Melatonīns novērš T-limfocītu infiltrāciju hipertensijas žurku nierēs, ko izraisa diēta ar augstu sāls saturu, novēršot CXCR3 ligandu ķīmokīnu ekspresiju

Plašāka informācija:ali.ma@wecistanche.com

Ariels Bīrs¹, Rawan Khashab², Jehonatans Šarabi^1,2,3, Ehuds Grosmans^1,2,3un Avšaloms Leibovics^1,2,3,*

¹Medicine D, Chaim Sheba medicīnas centrs, Tel-Hashomer 5262000, Izraēla; arielbier@gmail.com (AB);Yehonatan.Sharabi@sheba.health.gov.il (YS); Ehud.Grossman@sheba.health.gov.il (EG)² Hypertension Unit, the Chaim Sheba Medical Center, Tel-Hashomer 5262000, Israel;rawankhasbab@gmail.com³Sackler Medicīnas fakultāte, Telavivas Universitāte, Telaviva 6997801, Izraēla*

Kopsavilkums: Iepriekšējā pētījumā mēs to parādījāmmelatonīnsnovēršnieresbojājumi sāls izraisītas hipertensijas modelī, samazinot oksidatīvo stresu. Mēs izvirzījām hipotēzi, ka šis efekts ietver melatonīna imūnmodulējošās īpašības. In vivo Study-Dahl sāls jutīgās (DSS) žurkas tika barotas ar parasto ēdu, diētu ar augstu sāls saturu (HSD) vai HSD unmelatonīns(30 mg/kg/dienā) savā ūdenī astoņas nedēļas.Nierestika savākti tūlītējai limfocītu izolācijai un raksturošanai ar plūsmas citometriju (CD3 plus CD4 plus un CD3 plus CD8 plus) un limfocītu ķīmijatraktantam (galvenokārt CXCLķīmokīni) gēnu ekspresijas pētījumi. In vitro pētījumā ar žurkām mezangiālās šūnas (RMC) tika kultivētas barotnē ar augstu sāls saturu bez un armelatonīns. HSD bija saistīta ar ievērojamu CD4 plus un CD8 plus T limfocītu renalinfiltrāciju, salīdzinot ar kontroli. Melatonīns ievērojami samazināja nieru limfocītu infiltrāciju. HSD ievērojami palielināja CXCL mRNS ekspresijuķīmokīni.Melatonīna pievienošana HSD šo efektu atcēla. RMC šūnu apstrāde ar sāli palielināja CXCL10 un CXCL11 ekspresiju, bet ne CXCL9. Pievienošanamelatonīnsuz barotnēm novērsa šo pieaugumu. Ar HSD barotu žurku ārstēšana ar melatonīnu samazināja nieru limfocītu ķīmijatraktantu RNS ekspresiju un ir saistīta ar ievērojamu nieru T limfocītu infiltrācijas samazināšanos. Sālim var būt tieša ietekme uz kemokīnu ražojošām nieru šūnām, ko mazina ārstēšana ar melatonīnu.

Atslēgvārdi:melatonīns; sāls; T-limfocīti; hipertensija;nieres; CXCL 9; CXCL 10; CXCL 11

1. Ievads

Hipertensija (HTN) ir vadošais modificējams kardiovaskulārais riska faktors. Iedzīvotāju novecošanas dēļ HTN izplatība nepārtraukti pieaug, sasniedzot līdz pat 30 procentiem progresīvos gados [1]. Neskatoties uz dažādām medicīniskām terapijas iespējām, HTN kontrole visā pasaulē ir vāja. Nekontrolēta HTN sekas ir postošas, radot milzīgu negatīvu ietekmi uz sabiedrības veselību [2].

HTN patoģenēzē ir iesaistīti dažādi uzvedības, vides un ģenētiskie faktori. Augstais sāls saturs Rietumu diētās ir bijis galvenais HTN veicinātājs, un tas ir saistīts ar palielinātu saslimstību un mirstību. Vadlīnijas un publicitātes iesaka samazināt sāls uzņemšanu plašai sabiedrībai. Tomēr ne katrs indivīds var gūt labumu no šī ierobežojuma, jo patofizioloģija, kas savieno sāls jutību ar HTN, nav pilnībā izprotama, un tai ir nepieciešama uzlabota mehāniskā izpratne [3]. Tādējādi jaunas stratēģijas ir ļoti svarīgas labākai HTN izpratnei un kontrolei, padarot jaunas pētniecības paradigmas tūlītēju nepieciešamību.

Ir konstatēts, ka iekaisums un oksidatīvais stress ir iesaistīti būtiskā HTN patoģenēzē. Pētot ierosinātājus, kas ierosina un turpina šos procesus, daudzi eksperimentālie HTN modeļi liecina par adaptīvās imūnreakcijas iesaistīšanos [4].

Noklikšķiniet, laiCistanche ieguvumi un blakusparādības nieru darbībai

Pazīmes, kas savieno adaptīvo imunitāti ar HTN, pastāv jau kopš 1960. gadiem. Tomēr tikai pēdējā laikā, labāk izprotot imūnsistēmu, šajā virzienā varēja panākt progresu. Novatorisks pētījums, ko veica Guzik et al. pierādīja, ka angiotenzīna (Ang) II vai deoksikortikosterona (DOC) sāls HTN tika nomākts rag1-/-pelēm, kurām ir T un B limfocītu deficīts, un T, bet ne B šūnu pārnešana var atjaunot BP reakciju [5]. Kopš šī raksta tika konstatēts, ka dažādi adoptīvās imunitātes komponenti ir saistīti ar HTN patoģenēzi lielākajā daļā parasto dzīvnieku modeļu. T šūnu loma sāls izraisītajā HTN modelī ir arī plaši pētīta. In vitro pētījumi liecina, ka sāls var virzīt naivu T šūnu diferenciāciju TH17 šūnās [6]. Daudzos in vivo darbos ar augstu sāls diētu (HSD) izraisītiem HTN modeļiem, piemēram, žurkām, kas ir jutīgas pret Dhal sāli (DSS), ir novērojama plaša nieru T šūnu infiltrācija [7–9].

