet P1 4 P7 vecumā tika samazināta. (4.a attēls). Šie mt gēna un proteīna analīzes atklājumi atbilst pakāpeniskai mt kopiju skaita zudumam Tfam-/-epitēlijā.
Tālāk mēs pētījām vielmaiņas ietekmiTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)inaktivācija primārajās proksimālajās kanāliņu epitēlija šūnās (PTEC), kas izolētas P7 vecumā.TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7 PTEC uzrādīja ievērojamu skābekļa bāzes patēriņa rādītāju samazināšanos (40,77 ± 4,10 mutantiem pret 61,75 ± 5,18 pmol/min/10 šūnām kontrolēm, n=3 katra, P= 0.034 ),ar ATP saistīta elpošana (33,11 ± 3,91 mutantiem pret 46,92 ± 4,91 pmol/min/10* šūnām kontrolēm, n=3 katra, P=0,093), maksimālā elpošana (116,8 ± 4,91 14,19 mutantiem pret 225,5 ± 13,55 pmol/min/10* šūnām kontrolēm, n= 3 katra, P=0,005) un rezerves elpošanas kapacitāte (76,05 ± 10,18 mutantiem pret 163,7 ± 163,7 ± 10*). 8,61 pmol/min/10* šūnas kontrolēm, n=3 katra, P= 0,003; 4.b attēls).
cistanche reddit
Lai vēl vairāk raksturotu mt izsīkuma un bojājumu pakāpi, mēs pārbaudījāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- nieres ar transmisijas elektronu mikroskopiju un 3-dimensiju strukturētā apgaismojuma mikroskopiju (3D SIM). P7 vecumā mitohondrijiem bija neregulāras formas un balonēšana, kas atbilst iepriekšējiem atklājumiemTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)nokautas peles. Transmisijas elektronu mikroskopiskā analīze liecināja, ka mitohondriju strukturālās anomālijas, piemēram, palielināts izmērs un patoloģiskas kristas, progresēja pēcdzemdību periodā, jo morfoloģiskās atšķirības starp mutantiem un kontroli bija mazāk pamanāmas P0 vecumā un kļuva smagākas līdz ar vecumu (4.c attēls). ).3D SIM karte tika izmantota, lai pārbaudītu mt apjomu un tīkla izmēru sešos 2-mT/mG;TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ mutanti, salīdzinot ar sešām2-mT/mG kontroles pelēm P7 vecumā; mt tilpums tika mērīts 5 līdz 8 kanāliņu šķērsgriezumos katrā sekcijā, pārbaudot 25 līdz 40 eGFP pozitīvas garozas epitēlija šūnas, kas iekrāsotas uz no sprieguma atkarīgo anjonu selektīvo kanālu 1 ar IF krāsošanu. Mēs noskaidrojām, ka kopējais mt tilpums uz vienu eGFP pozitīvo šūnu ir ievērojami samazināts (62,66 ± 16,46 μm/šūnā mutantiem pret 177,4±30,17 μm'/šūnu kontrolei, n=3 katrai , P= 0.0289), un tas bija saistīts ar kopējā mt tilpuma attiecības izmaiņām pret kopējo šūnu tilpumu no 0,230 ±0,01 kontroles grupā līdz 0,089 ± 0,016 sešās grupās. 2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7 mutanti (n= 3 katrs, P=0.0017; 4.c attēls). Maksimālais mt tīkla lielums, kas mēra lielāko mt tīklu visās pārbaudītajās eGFP pozitīvajās šūnās, tika samazināts sešos 2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ nieres (143,2 ± 23,2 μm² mutantiem pret 318,3 ± 49,45 um² kontrolēm, n= 3 katra, P= 0,0327). Kopumā ultrastrukturālie un SIM atklājumi, kā arī mt gēnu un olbaltumvielu analīzes rezultāti atbilst progresējošam mt kopiju skaita zudumam.TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-7-epitēlijs.
