Mātes autogēna inaktivēta vīrusa vakcinācija uzlabo imunitāti pret PRRSV sivēniem, 1. daļa

Anotācija:

No mātes iegūtā imunitāte ir izšķiroša sastāvdaļa cūku pēcnācēju izdzīvošanai un panākumiem, lai pasargātu no cirkulējošiem patogēniem, piemēram, 2. tipa cūku reproduktīvā un respiratorā sindroma vīrusa (PRRSV-2).

Šī pētījuma mērķis ir izpētīt anti-PRRSV imunitātes pārnešanu uz sivēniem no jauncūkām, kuras saņēma modificētu dzīvo vīrusu (MLV) atsevišķi (ārstēšana (TRT) 0) vai kombinācijā ar vienu no diviem autogēniem inaktivētiem. vakcīnas (AIV, TRT 1 plus 2). Šo jauncūku sivēni divu nedēļu vecumā tika inficēti ar autogēno PRRSV{5}} celmu, un to adaptīvā imūnreakcija (IR) tika novērtēta līdz 4 nedēļām pēc inokulācijas (dpi).

Sistēmiskā humorālā un šūnu IR tika analizēta jauncūkām pirms atnešanās, sivēniem, pirmspotēšanas un 2 un 4 wpi. Abi AIV daļēji aizsargāja sivēnus ar samazinātu plaušu patoloģiju un palielinātu svara pieaugumu; TRT 1 arī samazināja sivēniem virēmiju, ko vislabāk izskaidro ar AIV izraisītu neitralizējošu antivielu veidošanos jauncūkām un to pārnesi uz sivēniem. Sivēniem pirms inokulācijas galvenie sistēmiskie IFN ražotāji bija CD21 plus B šūnas. No 0 līdz 4 wpi šo B šūnu loma samazinājās, un CD4 T šūnas kļuva par primārajām sistēmiskajām IFN ražotājām.

Labi dzīvi vīrusi attiecas uz vīrusiem, kas neizraisa slimības, un tiem ir noteikta saistība ar cilvēka ķermeņa imunitāti. Dzīvi vīrusi var stimulēt cilvēka imūnsistēmu, lai radītu imūnreakciju, tādējādi uzlabojot cilvēka imunitāti. Pētījumi liecina, ka pēc cilvēka ķermeņa inficēšanās ar dzīvu vīrusu tas atbrīvos dažus mediatorus un citokīnus, kas var aktivizēt imūnās šūnas, veicināt imūnsistēmas darbību un uzlabot organisma spēju pretoties vīrusiem.

Turklāt labdabīgi un dzīvotspējīgi vīrusi var arī konkurētspējīgi aizņemt šūnas, apgrūtinot patogēnu iebrukumu un vairošanos, tādējādi aizsargājot cilvēka ķermeni no citām infekcijām. Tāpēc atbilstoša labdabīga un dzīvu vīrusu infekcija var uzlabot cilvēka imunitāti, bet pārmērīga infekcija var izraisīt slimības. Tāpēc ikdienas dzīvē cilvēkiem vajadzētu pievērst uzmanību dzīvu vīrusu infekcijas kontrolei un imunitātes uzlabošanai, izmantojot veselīgu dzīvesveidu. No šī viedokļa mums ir jāuzlabo imunitāte. Cistanche var ievērojami uzlabot imunitāti. Gaļas pelni satur dažādas bioloģiski aktīvas sastāvdaļas, piemēram, polisaharīdus, divas sēnes un Huangli uc Šīs sastāvdaļas var stimulēt dažādas imūnsistēmas funkcijas. šūnām līdzīgas šūnas, palielinot to imūno aktivitāti.

Noklikšķiniet uz cistanche ieguvumiem veselībai

Plaušās CD8 T šūnas bija primārās un CD4 T šūnas bija sekundārie IFN ražotāji, ieskaitot jaunu cūku CD8 -CCR7 - CD4 T šūnu apakškopu, kas ir potenciāli termināli diferencētas CD4 TEMRA šūnas. Rezumējot, šis pētījums parāda, ka mātes AIV vakcinācija var uzlabot sivēnu aizsardzību pret PRRSV pirms atšķiršanas{8}}; tas parāda, cik svarīgi ir pārnest neitralizējošās antivielas uz sivēniem, un tas ievieš divas jaunas imūno šūnu apakškopas cūkām - IFN ražojošās CD21 plus B šūnas un CD8 -CCR7 - CD4 T šūnas.