Starp daudzajiem fizioloģiskajiem procesiem,melatonīnsiesaistīšanās asinsspiediena regulēšanā ir zināmā mērā intuitīva. Asinsspiediena diennakts modelis mudina veikt plašus pētījumus par melatonīnu un HTN. Daudzi darbi pagātnē, cilvēkos un eksperimentālos modeļos, saistīja zemu melatonīna līmeni ar HTN [10]. Ir daži klīniskie dati, kas liecina, ka melatonīna papildināšana var ārstēt HTN, galvenokārt pacientiem ar nakts HTN [11]. Tomēr šo datu nekonsekvence rada jautājumus par to, vai ne-diennakts melatonīna īpašības ir saistītas arī ar asinsspiediena regulēšanu.

Melatonīna pretiekaisuma un antioksidanta īpašības liecina, ka melatonīns mijiedarbojas ar imūnsistēmu. Jaunie dati ir saistīti ar melatonīna signālu lomu T šūnu attīstībā, aktivācijā, diferenciācijā un atmiņā. Ir pierādījumi, kamelatonīnsmembrānas un kodola receptori atrodas uz T šūnām [12,13].Melatonīnsietekmē daudzu imūnreakcijā iesaistīto citokīnu veidošanos, piemēram, ainterferonu (IFN), kas ir galvenais Th1 reakcijas regulators [14].

Pēc dažu pētnieku domām, oksidatīvais stress un T šūnu reakcija darbojas, lai veicinātu HTN un orgānu hipertensīvo bojājumu attīstību [15]. Iepriekšējā darbā mēs to parādījāmmelatonīnssamazina vietējo (nieru) oksidatīvo stresu un novērš sāls izraisītu nieru fibrozi un proteīnūriju sāls jutīgā HTN žurku modelī (DSS modelis) [16]. Tā kā oksidatīvajam stresam ir galvenā loma ar HTN saistītajā adaptīvajā imūnreakcijā, mēs izvirzījām hipotēzi, ka melatonīna imūnmodulējošās īpašības ir atbildīgas par tā aizsargājošo lomu HSD izraisītajā HTN.

Šī pētījuma mērķis ir novērtēt, vaimelatonīnssamazina sāls izraisīto T šūnu reakciju un izskaidro mehānismus, kas ir atbildīgi par šo efektu.

2. Materiāli un metodes

2.1. Dzīvnieki un pētījuma protokols

Pētījuma protokolu apstiprināja Izraēlas Šebas medicīnas centra institucionālā dzīvnieku ētikas komiteja. Viņu veselības stāvoklis tika uzraudzīts, mērot ķermeņa svaru un ikdienas vispārīgus novērojumus par katra dzīvnieka kustību un veselības stāvokli. Dāla sāls jutīgu žurku tēviņi, četras nedēļas veci (RGD Cat# 1582190, RRID: RGD_1582190), tika novēroti. turēti dzīvnieku novietnē parastos būros (divas žurkas katrā būrī) 22 ◦C ar 14 h gaismas/10 h tumsas ciklu. Žurkas tika uzturētas ar parastu sāls diētu, un tām tika dots krāna ūdens, lai dzertu ad libitum piecu dienu aklimatizācijas periodā. Pēc tam žurkas tika sadalītas trīs grupās (n=8) atbilstoši diētai 8 nedēļu laikā. Saskaņā ar ētikas komitejas teikto, dzīvnieki, kuriem bija slimības un ciešanu pazīmes, bija jāupurē.

Kontroles grupa tika barota ar standarta žurku čau diētu (2018 SC; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) un krāna ūdeni; augsta sāls diētas (HSD) grupa tika barota ar atbilstošu bagātinātu sāls diētu (4 procenti) (TD.120485; Teklad Envigo, Madison, WI, USA) un krāna ūdeni, unmelatonīnsgrupa tika barota ar to pašu bagātinātu sāls diētu (4 procenti) ar melatonīnu (M5250; Sigma, Rehovot, Izraēla) (30 mg/kg/dienā) dzeramajā ūdenī. Periodiski tika mērīts ķermeņa svars un ūdens patēriņš. Pareizais melatonīna daudzums tika izšķīdināts atbilstošā ūdens daudzumā katrā būrī, lai katram dzīvniekam ievadītu pareizo devu. Nulles diena ir HSD un melatonīna patēriņa sākuma diena. Pētījuma beigās žurkas tika nogalinātas ar dziļu anestēziju ar 3% izoflurānu (anestēzijas dziļumu apstiprina pēdas aizmugures saspiešana) unnierestika novāktas. Abas nieres tika izņemtas un izgrieztas. Nieres tika ņemtas plūsmas citometrijas analīzei, izņemot vairākas porcijas, kuras tika ātri izņemtas un ātri sasaldētas šķidrā N2 un uzglabātas –80 ◦C temperatūrā. RNS ekstrakcijai tika izmantoti saldēti audumi.

Cistanche-nieru slimības simptomi

2.2. Reāllaika kvantitatīvā reversās transkripcijas PCR

gēnu mRNS ekspresijas līmeņi tika noskaidrotinieresaudu reāllaika kvantitatīvā reversās transkriptāzes-PCR (qRT-PCR). Kopējā RNS tika ekstrahēta no nieru audiem, izmantojot NucleoSpin RNA komplektu (MACHERY-NAGEL, Düren, Vācija). Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot Applied Biosystems High-Capacity cDNAReverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, ASV). qRT-PCR reakcijas tika veiktas, izmantojot Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Warrington, UK) un Applied Biosystems 7500 reāllaika PCR sistēmu. Cikla apstākļi bija šādi: pirmais solis 95 ◦C temperatūrā 0,20 minūtes un pēc tam 40 kausēšanas cikli 3 s 95 ◦C temperatūrā un pagarināts 30 s posms 60 ◦C temperatūrā. 40 ciklu beigās tika veikta kausējuma līkne. Ribosomu proteīna sānu kātiņa apakšvienības P0 (Rplp0) mRNS tika izmantota kā iekšējā kontrole. Primeri ir uzskaitīti 1. tabulā.

1. tabula. Šajā pētījumā izmantoto žurku primeru saraksts.

