Baktericīda/caurlaidību palielinoša proteīna (BPIFA1), kas regulē iedzimtas imūnās atbildes reakcijas zīdītājiem, molekulārā evolūcija 1. daļa

Anotācija:

Baktericīda/caurlaidību palielinoša olbaltumviela, kas ir primārais zīdītāju iedzimtās imūnsistēmas faktors, piedalās dabiskajā imūnās aizsardzībā pret invāzijas baktērijām. BPIFA1 aktīvi veicina saimnieka aizsardzību, izmantojot vairākus mehānismus, piemēram, antibakteriālas, virsmaktīvās vielas, elpceļu virsmas šķidruma kontroli un imūnmodulējošas aktivitātes. Tomēr BPIFA1 gēna evolūcijas vēsture un selekcijas spēki zīdītājiem adaptīvās evolūcijas laikā ir slikti izprotami. Šajā pētījumā tika pārbaudīts cilvēku BPIFA1 gēns, salīdzinot ar citu zīdītāju sugu gēnu, lai novērtētu adaptīvās evolūcijas rezultātā iegūto selektīvo spiedienu. Lai novērtētu, vai ir notikusi pozitīva atlase, mēs izmantojām vairākus dažādus iespēju testus (M1 pret M2 un M7 pret M8).

Pozitīvi atlasīto vietu proporcijas bija nozīmīgas, un BPIFA1 proteīna varbūtības log vērtība bija 93, 63. Atlases serveris tika izmantots tajā pašā datu kopā, lai atkārtoti apstiprinātu pozitīvo atlasi noteiktām vietnēm, izmantojot mehāniskās un empīriskās kombinācijas modeli, tādējādi nodrošinot papildu pierādījumus, kas apstiprina pozitīvās atlases konstatējumus. Bija pārliecinoši pierādījumi par pozitīviem selekcijas signāliem zīdītāju sugu BPIFA1 gēnos, kas bija nozīmīgāki atlases pazīmēm un signālu radīšanai.

BPIFA1 proteīns, kas pazīstams arī kā LPLUNC1 vai ar nazofaringeālo karcinomu saistītais gēns 6 (NAG6), ir proteīns, kas ļoti izteikts augšējos elpceļos un mutes dobumā. BPIFA1 proteīns ir cieši saistīts ar imunitāti.

Pētījumi liecina, ka BPIFA1 proteīnam piemīt antibakteriāla un imūnmodulējoša iedarbība. BPIFA1 proteīns var saistīties ar invazīvo Escherichia coli un iznīcināt tās šūnu membrānu, tādējādi spēlējot antibakteriālu lomu. Turklāt BPIFA1 proteīnam ir imūnmodulējoša loma, aktivizējot Toll līdzīgo receptoru (TLR) 4 un TLR2 ceļus, veicinot iekaisuma reakcijas, apoptozi un imūno šūnu aktivāciju.

Plaši pētīta arī saistība starp BPIFA1 proteīnu un elpceļu slimībām. Piemēram, pētījumi ir parādījuši, ka BPIFA1 proteīna ekspresijas līmenis elpceļu slimībās, piemēram, bronhiālā astma un hroniska obstruktīva plaušu slimība (HOPS), ir cieši saistīta ar slimības smagumu. Īpaši infekcijas apstākļos var ievērojami paaugstināt BPIFA1 proteīna ekspresijas līmeni, tādējādi piedaloties elpošanas sistēmas imūnās atbildes un floras līdzsvara regulēšanā.

Tāpēc nevar ignorēt BPIFA1 proteīna lomu imūnsistēmā, un tā saistība ar elpceļu slimībām un infekcijām ir nepieciešama turpmāka padziļināta izpēte. Tāpēc īpaša uzmanība jāpievērš imunitātes uzlabošanai. Cistanche būtiski uzlabo imunitāti. Gaļā esošie polisaharīdi var regulēt cilvēka imūnsistēmas imūnreakciju, uzlabot imūnsistēmu stresa spēju un stiprināt imūnās šūnas. baktericīda iedarbība.

