Melanocītu aktivācijas mehānismi un saules lentigo racionāla terapeitiskā ārstēšana

Abstract:Lai raksturotu saules lentigo (SL) patobioloģiju, analīzes ar puskvantitatīvo RT-PCR, Western blotēšanu un imūnhistoķīmiju atklāja endotelīna (EDN) -1/endotelīna B receptoru (EDNBR), cilmes šūnu faktora (SCF) ekspresiju. )/c-KIT un audzēja nekrozes faktoru (TNF) bojājuma epidermā, kas kontrastēja ar samazinātu interleikīna (IL) ekspresiju 1 . Šie atklājumi stingri apstiprina hipotēzi, ka iepriekšējā atkārtotā UVB iedarbība izraisa keratinocītu nepārtrauktu TNF ražošanu. Pēc tam TNF stimulē EDN sekrēciju un SCF veidošanos autokrīnā veidā, izraisot nepārtrauktu blakus esošo melanocītu melanogēno aktivāciju, kas izraisa SL. Klīniskais pētījums ar 36 pacientiem ar SL sešus mēnešus, kuri tika ārstēti ar M. Chamomilla ekstraktu ar spēcīgu spēju atcelt EDN1-inducēto DNS sintēzes palielināšanos un cilvēka melanocītu melanizāciju kultūrā, atklāja ievērojamu pigmenta rādītāju uzlabošanos. un krāsu atšķirības, kas izteiktas kā L vērtības. Vēl viens klīnisks pētījums, izmantojot atirozināzeinhibitors L-askorbāts-2-fosfāts 3 Na (ASP) parādīja, ka ar testa losjonu (6 procenti APS) apstrādātās ādas L vērtības ievērojami palielinājās SL un nebojātā ādā ar ievērojami augstāku ∆L vērtību SL, kad salīdzinot ar ādu bez bojājumiem. Šo atklājumu summa stingri liecina, ka kombinēta lokāla ārstēšana ar EDN signālu blokatoriem untirozināzeinhibitori ir vēlama terapeitiska izvēle SL.

Atslēgvārdi: saules lentigo; endotelīns; cilmes šūnu faktors; keratinocītu augšanas faktors; interleikīns-1; audzēja nekrozes faktors ; intracelulārā signalizācija; kalcija mobilizācija; signalizācijas bloķētājs; M. chamomilla; askorbāts-fosfāts Na; balināšanas līdzeklis; tirozināzes inhibitors

Cistanche ir tirozināzes inhibitors.

Noklikšķiniet uz cistanche efektiem tirozināzes inhibēšanai

1. Ievads

Visbiežāk sastopamie epidermas hiperpigmentārie traucējumi Āzijas ādā ir saules lentigos (SL), kas parasti rodas uz sejas un roku muguras. Atšķirībā no UVB izraisītas hiperpigmentācijas (UVB melanozes), kas atkarībā no pētāmās personas vecuma izzūd divu nedēļu līdz dažu mēnešu laikā pēc UVB iedarbības pārtraukšanas, SL attīstās uz saules pakļautas ādas, īpaši uz sejas, un nekad nepazūd iespējamu DNS bojājumu dēļ keratinocītos, ko izraisa atkārtota bojājuma epidermas UVB apstarošana. Kopumā hiperpigmentāri traucējumi parasti ir vērsti pret pigmentācijas līdzekļiem, un tie ietver UVB melanozi, SL un melasmu. Pamatojoties uz galīgās diagnozes biežumu pacientiem ar dažādiem pigmentācijas traucējumiem Japānā, SL ir visaugstākā sastopamība, kas rodas aptuveni 60 procentiem no visiem pacientiem ar hiperpigmentāriem traucējumiem, savukārt melasma un pēciekaisuma hiperpigmentācija (tostarp UVB melanoze) rodas attiecīgi pat 5,2 procenti un 3,3 procenti pacientu [1]. Tas liek domāt, ka SL ir dominējošais pretpigmentācijas līdzekļu mērķis Āzijas ādai. Tomēr ir bijis maz publicētu rakstu par pretpigmentācijas līdzekļu klīnisko ietekmi uz SL, jo daudzi pretpigmentācijas līdzekļi kalpo kātirozināzeinhibitori, un tas nav paredzamstirozināzeinhibīcija būtu pietiekama, lai uzlabotu SL hiperpigmentāciju. Turklāt šķiet grūti racionāli izstrādāt efektīvu terapeitisku lokālu ārstēšanu SL, jo maz ir zināms par melanocītu aktivācijas mehānismiem bojājuma epidermā. Šajā pārskata rakstā mēs raksturojam SL patobioloģiju saskaņā ar lokālu SL ārstēšanu, jo maz ir zināms par melanocītu aktivācijas mehānismiem bojājuma epidermā. Šajā pārskata rakstā mēs raksturojam SL patobioloģiju saskaņā ar zināmajiem melanogēnajiem parakrīna citokīnu tīkliem un, pamatojoties uz atklātajiem melanocītu aktivācijas mehānismiem SL bojājuma epidermā, mēs ieviešam racionālas klīniskas pieejas SL vietējai ārstēšanai, lai uzlabotu hiperpigmentāciju. līmenī.

2. Klīniskās īpašības

SL klīniski attīstās kā plakani, labi norobežoti ādas plankumi ar dažādu krāsu un izmēru, kas bieži parādās uz sejas un roku muguras (1.a attēls) [2]. Ar Hemoxylin & Eosin krāsotu SL bojājumu histoķīmija atklāja nelielu akantozi un pigmentāciju gar bazālo šūnu slāni (1.b attēls) [2]. Sejas SL histopatoloģisko pazīmju ziņā ir divi modeļi: viens modelis parādīja saplacinātu epidermu ar bazālo melanozi, bet otrs modelis parādīja epidermas hiperplāziju ar iegarenām rete izciļņiem, kas sastāv no dziļi pigmentētām bazaloīdām šūnām [3].

