Mitohondriju proteīni atklāj mehānismu, ar kuru fiziskie vingrinājumi uzlabo atmiņu, mācīšanos un motorisko aktivitāti hipoksiskās išēmiskās encefalopātijas žurkas modeļa 3. daļā

4. Materiāli un metodes

4.1. Dzīvnieki un eksperimentālās grupas

Šim pētījumam tika izmantotas trīsdesmit sešas Sprague-Dawley žurkas. Dzīvnieki tika turēti 22 ± 1◦C ar 12 stundu gaismas/tumsas cikliem, un tiem bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim. Eksperimentālās procedūras tika veiktas ar Džendžou universitātes Ētikas institucionālās dzīvnieku aprūpes un pētniecības komitejas apstiprinājumu.

Tumšais cikls attiecas uz periodu, kad cilvēki naktī guļ, un tas ir cieši saistīts ar atmiņu. Lielākajai daļai cilvēku labs miegs uzlabo fizisko veselību un smadzeņu darbību. Tajā pašā laikā miegs ir saistīts arī ar smadzeņu atmiņas procesu.

Kad mēs guļam, mūsu ķermenis nonāk dažādos miega posmos, tostarp ātrās acu kustības (REM) miegā un ne-ātrās acu kustības (NREM) miegā. Šiem posmiem ir svarīga loma smadzeņu informācijas integrācijas un atmiņas konsolidācijas regulēšanā.

Lielākā daļa cilvēku izjūt miega pozitīvo ietekmi uz koncentrēšanos un atmiņu. Pētījumi liecina, ka miegs var palīdzēt mums nostiprināt un stiprināt atmiņas un pat uzlabot mūsu spēju mācīties. Miega laikā smadzenes integrē jaunu informāciju ar esošajām zināšanām, tādējādi uzlabojot spēju saglabāt un izmantot atmiņu.

Un otrādi, pietiekama miega trūkums var izraisīt atmiņas zudumu un mācīšanās grūtības. Ilgstošs bezmiegs var izraisīt dažādas problēmas organismā un smadzenēs, ietekmējot ikdienas dzīvi un darbspēju. Tāpēc pareiza miega stratēģija un saprātīgs dzīvesveids ir ļoti svarīgi, lai saglabātu labu atmiņu.

Kopumā pastāv saikne starp tumšajiem cikliem un atmiņu. Pietiekams miegs var veicināt smadzeņu informācijas integrāciju un atmiņas konsolidāciju, savukārt ilgstoši miega traucējumi var ietekmēt smadzeņu darbību un atmiņu. Tāpēc mums ikdienā jāpievērš uzmanība miega kvalitātei un jāievēro veselīgs dzīvesveids, lai efektīvi atbalstītu un uzlabotu atmiņu un mācīšanās spējas. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola var regulēt arī neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni. Šīs vielas ir ļoti svarīgas atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche deserticola var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekami daudz barības vielu un enerģijas, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Tika pieliktas visas pūles, lai samazinātu dzīvnieku skaitu un samazinātu dzīvnieku ciešanas eksperimentu laikā. Dzīvnieki tika nejauši sadalīti četrās grupās (8. attēls). (1) HIE, NT (hipoksijas-išēmijas encefalopātijas grupa bez treniņa) sastāvēja no dzīvniekiem, kas tika modelēti hipoksiski-išēmiskai encefalopātijai 7. pēcdzemdību dienā, anestēzējot mazuļus ar izoflurānu (5% indukcija, 1,5% uzturēšana).

