Policistiskā nieru slimība

ali.ma@wecistanche.com

Ⅱ daļa: nieru organoīdi, kas iegūti no eritroīdo cilmes šūnu šūnām pacientiem ar autosomāli dominējošu policistisku nieru slimību

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice un citi.

Fons:Nieresorganoīdi ir plaši iegūti no komerciāli pieejamām inducētām pluripotentām cilmes šūnām (iPSC); tomēr ir bijis liels izaicinājums efektīvi ražot nieru organoīdu modeļus pacientiem ar autosomāli dominējošu policistisku.nieresslimība (ADPKD), kas apkopo gan embrioģenēzi, gan cistoģenēzes mehānismus.

Noklikšķiniet uz cistanche blakusparādībām un ieguvumiem nierēm

Metodes: Asins eritroīdo priekšteči (EP) no diviem ADPKD (autosomāli dominējoši policistinieresslimība) pacienti un viens vesels donors (HC) tika izmantots kā salīdzinošā kontrole, lai normalizētu daudzos tehniskos posmus EP pārprogrammēšanai un organoīdu ģenerēšanai. EP tika pārprogrammēti ar epizomālu vektoru iPSC (inducētās pluripotentās cilmes šūnās), kas tika diferencēti nieru kanāliņu organoīdos un pēc tam stimulēti ar forskolīnu, lai izraisītu cistu veidošanos.

Rezultāti: iPSC (inducētās pluripotentās cilmes šūnas), kas iegūtas no EP, uzrādīja visas pluripotences īpašības un spēja diferencēties visos trīs dīgļu slāņos. 3D cauruļveida organoīdi tika ģenerēti no atsevišķām šūnām pēc 28 dienām Matrigel. HC un ADPKD (autosomāli dominējoša policistiskanieresslimība) organoīdi spontāni neveidojās cistas, bet pēc forskolīna stimulācijas ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā) tika novērotas cistām līdzīgas struktūras.nieresslimība) organoīdos, bet ne HC atvasinātajos organoīdos.

Secinājums: šī pētījuma rezultāti parādīja, kanieresorganoīdi tika veiksmīgi ģenerēti no ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā) asins EP šūnāmnieresslimības) pacientiem un veselīgam kontroles donoram. Šai pieejai vajadzētu dot ieguldījumu kā spēcīgam embrionālajam instrumentamnieresattīstības modeli, kas spēj apkopot ļoti agrīnos patofizioloģiskos mehānismus, kas saistīti ar citoģenēzi.

SPIED ŠEIT, LAI DALĪTIESⅠ

Diskusija

Šajā pētījumā mēs sīki aprakstījām procedūru nieru organoīdu ģenerēšanai no cilvēka iPSC (inducētām pluripotentām cilmes šūnām), kas iegūtas no pacientu ar ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) asins eritroīdo cilmes šūnām. Daudzi somatisko šūnu veidi ir veiksmīgi pārprogrammēti iPSC (inducētās pluripotentās cilmes šūnās), tostarp asins šūnās [Z]. Šeit mēs izvēlējāmies izmantot asins eritroīdu priekštečus kā sākuma šūnu tipu vairāku iemeslu dēļ, piemēram, to genoma integritāte, epiģenētiskā atmiņa un efektīva pārprogrammēšana [11, 17, 18]. Efektivitāte, ar kādu eritroīdu priekšteči tika pārveidoti par iPSC, bija pat par divām kārtām labāka (7 procenti -28 procenti) nekā diferencētu asins šūnu tipu efektivitāte (0).0 2 procenti -0,60 procenti )vai fibroblasti (0,74 procenti )[Z]. Neskatoties uz šo šūnu mazo daudzumu perifērajās asinīs, tās var viegli izolēt un paplašināt in vitro, lai iegūtu pietiekamu skaitu pārprogrammēšanai. Viens no svarīgākajiem izaicinājumiem piemērotu iPSC izveidē ir to genotips un fenotipa mainīgums [6], taču ir ierosinātas dažas tehniskas stratēģijas, lai apietu vai samazinātu šādu mainīgumu. Šajos eksperimentos mēs izmantojām neintegrējošu epizomālu sistēmu pārprogrammēšanai, kurai nav nepieciešama genoma integrācija, lai pārprogrammējamie gēni tiktu ekspresēti [10], tādējādi nodrošinot mazāku imunogenitāti un padarot šūnas ģenētiski stabilākas [19, 20]. Turklāt visi paraugi tika iegūti no viena avota, kas palīdz samazināt epiģenētisko mainīgumu [12], pieņemot, ka sākuma šūnas diferenciācija varētu ietekmēt gala rezultātu efektivitāti. Pluripotences marķieru analīze un iPSC (inducēto pluripotento cilmes šūnu) spēja diferencēties visos trīs dīgļu slāņos tika salīdzināta blakus, kā arī tika salīdzināta ar H9 embrionālo šūnu līniju, kas tika izmantota kā pozitīva kontrole. . Visi šie salīdzinājumi neuzrādīja būtiskas atšķirības starp ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) pacientiem, HC un H9 šūnām.