4. attēls| Tfam-/nieru epitēliju raksturo progresējoša mitohondriju izsīkšana.(a) Mitohondriju (mt) gēna ekspresija ar kvantitatīvu polimerāzes ķēdes reakciju vecuma pēcdzemdību dienā (P) {{0}}, P7 un P14 (reizes izmaiņas salīdzinājumā ar kontroli, katra n =6) un mt DNS saturs (P7) kopējos nieru homogenātos no Cre~ metiena biedru kontroles (co) un sešām 2-Tfam-/pelēm. (b) Skābekļa patēriņa ātrums (OCR) primārajās proksimālajās tubulārās epitēlija šūnās (PTEC), kas izolētas no Cre metiena biedru kontroles un sešām 2-7ģimenes nierēm P7 vecumā uz Seahorse XFe24 platformas. Reprezentatīvi OCR mērījumi kontroles un Tfam-7PTEC, kas apstrādāti ar oligomicīnu A (oligo A, adenozīna trifosfāta [ATP] sintāzes inhibīcija), karbonilcianīda-p-trifluormetoksifenilhidrazonu (FCCP, atvienotājs) un oksidatīvā rotenona fosfora inhibitoriem. un antimicīns A(AA). Parādīta arī aprēķinātā bazālā un maksimālā elpošana, ar ATP saistītā elpošana un rezerves elpošanas kapacitāte (katra n =3). c ) mitohondriju ultrastrukturālā analīze ar transmisijas elektronu mikroskopiju. Reprezentatīvi caurlaidības elektronu mikroskopiski attēli nieru sekcijām no Cre-control un sešām 2-Tfam-7pelēm vecumā P0 un P7. Sarkanās bultiņas attēlo mitohondrijus. Stienis=500 nm. (d) trīsdimensiju strukturētas apgaismojuma mikroskopijas attēli nieru sekcijām no Six2-mT/mG (co) un Six2-mT/mG; Tfam-/- peles P7 vecumā. Uzlabots zaļais fluorescējošais proteīns (eGFP), citohroma c oksidāzes 4. apakšvienība (COXⅣ) un no sprieguma atkarīgs anjonu selektīvais kanāls 1 (VDAC) tika noteikts ar imunofluorescenci.4',6-diamidino-2-fenilindols (DAP) ) tika izmantots kodolkrāsošanai (zilā fluorescence). Baltas punktētas līnijas iezīmē nieru kanāliņu kontroli un cistas lūmenu mutējošās nierēs, un skaitļa zīmes attēlo tubulāru lūmenu kontroles vai cistas lūmenu mutācijas nierēs. Mt apgabals tika kvantificēts ar Imaris. programmatūra (Oxford Instruments, Abingdon, Apvienotā Karaliste; n =3 katrā). Kopējais (kopējais) mt apjoms (tilpums) uz vienu eGFP pozitīvo šūnu (25-40 šūnas/analizēts paraugs), kopējā mt tilpuma attiecība. uz kopējo šūnas tilpumu un Mt tīkla maksimālo (maksimālo) lielumu vienā šūnā. Mt tīkla izmērs tika noteikts cauruļveida šķērsgriezumā ar 5 šūnām šķērsgriezumā. Joslas =4 um. Dati ir attēloti kā vidējais± SEM un tika analizēti ar Stjudenta t-testu. *P<><><0.001, mt-atp6,="" mitochondrially="" encoded="" atp="" synthase="" membrane="" subunit="" 6;="" mt-co1,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" c="" oxidase="" 1;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b;="" ndufs3,="" nadh:="" ubiquinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" sdha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a;="" tfam,="" mitochondrial="" transcription="" factor="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)deficīts novirza nieru epitēlija metabolismu uz glikolīzi