Kreisā kopējā miega artērija tika pastāvīgi sasaistīta, un mazuļus uz 30 minūtēm novietoja uz silta atveseļošanās dīvāna, pirms tos 90 minūtes pārnesa uz hipoksijas kameru ar nepārtrauktu 92% N2 un 8% O2 hipoksiskā gāzu maisījuma plūsmu un pēc tam. atgriezās būros līdz 10. nedēļai, nepakļaujot viņiem peldēšanas vingrinājumus. (2) HIE, T (hipoksijas-išēmijas encefalopātijas grupa ar treniņu) sastāvēja no dzīvniekiem, kuri tika modelēti hipoksiski išēmiskai encefalopātijai, kā norādīts 1) punktā, un tika atgriezti būros līdz 6. dzīves nedēļai un pēc tam pakļauti 90 minūtēm. peldēšana katru dienu piecas dienas ar 2 atpūtas dienām nedēļā 4 nedēļas, (3) SHAM, NT (kontroles grupa) ietvēra dzīvniekus, kuri netika pakļauti nekādai ārstēšanai, bet dzīvoja normālu dzīvi būros no 1. pēcdzemdību dienas līdz 10. nedēļai bez vingrojumu treniņš un (4) SHAM, T sastāvēja no dzīvniekiem, kas netika pakļauti nekādai ārstēšanai, bet dzīvoja normālu dzīvi būros no pēcdzemdību dienas1 līdz 6 nedēļām, pēc tam viņi 4 nedēļas tika pakļauti peldēšanas vingrinājumiem.

Pēc tam dzīvnieku smadzenes no dažādām grupām tika novāktas un sagatavotas Western blotēšanai (hipokamps un smadzeņu garoza) un imunofluorescence (motorā garozā).

4.2. Vingrinājumu paradigma

Dzīvnieki tika izmitināti ar barību un ūdeni ad libitum un tika uzturēti 12-gaismas/tumsas ciklā. Tie tika sadalīti divās grupās: mazkustīgi dzīvnieki (HIE, NT un SHAM, NT) un vingrojoši dzīvnieki (HIE, T un SHAM, T). Vingrojošie dzīvnieki tika pakļauti peldēšanas treniņiem pēc 6. pēcdzemdību nedēļas 4 nedēļas; viņi tika pakļauti peldēšanas vingrinājumiem 5 dienas nedēļā ar 2 atpūtas dienām. Katra peldēšanas sesija ilga 90 minūtes. Baseins tika piepildīts līdz 50 cm dziļumam, lai dzīvnieki nepieskartos tvertnes apakšai.

Dzīvniekiem tika ļauts brīvi peldēt bez papildu slodzes, un peldēšanas laikā tie tika viegli stimulēti. Pēc vingrinājuma žurkas tika rūpīgi žāvētas un atgrieztas būros.

4.3. Vertica! Polu motora pārbaude

Katras grupas dzīvnieki pa vienam tika novietoti ar seju uz augšu uz ar audumu pārklāta staba (3.0 cm diametrā un 150 cm garumā), kas tika turēts horizontālā stāvoklī, pēc tam pakāpeniski tika pacelts uz augšu. vertikālā stāvoklī, un laiks, kad žurka palika uz staba, tika reģistrēts ne ilgāk kā 2 minūtes (120 s). Šajā testā dzīvnieks ar kustību koordinācijas un līdzsvara deficītu nokrīt no staba.

4.4. Morisa ūdens labirinta tests (MWM)

Žurkas (10 nedēļas vecas) tika pakļautas MWM pēc 4 nedēļu treniņa protokola (SHAM, 'T un HlE, T). Visi ūdens labirinta dati tika ierakstīti, izmantojot Panjab SMART video izsekošanas sistēmu (Panlab Howo Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.) (Šanhaja, Ķīna). MWM tika izmantots, kā aprakstīts l32]. Īsumā, žurkas izmantoja vizuālas norādes, kas novietotas uz peldbaseina robežām, lai sasniegtu slēptu platformu un izkļūtu no ūdens. Mācīšanās tika novērtēta 7 dienu laikā. Pirms mācību novērtējuma žurkas tika ievadītas baseinā, kurā bija dzidrs ūdens un redzama platforma. Apmācības laikā žurkām tika doti izmēģinājuma peldēšanas vingrinājumi, lai iepazītos ar uzdevumu.