Noklikšķiniet, lai uzzinātu par veseliem pārtikas produktiem

Mēs veicām varbūtības testus, salīdzinot dažādus modeļus, kuru pamatā ir dN / dS attiecības, lai atpazītu specifiskus kodonus pozitīvas atlases spiedienā. Mēs identificējām pozitīvi atlasītas vietas BPIFA1 proteīnu LBP-BPI domēnā zīdītāju genomā, ieskaitot lipīdus saistošu domēnu ar ļoti augstu selektivitātes pakāpi attiecībā uz DPPC. BPIFA1 aktivizē augšējo elpceļu iedzimto imūnsistēmu, reaģējot uz daudziem ģenētiskiem signāliem zīdītāju genomā. Šie atklājumi izceļ evolūcijas sasniegumus imūnregulācijas iedarbībā, kam ir nozīmīga loma zīdītāju sugu antibakteriālajā un pretvīrusu aizsardzībā.

Atslēgvārdi:

BPIFA1; baktericīds; imūnsistēma; molekulārā evolūcija; pozitīva atlase.

1. Ievads

Baktericīda caurlaidību paaugstinoša olbaltumviela (BPI) ir ļoti efektīvs pretmikrobu proteīns, kas saista un neitralizē lipopolisaharīdus, kas izdalās no baktēriju ārējās membrānas [1]. Ir zināms, ka BPI kroku saturošajam ģimenes A loceklim (BPIFA1) gēnam ir ietekme uz vietējo imūnsistēmu, un šī ietekme var potenciāli ietekmēt mikroorganismu augšanu un invāziju [2]. Viens no iespējamiem mehānismiem, kas ir šīs saites pamatā, ir BPIFA1 spēja uzlabot baktēriju uzsūkšanos fagocītiskajās šūnās un to spēju tās iznīcināt [3].

Lai gan tiem ir minimāla secību līdzība, BPI ir divi domēni, kas izmanto tādu pašu strukturālo kroku [1, 4]. Gramnegatīvu baktēriju invāzija izraisa integrētu saimnieka reakciju, ko veicina lipopolisaharīdus saistoša proteīna (LBP) klātbūtne. LBP ir endotoksīnu saistošs proteīns, kas ir cieši saistīts un koordinēts ar BPI [5]. BPIFA1 kontrolē gļotādas mikrobiotu un sākotnējo interferona signālu pārraidi. SPLUNC1 (agrāk pazīstams kā BPIFA1) ir proteīnu kroku saturošs ģimenes loceklis ar antibakteriālām, virsmaktīvām un imūnmodulējošām aktivitātēm, kas visas veicina saimnieka aizsardzību. Elpošanas sistēma ir galvenā tās izpausmes vieta [6]. SPLUNC1, peles gēna PLUNC cilvēka homologs, uzrāda tādu pašu ekspresijas modeli augšējos elpceļos un nazofaringijas zonās kā peles homologam. Antibakteriālo iedarbību pret gramnegatīvām baktērijām parāda kodētais pretmikrobu proteīns [5]. Nesīkšūnu plaušu vēža gadījumā tas var kalpot kā potenciāls molekulārais marķieris mikrometastāžu noteikšanai. Vairāki transkripta varianti ir atklāti 3' netulkotā reģiona alternatīvās savienošanas rezultātā; tomēr ir saprotams tikai trīs no šiem transkripta variantiem pilna garuma raksturs [7].