2.3. T šūnu izolēšana no nierēm

Pēc nieru kapsulas izņemšanas abinierestika sasmalcināti un ķircināti ar 2 ml šļirces virzuli caur 100 µm šūnu sietiņu RPMI 1640, kas satur 2 mML-glutamīnu, 10 procentus FBS, 10 ug/mL DNāzi 1 (cilmes šūnu tehnoloģijas, Kembridža, MA , ASV) un 0,1% IV tipa kolagenāzes (CLS 4, Worthington Decatur, AL, ASV). Šķīdumu inkubēja 25 minūtes 37 ◦C temperatūrā. Mazgāšanas šķīdums (DPBS/2 procenti FBS/2 mM EDTA) tika pievienots nieru homogenātam, lai sasniegtu 45 ml, un filtrēts caur 70 µm šūnu filtru. Šķīdumu centrifugēja ar ātrumu 400 × g/7 min. un granulu suspendēja 5 ml mazgāšanas šķīdumā un filtrēja caur 40 µm šūnu sietiņu un atkārtoti centrifugēja ar ātrumu 400 × g/7 min. Granulas tika atkārtoti suspendētas 3 ml FBS (10 mM EDTA) un pārklātas ar Histopaque -1083 (Sigma, Rehovot, Izraēla) un centrifugētas 20 ◦ C temperatūrā ar ātrumu 400 × g/30 min ar izslēgtu bremzi. Mononukleāro šūnu slānis, kas atrodas virs Histopaque, tika noņemts, divreiz mazgāts ar mazgāšanas šķīdumu un suspendēts 5 ml mazgāšanas šķīdumā plūsmas citometriskai analīzei.

2.4. Plūsmas citometrija

No katras grupas,nierestika analizētas 5–7 žurkas. Katram paraugam tika ņemtas 1 × 106 šūnas. Izolētas mononukleārās šūnas tika inkubētas ar ārpusšūnu marķieriem: anti-CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-0030-82, RRID:AB_465493) un tā izotipa kontroli (Thermo Fisher Scientific Cat# 12-4742-41, RRID). :AB_10753770), anti-CD4 (Thermo FisherScientific Cat# 17-0040-80, RRID:AB_1210581) un tā izotipa kontrole (Thermo Fisher Scientific Cat# 17-4724-81, RRID: AB_470188), anti-CD8 (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-0084-82, RRID:AB_10548361) un tā izotipa kontrole (Thermo Fisher Scientific Cat# 25-4714-80,RRID: AB_657914). Visas šūnas tika analizētas ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur Flow Cytometry System, RRID: SCR_000401), izmantojot FlowJo programmatūru (FlowJo, RRID: SCR-008520).

Cistanche-nieru funkcija

2.5. Šūnu kultūra

Žurku mezangiālā šūnu līnija RMC (ATCC Cat# CRL{{0}}, RRID: CVCL_0506) tika iegūta no ATCC®. Šūna tika kultivēta Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (01-055-1A, biological Industries, Beit HaEmek, Izraēla) ar 4 mM L-glutamīnu, kas pielāgots 1,5 g/l nātrija bikarbonāta un 4,5 g/l glikozes un papildināts ar 0,4 mg/mLG418 un 15 procenti liellopu augļa seruma. Melatonīns tika iegūts no Sigma (M5250 Rehovot, Izraēla). A 250 mMmelatonīnsizejvielas tika izgatavotas etanolā. Šūnas tika kultivētas normālos vai ar augstu sāls saturu (barotnei pievienojot 80 mM NaCl) bez vai ar melatonīnu (0,5 mM). Melatonīna apstrāde tika noteikta 45 minūtes pirms NaCl pievienošanas barotnei. Visi eksperimenti tika veikti 6 iedobju plāksnēs ar 3 × 105 šūnām katrā iedobē, un tos veica 6 neatkarīgi izmēģinājumi.

2.6. Statistiskā analīze

Dati tiek parādīti kā vidējais ± SEM. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot IBMSPSS Statistics, RRID: SCR_019096. Vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA) un posthoc Tukey metode pārbaudīja atšķirības starp grupām. Reāllaika qPCR dati tika analizēti, izmantojot DataAssist, RRID: SCR_014969.

3. Rezultāti

3.1. Melatonīns aizsargā žurkas, kas patērē HSD

Žurku vecums šī pētījuma laikā bija 4–13 nedēļas. Šajā vecumā par žurku labsajūtu liecina svara pieaugums, ko uzrādīja kontroles grupa [17]. Tomēr HSD grupa sasniedza plato 30. dienā un pievienojotmelatonīnsHSD uzlaboja šo parādību (1.A attēls). HSD grupai eksperimenta periodā bija augsts mirstības līmenis, kur 50 procenti žurku nomira vai tām bija klīnisks stāvoklis, kad saskaņā ar dzīvnieku ētikas komitejas noteikumiem bija nepieciešama eitanāzija. Melatonīna piedevas ievērojami novērsa žurku mirstību, kur tikai viena no astoņām žurkām nomira 58. dienā eksperimenta perioda beigās (1.B attēls).

1. attēls.Melatonīnsuzlabojās asinsspiediens un izdzīvošana HSD. DSS žurkas tika ārstētas 9 nedēļas ar HSD ar un bez melatonīna. Diēta ar augstu sāls saturu samazināja ķermeņa svaru no 36. dienas, un melatonīns mazināja šo efektu (A). HSD palielināja mirstības līmeni no 4. dienas0. HSD-fedrātu ārstēšana ar melatonīnu uzlabo to izdzīvošanu. (B). (n=8) *-p Mazāks vai vienāds ar 0,05 sāls un sāls plus melatonīns pret kontroli. #-p Mazāks vai vienāds ar 0,05 sāls pret kontroles un sāls plus melatonīns. HSD — diēta ar augstu sāls saturu.

3.2. Melatonīns novērš nieru T šūnu infiltrāciju, ko izraisa HSD

Mēs izolējām šūnas nonieresun piesaistīja tos T šūnu marķierim CD3. CD3 plus šūnas tika piesaistītas CD4 un CD8. Gan CD3 plus CD4 plus, gan CD3 plus CD8 plus bija ievērojami augstāki HSD (attiecīgi 5,18 ± 1,62 un 4,6 ± 0,75 procenti), salīdzinot ar kontroli (0,16 ± {{18}). }.{{20}}attiecīgi 2 un 0,95 ± 0,15 procenti) unmelatonīnsHSD papildinājums samazināja gan CD3 plus CD4 plus, gan CD3 plus CD8 plus šūnas atpakaļ līdz kontroles līmenim (attiecīgi 0.68 ± 0.21 un 1.37 ± 0.45) (attēls 2A–D).