Atslēgvārdi:

mātes vakcinācija; autogēna inaktivēta vakcīna; imunitātes nodošana; humorālā imūnā atbilde; šūnu mediēta imūnā atbilde; T šūnas; PRRSV; cūkas; IFN ražojošās B šūnas; CD4 TEMRA šūnas.

1. Ievads

Mātes radītā imunitāte (MDI) zīdītājiem ir bijību iedvesmojoša simfonija ("harmoniskā sarežģītība" — [1]). Šajā sistēmā jeb simfonijā māte savam pēcnācējam nodod imūno aizsardzību (īslaicīgu un/vai ilgstošu) vai nu grūsnības laikā caur placentu, pēc piedzimšanas ar piena dziedzeru sekrēciju vai abiem [2]: cilvēki grūtniecības laikā saņem imūnglobulīnus un galu galā caur piena dziedzeri. izdalījumi [3]; suņi un grauzēji saņem imūnglobulīnus grūsnības laikā un ar piena dziedzeru sekrētiem, un cūkas un citi mājlopi saņem imūnglobulīnus tikai ar piena sekrēciju.

Līdzīgi kā citas sugas, sivēni šo MDI saņem imūnglobulīnu, imūnšūnu un citu ar imūnsistēmu saistītu molekulu veidā [4,5]. Lai gan imūnglobulīnus var saņemt no dažādām sivēnmātēm (= savstarpēja audzināšana), tikai bioloģiskās mātes var veiksmīgi pārnest imūnšūnas saviem pēcnācējiem [5], un uzņemtais jaunpiena daudzums sivēniem būtiski samazina mirstību un uzlabo veiktspēju [6] ]. Šīs imūnās šūnas ietver B šūnas [7], kā arī dažādas T-šūnu apakšgrupas — CD4, CD8 un galvenokārt T-šūnu receptoru (TCR) — δ T šūnas [8].

Pēc tam šīs T-šūnu apakškopas var tālāk atšķirt, pamatojoties uz to diferenciācijas stadiju un izvietošanas modeli. Cūkām CD8 ķēdi izmanto, lai atšķirtu CD8 – naivās no CD8 plus antigēnu vai atmiņas CD4 T šūnām [9–11]. Ķīmokīna receptora (CCR) 7 ekspresija vēl vairāk atšķir CCR7 plus limfmezglu izvietošanu no CCR7- perifēro audu izvietošanas T šūnām [12]. Izmantojot kombinēto CD8 / CCR7 analīzi, mēs varam atšķirt vairākas dažādas T-šūnu apakškopas: CD8 -CCR7 plus naivās CD4 T šūnas, CD8 plus CCR7 plus centrālās atmiņas (TCM) CD4 T šūnas un CD8 plus CCR7 - efektora atmiņa (TEM). ) CD4 T šūnas; perifēro audu izvietošanas CCR7− un limfmezglu izvietošanas CCR7 plus CD8 T šūnas un CD8 −CCR7−, CD8 plus CCR7− un CD8 plus CCR7 plus TCR-δ T šūnas.
Lai gan mēs iepriekš ziņojām, ka cūku TCR-δ T šūnām ir apgriezts izvietošanas modelis, salīdzinot ar to TCR līdziniekiem, šo dažādo apakškopu īpašā loma vēl ir jāapraksta [13]. Gan imūno šūnu apakšgrupas, gan antivielas tiek pārnestas uz pēcnācējiem, lai aizsargātu tos pret dažādiem patogēniem [4,5].

Gadu desmitiem vispostošākais cūku patogēns ir bijis cūku reproduktīvā un respiratorā sindroma vīrusi (PRRSV, [14,15]). Pastāv divi galvenie PRRSV veidi — 1. un 2. tips (PRRSV-1 un 2); to lielā daudzveidība un imūnsupresīvās spējas padara PRRSV par problemātisku slimību, izraisot milzīgus ekonomiskus zaudējumus cūkkopības nozarei [16], un līdz šim, lai gan vakcīnas nodrošina daļēju aizsardzību pret PRRSV, tās nav spējušas pilnībā kontrolēt šo slimību.