3. Melanocītu aktivācijas mehānismi saules lentigo gadījumā, pamatojoties uz melanogēno parakrīno citokīnu tīklu

3.1. Melanocītu skaits un tirozināzes ekspresija

Lai gan ir bijuši daži argumenti par palielinātu melanocītu skaitu SL, imūnhistoķīmiskā analīze, izmantojot melanocītiem specifisko marķieri MART-1, atklāja palielinātu melanocītu skaitu saules lentigo [5–7]. Tomēr faktiskais melanocītu blīvums gar robežu starp dermu un epidermu SL ir līdzīgs perilesionālās kontroles ādā sakarā ar palielinātu keratinocītu proliferāciju [7]. Imūnhistoķīmija, izmantojot anti-tirozināzeatklāja totirozināze-pozitīvo melanocītu skaits SL bojājuma epidermā ievērojami palielinājās 2-kārtīgi [4]. Gēnu analīze ar puskvantitatīvo RT-PCR atklāja, ka tirozināzes mRNS ekspresijas līmenis bojājuma epidermā ir ievērojami paaugstināts par 2{5}} reizēm [4]. Iepriekš minētie atklājumi apstiprina iespēju, ka SL bojājuma melanocītos tiek stimulēta gan proliferācija, gan melanizācija. Tāpēc mēs izvirzījām hipotēzi, ka nedaudz proliferējoši keratinocīti SL izraisa blakus esošo melanocītu aktivāciju, izdalot melanocītus stimulējošus citokīnus.

3.2. Melanogēnie parakrīno citokīnu tīkli

Mēs un citas grupas esam noskaidrojuši, ka starp ādas šūnām ir vairāki svarīgi melanogēnie parakrīno citokīnu tīkli (2. attēls). Galvenokārt tie ietver endotelīnu (EDN)-1 [8–15], ar membrānu saistīto cilmes šūnu faktoru (mSCF) [16], proopiomelanokortīnu (POMC) [17–20], prostaglandīnu E2 [21], granulocītu makrofāgu. koloniju stimulācijas faktors (GM-CSF) [22], pamata fibroblastu augšanas faktors [23], ar augšanu saistīts onkogēns [24] un keratinocītu augšanas faktors (KGF) [25,26], kas iesaistīti keratinocītu/melanocītu mijiedarbībā un šķīstošā SCF [27]. ], hepatocītu augšanas faktors (HGF) [8, 10, 27–29] un KGF [30], kas iesaistīti fibroblastu/melanocītu mijiedarbībā. Pamatojoties uz noskaidrotajiem melanogēnajiem parakrinecitokīnu tīkliem, tostarp to atbilstošajiem receptoriem, ir svarīgi noteikt, kuri melanogēnie parakrīno citokīnu tīkli ir iesaistīti un īpaši aktivizēti in vivo SL bojājuma epidermas hiperpigmentācijas mehānismos.

3.3. Galvenie parakrīnie citokīni un receptori, kas ir atbildīgi par melanocītu aktivāciju SL

Starp iepriekš minētajiem melanogēnajiem citokīniem un to atbilstošajiem receptoriem mēs vispirms noteicām pamata fibroblastu augšanas faktora (bFGF) un ar augšanu saistītā onkogēna (GRO) lomu SL epidermā. Tika konstatēts, ka pamata FGF ir pārmērīgi ekspresēts UVB pakļautajos cilvēka keratinocītos, kuru homogenātiem bija izteikts potenciāls stimulēt melanoģenēzi un cilvēka melanocītu proliferāciju kultūrā, lai gan melanogēnai stimulācijai būtībā ir nepieciešami kofaktori ar spēju palielināt ciklisko AMP līmeni [23]. ]. Mūsu pētniecības grupa identificēja GRO kā melanogēnu citokīnu, kam ir būtiska loma fenilazonaftola izraisītā hiperpigmentācijā pēc alerģiskas reakcijas brūngani dzeltenā jūrascūciņu ādā [24,31]. Puskvantitatīvā RT-PCR atklāja, ka bFGF un GRO gēnu ekspresijas līmeņi SL bojājuma epidermā nemainās, salīdzinot ar nebojāto epidermu [2]. Atbilstoši bFGF un GRO mRNS ekspresijas līmenim imūnhistoķīmija atklāja, ka imūnās krāsošanas intensitātē ar anti-bFGF (1.c, d attēls) un anti-GRO (1.e, f attēls) nebija atšķirības starp SL bojājumu un bez bojājumiem. epidermu [2]. Šie atklājumi neliecināja par bFGF vai GRO kā iekšējo melanogēno citokīnu iesaistīšanos melanocītu aktivācijas mehānismā SL.

UVB izraisītas hiperpigmentācijas bioloģiskajā mehānismā EDN1, vazokonstriktora peptīda, kas sākotnēji izolēts no cūku endotēlija šūnām [32], un mSCF [16] ekspresija tiek regulēta autokrīnā veidā, iedarbojoties uz UVB stimulēto interleikīna izdalīšanos. IL)-1, radot reaktīvas skābekļa sugas (ROS) [15]. Šie citokīni liek blakus esošajiem melanocītiem palielināt kritisko melanīnu sintezējošo enzīmu tirozināzes [14,33], EDNBR [34] un melanosomu matricas proteīna PMEL17 [34], kā arī ar proliferāciju saistīto enzīmu, piemēram, cikliskās atkarīgās kināzes (CDK)2 ekspresiju. [34], kas izraisa hiperpigmentāciju UVB pakļautajā ādā. Pamatojoties uz galvenajiem melanogēnajiem citokīniem, kas būtībā ir iesaistīti UVB melanozē, mēs pēc tam noteicām EDN1 lomu melanocītu aktivācijas mehānismā SL epidermā. EDN1 mRNS ekspresijas līmeņa raksturojums epidermā, izmantojot puskvantitatīvu RT-PCR analīzi, parādīja, ka SL bojājuma epidermā bija izteikts ekspresijas pieaugums vidēji par 3{21}}, salīdzinot ar epidermu bez bojājumiem. [4]. Atbilstoši paaugstinātam EDN1 gēnu ekspresijas līmenim visā SL bojājuma epidermā tika palielināta imūnkrāsošana ar anti-EDN1 (1.g, h attēls) [4].