2. attēls. Melatonīns novērš T šūnu infiltrāciju uznieres. T šūnas tika izolētas no žurku nierēm un tika noteiktas CD3. CD3-pozitīvās šūnas tika noteiktas attiecībā uz CD4 un CD8. Melatonīns (C) samazināja gan CD3 plus CD4 plus, gan CD3 plus CD8 plus, salīdzinot ar HSD bez melatonīna (B), neatšķiroties no kontroles grupas (A). Analīze visām žurkām ir parādīta (D) (n=7–8). HSD — diēta ar augstu sāls saturu. *-p Mazāks vai vienāds ar 0.05 pret kontroli. #-p Mazāks vai vienāds ar 0,05 pret sāli plus melatonīnu.

3.3. Melatonīns samazina noteiktus nieru chemokīnus, kas tika pārregulēti HSD

T šūnu piesaisti iekaisuma audos regulē vietējā ķīmokīna ekspresija. Tāpēc mēs izmērījām divu ķemokīnu ģimeņu ekspresiju žurkāmnieres: ķemokīna (CXC motīvs) ligandu (CXCL) saime un ķemokīna (C-Cmotif) ligandu (CCL) saime.

CXCL saimei CXCL 9, 10 un 11, kas piesaista T šūnas to mērķa audiem, izmantojot CXCR3 receptoru uz T šūnām, HSD žurkām tika ievērojami paaugstināti. Papildinājumsmelatonīnslīdz HSD samazināja to ekspresiju atpakaļ līdz kontroles līmenim. Tāds pats modelis tika konstatēts CXCL 1 un 16. Tomēr CXCL12 gadījumā HSD netika konstatēta augšregulācija (3.A attēls).

CCL saimei CCL 2, 4, 12, 17, 19 un CX3CL1 neuzrādīja paaugstinātu HSD regulējumu. CCL3 tika paaugstināts HSD gadījumā, bet būtiskas izmaiņas netika konstatētas, pievienojot diētai melatonīnu. Attiecībā uz CCL7 — ievērojams HSD regulējums un ievērojams pazeminājums, pievienojotmelatonīnstika konstatēts HSD (3.B attēls).

3. attēls. AugšupregulēšananieresķīmokīniHSD ar un bez melatonīna. Žurkām tika noteikta ķīmokīna (CXC motīvs) ligandu (CXCL) saimes (A), ķemokīna (CC motīvs) ligandu saimes un CX3CL1 (B) ekspresija. (n=7–8) *-p Mazāks vai vienāds ar 0.05 pret kontroli. #-p Mazāks vai vienāds ar 0,05, salīdzinot ar sāli un melatonizāciju. HSD — diēta ar augstu sāls saturu.

3.4. Melatonīna tiešā ietekme uz RMC mezangiālo šūnu līniju

Pēc tam mēs koncentrējāmies uz CXCL9, 10 un 11, kas piesaista T šūnas, saistoties ar receptoru CXCR3. Mēs noteicām šo izteiksmiķīmokīniRMC šūnās, kas ir žurku mezangiālā šūnu līnija.

Mēs apstrādājām šūnas ar 80 mM NaCl bez un ar 0,5 mMmelatonīns. Šī NaCl koncentrācija ievērojami palielināja CXCR10 ekspresiju par 2,4 ± 0.26- reizes, salīdzinot ar kontroli, un 0,5 mM melatonīna pievienošana ievērojami samazināja šī izteiksme ir 1,4 ± 0.{{10}} reizes, salīdzinot ar kontroli (4.A attēls). CXCL11 gadījumā 80 mM NaCl ievērojami palielināja ekspresiju par 3 ± 0.{16}}reizēm, salīdzinot ar kontroli, un 0,5 mM melatonīna pievienošana ievērojami samazināja šo izteiksmi līdz 1,8 ± 0.{22 }}reizi, salīdzinot ar kontroli (4.B attēls). CXCL9 RMC šūnās netika atklāts.

4. attēls. Sāls pārregulēja CXCL10 un CXCL11 ekspresiju mezangiālajā šūnu līnijā, kur melatonterapija pazemināja tās ekspresiju. RMC (žurku mezangiālā šūnu līnija) apstrādāja ar 80 mM sāli ar un bez 0, 5 mM melatonīna. CXCL10 (A) un CXCL11 (B) tika regulēti, apstrādājot ar sāli un pievienojotmelatonīnssamazināt šo regulējumu. Grafikos parādīti 6 neatkarīgi izmēģinājumi. *-p Mazāks vai vienāds ar 0.001 pret kontroli #-p Mazāks vai vienāds ar 0.005 pret sāls 80 mM un melatonīns 0,5 mM. $-p Mazāks vai vienāds ar 0,05 pret sāli 80 mM un melatonīnu 0,5 mM.

4. Diskusija

Labvēlīgā ietekmemelatonīnsPar HTN tika pierādīts iepriekšējos pētījumos un tika ierosināts kā iespējamais darbības veids pret ārstēšanu rezistentu HTN [18]. Pirmajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz oksidatīvo stresu un atklājām, ka melatonīns samazina HSD izraisīto oksidatīvo stresu. Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz adaptīvo imūno efektu un parādījām, ka melatonīns uzlabo ar HSD barotu žurku izdzīvošanu. Šis efekts ir saistīts ar T šūnu skaita samazināšanos, kas infiltrējas nierēs, un pazeminātu to regulēšanunieresķīmokīna ekspresija.

Vēsturiskie dati liecina, ka DSS žurkām, kas patērē HSD, attīstās smags HTN un tām ir augstāks mirstības līmenis [19]. Pats Dāls, izstrādājot modeli, ziņoja, ka, kad DSS žurkām atšķiršanas laikā (21–23 dienu vecumā) tika uzlikts HSD (8% NaCl), tām ātri attīstījās HTN un visas nomira līdz 16. sāls barošanas nedēļai [20]. Vēlāk, pēc dažām celma modifikācijām, Rapp et al. ziņoja, ka visas žurkas bija mirušas astoņu nedēļu laikā pēc HSD (8 procenti NaCl) [21]. Mūsu pētījumā iesaistītajām žurkām bija augsts mirstības līmenis, taču tās nesasniedza 100 procentus, iespējams, tāpēc, ka to uzturā ir mazāks sāls daudzums (4 procenti). Tomēr ir skaidrs, kamelatonīnsPapildinājumi ievērojami novērsa mirstību.