Ir pieejami divi galvenie vakcīnu veidi, lai aizsargātu pret PRRSV — modificētu dzīvu vīrusu (MLV) vakcīnām un inaktivētām vakcīnām, galvenokārt autogēnām inaktivētām vakcīnām (AIV); tomēr abi veidi saskaras ar savām problēmām.

Ilgais laiks ļoti imunogēno MLV vakcīnu izstrādei nozīmē, ka tās parasti ir heterologākas pret saimniecībās izplatītajiem PRRSV celmiem, un, lai gan AIV ir vērsti pret šiem fermās izplatītajiem celmiem, to inaktivētā daba padara tās kopumā mazāk imunogēnas.

Šīs problēmas izraisa aizsardzības trūkumu, īpaši jaunām cūkām, ko var saistīt ar trim faktoriem: pirmkārt, PRRSV augstais mutāciju līmenis ierobežo heterologo aizsardzību, tādējādi samazina MLV vakcīnas efektivitāti; otrkārt, tā imūnsupresīvā spēja ierobežo vājākas vakcīnas (piem., AIV) un aizsargājošas imūnās atbildes reakcijas aizkavēšanās padara jaunas cūkas īpaši uzņēmīgas [17]; un, treškārt, mūsu izpratne par imūnreakciju pret PRRSV, īpaši sivēniem, ir ierobežota. Loving un Lunney sniedza jauku pārskatu par vispārējo izpratni par imūnreakciju pret PRRSV [18, 19].

Galvenokārt, pamatojoties uz pagarināto laiku, lai izveidotu vakcīnu izraisītu imunitāti pret PRRSV, cūku audzētāji bieži vakcinē jauncūkas un sivēnmātes, lai nodrošinātu imunitātes nodošanu sivēniem. Pētījumi par māšu vakcināciju, izmantojot komerciālu MLV pret PRRSV-1 tipu, netraucēja vakcinēt 2 vai 3-nedēļas vecus sivēnus un daļēji aizsargāja sivēnus pret heterologu infekciju [20]. Šī vakcinācijas stratēģija vakcinētu sivēnmāšu jaunpienā un pienā izraisīja arī PRRSV -1-specifiskas IgG, IgA un interferonu (IFN) izdalošas šūnas. Šīs IFN ražojošās šūnas ir ļoti svarīgas pretvīrusu reakcijās, tostarp PRRSV [19, 21].
Šī vakcinācija arī izraisīja seruma anti-PRRSV IgG, kas bija nosakāms pēc sešu nedēļu vecuma nevakcinētiem sivēniem un saglabājās stabils vakcinētiem sivēniem pirms inficēšanās; tomēr IFN izdalošās šūnas nevarēja atšķirt no fona līmeņiem pirms atšķirtiem sivēniem [22]. Lai gan MLV lietošana ir nozares standarts, kombinētais MLV primārās un AIV pastiprinošās vakcinācijas režīms šķiet daudzsološs, lai pārvarētu katru no MLV un AIV neatkarīgas lietošanas negatīvajām pusēm.

Tāpēc šī pētījuma galvenais mērķis bija ne tikai noteikt, vai, bet arī kā mātes vakcinācija ar diviem dažādiem AIV (ārstēšana (TRT) 1 plus 2) var veicināt nozares standarta MLV vakcināciju atsevišķi (TRT 0 ), lai labāk aizsargātu pēcnācējus no agrīnas PRRSV2 izaicinājuma. Šim nolūkam mēs pētījām vakcīnas izraisīto humorālo un šūnu mediēto imūno (CMI) reakciju šīm jauncūkām un katrā no šīm grupām 2 nedēļu vecumā izaicinājām agrīnos atšķirtos jauncūkas. Šo sivēnu sistēmiskā un lokālā imūnreakcija tika novērota 2–4 ​​nedēļas.

Mēs parādām, ka AIV pastiprināta vakcinācija varētu uzlabot sivēnu aizsardzību pret PRRSV infekciju 2 nedēļu vecumā, un mēs arī identificējam pamatā esošos imūnmehānismus un raksturojam anti-PRRSV humorālo un CMI reakciju šīm jaunajām cūkām. Turklāt cūkām mēs atklājām divus jaunus šūnu tipus: (1) CD8 -CCR7 - CD4 T šūnas, kas spēcīgi veicina IFN veidošanos bronhoalveolārā skalošanas (BAL) - iespējamās CD4 TEMRA šūnās, un (2) galvenais avots anti-PRRSV reakcija, īpaši sivēniem — IFN ražojošām B šūnām.