Ir izstrādāti vairāki protokoli, lai izraisītu iPSC (inducētu pluripotentu cilmes šūnu) diferenciāciju nieru organoīdos [13, 21]. Pamatojoties uz Cruz et al. aprakstītajiem protokoliem. [6], mēs ieguvām struktūras ar proksimālo kanāliņu īpašībām, ieskaitot NHE3 un AOP1 ekspresiju. Turklāt organoīdi ekspresēja NPHS2, norādot uz podocītiem līdzīgu šūnu klātbūtni.

Un otrādi, AQP2 netika izteikts šajos cauruļveida organoīdos. Šis atklājums saskan ar iepriekšējiem pētījumiem, kas norāda uz vairākiem ierobežojumiem, veidojot struktūras, kas iegūtas no urēteriskā pumpura (UB) in vitro, jo UB attīstībai ir nepieciešami īpaši protokoli, jo laika logs konkrētā induktora pievienošanai ir ļoti ierobežots. 6,22,23].

Nieru organoīdu ģenerēšanas procesā no iPSC (inducētām pluripotentām cilmes šūnām), visa nieru embrioģenēze tiek apkopota in vitro, sākotnēji ietverot kavitētu sferoīdu veidošanos no atsevišķām šūnām [14]. Patiešām, mēs noskaidrojām, ka nediferencētas iPSCss (inducētas pluripotentas cilmes šūnas) gan no ADPKD (autosomāli dominējošās policistiskās nieru slimības) pacientiem, gan veselīgas kontroles veidoja epiblastiem līdzīgas sferoīdas struktūras, kas bija morfoloģiski līdzīgas. Lai gan šajā pētījumā netika veikta PKD1 un PKD2 gēnu DNS sekvencēšana, pašreizējie atklājumi liecina, ka pacientu veiktais mutācijas veids neietekmēja tipisko epiblastu morfoģenēzi. Joprojām ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai precīzāk novērtētu šajā embrija attīstības fāzē iesaistīto galveno molekulu ekspresiju.

Saskaņā ar Freedman et al. [14], mēs novērojām, ka sferoīdi diferencējās cauruļveida organoīdos 26 dienas pēc diferenciācijas indukcijas, un laiks bija līdzīgs gan ADPKD (autosomāli dominējošai policistiskai nieru slimībai), gan HC (att. ③). Tomēr mēs pamanījām dažas atšķirības attiecībā uz izteiksmes grafiku un diferenciācijas marķieru līmeņiem. No otras puses, cauruļveida struktūru morfoloģija bija līdzīga un salīdzināma starp paraugiem no ADPKD pacientiem un HC. Turpretim, izmantojot iPSC (inducētās pluripotentās cilmes šūnas), kas iegūtas no ADPKD (autosomāli dominējošās policistiskās nieru slimības) pacientu nieru biopsijām, Cruz et al grupa konstatēja, ka šo šūnu spēja veidot organoīdus ir mainījusies[6]. Papildus šai slimībai raksturīgo mutāciju milzīgajai daudzveidībai šīs atšķirības organoīdu iegūšanas efektivitātē var izskaidrot arī ar neviendabīgiem šūnu tipiem, kas atrodas biopsijas paraugos, atšķirībā no eritroīdiem priekštečiem, kas veido viendabīgāku šūnu populāciju. Kopumā šie rezultāti liecina, ka, neraugoties uz dažādu iPSC klonu efektivitātes dažādību un atšķirībām nieru organoīdu veidošanā, pēdējo iegūšana no ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) pacientiem var būt unikāls modelis dažādu fenotipisko izpausmju formu izpētei. no šīs slimības. Turklāt ir svarīgi atzīmēt, ka, ja ADPKD skartajā populācijā ir ievērojamas mutāciju atšķirības, pacientam specifiskās iPSC (inducētās pluripotentās cilmes šūnas), kas ir pilnībā saderīgas ar imūnsistēmu, nākotnē tās var izmantot individuālām reģeneratīvajām terapijām. , papildus tam, ka ļauj izstrādāt in vitro modeli, lai pārbaudītu, vai ļoti agrīnās fenotipiskās izpausmes ir tikpat dažādas kā klīniskā prezentācija.