Gan pelēm, gan cilvēkiem ir ievērojams BPIFA1 gēna ekspresijas līmenis trahejas augšējā daļā, taču šī ekspresija samazinās, attālinoties no trahejas, sasniedzot minimumu galveno stumbra bronhu bifurkācijā un kļūstot nenosakāmam plaušu perifērijā. [8]. Plašos gēnu ekspresijas pētījumos ar pelēm un cilvēkiem nav izdevies noteikt BPIFA1 perifēro plaušu audos [9]. Izņemot ļoti zemo BPIFA1 mRNS ekspresijas līmeni peles aizkrūts dziedzerī, žurkas sirdī un ožas gļotādā, BPIFA1 netiek ekspresēts nevienā orgānā vai audos ārpus grauzēju elpošanas sistēmas [10]. Nekas neliecina, ka BPIFA1 mRNS atrodas kādā no šādiem cilvēka audiem: sirdī, aknās, smadzenēs, kuņģī, tievās zarnās, placentā, skeleta muskuļos, aizkuņģa dziedzerī, liesā, normālos limfmezglos, perifēros limfocītos, prostatā, sēkliniekos vai olnīca [11].

BPIFA1 mRNS ekspresija seko izplatības modelim, kas ir ļoti salīdzināms embriju un pieaugušo audos. Šis modelis tiek novērots abu veidu audos [1]. BPIFA1 pārmērīga ekspresija transgēnās pelēs radīja alveolārus makrofāgus ar pastiprinātu oglekļa nanocauruļu opsonizāciju un fagocitozi kontrolēta elpceļu iekaisuma modelī [12]. Turklāt tika pierādīts, ka komensālās gramnegatīvās nanobaktērijas vienlaikus lokalizējas ar BPIFA1 nazofaringeālā vēža audu epitēlija šūnās [13]. Paraugi tika ņemti no pacientiem, kuriem iepriekš bija konstatēta nazofaringeāla karcinoma. Nesenā pētījuma rezultāti liecina, ka mijiedarbība starp BPIFA1 un ne-bakteriālo LPS var mazināt ķermeņa iekaisuma reakciju, ko izraisa ne-bakteriāla LPS. [1].

Tā antibakteriālās iedarbības diapazons un struktūras saglabāšana mugurkaulniekiem, kas elpo ar gaisu, liecina, ka BPIFA1 ir attīstījies, lai nodrošinātu būtisku saimnieka aizsardzības spēju [14]. Tomēr, ņemot vērā tā atrašanās vietu proksimālajos elpceļos un tā augsto līmeni pamata apstākļos, BPIFA1 var būt neaizstājams. Tas ir tāpēc, ka dzīvniekiem ir daudz pretmikrobu efektoru [15]. Līdz ar to šķiet, ka BPIFA1 ir visnozīmīgākā ietekme, lai izvairītos no infekcijas un notīrītu to pirms patogēnu invāzijas. Pateicoties šīm funkcijām, var novērst bakteriālas infekcijas elpošanas sistēmā, kas var liecināt par imunitātes aktivizēšanos un citu elpceļu funkciju regulēšanas uzlabošanos [15].

Tiek uzskatīts, ka adaptīvās izmaiņas, reaģējot uz vides prasībām, ierobežo biofizikālie faktori, taču to vietu strukturālos aspektus, kurās ir adaptīvas izmaiņas, nevar paredzēt neviena evolūcijas teorija [16]. Tas ir tāpēc, ka biofizikālie ierobežojumi ierobežo aizvietojumu veidus, kas ir atļauti proteīna funkcijas uzturēšanai [17]. Pozitīvā selekcija var būt vairāk izplatīta proteīnu sekcijās, kur sagaidāms, ka mutācijām būs mazāka ietekme nekā citās proteīna daļās, lai gan tas nav pierādīts (piemēram, allosteriskās regulēšanas vietas) [18]. Tomēr sagaidāms, ka funkcionālie reģioni evolūcijas laikā saglabāsies būtiski konservēti, lai gan adaptīvās izmaiņas ir saistītas ar ātru labvēlīgu mutāciju fiksāciju [19]. Olbaltumvielu secību molekulāro evolūciju būtiski ietekmē dabiskās atlases process.