2. Materiāli un metodes

2.1. Pētījuma dizains, dzīvnieki un paraugu apstrāde

Šī pētījuma mērķis bija novērtēt dažādu māšu PRRSV2 vakcinācijas sēriju ietekmi uz atšķirto sivēnu aizsargimunitāti pret PRRSV-2. Pirms pētījuma cirkulējošo PRRSV-2 celmu (restrikcijas fragmenta garuma polimorfisms (RFLP), 1-7-4) no Ziemeļkarolīnas cūkgaļas uzņēmuma izolēja un pavairoja divi neatkarīgi bioloģijas zinātņu uzņēmumi; viņi ražoja divas atšķirīgas autogēnas vakcīnas. Abas vakcīnas saturēja dažādus patentētus komponentus, taču tajās bija viens un tas pats inaktivēts 1-7-4 PRRSV-2 celms. Šī pētījuma plāns ir parādīts 1. attēlā.

Abas vakcinācijas tika ievadītas intramuskulāri četru devu sērijā pirms atnešanās: saskaņā ar Ziemeļkarolīnas cūkgaļas uzņēmuma korporatīvo vakcinācijas grafiku 46 PRRSV-2 negatīvas jauncūkas komerciālā sivēnmāšu fermā tika vakcinētas ar Ingelvac PRRS MLV vakcīnu (Boehringer Ingelheim Veemedica). GmbH, Vācija) deviņas nedēļas pirms audzēšanas. Lai saglabātu konsekventu terminoloģiju visā šajā pētījumā, reģistrētās seksuāli nobriedušās cūkas (šeit definētas kā jauncūkas) tiks sauktas par jauncūkām pat pēc tam, kad tās ir audzētas un dzemdējušas (parasti sauktas par sivēnmātēm). Četras nedēļas pirms vaislas no visām jauncūkām tika savākti asins paraugi seruma noteikšanai, un pēc tam jauncūkām tika iedalītas trīs ārstēšanas metodes: TRT 0 (tikai MLV vakcinācija); TRT 1 (MLV vakcinācija plus 4 autogēnas (1-7-4) inaktivētas 1. vakcīnas devas); vai TRT 2 (MLV vakcinācija plus 4 autogēnas (1-7-4) inaktivētas 2. vakcīnas devas).

Gilts that did not breed were dropped from the study. 3 weeks before farrowing, blood was collected from pregnant gilts for the isolation of serum and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). At this point, five gilts remained in both TRT 0 and TRT 2; nine gilts remained in TRT 1. Within these gilts, we selected three gilts per group to provide the piglets for the challenge study. The selected gilts had an adequate litter size (>7) un augstākais seruma fluorescējošā fokusa neitralizācijas (FFN) titrs (primārie imūnie kritēriji) un visaugstākā CD4 T-šūnu IFN reakcija (sekundārie imūnie kritēriji) pret AIV izaicinājuma celmu savā grupā. TRT 1 plus 2 šie FFN titri svārstījās no 1:4 līdz 1:128. Tā kā TRT {{10}} nebija titru pret AIV celmu, mēs izvēlējāmies jauncūkas ar augstākajiem anti-MLV titriem; šie titri svārstījās no 1:16 līdz 1:32. IFN atbildes reakcija visās atlasītajās jauncūkās svārstījās no 0,09 līdz 0,21 procentam no kopējā CD4 T šūnu skaita.

Katra no šīm jauncūkām izaicinājuma pētījumam nodrošināja četrus sivēnus. 2 nedēļu vecumā (= 0 nedēļas pēc inficēšanās, wpi) izaicinājuma pētījumam tika atlasīti četri sivēni ar vidējo metiena svaru un nogādāti uz Ziemeļkarolīnas štata universitātes bioloģiskās drošības 2. līmeņa novietnēm ( NCSU) Laboratory Animal Resources (LAR) (Roli, Ziemeļkarolīna). Šeit viņi nejauši tika iedalīti vienā no sešām pildspalvām tajā pašā telpā; divas cūkas katrai apstrādei tika izmitinātas katrā aizgaldā (viena katrai jauncūkai). Kopumā pētījumā bija 36 sivēni ar 12 sivēniem katrā ārstēšanas grupā.

