MikroRNS nieru attīstībā un slimībās Ⅲ

MiRNS Vilmsa audzējā

Vilmsa audzējs,vainefroblastoma, ir visizplatītākā bērnībanieru vēzis, ar sastopamību 1 no 10, 000 bērniem Ziemeļamerikā (111). Tā galvenokārt ir sporādiska slimība, lai gan ģimenes formas sastopamas aptuveni 1–2% gadījumu (112, 113). Vilmsa audzēji rodas novirzes nefroģenēzes rezultātā, kad pluripotentie embrionālie nieru prekursori nespēj diferencēties un saglabājas.neparasti pēcdzemdību dzīvē(111, 114, 115). Šie audzēji histoloģiski atgādinaattīstās nieresartraucēta morfoloģija(116), un mutācijas gēnos, kas iesaistīti augļa nefroģenēzē, tostarp WT1 (117–119), CTNNB1 (120), SIX1/2 (121, 122) un TP53 (123, 124), ir saistītas ar aptuveni 40% Vilmsa audzēji (125). Nesenie pētījumi, kuros izmantoja Vilmsa audzēju visa genoma un visa eksoma sekvencēšanu, atklāja jaunas mutācijas vēža riska gēnos (REST, CHEK2, PALB2) (126, 127), gēnos, kas kodē proteīnus, kas mediē histonu modifikācijas nefroģenēzes laikā (BCOR, MAP3K4) (126). ) un miRNS apstrādes gēnus (121, 122, 128, 129).

CIK ILGS IR VAJADZĪGS, LAI CISTANČE STRĀDĀS NIERU SLIMĪBU PACIENTIEM?

Starp miRNS apstrādes gēniem ir ziņots par mutācijām DROSHA, DGCR8, DICER1, TARBP2 un XPO5 (kodē eksportīnu 5) iepriekš neārstētos un ar neoadjuvantu ķīmijterapiju ārstētos Vilmsa audzējos (3. attēls) (121, 122, 128, ). Apmēram 33% pārbaudīto Vilmsa audzēju uzrāda kaitīgas mutācijas miRNS apstrādes ceļa gēnos (128). Atkārtota karstā punkta mutācija (E1147K) DROSHA RNāzes IIIb domēna met al saistošajā (Mg2+) atlikumā, kas, šķiet, ir unikāls Vilmsa audzējam, pārtrauc šī domēna katalītisko aktivitāti, izraisot nepilnīgu. pri-miRNS šķelšanās un samazināta miRNS nobriešana (128). Somatiskās karstā punkta mutācijas, kas ietekmē DICER1 RNāzes IIIb domēnu, pasliktina 5p miRNS apstrādi (tās, kas iegūtas no pre-miRNS matadata 5′-zara) (129) un bieži tiek konstatētas kā "otrās trāpījuma" mutācijas, kas darbojas tandēmā ar DICER1. dzimumšūnu mutācijas, lai izraisītu Vilmsa audzēju ģenēzi DICER1 sindromā (traucējumā, kas palielina jutību pret dažādiem audzējiem) (130–132). Joprojām nav skaidrs, kāpēc traucēta DICER1 funkcija Vilmsa audzējos izraisa noturīgu un novirzītu nefroģenēzi, atšķirībā no Dicer1 zuduma peles nefrona priekštečos, kas izraisa pastiprinātu apoptozi un priekšlaicīgu nefroģenēzes pārtraukšanu (72–75). Dažas iespējamās iespējas ietver to, ka gēna devas aktivitāte varētu būt izšķiroša, lai noteiktu šūnu izdzīvošanu, vai ka mutācijas RNāzes IIIb domēnā var ietekmēt DICER1 miRNS saistīšanās specifiku.