Jaunākie notikumi genoma sekvencēšanas jomā un uzticamas secinājumu metodes filoģenētiskā un populācijas līmenī ir ļāvušas veikt ātru un stabilu dabiskās atlases izraisīto evolūcijas ātrumu un adaptāciju novērtējumu [20]. Gan filoģenētiskajā, gan populācijas līmenī ir veikts ievērojams darbs, lai izveidotu secinājumu metodes. Turklāt pieaugošā proteīnu strukturālo un funkcionālo datu pieejamība ir ļāvusi pētniekiem izpētīt strukturālo un funkcionālo ierobežojumu ietekmi uz olbaltumvielu sekvenču evolūciju un adaptāciju [16]. Ierobežojumu dēļ, ko nosaka to struktūras un funkcijas, evolūcijas un adaptācijas ātrums dažādiem proteīniem un vietām vienā un tajā pašā proteīnā ir atšķirīgs [19].

Lielākā daļa šūnu funkciju ir cieši saistītas ar gēnu ekspresijas regulējošajiem tīkliem, kas ļauj organismiem izturēt augstāku infekcijas līmeni vai mazināt šo infekciju sekas [21]. Lielākā daļa komponentu, kas veido šūnu fizioloģiju, ir cieši saistīti ar šīm gēnu ekspresijas regulēšanas sistēmām, kas bieži vien ir vecas evolūcijas adaptācijas [22]. Šie mehānismi ir radījuši ievērojamu interesi par pētījumiem, kuros ir izmantots ierobežots modeļu sugu kopums, par kuru ir pieejama ģenētiskā informācija [23]. Tomēr maz ir zināms par mehānismiem, kas izraisīja šo sistēmu attīstību, vai to, kā tās pielāgojās dažādiem vides apstākļiem attīstības gaitā.

Šī pētījuma mērķis ir izpētīt BPIFA1 gēna evolūcijas izcelsmi, lai atklātu tā fizikāli ķīmiskās īpašības un pielietotu salīdzinošo genomiku, lai sniegtu gēna novērtējumu dažādās zīdītāju sugās. Mēs veicām padziļinātus salīdzinošus pētījumus par baktericīdo/caurlaidību palielinošo proteīnu (BPIFA1) gēnu, kas regulē iedzimto imūnreakciju zīdītājiem, lai labāk izprastu, kā šie gēni darbojas. Pastāv iespēja, ka selektīvam spiedienam būs būtiska ietekme uz adaptācijas evolūciju. Šajā pētījumā mēs pētām šo gēnu vēsturi dažādās mugurkaulnieku sugās, kā arī to, kā ģenētiskā daudzveidība un dabiskā atlase laika gaitā ir ietekmējušas šīs gēnu ģimenes attīstību.

2. Materiāli un metodes

2.1. Secību izguve un analīze

BPIFA1 gēna aminoskābju un kodējošo nukleotīdu sekvences 34 zīdītāju sugās, ieskaitot cilvēkus kā atsauces sugu šajā pētījumā, tika savāktas no GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank, piekļūts 20. 2021. gada septembrī), un tie tika saskaņoti, izmantojot MEGA 6 programmatūrā rīku Clustal Omega [24]. Maksimālās varbūtības metode tika izmantota MEGA 6 programmatūrā, lai ģenerētu BPIFA1 gēna filoģenētisko koku. Šis koks tika izveidots, pamatojoties uz gēnu evolūcijas attiecībām. Bootstrap tests aprēķināja vidējo aizstāšanu skaitu vienā vietā un vidējo zaru garumu, izmantojot maksimālās varbūtības metodi ar 1000 atkārtojumiem, lai noteiktu taksonomisko klasterizāciju. Šī metode tika izmantota, lai izvēlētos topoloģiju progresīvākām log-iespējamības vērtībām [25,26]. BPIFA1 gēna pētīšanai izmantotie sugu nosaukumi un pievienošanās numuri ir sniegti S1 papildu tabulā.