Mācību fāzē žurkas tika iesmērētas ar melnu krāsu, lai atvieglotu video izsekošanu, un platforma tika iegremdēta. Katra žurka tika pakļauta četriem izmēģinājumiem no dažādiem sākuma punktiem (kvadrantiem). Latentu jeb laiku, kas nepieciešams, lai sasniegtu platformu, katru dienu ierakstīja Panlab SMART video izsekošanas sistēma. Eksperimenta pēdējā dienā platforma tika noņemta, un katra žurka tika atkārtoti ielaista ūdenī tik reižu, cik dzīvnieki šķērsoja slēptās platformas vietu kvadrantā, kurā iepriekš bija platforma (mērķa kvadrants).

4.5. Western blotēšana

Proteīna līmeņa eksperimentam no katras grupas nejauši tika atlasītas sešas žurkas. Olbaltumvielas tika ekstrahētas no hipokampa un garozas un homogenizētas RIPA reaģentā (CW2333S, CoWin Biosciences, Kembridža, MA, ASV) un sadalītas citoplazmas un kodolproteīnos. Olbaltumvielu koncentrācijas tika noteiktas, izmantojot bicinhonīnskābes testu (BCA) (CW0014S, CoWin Biosciences, Kembridža, MA, ASV), un kopumā 20 g proteīna tika atdalīti ar elektroforēzi uz universālajiem SDS-PAGE gēliem (CFAS AnyKD PAGE) # PE008, Zhonghui Hecai Bio-pharmaceutical Technology Co., Ltd., Shaanxi, Ķīna.

Pēc tam olbaltumvielas tika pārnestas uz polivinilidēna fluorīda membrānām (PVDF) (R1CB12934, Merck Millipore Ltd., (Burlington, MA, ASV). Membrānas tika bloķētas 2 stundas ar 5% liellopu seruma albumīnu (BSA) (#A8020, Solarbio Life Sciences). , Pekina, Ķīna) istabas temperatūrā un inkubēts ar šādām primārajām antivielām no Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ASV): AIF (D39D2, 1:1000), citohroms C (136F3, 1:1000), šķelto kaspāzi{{ 13}} (Asp175, 1:1000), Smac/Diablo (D553R, 1:1000) un OPA1 (D7C1A, 1:1000).

GAPDH no Servicebio, Uhaņa, Ķīna (GB11002, 1:2000) un H3 no Proteintech (17168-1-AP, 1:1000) 4 ◦C nakti, kam seko HRP konjugētā sekundārā antiviela SA00001-2 no Proteintect (1:5000) inkubācija 2 stundas istabas temperatūrā. Olbaltumvielu joslas tika vizualizētas ar uzlabotu hemiluminiscences komplektu #KF005 no Affinity Biosciences un attēlotas ar Bio-Image Analysis sistēmu (Zhengzhou Universitāte, Džengžou, Ķīna). Olbaltumvielu joslu intensitātes attiecība pret GAPDH (citoplazmas proteīniem) un H3 (kodolproteīniem) kā iekšējām atsaucēm tika noteikta, izmantojot ImageJ.

4.6. Imunofluorescence

Smadzeņu audu {{0}}µm koronālās šķēles tika iegūtas, izmantojot sasaldēšanas mikrotomu (Leica, Vācija) imunofluorescencei. Priekšmetstikliņus 2 stundas bloķēja ar PBS ar 10% liellopu augļa serumu (#A8020, Solarbio Life Sciences, Pekina, Ķīna) un 0,3% Triton ×-100, Amresco 0694, Biosharp, Igaunija istabas temperatūrā un pēc tam inkubēts ar primārajām antivielām no šūnu signalizācijas tehnoloģijas (Danvers, MA, ASV): anti-AIF, D39D2 (atšķaidījums 1:400), anti-citohroms C, 136F3 (atšķaidījums 1:200), anti-šķelto kaspāze-3 , Asp175 (atšķaidījums 1:400), anti-Smac/Diablo, D553R (atšķaidījums 1:200) un anti-OPA1, D7C1A (atšķaidījums 1:400) nakti 4 ◦C temperatūrā.