PTEC nierēs izmanto taukskābju oksidāciju un OXPHOS ATP ģenerēšanai, un tie ir glikoneoģenētiski. grāds Lai iegūtu papildu ieskatu vielmaiņas izmaiņās, kas saistītas ar Tam inaktivāciju, mēs veicām RNS sekvences analīzi nierēm no Six2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- un Cre~ metiena biedru kontroles peles P7 vecumā. Mēs noskaidrojām, ka galvenie glikolīzē iesaistītie regulējošie gēni, piemēram, heksokināze 2 (Hk2) un enolāze 2 (Eno2), tika regulēti. Turpretim vairumam trikarbonskābes ciklā iesaistīto gēnu ekspresija tika samazināta (piemēram, izocitrāta dehidrogenāze 1 [Idh1), tāpat kā taukskābju oksidācijā iesaistīto gēnu ekspresija, piemēram, acetilkoenzīma A aciltransferāze 1B (Acaalb), vidējas ķēdes acilkoenzīma A dehidrogenāze (Acadm) (5.a un b attēls, S8 papildu attēls). Atbilstoši samazinātai to gēnu ekspresijai, kas iesaistīti trikarbonskābes cikla kontrolē un mutantu nierēs P7 vecumā, izmantojot Seahorse XFe24 platformu (Agilent, Santa Clara, CA). Mutantu PTEC raksturoja ievērojams bazālās glikolīzes pieaugums (protonu izplūdes ātrums=117,4 ± 12.07 pmol/min mutantiem un 73,34 ± 6,33 pmol/min kontrolei, n{{25 }}, P=0.{{30}}032) un mt skābekļa patēriņa ātruma attiecības samazināšanās pret glikolītiskā protonu izplūdes ātrumu no 0,73 ± 0,08 kontroles grupā līdz 0,34 ± 0,02 mutantu PTEC(n=3,P=0.0074). Kopumā šie dati liecinaTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/- epitēlija šūnās bija veikta vielmaiņas maiņa no OXPHOS un taukskābju oksidācijas uz glikolīzi (5.d attēls).
5. attēls] Nieru epitēlija mitohondriju transkripcijas faktora A (TFAM) deficīts ir saistīts ar pastiprinātu glikolīzi un patoloģisku taukskābju metabolismu.(a) Metabolisma gēnu ekspresijas analīze ar RNS sekvencēšanu visa nieres garozai, kas izolēta no sešām 2-Tfam-/- un Cre-metiena biedru kontroles (co) pelēm pēcdzemdību dienas (P) 7 vecumā (n {{6). }} katrs). Parādīti atšķirīgi regulēti vielmaiņas gēni, kas iesaistīti glikolīzē un trikarbonskābes ciklā. Gēni ar statistiski nozīmīgu mRNS ekspresijas pieaugumu ir parādīti sarkanā krāsā, bet gēni ar samazinātu ekspresiju ir parādīti zaļā krāsā.(b) mRNS ekspresijas līmeņi atlasītiem atšķirīgi regulētiem gēniem ar kvantitatīvu polimerāzes ķēdes reakciju (n=4-6). (c) Izmainīts taukskābju metabolisms sešām 2-7Tfam-7mutantu pelēm. Reprezentatīvi attēli ar eļļas sarkanu O iekrāsotu nieru sekciju no Six2-Tfam-7un Cre-littermate kontroles pelēm P14 gadu vecumā. Bultiņas norāda uz eļļas sarkanām O-pozitīvām šūnām, un skaitlis sian attēlo izmaksas. Josla=10 um.(d) Primāro proksimālo tubulāro epitēlija šūnu (PTEC) glikolītiskās plūsmas analīze, kas izolētas no Cre metiena biedru kontroles un sešām 2-Tfam-/nierēm P7 vecumā (n=4 katrā) ) uz Seahorse XFe24 platformas. Parādīti reprezentatīvi glikolītisko protonu izplūdes ātruma (gliko PER) mērījumi kontroles un Tfam{21}}PTEC, kas apstrādāti ar 2-deoksiglikozi (2-DG) un oksidatīvās fosforilācijas inhibitoriem rotenonu un antimicīnu A(AA). . Parādīts arī vidējais gliko PER sākotnējā stāvoklī un mitohondriju (mt) skābekļa patēriņa ātruma (OCR) attiecība pret gliko PER. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM un tika analizēti, izmantojot Stjudenta t-testu. (Turpinājums)
SamazinātsTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ekspresija peles un cilvēka PKD audos ir saistīta ar mt samazināšanos