Papildus EDN1 mēs pēc tam noteicām EDN receptoru lomu melanocītu aktivācijas mehānismā, kas ir SL pamatā. EDN saistīšanās ar tā receptoriem ir pirmais solis galvenajā parakrīnajā līnijā starp keratinocītiem un melanocītiem, kas regulē ādas pigmentāciju [11,14,35,36]. EDN receptori ir septiņu transmembrānu G-proteīnu saistīti receptori ar divām izoformām (A un B), kas mijiedarbojas attiecīgi ar EDN1 un ar visu veidu EDN (EDN1, EDN2 un EDN3) [37]. Attiecībā uz EDN receptoru antagonistu inhibējošo iedarbību uz EDN stimulēto cilvēka melanocītu proliferāciju kultūrā, nozīmīga inhibējoša iedarbība radās tikai BQ 788, anendotelīna B receptoru (EDNBR) antagonista klātbūtnē, bet ne BQ123 vai BQ610, endotelīna klātbūtnē. Receptoru (EDNAR) antagonists [9], kas norādīja, ka EDN1/EDN receptoru signālu pārraide notiek caur EDNBR. EDNBR mRNS ekspresijas puskvantitatīvā RT-PCR analīze atklāja, ka starp dažādiem ādas šūnu veidiem melanocīti ir vienīgais būtiskais šūnu veids, kas ekspresē EDNBR. Tā kā mēs jau esam pierādījuši, ka keratinocītu izdalītais EDN1 izraisa intracelulārās proteīna kināzes C (PKC) aktivāciju, izmantojot EDNBR [35], mēs noteicām, vai EDNBR ekspresijas līmenis tika akcentēts arī melanocītos bojājuma SL epidermā. EDNBRmRNS puskvantitatīvā RT-PCR analīze SL epidermā uzrādīja izteikti palielinātu ekspresiju par vidēji 6{23}} SL bojājuma epidermā [4]. Atbilstoši palielinātajai EDNBR mRNS ekspresijai tika palielināta imūnkrāsošana ar anti-EDNBR, kas lokalizēts melanocītos bojājuma SL epidermā (1.i, j attēls) [4]. Šo atradumu summa stingri liecina par koordinētu EDN1 ekspresijas un tā receptoru saites palielināšanos SL bojājuma epidermā.

Pamatojoties uz galvenajiem melanogēnajiem citokīniem, kas iesaistīti UVB melanozē, mēs pēc tam noteicām SCF lomu melanocītu aktivācijas mehānismā bojājuma SL epidermā. Mēs jau ziņojām, ka kultivēto cilvēka keratinocītu, kā arī cilvēka epidermas UVB iedarbība ievērojami stimulē SCF ekspresiju gan gēnu, gan olbaltumvielu līmenī [15, 16]. SCF mRNS puskvantitatīvā RT-PCR analīze SL epidermā liecināja par izteikti palielinātu ekspresiju vidēji par 3{5}} SL bojājuma epidermā salīdzinājumā ar nebojāto epidermu [2]. Vesterna blotēšana SCF noteikšanai sešu pacientu ar SL ādā parādīja, ka SCF proteīna līmenis SL bojājuma epidermā ievērojami palielinājās vidēji par 1{9}}, salīdzinot ar epidermu bez bojājumiem [2].

Atbilstoši paaugstinātam SCF gēnu un proteīnu ekspresijas līmenim visā bojājuma SL epidermā tika palielināta imūnkrāsošana ar anti-SCF (1.k, l attēls) [2]. Bija strīds par to, vai proteīna līmenī paaugstināts regulējums bojājuma epidermā ir šķīstošs vai ar membrānu saistīts tips. Ja bazālās membrānas caurlaidīgā šķīstošā SCF epidermā tiek regulēta, dermā esošās tuklo šūnas jāaktivizē, lai tās vairotos un palielinātos to skaits. Tā kā toluidīna zilā krāsošana SL neliecināja par tuklo šūnu skaita palielināšanos bojājuma SL dermā [2], iespējams, ka SL pārregulētais SCF veids ir ar membrānu saistīts tips.

Papildus SCF mēs pēc tam noteicām SCF receptora c-KIT lomu melanocītu aktivācijas mehānismā, kas ir SL pamatā. Mēs jau ziņojām, ka kultivētu cilvēka melanocītu, kā arī cilvēka epidermas UVB iedarbība ievērojami stimulē c-KIT ekspresiju gan gēnu, gan olbaltumvielu līmenī [15, 38]. Turklāt brūngani dzeltenās jūrascūciņas ādas UVB stimulētās pigmentācijas gadījumā bloķējoša antiviela pret c-KIT ievērojami atcēla palielināto dopapozitīvo melanocītu skaitu, kā arī hiperpigmentāciju UVB izraisītā pigmentācijas procesa agrīnā fāzē [16]. , kas stingri norāda, ka SCF saistīšanās ar c-KIT spēlē nozīmīgu lomu UVB izraisītā melanocītu aktivācijā, izraisot hiperpigmentāciju. Vienlaikus ar paaugstinātu SCF ekspresiju gēnu un proteīnu līmeņos, tā c-KIT receptoru gēnu ekspresijas līmenis tika palielināts vidēji par 2{13}} SL bojājuma epidermā [2]. Atbilstoši palielinātajai c-KIT mRNS ekspresijai tika palielināta imūnkrāsošana ar c-KIT antivielu, kas lokalizēta melanocītos bojājuma SL epidermā (1. m, n attēls) [2]. Tas liecina, ka SCF un tā receptoru c-KIT ekspresija SL bojājuma epidermā ir saskaņoti pieaugusi.