Svara pieaugums ir žurku labklājības marķieris 4–13 nedēļu vecumā. DSS žurkas ir cēlušās no Sprague Dawley, kas ir labi raksturots celms. Žurku vecumā, ko izmantojām savos eksperimentos, žurkām vajadzētu pastāvīgi pieņemties svarā [22]. Daudzos pētījumos ar dzīvniekiem svara samazināšana tiek uzskatīta par vienu no eksperimentu "gala punktiem" [23]. Vairākos pētījumos ir skaidrs, ka HSD DSS žurkām izraisa zemāku svara pieauguma līmeni, salīdzinot ar kontroles grupām [24,25]. Saskaņā ar šiem pētījumiem mēs arī novērojām svara atšķirības starp grupām. Šeit žurkas nepieņēmās svarā pēc četrām HSD nedēļām. Melatonīns apturēja arī šo HSD efektu, jo žurkas, kuras tika ārstētas ar melatonīnu, turpināja pieņemties svarā, lai gan mazāk nekā kontroles.

Spēja parmelatonīnsLai samazinātu asinsspiedienu dzīvnieku modeļos, tika atklāts 20. gadsimta septiņdesmito gadu beigās [26–28]. Kopš tā laika par to ziņots vairākos citos modeļos, piemēram, ka diēta ar augstu fruktozes saturu spontāni hipertensīvām žurkām izraisa metabolisko sindromu [29,30]. Mūsu pētījumi šajā jomā ir pirmie, kas parāda, ka melatonīnam ir nozīme sāls izraisītā HTN, novēršot orgānu bojājumus un samazinot mirstību.

Šajā pētījumā mēs parādījām, ka HSD izraisa T limfocītu infiltrāciju uznieres, procesu, ko DSS žurkām galvenokārt aprakstījusi Metsona grupa [31–33]. Šī infiltrācijas procesa galvenā loma DSS modelī ir pierādīta nesenā pētījumā, kurā tika novērots, ka DSS žurkas, kurām trūkst T-šūnu, ir aizsargātas no HTN, ko izraisa HSD un splenocītu pārnešana, saasina sāls jutīgo HTN [34].

Melatonīns var ietekmēt T šūnas dažādos aspektos (pārskatu sk. [35]). Šis pētījums pirmo reizi to parādījamelatonīnssamazina gan CD4 plus, gan CD8 plus Tšūnu piesaistinieresHSD. Šis melatonīna efekts var būt mehānisms, kas pasvītro tā labvēlīgo ietekmi šajā modelī.

Melatonīna spēja samazināt T šūnu infiltrāciju ir aprakstīta eksperimentālajā autoimūnā encefalomielīta (EAE) peļu modelī. EAE gadījumā tika pierādīts, ka melatonīns samazina CD4 plus T šūnu un Th17 šūnu infiltrāciju CNS [36, 37].

T šūnu piesaisti konkrētiem audiem galvenokārt regulē vietējā augstā koncentrācijaķīmokīnikas ir ķīmijaktiskie citokīni, kas kontrolē imūno šūnu migrācijas modeļus un izvietojumu. Divas lielas ķemokīnu ģimenes, kas izraisa T šūnu infiltrāciju, ir CXC motīvu ligandu (CXCL) un CC motīvu ligandu (CCL) ķemokīnu ģimenes [38].

Cistanche nieru disfunkcijas uzlabošanai

Mūsu pētījumā mēs neatradām nemainīgu modeli CCL ģimenes reakcijā uz HSDun uzmelatonīns. No deviņiemķīmokīnišajā ģimenē tika novērots, ka tikai CCL7 un CLL21 palielina to ekspresiju HSD dēļ, un melatonīna papildināšana to samazināja. HSD palielināja CCL3 ekspresiju, bet ar melatonīnu ārstētām žurkām samazinājums netika konstatēts. Nesen veikts pētījums ar to pašu modeli ir parādījis, ka HSD pārregulē CCL2 iekšienēnieresizmantojot RNA-Seq metodi [39]. Tomēr šajā pētījumā tika pārbaudīts līmenis 3. un 21. dienā pēc diētas sākuma. Mūsu pētījumā mēs pārbaudījām līmeņus pēc astoņām nedēļām. Iespējams, ka ķīmokīna ekspresija mainās HSD periodā.

Un otrādi, lielākajai daļai CXCL saimes, tostarp CXCL 1, 9, 10, 11 un 16, līmenis palielinājās ar HSD ārstētām žurkām unmelatonīnspapildinājums atcēla šo pieaugumu. Tikai CXCL12 nepalielināja reakciju uz HSD.

CXCL9, CXCL10 un CXCL11, kas nosaukti par "interferonu inducējamiem CXC ķemokīna receptoru 3 ligandiem", tiek inducēti ar IFN- un tie ir CXC ķemokīna receptora 3 (CXCR3) ligandi. In vivo pētījumi ir pierādījuši to nozīmi T limfocītu aktivizēšanā un piesaistē mērķa orgānam [40–42]. Youn et al. cilvēkiem ar hipertensiju tika konstatēta gan T šūnu infiltrācija nierēs, gan paaugstināts visu trīs CXCR3 līmenis cirkulācijā.ķīmokīni, kas liecina, ka CXCR3 un tā ligandi ir svarīgi T šūnām, kas iesaistītas cilvēka HTN [43]. Cits pētījums parādīja, ka CXCL10 ir paaugstināts hipertensijas pacientiem, un tā līmenis ir saistīts ar viņu asinsspiediena vērtībām [44].

Šo pētījumu dēļ mēs koncentrējāmies uz CXCL9, CXCL10 un CXCL11. Mēs kultivējām mezangiālo žurku šūnu līniju un apstrādājām tās ar 80 mM NaCl un 0,5 mM melatonīnu. Mēs atklājām, ka CXCL 10 un 11 šūnās ir pārregulēti un melatonīns atceļ šo paaugstināšanos. Mūsu rezultāti liecina, ka sāls ietekme uz CXCL 10 un 11 paaugstināšanu un pretēja ietekmemelatonīns, abi tika tieši atklāti mezangiālajās šūnās. Turpretī CXCL9 šajās šūnās netika atklāts.