Tā kā seši2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/ nierēm bija liela līdzība ar PKD nierēm, mēs pēc tam novērtējām, vaiTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)tika disregulēts PKD audos. Vispirms mēs pārbaudījāmTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)un TFAM regulēta gēnu ekspresija 2 labi izveidotos ģenētiskos PKD peles modeļos.TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)mRNS līmenis tika ievērojami samazināts visu nieru homogenātos no Pkd1-/- un Cyspk/pk pelēm, kurām ir mutācijas Pkd1 vai Cys1. Tas bija saistīts ar mitohondriju un kodolu kodēto mt gēnu ekspresijas samazināšanos, kā arī ar disregulētu glikolītiskā gēnu ekspresiju. Līdzīgi kā Seši2-TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)-/nierēm, Pkd1-7 un CysPkpk nierēm bija raksturīgs paaugstināts Eno2 un Hk2 līmenis un ievērojami samazināts fosfoglicerāta kināzes (Pkg)1, piruvāta dehidrogenāzes kināzes (Pdk)1 un Pdk4 transkripta līmenis (6.a attēls).TFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)proteīna ekspresija, kas novērtēta ar IF krāsošanu, tika samazināta cistu apvalka epitēlija šūnās, salīdzinot ar epitēlija šūnām no blakus esošajām necistiskām kanāliņām (6.b attēls). Tas bija saistīts ar samazinātu mt-Co1 un mt-Atp6 ekspresiju ar RNS fluorescences in situ hibridizāciju (6.b attēls, S9 papildu attēls); mt tilpums, kā noteikts ar 3D SIM, tika samazināts par 55 procentiem, salīdzinot ar epitēlija šūnām no blakus esošajām necistiskām kanāliņām vai PTEC no normālām kontroles nierēm. Mt tilpuma atšķirības starp parasto kontroles PTEC un PTEC no necistiskām kanāliņām netika konstatētas (6.c attēls).
6. attēls| Mitohondriju transkripcijas faktora A (TFAM) ekspresija ir samazināta Pkd1-7- un CysPkepk nieru cistās.(a) Mitohondriju un kodolā kodētu mitohondriju un glikolītisko gēnu relatīvie mRNS ekspresijas līmeņi (reizes izmaiņas salīdzinājumā ar Cre metiena biedru kontroli) Pkd1-7 un Cyskidneys (n=3-5).(b) Reprezentatīvi nieru attēli sadaļas no Pkd1-7un metiena biedru kontroles pelēm, kas analizētas pēcdzemdību dienā (P)22. Parādīta imūnfluorescences (IF) krāsošana TFAM un RNS fluorescējošā in situ hibridizācijai (RNA-FISH) mitohondriju kodētai citohroma c oksidāzei 1 (mt-Co1) un mitohondriāli kodētiem ATP sintāzes membrānas 6. apakšvienības (mt-Atp6) transkriptiem. Baltās bultiņas identificē cistu oderējošās epitēlija šūnas ar stipri samazinātu TFAM, mt-Co1 vai mt-Atp6 ekspresiju. Glomeruli iezīmē gl. TFAM ekspresējošās cauruļveida struktūras tiek identificētas ar sarkano fluorescenci. Zvaigznītes attēlo cauruļveida epitēlija šūnas ar nosakāmiem mt-Co1 un mt-Atp6 transkriptiem. Kodolkrāsošanai (zilai fluorescencei) tika izmantots 6-diamidino-2-fenilindols (DAPI). Joslas=25 um IF attēliem un 10 μm RNA-FISH attēliem. (c) Trīsdimensiju strukturēta apgaismojuma mikroskopija. Parādīti nieru sekciju attēli no Pkd1-7-nierēm, kas histoķīmiski analizēti ar lotosa tetragonolobusa lektīnu (LTL) un IF citohroma c oksidāzes 4. apakšvienības (COXIV) un no sprieguma atkarīgā anjonu selektīvā kanāla 1 (VDAC) ekspresijai. Mitohondriju (mt) tilpums tika kvantificēts ar Imaris programmatūru, pamatojoties uz COXIV krāsošanu. Bultiņas attēlo epitēlija šūnas, kas klāj cistu, skaitļu zīmes attēlo cistu luminisu, un zvaigznītes attēlo necistiskas kanāliņus. Cistas uzliku epitēlija šūnas ir iezīmētas ar pārtrauktām līnijām. Joslas=10 μm kreisajam panelim un 3 μum labajam panelim. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM un tika analizēti, izmantojot Stjudenta t-testu *P<><0.01, and=""><0.001.eno2, enolase="" 2;="" hk2,="" hexokinase="" 2;="" mt-cytb,="" mitochondrially="" encoded="" cytochrome="" b:="" ndufs3.="" nadhubiguinone="" oxidoreductase="" core="" subunit="" s3;="" pdk1,="" pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 1;="" pdk4.pyruvate="" dehydrogenase="" kinase="" 4;="" ppargc1a,="" peroxisome="" proliferator-activated="" receptor="" gamma="" coactivator="" 1-alpha:="" pgk1,="" phosphoglycerate="" kinase="" 1:="" ptec,="" proximal="" tubule="" epithelial="" cell;="" sudha,="" succinate="" dehydrogenase="" complex="" flavoprotein="" subunit="" a.="" to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
Lai pārbaudītu, vai zaudējumsTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ekspresija ir izplatīta cilvēka PKD molekulārā iezīme, mēs analizējām nefrektomijas paraugus no 5 ADPKD pacientiem, izmantojot imūnhistoķīmiju, IF krāsošanu, RNS fluorescenci in situ hibridizāciju un 3D SIM. SamazinātsTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)ekspresija tika novērota 75,2 procentiem ± 7,5 procentiem nieru cistu, kas analizētas ar imūnhistoķīmiju. Tas bija saistīts ar samazinātu MT-CO1 un MT-ATP6 ekspresiju ar RNS fluorescences in situ hibridizāciju (7.a attēls, papildu attēls S10); mt tilpums cistu apšuvumajās epitēlija šūnās tika samazināts par aptuveni 70 procentiem, novērtējot ar 3D SIM (7.b attēls). Kopumā 2 PKD peles modeļu un cilvēka ADPKD audu analīze liecināja par toTFAM(mērķtiecīgs mitohondriju transkripcijas faktors A)deficīts un mt samazināšanās ir bieži sastopami konstatējumi PKD audos un, iespējams, ietekmēs nieru cistiskās slimības patoģenēzi.
7. attēls| Mitohondriju transkripcijas faktora A (TFAM) ekspresija nieru cistās pacientiem ar policistisku nieru slimību ir samazināta.(a) Formalīnā fiksētu parafīnā iestrādātu sekciju reprezentatīvi attēli no normālām cilvēka nierēm un nieru policistisko nieru slimību (PKD) pacientiem, kas analizēti ar imūnhistoķīmiju TFAM ekspresijai, ar imūnfluorescenci (IF) no sprieguma atkarīgajam anjonu selektīvajam kanālam 1 (VDAC). ) ekspresiju un ar RNS fluorescējošu in situ hibridizāciju mitohondriāli kodētai citohroma c oksidāzei 1 (MT-CO1) un mitohondriāli kodētai ATP sintāzes membrānas apakšvienības 6 (MT-ATP6) mRNS ekspresijai. Bultiņas identificē cistas oderējošās epitēlija šūnas, skaitļu zīmes attēlo luminātu. , un zvaigznītes attēlo glomerulus. Josla=100 μm zema palielinājuma attēliem un 10 um attēliem ar lielu palielinājumu. (b) Reprezentatīvi 3-dimensiju strukturēti apgaismojuma mikroskopiski attēli no cilvēka PKD nieru sekcijām, kas analizēti ar IF VDAC izteiksmei.4',{ {17}}diamidino-2-fenilindols (DAPl) tika izmantots kodolkrāsošanai (zilā fluorescence). Punktētas līnijas apzīmē kanāliņus, un skaitļu zīmes attēlo cauruļveida vai cistu luminisu. Mitohondriju (mt) tilpums tika kvantificēts, izmantojot programmatūru Imaris (n=5). Josla =4 μm. Dati ir attēloti kā vidējie ± SEM un tika analizēti, izmantojot Stjudenta t testu.*P<0.05. to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">