No otras puses, citas grupas ir izvirzījušas hipotēzi, ka keratinocītu augšanas faktoram (KGF)/KGF receptoram (KGFR) ir svarīga loma SL veidošanās ierosināšanā un pigmentācijas palielināšanā tikai agrākās SL stadijas epidermā [25]. SL bojājuma epidermā [30] un/vai dermā [25] KGF ekspresija tiek regulēta tikai imūnās iekrāsošanās līmenī, lai gan ir nepieciešami turpmāki pētījumi par tā gēnu un proteīnu ekspresiju, lai varētu izdarīt galīgos secinājumus par to kā raksturīgu citokīnu, kas izraisa. SL. Lai gan ir zināms, ka IL-1 liek keratinocītiem stimulēt KGF veidošanos, joprojām nav skaidrs, kā KGF ekspresija tiek paaugstināta bojājuma epidermā, kur IL-1 ekspresija ir diezgan samazināta [2]. Protams, ir jānosaka, vai TNF (kas tiek regulēts bojājuma epidermā) spēj stimulēt KGF veidošanos. Tā kā KGF ekspresija ādā galvenokārt aprobežojas ar dermas fibroblastiem, ir ticams, ka palielināta KGF ekspresija ar dermas fibroblastiem SL bojājuma dermā [25] ir saistīta gan ar palielinātu keratinocītu proliferāciju, gan stimulēto melanoģenēzi. Tādējādi ir iespējams, ka ādas fibroblastus pastāvīgi aktivizē UV iedarbība, lai atbrīvotu KGF, kas tieši vai netieši iedarbojas uz pamatīgiem keratinocītiem, modulējot SCF ekspresiju, veicinot SL hiperpigmentāciju [25].

Pēc tam mēs noteicām bioloģiskos mehānismus, ar kuriem EDN1 sekrēcija tiek regulēta SL bojājuma epidermā. Ir labi zināms, ka bioloģiskie faktori, kas saistīti ar cilvēka keratinocītu EDN sekrēcijas stimulēšanu, ir IL-1, audzēja nekrozes faktors (TNF) un endotelīnu konvertējošais enzīms (ECE)-1. Mūsu atklājumi par autokrīnās citokīnu stimulāciju, kas saistīta ar UVB melanozi, parādīja, ka IL-1 augšupregulācija galvenokārt ir atbildīga par EDN1 un SCF ražošanas stimulēšanu cilvēka keratinocītos, kas pakļauti UVB iedarbībai [12,16]. Tādējādi ir konstatēts, ka IL-1 un ir potenciāli EDN sekrēcijas stimulatori ar aizkavētu cilvēka keratinocītu maksimumu kultūrā, kas līdzinās UVB izraisītās EDN sekrēcijas modelim [11]. Ir arī labi zināms, ka UVB apstarošana būtiski stimulē IL-1, bet ne IL-1 izdalīšanos kultivētos cilvēka keratinocītos un ka bloķējoša antiviela pret IL-1 būtiski aptur palielināto EDN1 sekrēciju. [11], kas norāda, ka UVB izraisīta hiperpigmentācija ir saistīta ar epidermas melanocītu aktivāciju, ko izraisa palielināta EDN1 sekrēcija ar UVB pakļautiem keratinocītiem. Turklāt tika konstatēts, ka cilvēka keratinocītu kultūrā apstrāde ar IL-1 ievērojami stimulē mSCF proteīna ekspresiju [16]. Tāpēc mēs pēc tam noskaidrojām, vai IL-1 arī tika paaugstināts regulējums, lai stimulētu EDN1 un/vai SCF ekspresiju SL bojājuma epidermā. Interesanti, ka puskvantitatīvā RT-PCR analīze atklāja, ka IL-1 mRNS ekspresija bojājuma epidermā ir diezgan pazemināta [16]. Saskaņā ar šo RT-PCR analīzi imūnhistoķīmija ar IL-1 antivielu atklāja vājāku imūno krāsojumu bojājuma epidermā nekā nebojātā epidermā (1o,p attēls) [2], kas liecināja, ka IL{ {33}} nav atbildīgs par pastiprinātu EDN1 un SCF ekspresiju SL bojājuma epidermā.

Attiecībā uz mehānismiem, kas ir pamatā paaugstinātai EDN1 ekspresijai SL, papildus IL-1 par TNF pie 10 ng/ml ziņoja Tsuboiet al. būt par spēcīgu kultivētu cilvēka keratinocītu EDN sekrēcijas stimulatoru ({3}}kārtīgi) [39]. Runājot par mehānismu, kas ir pamatā SCF ekspresijai SL, mēs pēc tam pārbaudījām TNF ietekmi uz SCF ekspresiju kultivētos cilvēka keratinocītos. Western blotēšana, izmantojot anti-SCF antivielu, parādīja, ka TNF būtiski stimulē mSCF veidošanos [15]. Tāpēc mēs pēc tam noteicām, vai TNF tiek regulēts, lai stimulētu EDN1 un / vai SCF ekspresiju SL bojājuma epidermā. Interesanti, ka puskvantitatīvā RT-PCRanalīze atklāja, ka bojājuma SL epidermā TNF mRNS ekspresija ir ievērojami pārregulēta [2]. Saskaņā ar RT-PCR analīzi imūnhistoķīmija ar anti-TNF antivielu atklāja spēcīgāku imūno krāsojumu bojājuma SL epidermā nekā nebojātajā epidermā (1q, r attēls) [2]. Tādējādi bija iespējams, ka TNF regulētā ekspresija galvenokārt ir atbildīga par palielinātu EDN1 un SCF ekspresiju SL bojājuma epidermā.