Nestimulēti organoīdi, kas iegūti no HCor ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) pacientiem, spontāni neveidoja cistas. Tipiskā cistu morfoloģija un cistoģenēzes marķieru ekspresija nebija nosakāma nevienā paraugā, pat pagarinot organoīdu diferenciāciju kultūrā līdz 35 dienām. Ir pierādīts, ka tikai šūnu proliferācija neizraisa cistas [24]. Turklāt ir nepieciešams trešais neatkarīgs notikums (pazīstams kā trešais trāpījums), lai paātrinātu cistu veidošanos un augšanu in vivo [23]. Un otrādi, forskolīna izraisīta cistu veidošanās notika ADPKD pacientu organoīdos, bet ne HC. Jāatzīmē, ka, lai gan cistas ir sastopamas, ADPKD paraugos tika novērots neliels procents pat forskolīna klātbūtnē, kā to novēroja arī Freedman et al. [14] organoīdos, kas izveidoti no ADPKD slimības CRISPR/Cas9 modeļa. Var izvirzīt dažas hipotēzes, lai izskaidrotu šajā modelī konstatēto cistu zemo biežumu. 1) Organoīdi, kas kultivēti 3D suspensijas vidē, uzrādīja daudz augstāku cistoģenēzes efektivitāti, salīdzinot ar adherentiem organoīdiem [6], kas norāda, ka mikrovide ir tieši saistīta ar cistoģenēzi.2) Šajā pētījumā izmantotais eksperimentālais protokols veidoja proksimālos kanāliņu organoīdus, bet ne. nefrona distālās daļas [23]. Lai gan no visiem nefrona segmentiem var rasties cistas, tostarp proksimālie kanāliņi [25], acīmredzot tie, kas iegūti no savākšanas kanāliem, ir lielāki un lielākā skaitā nekā citos segmentos [26], 3) Visbeidzot, nesen tika pierādīts, ka cistu izcelsme. var būt saistīta ar vairāku PKD1 mutāciju klātbūtni, kas nosaka slimības smagumu, un ka cistu veidošanās savākšanas kanālos bija saistīta ar slimības smagumu [27, 28].

Noslēgumā jāsaka, ka šie atklājumi parādīja, ka ir iespējams ģenerēt organoīdus ar trīsdimensiju struktūrām, kas līdzīgas nieru cilmes arhitektūrai, izmantojot iPSC (inducētas pluripotentas cilmes šūnas), kas pārprogrammētas no eritroīdiem priekštečiem, kurus viegli izolēt no ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība). pacientiem un ka šie organoīdi spēj veidot cistas, stimulējot forskolīnu. Šī daudzsološā metodoloģija atklāj metodi, kā palielināt izpratni par ļoti agrīniem ģenētiskiem, fenotipiskajiem un fizioloģiskajiem posmiem cistu veidošanā ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) apstākļos.

Atsauces

1. Chebib FT, Torres VE: Autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība: 2016. gada pamatizglītības programma.AmJ Kidney Dis, 67:792-810, 2016 https://doi.org/10.1053/j.aikd.2015.07:6653PMID07.

2. WatnickTJ, Torres VE, Gandolph MA, Qian F, Onuchic LF, Klinger KW, et al: Somatiskā mutācija atsevišķās aknu cistās atbalsta divu sitienu cistoģenēzes modeli autosomāli dominējošās policistiskās nieru slimībās.Mol Cell,2:{{ 3}}, 1998 https://doi.orq/10.1016/s1097-2765(00)80135-5 PMID:9734362

3. Pei Y, WatnickT, He N, WangK, Liang Y, Parfrey P uc Soc Nephrol, 10;1524-1529.1999 https://doi.or/10.1681/ASN.V1071524 PMID:10405208

4. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, Huso DL, Germino GG: Kritisks attīstības slēdzis nosaka nieru cistu veidošanās kinētiku pēc Pkd1 zaudēšanas. Nat Med, 13: 1490-1495, 2007 https:/ l doi.org/10.1038/nm1675 PMID: 17965720

5. TakakuraA, Contrino L, Zhou X, Bonventre JV, Sun Y, Humphreys BD u.c.: Nieru traumas ir trešais trāpījums, kas veicina pieaugušo policistiskās nieru slimības strauju attīstību. Hum Mol Genet, 18:2523-2531, 2009 https://doi.org/10.1093/hmg/ddp147 PMID: 19342421