During the study, four piglets died before the end of the study: three piglets from one gilt (TRT 0) died within 30 h of arrival at LAR and were dropped from the study. Additionally, one pig (TRT 2) was euthanized between weeks three and four of the study due to high fever (>106◦ F) un reakcijas trūkums uz fizisko stimulāciju. Šī cūka tika iekļauta visās analīzēs līdz 3. nedēļai, un tās plaušām tika novērtēta patoloģija. Šim dzīvniekam autopsijas laikā netika veikta plūsmas citometrijas (FCM) analīze.

Vienu dienu pēc atšķiršanas un ierašanās NCSU visi sivēni tika intranazāli inokulēti ar 1 × 105,5 PRRSV-2 vīrusa daļiņām (autogēnais celms 1-7-4) 1 ml 1x fosfātu buferšķīdumā (PBS, Corning, Corning, NY, ASV) (500 µL/nāsī), 30 sekundes noturēja guļus stāvoklī un atgriezās savās pildspalvās. Puse dzīvnieku tika nogalināti ar 2 dpi, bet pārējie dzīvnieki tika nogalināti ar 4 dpi. Autopsijas laikā BAL, plaušas un traheobronhiālie limfmezgli (TrBr LN) tika savākti un apstrādāti, kā aprakstīts iepriekš [13].

Paraugu ņemšana notika pirms inokulācijas (0 wpi) un pēc tam katru nedēļu, kā parādīts 1. attēlā. Serums tika savākts seruma atdalīšanas mēģenēs (SST) (Becton Dickinson (BD) Biosciences, Sanhosē, CA, ASV) un asinis PBMC izolēšanai tika savāktas heparīna mēģenēs (BD Biosciences). Dzīvnieku izmitināšanu nodrošināja Nacionālo veselības institūtu rokasgrāmata pētnieciskajiem dzīvniekiem. Sivēniem bija neierobežota piekļuve ūdenim, viņi tika baroti ar pārejas perioda atšķiršanas diētu, pēc tam ar parasto barību divas reizes dienā un tika uzturēta 83 ◦F ar 12-stundu gaismas/tumsas ciklu. Eksperimentālās procedūras apstiprināja NC Valsts universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (IACUC) ID Nr. 17-166A (2017. gada 29. novembris).

2.2. Vīrusu pavairošana, titrēšana un novērtēšana

PRRSV-2 vīrusa izolāts (celms, 1-7-4) tika pavairots uz PRRSV negatīviem cūku alveolārajiem makrofāgiem (PAM) RPMI-1640, 1x ar L-glutamīnu (Corning, Corning, NY). , ASV), kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa serumu (FBS) (VWR, Radnor, PA, ASV) un 1 reizi antibiotiku-pretsēnīšu līdzekli (Corning) (saukts par RPMI pilnu) aptuveni 30 stundas T-75 kolbās. (Sarstedt, Nümbrecht, Vācija), līdz tika novērots citopātisks efekts. Kolbas vienu reizi sasaldēja un atkausēja, un supernatantu 10 minūtes centrifugēja pie 2200 g 4 ◦C temperatūrā. Lai koncentrētu vīrusu, supernatants tika pārnests uz 36 ml Nalgene centrifūgas mēģenēm (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, ASV) un sagriezts Sorvall 100S Ultracentrifuge (Sorvall, Thermo Fisher Scientific), Ņūtauna, CT, ASV) 73 ° C temperatūrā. ,000 g pie 4 ◦C 2 stundas.

Supernatants tika izmests, un granula tika atkārtoti suspendēta barotnē (RPMI pabeigta) un uzglabāta 100 µL alikvotās daļās -80 ◦ C temperatūrā. Audu kultūras infekciozās devas 50 (TCID50) vīrusu izejas šķīdumu titri tika noteikti, izmantojot PAM, kā aprakstīts iepriekš (Spīrmena-Kārbera TCID50 metode saskaņā ar OIE diagnostikas testu rokasgrāmatu [Pasaules Dzīvnieku veselības organizācija, agrāk Starptautiskais epizootiju birojs (OIE). ), "2.8.7. nodaļa Cūku reproduktīvais un respiratorais sindroms", Terr. Man., Nr. 2015. gada maijs, 2015. gada maijs].