Runājot par mehānismu, kas saistīts ar palielinātu EDN1 ekspresiju, mēs pēc tam noskaidrojām, vai ECE-1 ir pārregulēta bojājuma SL epidermā. Tā kā šobrīd neviens pētījums nav aprakstījis ECE-1 ekspresiju cilvēka keratinocītos, mēs raksturojām ECE-1 kultivētos cilvēka keratinocītos, salīdzinot ar endotēlija šūnām. ECE-1 aktivitātes analīze dažāda veida ādas šūnās atklāja, ka cilvēka keratinocītiem, nevis cilvēka melanocītiem piemīt ECE-1 aktivitāte, kas notiek mazākā mērā nekā endotēlija šūnās [40]. Western blotēšana, izmantojot antivielas, kuras mēs sagatavojām pret ECE-1, parādīja, ka ECE-1 proteīns pastāv cilvēka endotēlija šūnās, cilvēka fibroblastos un cilvēka keratinocītos, bet ne cilvēka melanocītos [40]. ECE-1 aktivitātes testi supernatantos pēc imunoprecipitācijas ar ECE-1 antivielu parādīja, ka endotēlija šūnām un cilvēka keratinocītiem ir nosakāmas ECE-1 aktivitātes pie pH 6,8, kas labi korelē ar ECE{ {15}} imunoprecipitēts ar mūsu antivielu pret ECE-1 [40]. ECE-1 mRNS līmeņu puskvantitatīvā RT-PCR analīze atklāja, ka IL-1, bet ne TNF, bija neliela stimulējoša ietekme uz ECE-1 gēna ekspresiju kultivētos cilvēka keratinocītos [40]. Saskaņā ar RT-PCR analīzi Western blotting atklāja, ka IL-1, bet ne TNF, stimulē ECE-1 proteīna ekspresiju kultivētos cilvēka keratinocītos [40]. Visbeidzot, mēs noskaidrojām, vai ECE-1 ir arī pārregulēta, lai stimulētu EDN1 ekspresiju SL bojājuma epidermā. Saskaņā ar TNF stimulējošās iedarbības trūkumu, kas tiek regulēts SL, mRNS ekspresijas līmenī ECE-1 nebija atšķirības starp SL bojāto un nebojāto epidermu [2], kas liecina, ka ECE-1 nav atbildīga par pastiprinātu EDN1 sekrēciju SL.

3. attēlā parādīts kopsavilkums par autokrīno stimulāciju cilvēka keratinocītos kultūrā. Attiecībā uz bioloģiskajiem mehānismiem, kas izraisa EDN un SCF signālu kaskāžu aktivizēšanu [9], mūsu in vitro pētījumi liecina par interesantu kontrastu, ka, lai gan IL-1 regulēšana galvenokārt ir atbildīga par EDN1 un SCF ražošanas stimulēšanu UVB- melanozes gadījumā TNF regulēšana galvenokārt ir saistīta ar šo pašu divu citokīnu stimulēto ražošanu SL.

3.4. EDN1 un SCF kombinācijas sinerģiski stimulējošie efekti

Mēs jau ziņojām, ka kultivētos cilvēka melanocītos stimulētajā DNS sintēzē ir sinerģija, ko mēra ar 14C-timidīna iekļaušanu SCF un EDN1 līdzās klātbūtnē [41]. Līdzīga sinerģija bija arī melanīna sintēzes stimulācijā, ko mēra ar 14C-tiouracila iekļaušanu kultivētos cilvēka melanocītos, vienlaikus klātesot SCF un EDN1 [41]. Turpretim šādas sinerģijas starp EDN1 un granulocītu makrofāgu koloniju stimulējošu faktoru (GM-CSF) vai HGF nebija [13,42]. Runājot par signalizācijas mehānismiem, kas saistīti ar šiem sinerģiskajiem efektiem, mēs noskaidrojām, ka SCF un EDN1 signālu pārruna tika uzsākta, izmantojot c-KIT tirozīna fosforilāciju, ko netieši stimulē aktivizēts PKC, kas uzlabo Shc-Grb{ veidošanos. {18}}SOS komplekss, kas savukārt noved pie Ras/Raf-1/MEK/MAP kināzes cilpas sinerģiskas aktivācijas [41].

3.5. EDN/EDNBR un SCF/c-KIT savstarpēja mijiedarbība

Pēc tam mēs noteicām, vai palielināta SCF ražošana izraisa EDNBR ekspresiju vai tā afinitāti pret EDN ligandu cilvēka melanocītos papildus tā stimulējošajai iedarbībai uz to proliferāciju. Western blot analīze atklāja, ka SCF var stimulēt EDNBR proteīna ekspresiju kultivētos cilvēka melanocītos [43]. Kad EDNBR afinitāte pret ligandu tika novērtēta kultivētā cilvēka melanocītos, izmantojot ligandu saistīšanās testu, tika konstatēts, ka ar 125I iezīmētā EDN1 saistīšanās ar EDNBR ir ievērojami palielināta divas dienas pēc inkubācijas ar SCF [43]. Kopumā šie atklājumi liecina, ka SCF, kas izteikts agrīnā fāzē, var uzlabot EDNBR ekspresiju, kas izraisa melanocītu jutību pret vēlāku EDN1 sekrēciju. No otras puses, kad kultivētos cilvēka melanocītus 48 stundas apstrādāja ar EDN1 pie 10 nM, ligandu saistīšanās tests, izmantojot 125I-SCF, atklāja, ka EDN1 ievērojami uzlaboja SCF saistīšanās afinitāti ar c-KITreceptoru [43].

4. SL patobioloģijas kopsavilkums

1. tabulā parādīts parakrīno citokīnu tīklu kopsavilkums, kas rodas dažādu epidermas hiperpigmentāru traucējumu gadījumā. Attiecībā uz šiem tīkliem SL ir ļoti līdzīgi UVB melanozei, izņemot izraisošos citokīnus, piemēram, TNF, kas palielina EDN1 un SCF veidošanos.