Mūsu pētījumam ir ierobežojumi. Mūsu FACS rezultātos daudzi CD3 plus bija dubultnegatīvi gan CD4, gan CD8. Tie paši rezultāti bija redzami Metsona pētījumā no 2010. gada [31]. Tomēr jaunākajos Metsona grupas pētījumos CD3 plus CD4-CD8-šūnu bija ļoti maz [32,33,45,46]. Būtisks dubulto negatīvo CD3 šūnu samazinājums varētu būt CD45 marķiera pievienošanas rezultāts un tikai to šūnu analīze, kas bija CD45 pozitīvas, kā tas tika veikts vēlākajos Mattsona pētījumos. Iespējams, ka CD3 plus CD4-CD8- lielā populācija ir artefakts. Tomēr CD3 plus CD4 plus un CD3 plus CD8 plus šūnu populācijai nav zināms neviens artefakts.

5. Secinājumi

Noslēgumā jāsaka, ka diēta ar augstu sāls saturu ir saistīta ar T šūnu infiltrācijunieresDSS žurkām. Sāls arī palielināja specifisku T šūnu ķīmijatraktantu ekspresiju nierēs. Ārstēšana armelatonīns(30 mg/kg/dienā) atcēla šīs sekas (melatonīnssamazina HSD izraisītu T šūnu infiltrāciju nierēs, kā arī samazina CXCL3 ligandu ķīmokīna ekspresiju).

Mūsu in vitro pētījums parāda, ka sāls un melatonīns var regulēt ķīmisko atraktantu ekspresiju, tieši ietekmējotnieresšūnas.

Autora ieguldījums: Conceptualization, AL; formālā analīze, AB un RK; izmeklēšana, RK;metodika, AB un AL; rakstīšana — oriģinālais melnraksts, AB un AL; rakstīšana — pārskatīšana un rediģēšana, YSand EG Visi autori ir izlasījuši manuskripta publicēto versiju un piekrituši tai.

Finansējums: Šis pētījums nesaņēma ārēju finansējumu.

Institucionālās pārskata padomes paziņojums: Pētījuma protokolu apstiprināja institucionālā dzīvnieku ētikas komiteja Sheba medicīnas centrā, protokols Nr. 1219/19/ANIM un Veselības ministrijas protokols Nr. 16418.

Informētas piekrišanas paziņojums: Nav piemērojams.

Paziņojums par datu pieejamību: šajā pētījumā sniegtie dati ir pieejami pēc attiecīgā autora pieprasījuma.

Pateicības: Autori pateicas Zehava Shabtai par viņas lielisko tehnisko atbalstu un Maikls Kanovskis par viņa redakcionālajiem pakalpojumiem.

Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Olsens, MH; Angell, SY; Asma, S.; Boutouyrie, P.; Burger, D.; Chirinos, JA; Damasceno, A.; Delles, C.; Gimenez-Roqueplo, AP; Hering, D.; un citi. Aicinājums uz rīcību un dzīves cikla stratēģija, lai risinātu globālo paaugstināta asinsspiediena radīto slogu pašreizējām un nākamajām paaudzēm: Lancet komisija par hipertensiju. Lancet 2016, 388, 2665–2712. [CrossRef]

2. O'Braiens, E. Lanceta komisija hipertensijas jautājumos: paaugstināta asinsspiediena globālā sloga risināšana pašreizējām un nākamajām paaudzēm. Dž.Klins. Hipertensijas 2017, 19, 564–568. [CrossRef]

3. O'Donels, M.; Mente, A.; Yusuf, S. Nātrija uzņemšana un sirds un asinsvadu veselība. Circ. Res. 2015, 116., 1046.–1057. [CrossRef]

4. Schiffrin, EL Mazo artēriju pārveidošanas mehānismi, antihipertensīvā terapija un imūnsistēma hipertensijas gadījumā.Klin. Izpētīt. Med. 2015, 38, E394–E402. [CrossRef]

5. Guziks, TJ; Hoch, NE; Brauns, KA; McCann, LA; Rahmans, A.; Dikalovs, S.; Goronzijs, Dž.; Veyand, C.; Harisons, ĢD Tšūnas loma angiotenzīna II izraisītas hipertensijas un asinsvadu disfunkcijas ģenēzē. J. Exp. Med. 2007, 204, 2449–2460. [CrossRef][PubMed]

6. Kleinevietfeld, M.; Menzels, A.; Tice, J.; Kvakans, H.; Josefs, N.; Linker, RA; Mullers, DN; Hafler, DA. Nātrija hlorīds izraisa autoimūnu slimību, inducējot patogēnas TH17 šūnas. Daba 2013, 496, 518–522. [CrossRef]

7. Metsons, DL; Lunds, H.; Guo, C.; Rudemillers, N.; Geurts, AM; Jacob, H. Rekombināciju aktivizējošā gēna 1 ģenētiskā mutācija Dahl sāls jutīgajās žurkās mazina hipertensiju un nieru bojājumus. Am. J. Physiol. Regul. Vesels skaitlis. Comp. Fiziol. 2013, 304, 407–414.[CrossRef]

8. Mattson, DL Infiltrating immune cells in thenieresSāls jutīgas hipertensijas un nieru bojājumu gadījumā. Am. J. Physiol. Ren. Physiol.2014, 307. [CrossRef] [PubMed]

9. Lu, X.; Crowley, SD iekaisums pret sāli jutīgu hipertensiju un nieru bojājumiem. Curr. Hypertens Rep. 2018, 20. [CrossRef][PubMed]

10. Beikers, Dž.; Kempinski, K. Role ofmelatonīnsasinsspiediena regulēšanā: Papildu antihipertensīvs līdzeklis. Clin. Exp. Pharm.Physiol. 2018, 45, 755–766. [CrossRef] [PubMed]

11. Grosmans, E.; Laudons, M.; Zisapel, N. Melatonīna ietekme uz nakts asinsspiedienu: randomizētu kontrolētu pētījumu metaanalīze. Vasc. Veselības riska pārvaldība. 2011, 7, 577–584. [CrossRef] [PubMed]