2.3. Virēmija

Izolēto serumu analizēja Ziemeļkarolīnas cūkgaļas uzņēmuma diagnostikas laboratorija, izmantojot reversās transkripcijas kvantitatīvo polimerāzes ķēdes reakciju (RT qPCR) ar 5X MagMAX patogēna RNS/DNS komplektu (Thermo Fisher Scientific) un VetMAX PRRSV qPCR komplektu (Thermo Fisher Scientific). Vakcinētais jaundzimušo serums atnešanās laikā bija PRRSV negatīvs (qPCR), kā to noteica Aiovas štata universitātes Veterinārās diagnostikas laboratorija (ISU VDL, Eimsa, IA, ASV). ∆Ct vērtības tika aprēķinātas, atņemot parauga Ct vērtību no Ct vērtības, kas tika uzskatīta par PRRSV negatīvu (Ctneg=37) PRRSV: ∆Ct=37 − Ctx.

2.4. Neitralizējošo antivielu validācija un pozitīvo paraugu noteikšana

Seruma paraugi no jauncūkām un sivēniem tika nosūtīti uz Dienviddakotas štata universitātes Dzīvnieku pētniecības un diagnostikas laboratoriju (Brookings, SD), kas pabeidza PRRSV-2 neitralizējošās antivielas (NA) noteikšanu, izmantojot FFN un 1-7-4 inokulācijas celmu. Pozitīvs rezultāts ir lielākais seruma atšķaidījums ar fluorescējošu fokusu veidojošo vienību skaita samazināšanos par 90 procentiem vai vairāk [23].

2.5. Autopsijas procedūras, punktu noteikšana un audu šūnu izolācija

Autopsijas laikā (2 vai 4 wpi) dzīvnieki tika nogalināti, izmantojot letālu intravenozu Euthasol injekciju (Covetrus, MW, 390 mg/ml pentobarbitāls, 50 mg fenitoīna/ml). Pēc tam tika novāktas plaušas, aizkrūts dziedzeris un TrBr LN.

Plaušām tika uzņemtas muguras un vēdera fotogrāfijas; plaušas tika izskalotas ar 1 × PBS, lai savāktu bronhu alveolāro skalošanu (BAL), un histoloģijai tika ņemti pieci kopējie paraugi: pa vienam no labās un kreisās astes daivas, labās un kreisās vidējās daivas un pēc tam viens no palīgdaivas. Histoloģijas paraugi tika fiksēti formaldehīda / Zn fiksatorā (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA) 24 stundas, pārnesti uz 70% etanolu un iekrāsoti ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E). Krāsotie priekšmetstikliņi (histoloģija) un plaušu fotoattēli (kopējā patoloģija) tika nosūtīti uz ISU VDL, un tos novērtēja veterinārās diagnostikas patologs, kurš bija akls pret ārstēšanu un autopsijas datumiem; plaušu bojājumu un intersticiālās pneimonijas vērtēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [24].

Plaušu fotoattēlu dorsālais un ventrālais skats tika novērtēts, lai noteiktu pneimonijas skarto plaušu procentuālo daļu. Konkrēti, pneimonijas procentuālais daudzums tika vizuāli novērtēts katrai plaušu daivai, un kopējais procentuālais daudzums visai plaušās tika aprēķināts, pamatojoties uz katras daivas svērto proporciju attiecībā pret kopējo plaušu tilpumu. Katra no četrām kranioventrālajām daivām veidoja 10 procentus, papilddaivu 5 procentus un katra no divām astes daivām veidoja 27,5 procentus no kopējā plaušu apjoma.