Mutācijas miRNS apstrādes gēnos ir saistītas ar svarīgu miRNS, tostarp miR-200 (121) un let-7 saimes locekļu, pazemināšanos (3. attēls) (121, 129). Ļaujiet-7 miRNS un RNS saistošajam proteīnam Lin28 darboties saskaņoti, lai kontrolētu peles nefroģenēzes pārtraukšanas laiku, iespējams, regulējot augšanu veicinošo gēnu Igf2 (133). Lin28 pārmērīga ekspresija nieru attīstības laikā izraisa nefrogēno priekšteču paplašināšanos, kavējot to galīgo diferenciācijas vilni, kas beidzas ar neoplastisku transformāciju, kas ļoti atgādina cilvēka Vilmsa audzēju (134). Palielināts LIN28B DNS kopiju skaits un let-7a DNS kopiju zudums ir novērots attiecīgi 25% un 46% cilvēka Vilmsa audzēju paraugu (126). Saskaņā ar šiem novērojumiem dzimumšūnu mutācijas cilvēka DISL3L2 gēnā, kas kodē eksoribonukleāzi, kas ir atbildīga par iepriekš apstrādātu let-7 formu degradāciju, izraisa Perlmana sindromu un noslieci uz Vilmsa audzēju (135, 136). Perlmana sindroms ir iedzimts aizaugšanas sindroms, kam raksturīga makrosomija, polihidramniji, sejas dismorfoloģija, nieru displāzija un nefroblastomatoze (Vilmsa audzēja priekštecis) (137). No zīdaiņiem ar Perlmana sindromu, kuri izdzīvo pēc jaundzimušā perioda, 64% attīstās Vilmsa audzējs (138). Interesanti, ka pilnīgas vai daļējas DISL3L2 dzēšanas tika konstatētas aptuveni 30% sporādisku pārbaudīto Vilmsa audzēju (136).

Nesenais pētījums nostiprināja miRNS regulējošā tīkla nozīmi Vilmsa audzēja etioloģijā. Autori atklāja, ka pleiomorfās adenomas gēns 1 (PLAG1) ir viens no konsekventāk regulētajiem gēniem Vilmsa audzējos ar mutācijām miRNS apstrādes gēnos (125). PLAG1 ārpusdzemdes ekspresija jaunattīstības peles nierēs izraisa neoplaziju, ko pavada tā mērķa gēna, Vilmsa audzēja onkogēna IGF2, transaktivācija. miR-16 un miR-34, kas Vilmsa audzējos ir samazināti, tika identificēti kā potenciālie PLAG1 ekspresijas regulatori (125). 2. tabulā ir apkopoti citi pētījumi, kuros ziņots par specifisku miRNS ekspresiju, kas saistīta ar Vilmsa audzēja etioloģiju. Interesanti, ka šīs miRNS var darboties kā onkogēni (saukti par oncomiR) vai audzēja nomācēji Vilmsa audzēja attīstības apstākļos atkarībā no to mērķu rakstura.

MiRNS kā potenciālie biomarķieri un terapeitiskie līdzekļi

Papildus intracelulārajai atrašanās vietai miRNS ievērojamā daudzumā atrodas arī bioloģiskajos šķidrumos, tostarp asinīs, plazmā, urīnā, mātes pienā un siekalās (139). Šīs cirkulējošās miRNS ir atrodamas iesaiņotas mikrodaļiņās (eksosomās, mikrovezikulās un apoptotiskos ķermeņos) (140, 141), konjugētas ar AGO (142) vai nukleofosmīna 1 olbaltumvielām (143) vai ielādētas ABL (144), kas padara tos ievērojamus. stabils pat nelabvēlīgos apstākļos, piemēram, vārot, ārkārtējas pH svārstības, ilgstoša uzglabāšana un vairāki sasaldēšanas-atkausēšanas cikli (145, 146). Tādējādi miRNS paraksti bioloģiskajos šķidrumos var atspoguļot asociācijas ar fizioloģiskiem vai slimības apstākļiem (147). Kopā šīs īpašības padara cirkulējošās miRNS pievilcīgas lietošanai kā neinvazīvus biomarķierus slimību diagnosticēšanai un prognozēšanai.

Cirkulējošās miRNS var iegūt tieši no nefrakcionētiem bioloģiskiem šķidrumiem vai ārpusšūnu vezikulu preparātiem, izmantojot komerciāli pieejamus ekstrakcijas komplektus (148) vai TRIzol (149). Pēc izolācijas miRNS var uzglabāt –70 grādu temperatūrā un saglabāt stabilitāti līdz 1 gadam (148). MiRNS profilēšanai ir pieejamas vairākas platformas, tostarp mikroarray hibridizācija, qPCR un nākamās paaudzes sekvencēšana (150). Microarray un qPCR ir visbiežāk izmantotās metodes zināmo miRNS ekspresijas izpētei (151). Abu metožu priekšrocības ir tādas, ka tās ir vienkārši lietojamas, salīdzinoši ātras no RNS marķēšanas līdz datu ģenerēšanai un salīdzinoši rentablas (152). Tomēr tie paļaujas uz miRNS sekvenču pieejamību un precīzu anotāciju datu bāzēs zondes un primeru projektēšanai (150). Lai gan nākamās paaudzes sekvencēšana ir dārgāka, tā ļauj vienlaikus noteikt gan zināmās, gan jaunas miRNS sugas un nodrošina augstu jutību (153). Turklāt nākamās paaudzes sekvencēšanas viena nukleotīda izšķirtspēja ļauj identificēt izomiR, kas ir nobriedušas miRNS izoformas, kas atšķiras no kanoniskajām izoformām pēc garuma, secības vai abiem (154, 155), kas maina miRNS mērķa specifiku ( 156).