12. Pozo, D.; Delgado, M.; Fernandess-Santoss, JM; Kalvo, JR; Gomarizs, RP; Mārtiņš-Lācave, I.; Ortizs, GG; Guerrero, JM Mel1a-melatonīna receptoru mRNS ekspresija limfocītu T un B apakšgrupās no žurku aizkrūts dziedzera un liesas. Faseb J. Off. Publ. Fed.Am. Soc. Exp. Biol. 1997, 11, 466–473. [CrossRef]

13. Gerrero, Dž. M.; Pozo, D.; Garsija-Mauriņjo, S.; Osuna, C.; Molinero, P.; Calvo, JR. Kodolreceptoru iesaistīšanās uzlabotajā melatonīna IL-2 ražošanā Jurkat šūnās. Ann. NY Akad. Sci. 2000, 917, 397–403. [CrossRef] [PubMed]

14. Faress, MF; Mascanfroni, ID; Mendezs-Huergo, SP; Jā, A.; Murugajans, G.; Garo, LP; Balbuena Aguirre, ME; Patels, B.; Ysrraelit, MC; Žu, C.; un citi.MelatonīnsVeicina multiplās sklerozes recidīvu sezonalitāti. Cell 2015, 162, 1338–1352.[CrossRef] [PubMed]

15. Kirabo, A.; Fontana, V.; de Faria, APC; Loperēna, R.; Galindo, CL; Vū, Dž.; Bikinejeva, AT; Dikalovs, S.; Sjao, L.; Chen, W.; et al. DC izoketāli modificētie proteīni aktivizē T šūnas un veicina hipertensiju. Dž.Klins. Izpētīt. 2014, 124, 4642–4656. [CrossRef][PubMed]

16. Leibovics, A.; Volkovs, A.; Vološins, K.; Šemešs, C.; Baršeks, I.; Grossman, E. Melatonīns novēršnierestraumas augsta sāls diētas izraisītā hipertensijas modelī, samazinot oksidatīvo stresu. J. Pineal Res. 2016, 60, 48–54. [CrossRef] [PubMed]

17. Hokinss, P.; Mortons, DB; Bērmens, O.; Dennisons, N.; Honess, P.; Dženingss, M.; Lane, S.; Midltone, V.; Roughan, JV; Wells, S.; et al. Rokasgrāmata laboratorijas dzīvnieku labturības novērtēšanas protokolu noteikšanai un ieviešanai: BVAAWF/FRAME/RSPCA/UFAW kopīgās darba grupas par pilnveidošanu vienpadsmitais ziņojums. Lab. Anim. 2011, 45, 1.–13. [CrossRef]

18. Simko, F.; Reiters, RJ; Paulis, L.Melatonīnskā racionālu alternatīvu rezistentas hipertensijas konservatīvā ārstēšanā.Hypertens Res. 2019, 42, 1828–1831. [CrossRef] [PubMed]

19. Rapp, JP Dahl pret sāli jutīgas un pret sāli izturīgas žurkas. Hipertensija, 1982, 4, 753–763. [CrossRef]

20. Dāls, LK; Knudsens, KD; Heine, MA; Leitl, GJ Hroniskas pārmērīgas sāls uzņemšanas sekas. Eksperimentālās hipertensijas modifikācija žurkām, mainot diētu. Circ. Res. 1968, 22, 11–18. [CrossRef] [PubMed]

21. Rapp, JP; Dene, H. Dāla sāls jutīgu un pret sāli izturīgu žurku inbred celmu attīstība un īpašības. Hipertensijas 1985,7, 340-349. [CrossRef]

22. Brūers, M.; Greisa, M.; Kotz, CM; Koya, V. Sprague Dawley žurku augšanas īpašību salīdzinošā analīze, kas iegūta no dažādiem avotiem. Lab. Anim Res. 2015, 31, 166–173. [CrossRef]

23. Talbot, SR; Biernat, S.; Bleihs, A.; van Diks, RM; Ernsts, L.; Hēgers, C.; Hilgers, SOA; Kēgels, B.; Koska, I.; Kūla, A.; et al. Ķermeņa svara samazināšanas kā humāna mērķa noteikšana: kritisks novērtējums. Lab. Anim 2020, 54, 99–110. [CrossRef] [PubMed]

24. Geška, S.; Krečmers, A.; Šarkovska, Y.; Jevgenovs, OV; Lorencs, B.; Haks, A.; Hočers, B.; Stasch, J.-P. Šķīstošās guanilatciklāzes stimulācija novērš fibrotisko audu remodelāciju un uzlabo izdzīvošanu pret sāli jutīgām Dāla žurkām. PLoS ONE 2011, 6, e21853. [CrossRef] [PubMed]

25. Van, Y.; Mū, Dž. Liu, FQ; Ren, KY; Xiao, HY; Jans, Z.; Yuan, ZY Sāls izraisīta epitēlija-mezenhimāla pāreja pret dālssāli jutīgām žurkām ir atkarīga no paaugstināta asinsspiediena. Braz. J. Med. Biol. Res. Rev. Bras. Pesquisa Med. E Biol. 2014, 47, 223–230.[CrossRef]

26. Holmsa, DR; Sugden, D. Proceedings: Melatonīna ietekme uz pinealektomijas izraisītu hipertensiju žurkām. Br. J. Pharm.1976, 56, 360P–361P.

28. Zanoboni, A.; Zanoboni-Muciaccia, W. Eksperimentālā hipertensija pinealektomizētām žurkām. Life Sci. 1967, 6, 2327–2331. [CrossRef]

28. Zanoboni, A.; Forni, A.; Zanoboni-Muciakia, V.; Zanussi, C. Pinealektomijas ietekme uz arteriālo asinsspiedienu un pārtikas un ūdens uzņemšanu žurkām. J. Endokrinols. Izpētīt. 1978, 1, 125–130. [CrossRef] [PubMed]

29. Pečanova, O.; Ziča, J.; Paulis, L.; Zenebe, V.; Dobesova, Z.; Kojsova, S.; Jendekova, L.; Sládkova, M.; Dovinova, I.; Simko, F., et al. N-acetilcisteīna un melatonīna ietekme uz pieaugušām spontāni hipertensīvām žurkām ar konstatētu hipertensiju. Eiro. J.Pharmcol. 2007, 561, 129–136. [CrossRef] [PubMed]