2.2. Atlases analīze

Maksimālās varbūtības pieejas tika izmantotas, lai salīdzinātu dN/dS attiecības katrā kodona vietā, lai identificētu specifiskus kodonus zīdītāju BPIFA1 gēnu sekvencēs, kas pakļautas pozitīvai atlasei [27,28]. Analīzei tika izmantots PAML [29] izpildīts CODEML un DATA MONKEY tīmekļa serveris (https://www.datamonkey.org, piekļūts 2021. gada 29. septembrī) [30], un rezultāti tika noteikti, izmantojot kodonu aizstāšanas attiecības, kas bija ievērojami augstāki par 1 kodoniem ar pozitīvu atlasi. Šī pētījuma sākotnējais solis bija noteikt, vai ir notikusi pozitīva atlase, izmantojot maksimālās iespējamības koeficienta testu.

Šī analīze noteica vietu klātbūtni, kuru dN / dS attiecība ir lielāka par vienu. Šajā pētījumā mēs pretstatījām diskrētu (vispārēju) modeli, kas izpildīja šo funkciju, ar nulles modeli, kas aizliedza tādu vietņu rašanos, kuru vērtība ir lielāka par 1 [31]. Analīzes tika salīdzinātas, izmantojot varbūtības žurnāla (2∆l) sadalījumu ar df=4. Nulles hipotēze (M7) apgalvoja, ka sadalījumu ierobežo vērtības 0 un 1. Alternatīvs modelis (M8) ar diviem parametriem, omega (ω) un beta ( ), ļauj iegūt vērtību no datu kopa, kas var būt lielāka par 1 [27]. Analīzes, izmantojot fiksētā efekta iespējamību (FEL), vienas varbūtības priekšteču skaitīšanu (SLAC) un nejaušās ietekmes iespējamību (REL), atklāja, ka BPIFA1 gēns tika pakļauts pozitīvai atlasei, salīdzinot sinonīmu un nesinonīmu atšķirību globālās vērtības katrā vietā. [32].

Otrajā posmā bija jāizmanto maksimālās varbūtības aplēses, lai atrastu aminoskābju pozīcijas, kuras evolūcijas laikā bija pozitīvas atlases priekšmets. Lai sasniegtu šo mērķi, tika izmantota Bayes teorēma, kas paredz to vietu posterior varbūtības, kuras ir pakļautas pozitīvai atlasei. Tika novērota pozitīva atlase, kas darbojas aminoskābju vietās ar aizmugures varbūtību no 95 līdz 99 procentiem [33]. Aminoskābju atlikumi ar lielu varbūtību, ka vērtība bija lielāka par vienu, tika pakļauti selektīvai procedūrai. Šveices modelis un Phyre 2 (http://www.sbg.bio.ic.ec.k/pyre/html, piekļūts 2021. gada 28. septembrī) ir tīmekļa lietojumprogrammas, kas parāda labvēlīgi atlasīto aminoskābju atrašanās vietas uz olbaltumvielu struktūrām. [34].

Mēs paredzējām nukleīnskābju un aminoskābju evolucionārās saglabāšanās vietu proteīnos, izmantojot ConSurf rīku (http://consurftest.tau.ac.il, piekļūts 2021. gada 28. septembrī), kura pamatā bija filoģenētiskās attiecības starp sekvencēm [ 35]. BPIFA1 saskaņotā kodona secība tika pārbaudīta Selecton versijā 2.2 (//secton.tau.ac.il, piekļūts 2021. gada 28. septembrī), kas ļauj noteikt dažādu kodonu dažādās attiecības saskaņotajās sekvencēs. Šīs attiecības tika mērītas, izmantojot Beijesa secinājumu pieeju, izmantojot dažādus varbūtības testus. Tas tika veikts, lai apstiprinātu pozitīvi atlasītos kodonus [36]. Turklāt atlases rezultāti tika parādīti dažādās krāsās, lai apzīmētu dažādus atlases kritērijus.