Dažādos pētījumos ir pētīts cirkulējošo miRNS kā bērnu nieru slimību biomarķieru potenciāls (157–160). Piemēram, vienā pētījumā tika identificētas 14 miRNS, kas bija ievērojami paaugstinātas pacientu ar Vilmsa audzēju serumā. Interesanti, ka paraksts, kura pamatā ir miR-100-5p un miR-130-3p izteiksme, varētu atšķirt šos pacientus no veselām kontrolēm ar precizitāti, jutīgumu un specifiskumu (159). Lai gan šī pētījuma un daudzu citu pētījumu rezultāti ir nodrošinājuši pārliecinošu motivāciju izpētīt cirkulējošo miRNS kā biomarķieru potenciālu, pirms plašas klīniskas pielietošanas ir jāpārvar vairāki šķēršļi šajā jomā. Pirmkārt, pastāv relatīvs vienprātības trūkums starp pētījumiem, iespējams tāpēc, ka nav standartizētas metodoloģijas attīrīšanai (161) un paraugu analīzei (piemēram, atšķirības miRNS profilēšanas platformās, atsauces 162., 163. vai atšķirības smRNA-Seq bibliotēkā sagatavošanas metodes, atsauce 164). Otrkārt, trūkst liela mēroga pētījumu un detalizētu pētījumu par konkrētiemslimības.Vēl viens svarīgs aspekts ir tas, ka neskaidru mainīgo lielumu, piemēram, vecuma, dzimuma un ārējo faktoru (piemēram, tabakas, alkohola utt.) ietekme uz miRNS profiliem nav pilnībā izpētīta (padziļinātu pārskatu, lūdzu, skatiet atsaucē. 165).

No terapeitiskās puses vairākas uz miRNS balstītas zāles pašlaik ir klīniskajos pētījumos, taču tām vēl nav piešķirts FDA apstiprinājums (166, 167). Galvenās pieejas miRNS terapijai ietver miRNS līmeņa atjaunošanu, izmantojot miRNS atdarinājumus, vai specifisku miRNS inhibēšanu, izmantojot antagomiR (168). Viens no izaicinājumiem, kas saistīti ar miRNS balstītas terapijas izstrādi, ir miRNS kandidātu identificēšana katrai slimībai. Tā kā katrā slimībā vairākas miRNS tiek neregulētas, jāveic rūpīga pacientu paraugu analīze kombinācijā ar in vitro un in vivo testiem, kas pievēršas attiecīgo miRNS ietekmētajiem patofizioloģiskajiem mehānismiem, lai sašaurinātu miRNS kandidātu skaitu terapeitiskai intervencei (168, 169). Vēl viens izaicinājums ietver stratēģiju izstrādi, lai uzlabotu in vivo stabilitāti un vietai raksturīgu zāļu piegādi ar minimālu toksicitāti un blakusefektiem. RNS molekulas ir ķīmiski nestabilas, jo pentozes gredzenā ir 2'-hidroksilgrupa. Lai nodrošinātu lielāku stabilitāti un aizsardzību pret nukleāzēm, kas atrodas serumā vai šūnu endocītiskajā nodalījumā, biotehnoloģiju uzņēmumi ir ģenerējuši RNS molekulas ar ķīmiskām modifikācijām (2′-O-metilgrupa, fosforotioāts vai bloķētas nukleīnskābes) to mugurkaulā (166). Runājot par piegādi in vivo, daudzu citu stratēģiju starpā ir iekļautas uz lipīdu bāzes veidotas tehnoloģijas (piemēram, lipīdu nanodaļiņas un neitrāla liposoma) un dendrimēri, kas konjugēti ar mērķa daļu. Galvenās problēmas, kas saistītas ar miRNS piegādes sistēmām, ir imūntoksicitāte un mērķa specifiskā afinitāte pret slimības vietu (170). Piegādes stratēģijas, izmantojot dažādas ievadīšanas metodes (intraperitoneālas, intravenozas un subkutānas injekcijas) vai izmantojot vektorus, kas satur nierēm specifiskus un inducējamus promotorus, ir veiksmīgi izmantotas selektīvai nieru mērķa noteikšanai un, lai izvairītos no iespējamās nelabvēlīgās ietekmes citos audos un orgānos (171, 172). ).