Attiecībā uz bioloģiskajiem mehānismiem, kas izraisa EDN un SCF signālu kaskāžu aktivitātes palielināšanos, mūsu in vitro pētījumi liecina, ka, lai gan IL{0}} augšupregulācija galvenokārt ir atbildīga par EDN1 un SCF ražošanas stimulēšanu UVB melanozes gadījumā, augšupregulācija. TNF ir saistīta ar šo pašu divu citokīnu stimulēto ražošanu SL. 4. attēlā parādīts kopsavilkums par sarežģītajām attiecībām starp SCF un EDN1 saitēm SL epidermā. Tas ietver sinerģismu starp SCF un EDN1, kā arī EDNBR un c-KIT aktivizēšanu, ko veic attiecīgi SCF un EDN1. TNF izdalīšanās no keratinocītiem simulē SCF un EDN veidošanos autokrīnā veidā, kuriem abiem ir sinerģiska ietekme uz melanocītu aktivāciju, kā arī stimulējoša iedarbība uz atbilstošo receptoru, c-KIT un EDNBR, ekspresiju. Šīs sinerģiskās un starpšūnu mijiedarbības veicina melanocītu aktivāciju lielākā mērā SL bojājuma epidermā nekā UVB pakļautajā epidermā, izraisot intensīvāku SL hiperpigmentāciju.

Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka divām signalizācijas kaskādēm, EDN1 / EDNBR un mSCF / c-KIT, ir raksturīga un koordinēta loma, akcentējot melanocītu mitoģenēzi un melanoģenēzi SL hiperpigmentētajā epidermā. 5. attēlā parādīta bioloģiskā secība hiperpigmentācijas mehānismiem, kas saistīti ar SL, kur nezināmi audzēju izraisošie faktori kumulatīva DNS bojājuma dēļ tālā pagātnē izraisa keratinocītu veidošanos un TNF sekrēciju. Tādējādi TNF liek keratinocītiem pārmērīgi ražot melanogēnos citokīnus, piemēram, SCF un EDN1 autokrīnā veidā, izraisot blakus esošos melanocītus, lai stimulētu melanīna sintēzi, izraisot epidermas hiperpigmentāciju.

5. Terapeitiskās lokālās ārstēšanas pieejas

Pamatojoties uz koordinētu melanogēno parakrīna tīklu un aktivizētiem signalizācijas mehānismiem, kas izraisa melanocītu aktivāciju bojājuma SL epidermā, būtisku melanogēno intracelulāro signālu bloķēšana ir vēlama terapeitiska pieeja, lai panāktu pretpigmentācijas efektu uz SL. Šāda pieeja var izraisīt hipopigmentāciju, taču tai nevajadzētu būt efektīvai ādā, kas nav bojāta, kur šādas signālu kaskādes nav aktivizētas melanocītos. No otras puses, tirozināzes aktivitātes kavēšana ir vēl viena pieeja hiperpigmentācijas uzlabošanai SL, lai gan tā var izraisīt hipopigmentāciju un var būt efektīva arī ādā, kas nav bojāta.

5.1. Būtisku melanogēno intracelulāro signālu bloķēšana

Tā kā gandrīz visas mutācijas, kas izraisa ģenētiskus hipopigmentārus traucējumus, notiek EDN1/EDNBR un SCF/c-KIT asī [44] un tā kā EDN1/SCF ir sinerģiska stimulējoša iedarbība uz šūnu proliferāciju un melanizāciju kultivētos cilvēka melanocītos, ir iespējams, ka tas bloķē. vai nu EDN1/EDNBR, vai SCF/c-KIT signalizācija varētu novērst hiperpigmentāciju koordinēti palielinātās EDN1 un SCF ekspresijas dēļ, jo sinerģisks stimulējošais efekts nenotiek. Tāpēc mēs mēģinājām panākt pretpigmentācijas efektu uz SL, bloķējot EDN / EDNBR signālu līniju.

EDN aktivizētais intracelulārais signalizācijas ceļš sastāv no saistīšanās ar EDNBR, aktivizējot PKC, MAP kināzes kaskādi un cAMP/PKA kaskādi [34, 35, 41]. Tādējādi šīs šūnu darbības tiek uzsāktas, EDN1 saistoties ar G-proteīnu saistītu EDNBR, kam seko secīgi signalizācijas procesi, kas galvenokārt sastāv no PKC un MAPK. Pēc saistīšanās ar savu receptoru EDN1 izraisa polifosfoinositīda hidrolīzi, aktivizējot fosfolipāzi C, kas ģenerē inozitola-trifosfātus (IP3) un diacilglicerīnu, mobilizējot intracelulāro Ca plus plus un aktivizējot PKC. PKC aktivācija tiek panākta, pārvietojot to no citozola uz plazmas membrānu, un aktivizē Raf{10}} fosforilācijas ceļā. Tādējādi šķiet, ka Raf{11}} ir konverģences punkts starp PKC un MAPK ceļiem. Raf-1 aktivizēšana noved pie MAPK ceļa starpproduktu sērijas aktivizēšanas, kas sastāv no MEK, ERK un RSK. Fosforilēts Raf-1 aktivizē MEK, fosforilējot, un aktivētais MEK fosforilē ERK. Pēc tam aktivētais ERK fosforilē ar mikroftalmiju saistīto transkripcijas faktoru (MITF) serīnā 75, kā rezultātā tiek piesaistīts koaktivators vairāku melanogēno faktoru gēnu ekspresijas regulēšanai [41]. Vienlaikus aktivētais MAPK aktivizē RSK, kas fosforilē CREB, izraisot MITF transkripciju. No otras puses, aktivizētajam PKC ir savstarpēja saruna ar adenilciklāzes kaskādi, lai iegūtu cAMP[8], kā rezultātā tiek aktivizēts PKA, kas arī aktivizē CREB ar fosforilēšanos, kā rezultātā palielinās MITF ekspresija. Paaugstināts MITF proteīna līmenis stimulē melanocītiem specifisku gēnu, tostarp tirozināzes, PMEL17, EDNBR, c-KIT un CDK2, ekspresiju.