2.3. Rekombinācijas analīze

Lai atrastu pierādījumus par rekombināciju, mēs veicām modeļa atlases procedūru, pamatojoties uz statistisko iespējamību, kas var izsijāt daudzus secību saskaņojumus, meklējot pārtraukuma punktus un pamanot iespējamo rekombinanto DNS. Šajā paņēmienā tika izmantots ģenētiskais algoritms, lai meklētu vairāku secību sakārtojumus rekombinācijas pārtraukuma punktiem, lai sasniegtu savu mērķi. GARD pieeja ir vienkārši uztverama, viegli paplašināma un ļoti paralēla. Plaši simulācijas eksperimenti ir parādījuši, ka metode gandrīz visos gadījumos pārspēj citus pašreizējos rīkus, īpaši attiecībā uz precizitāti.

Lai izpētītu rekombinācijas pierādījumus, vispirms tika novērtētas nukleotīdu sekvences, lai identificētu haplotipus (Na) un novērtētu polimorfās vietas (S), vidējo nukleotīdu atšķirību skaitu (K) un nukleotīdu daudzveidību (π), izmantojot programmatūru DnaSP 5.10 [37]. ]. Pārtraukuma punktu noteikšana un rekombinanto signālu novērtēšana nukleotīdu sekvencēs tika veikta, izmantojot Datamonkey tīmekļa servera tiešsaistes GARD rīku [38]. Turklāt, izmantojot GARD, lai pārbaudītu sekvences rekombinācijai, tiek nodrošināts, ka metodēm, kas vērstas uz pozitīvas atlases identificēšanu, ir pieņemamas statistikas pazīmes.

2.4. Olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbības analīze

Liela interese ir pievērsta tam, lai izpētītu, kā olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbība tiek saglabāta no vienas sugas uz otru. Tā kā interaktīvo datu eksperimentālajai identificēšanai un apstiprināšanai ir vairāki šķēršļi, būtu interesanti saprast PPI, kas pārnests no sugas, kas ir pierādīta citā sugā [39]. STRING datu banka ir bezmaksas bioinformātikas resurss, kurā ir informācija par to, kā olbaltumvielas mijiedarbojas savā starpā kā daļa no vairākiem ceļiem. Līniju skaits, kas savieno katru proteīna mezglu, un starpības vērtības tiek izmantotas, lai identificētu starpposma mezglus, kas pārstāv proteīnus, kuriem ir svarīga bioloģiska loma un kas ir cieši saistīti viens ar otru. Tīkla izveide tika veikta, izmantojot STRING, un tīkla attēlošanai tika izmantota programmatūra Cytoscape (http://www.cytoscape.org, piekļūts 2021. gada 29. septembrī) [40]. Identificējot BPIFA1 proteīna-olbaltumvielu mijiedarbību starp imūno proteīniem un koekspresijas analīzi, izmantojot STRING versiju 9.1 (http://www.string-db.org, piekļūts 2021. gada 29. septembrī), mēs varējām tālāk noteikt, kā darbojas BPIFA1. molekulārā līmenī.

2.5. BPIFA1 proteīna strukturālā analīze

Šajā analīzē mēs izveidojām cilvēka BPIFA1 proteīna kristāla struktūru, izmantojot homoloģijas modelēšanu ar tiešsaistes rīkiem, piemēram, Šveices modeli (http://swissmodel.expasy.org, piekļūts 2021. gada 29. septembrī) [41], I-TESSAR [42] un Phyre2 (http://www.sbg. bio1.ic.ac.uk/phyre2/html, piekļūts 2021. gada 29. septembrī) [43]. Samontētā mērķa proteīna samazināšanai tika izmantota konjugētā gradienta metode un Amber spēka lauks UCSF Chimera 1.10.1 programmatūrā. Turklāt, lai novērtētu paredzamās struktūras stereoķīmiskās īpašības, tika izmantots ProSA tīmekļa serveris [22].

For more information:1950477648nn@gmail.com