Plaušu histopatoloģijas sekcijas tika akli pārbaudītas, lai noteiktu mikroskopiskus bojājumus, un katrai daivai tika piešķirts aptuvenais vērtējums, pamatojoties uz intersticiālās pneimonijas smagumu: 0=nav mikroskopisku bojājumu; 1=minimāla intersticiāla pneimonija; 2=viegla intersticiāla pneimonija; 3=vidēji smaga intersticiāla pneimonija; 4=bagātīga intersticiāla pneimonija; 5=smaga, multifokāla intersticiāla pneimonija; 6=smaga, difūza intersticiāla pneimonija. Visiem savāktajiem audiem (plaušās, aizkrūts dziedzerī un TrBr LN) audi tika sagriezti mazos gabaliņos un izspiesti caur nerūsējošā tērauda apaļiem drenāžas sietiņiem (Greindžers, Leikforests, IL, ASV) 50 ml mēģenēs ar ledus aukstu PBS, lai eluētu. vienšūnu suspensijas. Šķiedru kopas tika filtrētas ar 40 µm filtriem (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV).

2.6. Perifēro asiņu izolēšana, vīrusu stimulēšana un IFN-FCM krāsošana/analīze

PBMC izolēšana tika veikta, izmantojot Ficoll-Paque blīvuma centrifugēšanu (GE Healthcare, Upsala, Zviedrija) un SepMate-50 ml mēģenes (STEMCELL Technologies, Vankūvera, BC, Kanāda) saskaņā ar ražotāja protokolu. PBMC un atsevišķu šūnu suspensijas šūnu skaitīšana tika pabeigta CASY šūnu skaitīšanas sistēmā (Schärfe System, tagad: Roche Innovatis AG, Bīlefelde, Vācija). Lai veiktu IFN ražošanas testu, 5 × 105 PBMC un limfocīti no plaušām un TrBr LN astoņos atkārtojumos tika uzklāti uz 96-iedobes apaļas dibena plāksnē (Corning) 100 µl RPMI pilnā koncentrācijā un atpūtināti nakti. inkubators 37◦ C temperatūrā un 5 procenti CO2. Nākamajā rītā katrai iedobei pievienoja 100 µL RPMI-pilnīga, kas satur PRRSV celmu 1-7-4 (Multiplicity of Infection, MOI=0.1); plāksnes tika atgrieztas inkubatorā 24 h vīrusu stimulēšanai.

Pēdējās 4 kultivēšanas stundās tika pievienots monensīns (5 µg/ml, Alfa Aesar, Haverhill, MA, ASV), lai bloķētu IFN izdalīšanos no šūnām. Pēc 24 stundu inkubācijas pabeigšanas replikāti tika apvienoti un iekrāsoti, kā norādīts 1. tabulā; vidēji 276 756 atsevišķi dzīvi limfocīti (SLL) tika reģistrēti Cytoflex, izmantojot CytExpert programmatūru (Beckman Coulter, Brea, CA, ASV). Datu analīze tika veikta ar FlowJo versiju 10.6.1 (FLOWJO LLC). Vārtu hierarhija IFN reakcijas analīzei ir parādīta 4. un 5. attēlā PBMC un papildu attēlā S1 un 7. attēlā BAL, plaušu audiem un TrBr LN.

2.7. Statistiskā analīze

Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot Graphpad Prism 8 (Graphpad Software, Sandjego, CA, ASV). Dati ar pilnu datu kopu tika analizēti ar divvirzienu (visā pētījuma laikā) vai vienvirziena (autopsijas laikā) ANOVA. Dati ar trūkstošiem datu punktiem (galvenokārt sakarā ar autopsiju 50 procentiem cūku ar 2 dpi) tika analizēti, izmantojot jauktu efektu modeli (ierobežota maksimālā iespējamība, REML). Visi daudzkārtējie salīdzinājumi tika veikti ar Dunnett vairāku salīdzināšanas testu. Datu ilustrācija tika veikta, izmantojot vijoles diagrammas, kurās parādīts sadalījums, atsevišķi punkti, mediāna (attiecīgā gadījumā, pārtraukta melnā līnija) un 25./75. intervāls (kā piemērojama krāsaina līnija). Korelācijas analīzes starp jauncūku un sivēnu nAb līmeni tika veiktas, izmantojot Pīrsona korelācijas koeficientus un divpusēju 95 procentu ticamības intervālu.