Tā kā vairāki intracelulāri signalizācijas ceļi izraisa stimulētu melanoģenēzi melanocītos un EDN signālu kaskāde ir īpaši saistīta ar PKC ceļu, kas ietver kalcija mobilizāciju no endoplazmatiskā tīkla [13], mēs izmantojām kalcija mobilizācijas testu, lai pārbaudītu EDNBR antagonistus no dažādiem. no augu ekstraktiem. Kalcija mobilizācija no endoplazmatiskā tīkla notiek pēc IP3 un diacilglicerīna veidošanās polifosfoinositīda hidrolīzes dēļ, izmantojot aktivētu fosfolipāzi C. Ja cilvēka melanocītus kultūrā apstrādā ar EDN1, kalcija mobilizācija, kas nosakāma ar fura-2AM reaģentu, pēc saistīšanās ar atbrīvoto kalciju rada fluorescenci, ko var redzēt pēc dzeltenas krāsas straujas parādīšanās, ko var izmērīt reāllaikā digitālā attēlveidošanas mikroskopija. Pārbaudot daudzus augu ekstraktus, mēs atklājām, ka iepriekšēja inkubācija ar Matricaria chamomilla ekstraktu pārtrauca EDN1 izraisīto kalcija mobilizāciju [1], kas liecināja, ka tas var kalpot kā efektīvs antagonists pret EDNBR. M. chamomilla, plaši pazīstama kā kumelīte, ir viengadīgs Asteraceae dzimtas augs. M. chamomilla ir vispopulārākais augu izcelsmes produkta kumelīšu avots, lai gan kā kumelītes tiek izmantotas arī citas sugas.

Pamatojoties uz M. chamomilla ekstrakta frakcionētu paraugu inhibējošo iedarbību uz EDN{{0}}inducēto kalcija mobilizāciju kultivētos cilvēka melanocītos, mēs identificējām spiroēteri kā tā aktīvo savienojumu ar spēcīgu spēju pārtraukt kalcija mobilizāciju (6. attēls). ) [1]. Ir divi spiroētera izomēri (E un Z), un spiroētera E-izomērs var pilnībā atcelt kalcija mobilizāciju koncentrācijās, kas pārsniedz 1 µM. Apstrāde ar spiroētera E-izomēru 0,2 un 1,0 procentu koncentrācijās ievērojami samazināja UVB izraisīto pigmentāciju brūngani dzeltenās jūrascūciņas ādā, kas novērtēta pēc ∆L vērtības, kas liecināja par EDN mediētās signalizācijas kaskādes bloķēšanu. efektīvi novērš UVB izraisītu hiperpigmentāciju. Tas ir svarīgi in vivo pierādījumi, kas liecina par EDN kaskādes raksturīgo iesaistīšanos UVB melanozē. No otras puses, kā gaidīts, iepriekš vai līdzinkubējot melanocītu kultūrā, M. chamomilla ekstraktam bija spēcīga spēja likvidēt. EDN1-izraisītā DNS sintēzes palielināšanās (mērot ar 14C-timidīna iekļaušanu), kā arī melanīna sintēzes (mērot ar 14C-tiouracila iekļaušanu) ar kultivētiem cilvēka melanocītiem. Paralēlā pētījumā, izmantojot kultivētus cilvēka keratinocītus, mēs pārliecinājāmies, ka M.chamomilla ekstraktam nav inhibējošas ietekmes uz IL-1 -inducēto EDN1 sekrēciju [1]. Turklāt, izmantojot tirozināzes, kas iegūtas no cilvēka melanocītiem, mēs apstiprinājām, ka M. chamomilla ekstraktam nebija inhibējošas ietekmes uz tirozināzes aktivitāti in vitro pretstatā izteiktajai inhibējošajai iedarbībai, ko rada labi zināmie balināšanas līdzekļi, kojskābe un arbutīns [1]. Kad M. chamomilla ekstrakts katru dienu tika lokāli lietots brūngani dzeltenā jūrascūciņā divas nedēļas tūlīt pēc UVB apstarošanas, UVB izraisītās pigmentācijas intensitāte bija ievērojami samazināta, salīdzinot ar ārstēšanu ar 10 procentiem arbutīna vai tikai nesēju [1].

Klīniskā pētījumā ar cilvēkiem tika konstatēts, ka M. chamomilla ekstraktu lokāla lietošana uz UVB pakļautai cilvēka apakšdelma ādai sešas nedēļas uzreiz pēc apstarošanas būtiski novērš UVB izraisītu hiperpigmentāciju, ko mēra ar krāsu atšķirības mērītāju un izsaka kā ∆. L vērtība.

Izmantojot M. chamomilla ekstraktu saturošu stick tipa vasku, mēs pārbaudījām klīnisko ietekmi uz pigmentāciju SL. Šajā klīniskajā pētījumā katrs pigmentētais plankums tika pārbaudīts, lai noteiktu krāsas izmaiņas, un tika novērtētas klīniskās uzlabošanās un derīguma pakāpes. Klīniskais novērtējums, kas veikts Tokijas Sieviešu medicīnas universitātē, atklāja, ka divu mēnešu ārstēšana ar M.chamomilla ekstraktu ļāva 48 procentiem subjektu uzrādīt ievērojamu uzlabošanos un 40 procentiem ar nelielu uzlabojumu [1]. Pigmentācijas līmeņa izmaiņās, ko mēra ar ∆L vērtībām, visiem pacientiem ar SL pēc 2–3 mēnešu ārstēšanas bija izteikts ∆L vērtības pieaugums par diviem, kas ir acīmredzami atpazīstams līmenis. No 0, 1 līdz 2 mēnešiem pēc ārstēšanas bija ievērojams pigmentācijas līmeņa samazinājums, ko mēra ar ∆L vērtībām (7. attēls). Kopumā klīniskais novērtējums trīs mēnešus atklāja, ka ārstēšana ar M. chamomilla ekstraktu izraisīja ievērojamu uzlabošanos 42 procentiem subjektu, 12 procentiem – mērenu uzlabošanos un 25 procentiem – nelielu uzlabojumu. Cits klīniskais pētījums, kas tika veikts divās saistītās dermatoloģiskās slimnīcās Tokijā, parādīja, ka ārstēšana ar M. chamomilla ekstraktu pakāpeniski samazināja pigmentāciju, un pēc sešiem mēnešiem aptuveni 70 procentiem subjektu novēroja vairāk nekā nelielu uzlabojumu, tostarp 10 procentiem pazušanu un 15 procentiem ievērojamus uzlabojumus. . Bija divi gadījumi, kad SL pilnībā izzuda pēc aptuveni sešu mēnešu ārstēšanas, ∆L vērtībām palielinoties līdz 8,4 un 6,9 pēc sešu mēnešu ārstēšanas (8. attēls) [1].