Pēc tam priekšmetstikliņus 3 reizes nomazgāja, katrs 10 minūtes PBS, un pēc tam inkubēja ar sekundārajām antivielām (ab150077 no Abcam, Cambridge Biomedical Campus, Kembridža, Apvienotā Karaliste) 2 h istabas temperatūrā tumsā.DAPI,#C0065 no Solarbio Life Sciences, Pekina, Ķīna (1:100 PBS) tika pievienots 5 minūtes un izliets, mazgāts PBS 3 reizes, katra ilgums 5 minūtes, žāvēts, pievienots pretrūdošs līdzeklis (#P0126, Beyotime Biotechnology, Šanhaja, Ķīna), stikls uz priekšmetstikliņiem tika fiksēti plāksnītes, un paraugi tika uzglabāti –20 ◦C temperatūrā 2 stundas un ņemti mikroskopiskai attēlveidošanai. Audu attēli tika uzņemti, izmantojot konfokālās fluorescences mikroskopu (Ni-U942877, Nikon, Tokija, Japāna), un attēli proteīnus motorajā garozā pēc tam kvantitatīvi noteica, izmantojot FIJI-ImageJ, kā aprakstīts [33].

4.7. Statistiskā analīze

Visām analīzēm tika izmantota GraphPad Prism versija 8.{1}}.0 operētājsistēmai Windows (GraphPad Software, Sandjego, CA, ASV). Lai noteiktu statistisko nozīmīgumu, tika izmantota vienvirziena ANOVA, kam sekoja attiecīgi Daneta post hoc testi. Rezultāti ir parādīti kā vidējais ± SEM, un p < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.

5. Secinājumi

Šis pētījums parāda, ka peldēšana uzlaboja motorisko aktivitāti, atmiņu un mācīšanos, kas saistīta ar HIE, nomācot mitohondriju apoptozi, izmantojot Cyto.C/šķelto kaspāzes{0}} un AIF signālu ceļus. Turklāt ir pierādīts, ka iejaukšanās peldēšanas vingrinājumos stabilizē mitohondriju kristālu un membrānu potenciālu, ko attēlo Smac/Diablo un OPA1 maiņa žurkām ar HIE. Rezultātā tas ir pievilcīgs un dzīvotspējīgs pamats papildu pētījumiem, lai atšifrētu vairāk molekulāro ceļu, ar kuriem var manipulēt, lai efektīvi pārvaldītu HIE un no tā izrietošos deficītus. Lai gan šis pētījums veiksmīgi parādīja vingrinājumu lomu mitohondriju izraisīto strukturālo un funkcionālo deficītu novēršanā. HIE, tajā nav izsmeltas visas iespējamās metodes, lai noteiktu, kā tiek stabilizētas mitohondriju kristas; tas ir būtiski turpmākiem pētījumiem par šo tēmu.

Autora ieguldījums: konceptualizācija, FG, FP, YW un CC; datu pārvaldīšana, FG, FP, YW, HL un JF; formālā analīze, FG, HL un CC; finansējuma iegūšana, CC; izmeklēšana, FG, FP, YW, HL un JF; metodoloģija, FG, FP, YW un CC; projektu administrēšana, FG, YW un CC; resursi, CC; programmatūra, FG, FP, JF un CC; uzraudzība, CC; validācija, FG, FP, YW, HL un CC; vizualizācija, FG, FP, YW, HL un JF; rakstīšana – oriģinālais melnraksts, FG un YW; rakstīšana – pārskatīšana un rediģēšana FG un HL Visi autori ir izlasījuši un piekrituši publicētajai manuskripta versijai.