3. Rezultāti

3.1. Pētījuma izstrāde un vakcīnas efektivitāte — klīniskās pazīmes, virēmija, svara pieaugums un plaušu patoloģija

Pētījums tika veikts, kā parādīts 1. attēlā. Pēc PRRSV inokulācijas cūkām parādījās viegli PRRSV simptomi, kas sākās 3–4 dienu laikā pēc inficēšanās — drudzis [galvenokārt pie 1 wpi, dns], letarģija, samazināts pārtikas patēriņš, viegla klepus/šķaudīšana. Šiem simptomiem būtiskas atšķirības netika novērotas, un tās dažādās pakāpēs saglabājās līdz autopsijai. 2. attēlā parādīta virēmija, iknedēļas ķermeņa masas pieaugums, kā arī bruto un histopatoloģijas rādītāji.

Kā parādīts 2.A attēlā, visas cūkas bija PRRSV-2 negatīvas atšķiršanas laikā, un intranazālā inokulācija ar PRRSV-2 izraisīja virēmiju, kuras maksimums sasniedza 2 wpi. Lai gan starp TRT 0 un TRT 2 virēmijas atšķirības nebija, TRT 1 virēmija pirmajās divās nedēļās bija ievērojami zemāka nekā kontroles grupai TRT 0. Cūku svara pieaugums visās grupās pirmajās trīs nedēļās bija ļoti līdzīgs; tomēr pētījuma beigās, salīdzinot ar TRT 0, TRT 2 un TRT 1 bija ievērojami lielāks iknedēļas svara pieaugums. 2.B attēls. Jo īpaši, lai gan plaušu patoloģija parasti tiek atrisināta PRRSV infekcijas gadījumā un tāpēc bija līdzīga starp grupām ar 4 dpi (dns), abas mātes AIV vakcinācijas, tātad TRT 1 plus 2, ievērojami samazināja plaušu patoloģiju pie 2 wpi: abas samazināja procentuālo līmeni. makroskopisku bojājumu un/vai intersticiālas pneimonijas (2.C, D attēls). Makroskopisku plaušu bojājumu izplatība plaušās pēc TRT 0 bija 20–70 procenti; turpretim lielākajai daļai cūku TRT 1 plus 2 plaušu bojājumu izplatība bija zem 20 procentiem — 2.C attēls. Līdzīgi, lai gan vidējais histopatoloģijas rādītājs intersticiālai pneimonijai plaušās no TRT 0 cūkām bija trīs, tas bija attiecīgi 1,8 TRT 1 un 1,2 TRT 2. Salīdzinot ar TRT 0, tas parāda tendenci uz nozīmīgumu (p=0.07) un būtisku plaušu histopatoloģijas samazināšanos cūkām no AIV vakcinētām jauncūkām — 2.D attēls. Šie dati liecina, ka AIV vakcinācija var ievērojami samazināt virēmiju un plaušu patoloģiju, turklāt tie arī parāda, ka mātes AIV vakcinācija pret PRRSV-2 var uzlabot imunitāti 2-nedēļu veciem sivēniem.

3.2. Mātes neitralizējošu antivielu indukcija un to pārnešana uz sivēniem

Humorālās imūnreakcijas indukcija jauncūkām un to pēcnācējiem tika analizēta, nosakot NA FFN titrus (3. attēls).

Visu grupu vakcinācija ar MLV izraisīja NA titrus jauncūkām no 4 līdz 64 bez būtiskām atšķirībām starp trim grupām (dns). Turpretim, lai gan tikai MLV vakcinācija (TRT 0) neietvēra NA pret heterologo 1-7-4 celmu, abas AIV pastiprinošās vakcinācijas izraisīja NA titrus līdz 1:16 (TRT 2) un pat 1. :128 (TRT 1) — 3A attēls.

Šīs seruma NA tika pārnestas uz sivēniem (3.B attēls): lai gan TRT 0 sivēniem nebija NA titru pie 0 wpi, TRT 1 un TRT 2 sivēniem bija seruma NA celmam 1-7-4 pirms tam. infekcija, kas tieši korelēja ar mātes NA līmeni (3.C attēls, r=0.886, p < 0.0001). Šie NA titri samazinājās pirmajās divās nedēļās, pirms stabilizējās par 4 wpi. Tomēr, salīdzinot ar TRT 0, sivēniem no AIV vakcinētām jauncūkām (TRT 1 plus 2) jau pirms inficēšanās bija ievērojami augstāki seruma NA titri, un šie paaugstinātie titri saglabājās līdz 2–3 wpi, tātad līdz 4–5 nedēļu vecumam. 3B.

For more information:1950477648nn@gmail.com