Visbeidzot, attiecībā uz SL terapeitiskajām pieejām, bloķējot būtisku melanogēno intracelulāro signālu pārraidi, iepriekš minētie klīniskie pētījumi liecina, ka ar EDN1 / EDNBR saistītās signalizācijas bloķēšana ir efektīva SL terapija bez hipopigmentācijas efektiem.

5.2. Tirozināzes aktivitātes inhibēšana

Tirozināzes aktivitātes inhibēšana ir vēl viena pieeja hiperpigmentācijas uzlabošanai SL, kurai ir iespējami hipopigmentācijas trūkumi, taču potenciālais ieguvums ir arī efektīvai ādai, kas nav bojāta. Tā kā balināšanas līdzekļi parasti ir paredzēti UVB melanozes ārstēšanai, nav veikts klīnisks dubultmaskēts pētījums par balināšanas līdzekļu iespējamo pretpigmentācijas iedarbību uz SL. Mēs veicām dubultmaskētu pussejas pētījumu ar 27 japāņu brīvprātīgajām sievietēm ar SL. Šajā klīniskajā pētījumā losjoni ar vai bez 6% L-askorbāta{8}}fosfāta 3 Na (APS) (attiecīgi testa losjons/placebo losjons) tika lokāli uzklāti uz sejas divas reizes dienā 24 nedēļas [45]. Reprezentatīvās subjektu Nr. 012 un Nr. 016 sejas fotogrāfijas pirms un pēc ārstēšanas parādīja, ka ar testa losjonu apstrādāto SL pigmentācijas līmenis nedaudz pazeminājās vienlaikus ar nelielu samazināšanos ar testa losjonu apstrādāto nebojāto ādu [ 45]. Turpretim ar placebo losjonu apstrādāto SL un nebojātās ādas pigmentācijas līmenis nemainījās. Lai gan L vērtības ar testa losjonu apstrādāto SL ievērojami palielinājās pēc 24 nedēļu ilgas ārstēšanas, L vērtības ar placebo losjonu apstrādātajām SL palika nemainīgas (9. attēls) [45]. Salīdzinot oL vērtības pirms un pēc ārstēšanas, atklājās ievērojami augstāks rādītājs. oL vērtība testa losjoniem apstrādātajos SL nekā placebo losjonos apstrādātajos SL (9. attēls). Šie atklājumi liecina, ka APS saturošajam testa losjonam bija ievērojami spēcīgāka pretpigmentācijas iedarbība uz SL nekā placebo losjonam. Lai gan L vērtības ar testa losjonu apstrādātajā nebojātajā ādā ievērojami palielinājās pēc 24 nedēļu ilgas ārstēšanas, L vērtības ar placebo losjonu apstrādātai nebojātai ādai palika nemainīgas. Salīdzinot oL vērtības pirms un pēc apstrādes, atklājās ievērojami augstāka oL vērtība nebojātai ādai, kas apstrādāta ar testa losjonu, nekā ar placebo losjonu apstrādātai nebojātai ādai [45]. Šie atklājumi liecina, ka testa losjonam bija ievērojami spēcīgāka balinošā iedarbība uz ādu bez bojājumiem nekā placebo losjonam. Salīdzinot pretpigmentācijas efektu starp SL un ādu bez bojājumiem, atklājās, ka, lai gan starp pirms un pēc apstrādes ar testa losjonu SL bija ievērojami augstākas oL vērtības nekā nebojātajai ādai, oL vērtības bija līdzīgā līmenī. SL un nebojātā ādā bez būtiskas atšķirības starp tām [45].

Cistanche inhibē tirozināzes aktivitāti.

Attiecība starp L vērtībām un melanīna indeksiem visiem mērījumiem šī klīniskā pētījuma laikā atklāja nozīmīgu korelāciju starp tiem abiem. Šis rezultāts liecināja, ka 2.0 ∆L vērtība bija aptuveni līdzvērtīga 20 ∆ melanīna indeksam ar 10-reizi lielāku jutību melanīna indeksā nekā L vērtība. Salīdzinot L vērtības un melanīna indeksus katram mērījumam 0. un 24. nedēļā SL, atklājās būtiskas korelācijas. Šie L vērtību un melanīna indeksu salīdzinājumi liecināja, ka ar testa losjonu apstrādātajos SL bija izteikta sadalījuma maiņa uz gaišāku krāsu, piemēram, lielāku L vērtību un mazāku melanīna indeksu, turpretim placebo losjonā nebija tik izteiktas sadalījuma izmaiņas. -apstrādāti SL [45].

Noslēgumā jāsaka, ka attiecībā uz terapeitisko pieeju SL, izmantojot tirozināzes inhibitoru, iepriekšminēto atradumu summa skaidri norāda, ka APS ir vāja, bet nozīmīga pretpigmentācijas iedarbība uz SL un ievērojama balinoša iedarbība pat uz normālas krāsas veselīgu ādu, bez hipopigmentācijas efekta.

6. Secinājumi

Noslēgumā jāsaka, ka attiecībā uz melanocītu aktivācijas mehānismiem un SL terapeitisko lokālo ārstēšanu, pamatojoties uz iepriekš minētajiem atklājumiem par melanocītu aktivācijas mehānismu SL, kā arī uz klīnisko efektivitāti, kas iegūta, izmantojot EDN signālu blokatoru un tirozīnazes inhibitoru, ir stingri ieteicams kombinēt EDN signālu blokators un tirozināzes inhibitors ir vēlama SL terapija.

cistanche tabletes

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, noklikšķiniet uz attēla.