6. Cruz NM. Dziesma X, Czerniecki SM, Gulieva RE, Churchill AJ, Kim YK et al: Organoīdu cistoģenēze atklāj mikrovides kritisko lomu cilvēka policistisko nieru slimībā. Nat Mater, 16:1112-1119, 2017 https://doi.org/10.1038/nmat4994 PMID:28967916

7. Takahashi K, Okita K, Nakagawa M, Yamanaka S: Pluripotentu cilmes šūnu indukcija no fibroblastu kultūrām. Nat Protoc,2:3081-3089,2007 https://doi.org/10.1038/nprot.2007.418 PMID:18079707

8. Freedman BS, Lam AQ, SundsbakJL, Latino R, Su X, Koon SJ u.c.: Samazināts ciliārais policistīns-2 inducētās pluripotentās cilmes šūnās no policistisku nieru slimību pacientiem ar PKD1 mutācijām. J Am Soc Nephrol, 24:1571-1586, 2013 https://doi.org/10.1681/ASN.2012111089 PMID:24009235

9. Chen HY, Tan HK, Loh YH: Transgēnu nesaturošu inducētu pluripotentu cilmes šūnu atvasināšana no viena asins piliena. Curr Protoc Stem Cell Biol, 38:4A.9.1-4A.9.10, 2016. https: //doi.or/10.1002/CPSC.12 PMID:27532818

10. YuJ, Hu K, Smuga-Otto K, Tian S, Stewart R, Slukvin Il et al.: Human induced pluripotent cilmes šūnas bez vektora un transgēnu sekvencēm. Science, 324:797-801, 2009 https: //doi.org/10.1126/science. 1172482 PMID:19325077

11. EminliS, Foudi A, Stadtfeld M, Maherali N, Ahfeldt T, Mostoslavsky G, et al: Diferenciācijas stadija nosaka hematopoētisko šūnu potenciālu pārprogrammēšanai inducētās pluripotentās cilmes šūnās. Nat Genet, 41: 968-976, 2009 https://doi.orq/10.1038/ng.428 PMID: 19668214

12. Chou BK, Mali P, Huang X, Ye Z, Dowey SN, Resar LM, et al.: Efektīva cilvēka iPS šūnu atvasināšana ar neintegrējošu plazmīdu no asins šūnām ar unikāliem epiģenētiskiem un gēnu ekspresijas parakstiem. Cel/Res,21:518-529, 2011 https://doi.orq/10.1038/cr.2011.12 PMID:21243013

13. Schutgens F, Verhaar MC, Rookmaaker MB: Pluripotenti no cilmes šūnām iegūti nieru organoīdi: in vivo līdzīga in vitro tehnoloģija. Eur J Pharmacol,790:12-20, 2016 https://ldoi.org/10.1016/j.eiphar.2016. 06.059 PMID: 27375081

14. Freedman BS, Brooks CR, Lam AQ, Fu H, Morizane R, Agrawal V, et al: Nieru slimības modelēšana ar CRISPR-mutantu nieru organoīdiem, kas iegūti no cilvēka pluripotentiem epiblastu sferoīdiem. Nat Commun, 6:8715, 2015 https://doi.orq/10.1038/ncomms9715 PMID: 26493500

15. Pei Y. ObaiiJ. Dupuis A. Patersons AD. Magistroni R. Diks E, et al; Vienoti kritēriji ADPKD (autosomāli dominējošā policistiskā nieru slimība) ultrasonogrāfiskai diagnostikai. JAm Soc Nephrol, 20:205-212, 2009 https://doi.org/10.1681/ASN.2008050507 PMID:18945943

16. Watanabe K, Ueno M, Kamiya D, Nishiyama A, Matsumura M, Wataya T u.c.: ROCK inhibitors ļauj izdzīvot atdalītām cilvēka embrija cilmes šūnām. Nat Biotechnol, 25:681-686, 2007 https://doi.org/10.1038/nbt1310 PMID: 17529971

17. Hochedlinger K, Jaenisch R: Kodolenerģijas pārprogrammēšana un pluripotence. Nature, 441: 1061-1067, 2006 https://doi.org/10.1038/nature04955 PMID: 16810240

18. Maherali N, Ahfeldt T, Rigamonti A, UtikalJ, Cowan C, Hochedlinger K: Augstas efektivitātes sistēma cilvēka izraisītu pluripotentu cilmes šūnu ģenerēšanai un izpētei. Cel/ cilmes šūna. 3:340-345. 2008 https://doi.org/10.1016/.stem.2008.08.003 PMID: 18786420