2. tabula. Vilmsa audzējā izmainīto miRNS saraksts

MiRNS saraksts, analizētie paraugi/paraugi, miRNS līmenis, kas novērots šajos paraugos/paraugos, salīdzinot ar atbilstošām kontrolēm, mērķa gēns, miRNS izmaiņu sekas un atsauces. CAMKK2, kalcija/kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes kināze 2; CDC7, šūnu dalīšanās cikls 7; CDH1, kadherīns 1; CREB1, cAMP-reakcijas elementu saistošais proteīns 1; EYA1, acis nav homologa 1; E2F3, E2F transkripcijas faktors 3; FRS2, FGF receptoru substrāts 2; Glut1, glikozes transportētājs 1; IGF1R, IGF1 receptors; Jag1, robains1; MET, mezenhimālas-epitēlija pāreja; MKNK1, ar MAPK mijiedarbojošā serīna/treonīna kināze 1; PTEN, fosfatāzes un tenzīna homologs; PUMA, p53-pārregulēts apoptozes modulators; p73, audzēja proteīns p73; SIX1, sineoculis homeobox homologs 1; TGFBR1, TGF- receptors 1; WT, Vilmsa audzējs.

Kopsavilkums

Kopš sākotnējās miRNS atklāšanas 1993. gadā ir bijis informācijas eksplozija par miRNS bioģenēzi, miRNS ekspresijas regulēšanu un miRNS funkciju (6, 7). Tam ir pievienota arvien pieaugoša izpratne par to, kā miRNS darbojas gan normālā fizioloģijā, gan daudzu slimību patofizioloģijā. Ir kļuvis skaidrs, ka miRNS ekspresijas disregulācija traucē agrīnu nieru attīstību un ir saistīta ar nieru slimību attīstības patoģenēzi, piemēram, CAKUT un Wilms audzēju. Ņemot vērā nesenos notikumus miRNS kā biomarķieru un kā jaunu zāļu mērķu izmantošanā, ieskats par to, kā miRNS regulē nieru attīstību un slimības, ir ļoti svarīgs, lai saprastu, kā tos varētu izmantot jaunās diagnostikas un terapeitiskās pieejās šīm slimībām. Lai pilnībā īstenotu šos centienus, turpmākie pētījumi, kas identificē specifisku miRNS funkciju nieru attīstībā, ir svarīgi papildus tehnoloģijām, lai optimizētu mazu oligonukleotīdu terapijas mērķēšanu uz nierēm.

Pateicības

JH laboratoriju atbalsta NIH Nacionālā diabēta un gremošanas un nieru slimību institūta dotācijas (R01DK125015 un R01DK102843). DMC atbalstīja Nefrotiskā sindroma pētījumu tīkla karjeras attīstības balva un Pitsburgas Bērnu slimnīcas Pētniecības konsultatīvās padomes pēcdoktorantūras stipendija. MT atbalstīja Pitsburgas Universitātes Vasaras pētniecības prakses programma (R25DK119180). Skaitļi tika izveidoti ar BioRender.com. Adreses korespondence: Jacqueline Ho, Nefroloģijas nodaļa, Pediatrijas nodaļa, Pitsburgas UPMC Bērnu slimnīca, Rangosas pētniecības centrs, 4401 Penn Ave., Pitsburga, Pensilvānija 15224, ASV. Tālrunis: 412.692.9440; E-pasts: jacqueline.ho2@chp.edu.

1. Kozomara A, et al. miRBase: no mikroRNS sekvencēm līdz funkcijai. Nucleic Acids Res. 2019;47(d1): D155–D162.

2. Friedman RC, et al. Lielākā daļa zīdītāju mRNS ir konservēti mikroRNS mērķi. Genome Res. 2009;19(1):92–105.

3. Ghildiyal M, Zamore PD. Mazie trokšņa slāpēšanas RNS: paplašinās Visums. Nats Revs Ženē. 2009;10(2):94–108.

4. Djuranovičs S, et al. miRNS mediēta gēnu klusēšana ar translācijas represijām, kam seko mRNS deadenilācija un sabrukšana.

Zinātne. 2012;336(6078):237–240.

5. Huntzinger E, Izaurralde E. Gēnu klusēšana ar mikroRNS: translācijas represiju un mRNS samazinājuma ieguldījums. Nats Revs Ženē. 2011;12(2):99–110. 6.Lee RC, et al. C. elegans heterohroniskais gēns lin-4 kodē mazas RNS ar antisensu komplementaritāti ar lin-14. Šūna.