30. Leibovics, A.; Peļegs, E.; Šarabi, Y.; Šabtajs, Z.; Šamiss, A.; Grosmans, E. Lomamelatonīnshipertensijas patoģenēzē žurkām ar metabolisko sindromu. Am. J. Hypertens 2008, 21. [CrossRef] [PubMed]

31. De Migels, C.; Das, S.; Lunds, H.; Mattson, DL T limfocīti mediē hipertensiju unnieresbojājumi Dāla sāli jutīgiem cilvēkiem. Am. J. Physiol. Regul. Vesels skaitlis. Comp. Fiziol. 2010, 298, R1136–R1142. [CrossRef] [PubMed]

32. Evanss, LC; Petrova, G.; Kurts, T.; Yang, C.; Bukovijs, Dž. Metsons, DL; Cowley, AW Paaugstināts perfūzijas spiediens veicina nieru T-šūnu infiltrāciju Dāla sāli jutīgai žurkai. Hipertensija 2017, 70, 543–551. [CrossRef]

33. Abais-Battad, JM; Alšeiha, AJ; Pan, X.; Fērenbahs, dīdžejs; Dasinger, JH; Lunds, H.; Roberts, ML; Krīgels, AJ; Cowley, AWJ; Kidambi, S.; un citi. Uztura ietekme uz Dāla sāls jutīgu hipertensiju, nieru bojājumiem un T limfocītu transkriptu.Hypertens 2019, 74, 854–863. [CrossRef] [PubMed]

34. Fērenbahs, dīdžejs; Dasinger, JH; Lunds, H.; Zmaj, J.; Mattson, DL Splenocītu pārnešana saasina pret sāli jutīgām hipertensijas infekcijām. Exp. Fiziol. 2020, 105, 864–875. [CrossRef] [PubMed]

35. Ren, V.; Liu, G.; Čens, S.; Iņ, J.; Van, Dž.; Tan, B.; Vu, G.; Bazer, FW; Pengs, Y.; Li, T.; un citi. Melatonīna signalizācija T šūnās: funkcijas un lietojumi. J. Pineal Res. 2017, 62. [CrossRef]

36. Alvaress-Sančess, N.; Kruss-Šamorro, I.; Lopess-Gonzáless, A.; Utrilla, JC; Fernandess-Santoss, JM; Martiness-Lopess, A.; Lardone, PJ; Guerrero, JM; Carrillo-Vico, A. Melatonīns kontrolē eksperimentālo autoimūno encefalomielītu, mainot T efektora/regulācijas līdzsvaru. Smadzeņu uzvedība. Immun. 2015, 50, 101–114. [CrossRef]

37. Čens, S.-J.; Huangs, S.-H.; Chen, J.-W.; Vanga, K.-C.; Yang, Y.-R.; Liu, P.-F.; Lin, G.-J.; Sytwu, H.-K.Melatonīnsuzlabo interleikīna 10 ekspresiju un nomāc ķīmotaksi, lai kavētu iekaisumu in situ un samazinātu eksperimentālā autoimūno encefalomielīta smagumu. Int. Imūnfarmakols. 2016, 31, 169–177. [CrossRef] [PubMed]

38. Grifits, Dž. Sokol, CL; Spīdums, ADĶīmokīniun chemokine receptors: pozicionēšanas šūnas saimnieka aizsardzībai un imunitātei.Annu. Immunol. 2014, 32, 659–702. [CrossRef] [PubMed]

39. Alsheikh, AJ; Dasinger, JH; Abais-Battad, JM; Fērenbahs, dīdžejs; Yang, C.; Koulijs, AWJ; Mattson, DL CCL2 mediē agrīnu nieru leikocītu infiltrāciju sāls jutīgas hipertensijas laikā. Am. J. Physiol. Ren. Fiziol. 2020, 318, F982–F993. [CrossRef][PubMed]

40. Liu, L.; Callahan, MK; Huangs, D.; Ransohoff, RM Chemokine receptors CXCR3: negaidīta mīkla. Curr. Tops. Izstrādātājs Biol.2005, 68, 149–181. [CrossRef] [PubMed]

41. Līgavainis, JR; Spīdums, AD CXCR3 ligandi: liekas, sadarbības un antagonistiskas funkcijas. Immunol. Cell Biol. 2011, 89,207–215. [CrossRef] [PubMed]

42. Van Remdonks, K.; Van den Stīns, PE; Liekens, S.; Van Damme, Dž.; Struyf, S. CXCR3 ligandi slimībā un terapijā. CytokineGrowth Factor Rev. 2015, 26, 311–327. [CrossRef] [PubMed]

43. Youn, J.-C.; Yu, HT; Lims, BJ; Koh, MJ; Lī, Dž.; Čangs, D.-Y.; Choi, YS; Lī, S.-H.; Kangs, S.-M.; Jang, Y.; un citi. Imunosējošs CD8 plus T šūnas un CXC ķīmokīna receptoru 3. tipsķīmokīnipalielinās cilvēka hipertensijas gadījumā. Hypertens 2013, 62, 126–133.[CrossRef] [PubMed]

44. Stumpfs, C.; Auers, C.; Yilmaz, A.; Lewczuk, P.; Klinghammers, L.; Šneiders, M.; Daniels, darba grupa; Šmieders, RE; Garlichs, CD Pacientiem ar esenciālo hipertensiju ir paaugstināts Th1 ķīmijatraktanta gamma-interferona inducējamā proteīna (IP) 10 līmenis. Hypertens Res. 2011, 34, 484–488. [CrossRef] [PubMed]

45. Rudemillers, NP; Lunds, H.; Priestley, JRC; Endres, BT; Prokop, JW; Jēkabs, HJ; Geurts, AM; Koens, EP; Mattson, DL SH2B3 (LNK) mutācija, kas ir genoma mēroga asociācijas pētījuma kandidāts hipertensijai, mazina Dāla sāls jutīgo hipertensiju, izmantojot iekaisuma modulāciju. Hipertensijas 2015, 65, 1111–1117. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Veids, B.; Petrova, G.; Mattson, DL Imūnfaktoru loma angiotenzīna II izraisītā hipertensijā un nieru bojājumos pret dāla sāli jutīgām žurkām. Am. J. Physiol. Regul. Vesels skaitlis. Comp. Fiziol. 2018, 314, R323–333. [CrossRef] [PubMed]