Finansējums: šo pētījumu atbalsta Henanas provinces Zinātnes un tehnoloģiju departamenta zinātniskās un tehnoloģiskās izpētes projekts (granta Nr. 212102310217) un Ķīnas Nacionālā dabaszinātņu fonda fondu dotācija (granta Nr. 81401015).

Institucionālās pārskata padomes paziņojums: pētījums tika veikts saskaņā ar Džendžou Universitātes Pētniecības dzīvnieku aprūpes komitejas vadlīnijām; ZZUIRB2022-32.

Paziņojums par informētu piekrišanu: Nav piemērojams.

Paziņojums par datu pieejamību: Nav piemērojams.

Interešu konflikti: autori paziņo, ka nav interešu konflikta.

Atsauces

1. Li, B.; Konsepsjons, K.; Mengs, X.; Zhang, L. Smadzeņu-imūnās mijiedarbības perinatālās hipoksiskās-išēmiskās smadzeņu traumas gadījumā. Prog. Neurobiol.2017, 159, 50–68. [CrossRef]

2. Duglass-Eskobars, M.; Weiss, MD Hipoksiskā-išēmiskā encefalopātija: pārskats klīnicistam. JAMA Pediatr. 2015, 169, 397–403.[CrossRef] [PubMed]

3. Melns, RE; Cousens, S.; Džonsons, HL; Zālājs, J.; Rudāns, I.; Bassani, D.; Jha, P.; Kempbels, H.; Vokers, CF; Cibuļskis, R.; et al. Globālie, reģionālie un valsts mēroga bērnu mirstības cēloņi 2008. gadā: sistemātiska analīze. Lancet 2010, 375, 1969–1987. [CrossRef]

4. Juul, SE; Ferriero, DM Farmakoloģiskās neiroprotektīvās stratēģijas jaundzimušo smadzeņu traumu gadījumā. Clin. Perinatols. 2014, 41, 119–131.[CrossRef]

5. Žu, C.; Rodrigess, JI; Li, T.; Sju, Y.; Sun, Y. Apoptozi izraisošā faktora loma perinatālā hipoksiskā-išēmiskā smadzeņu traumā. NeuralRegen. Res. 2021, 16, 205–213. [CrossRef] [PubMed]

6. Dziesma, S.-H.; Jee, Y.-S.; Ko, I.-G.; Lī, S.-W.; Sim, Y.-J.; Kims, D.-Y.; Lī, S.-J.; Cho, YS skrejceliņu vingrinājumi un riteņu vingrinājumi uzlabo motoro funkciju, nomācot apoptotisko neironu šūnu nāvi smadzeņu iekaisuma žurkām. J. Exerc. Rehabil. 2018, 14, 911–919.[CrossRef]

7. Kellija, M.; Darrah, J. Ūdens vingrošana bērniem ar cerebrālo trieku. Izstrādātājs Med. Bērns. Neirol. 2005, 47, 838–842. [CrossRef]

8. Millers, P.; Duderstadt, Y.; Lesmans, V.; Müller, NG laktāts un BDNF: galvenie vingrojumu izraisītas neiroplastikas mediatori? J. Clin. Med. 2020, 9, 1136. [CrossRef]

9. Intlekofers, KA; Cotman, CW Vingrinājumi neitralizē hipokampu funkcijas samazināšanos novecošanas un Alcheimera slimības gadījumā. Neirobiol.Dis. 2013. gads; presē. [CrossRef]

10. Real, C.; Fereira, A.; Čavess-Kirstens, G.; Torrao, A.; Pires, R.; Britto, L. BDNF receptoru blokāde kavē vingrojumu labvēlīgo ietekmi Parkinsona slimības žurku modelī. Neuroscience 2013, 237, 118–129. [CrossRef]

For more information:1950477648nn@gmail.com