Cistanche Deserticola un tās rīsu vīna tvaicēšanas produktu neiroendokrīni imūnā funkcija glikokortikoīdu izraisītā žurkas modelī-Ⅰ

1. Ievads

Cistanche tuksnesis, ko sauc par "tuksneša žeņšeņu", ir tradicionāla ķīniešu medicīna, kas ir izmantota gadsimtiem ilgi kā jantonizējoša zāleuzmundrina nieres un stiprina jaņ[1]. Astoņas sugas un viena variācijaCistanche Herba ir reģistrēti Ķīnā un tikaiCistanche deserticolaYC Ma unCistanche tubulosa(Schenk) Wight ir ierakstīti Ķīnas farmakopejā [2]. To pierādīja farmakoloģiskie pētījumiCistanches Herbapiemīt neiroprotektīvs [3], imūnmodulējošs [4], kardioprotektīvs [5], pretnoguruma [6], pretiekaisuma [7], hepatoprotektīvs [8], antioksidants [9], antibakteriāls [10], caureju veicinošs [11] un pretaudzēju līdzeklis sekas [12]. Plašais šīs ģints ziņoto bioloģisko aktivitāšu spektrs ir saistīts ar tās sarežģīto un daudzveidīgo fitoķīmisko sastāvu.Cistanche deserticolasatur feniletanola glikozīdus, iridoīdus, polisaharīdus [13] utt. Feniletanola glikozīdu saturs ir visaugstākais oriģinālajos zāļu materiālos [14].

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA NIERU ATZINĀŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Ķīniešu Materia Medica (CMM) apstrāde ir tradicionāls farmaceitiskais paņēmiens, lai izpildītu dažādas prasības ārstēšanai, izsniegšanai un preparātu pagatavošanai saskaņā ar tradicionālās ķīniešu medicīnas teoriju. Šos pārstrādes produktus sauc par novārījumu gabaliņiem, kurus izmanto klīnikās. Apstrādes mērķis ir uzlabot neapstrādātu zāļu toksicitātes samazināšanu. 2015. gada Ķīnas farmakopejā tika reģistrēts, ka Cistanche biezās šķēles (CD) un rīsu vīnā tvaicētas Cistanche (WCD) klīnikā varēja izmantot kā novārījumu gabalus. Mūsu pētījumu grupa parādīja, ka caureju veicinošais efekts tika atvieglots, un pretnovecošanās un nieru jangu uzmundrinošā iedarbība tika pastiprināta pēc tam, kad Cistanche tika tvaicēts ar rīsu vīnu [15].

Hipotalāma-hipofīzes-virsnieru dziedzera-akrūts dziedzera (HPAT) ass funkcija ir traucēta nieru-jaņ deficīta sindroma gadījumā [16]. Pacientiem ar nieru-jaņ deficītu ir arī plaša imūnsistēmas disfunkcija. HPA ass disfunkcija ir cieši saistīta ar imūndeficītu. Neiroendokrīno imūno tīklu (NEI) teorija liecina, ka imūnsistēmai un neiroendokrīnajām sistēmām ir daudz kopīgu ligandu un receptoru [17], un hipotalāmu uzskata par galveno, kas savieno neiroendokrīno sistēmu ar imūnsistēmām.

Šajā pētījumā mēs atkārtojām nieru-jaņ deficītu modeļu žurkām ar eksogēnu kortikosteroīdu injekciju un pētījām nieru-jaņ deficīta mehānismu, reaģējot uz dažādiem apstrādātiem Cistanche deserticola produktiem no endokrīnās un imūnās funkcijas viedokļa.

2. Materiāli un metodes

2.1. Materiāli un reaģenti

Cistanche deserticola tika savākta no Alashan Neimenggu 2019. 5. gadā, un prof. Yanjun Zhai (Farmācijas skola, Liaoningas Tradicionālās ķīniešu medicīnas universitāte, Ķīna) to identificēja kā kaltētus, mīkstus Cistanche deserticola YC Ma stublājus. Vaučera paraugi tika saglabāti Liaoning Processing Engineering Technology centrā.

Standarta ajugola savienojumi tika iegādāti no Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Ķīna); cistanozīds F,ehinakozīds, cistanozīds A un izoakteozīdstika iegādāti no Must Company (Sichuan, Ķīna); akteozīds tika iegādāts no Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Ķīna). MS klases acetonitrils un metanols tika iegādāti no Merck KGaA (Darmštate, Vācija). HPLC kvalitātes skudrskābe tika iegādāta no Merck KGaA (Darmštate, Vācija). Rīsu vīns tika iegādāts no Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Ķīna).

Kortikosterons (CAS: 50-22-6, tīrība > 98%, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), chinkuei shin chewan tabletes (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), žurku AKTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 un IL-10 ELISA noteikšanas komplekti tika iegādāti no Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Žurku kortizola ELISA komplektu nodrošināja BOSK Co., žurku CD4 antiviela, CD8a antiviela (nr. 561833 un 559976), RBC lizāts (Solarbio, R1010), PBS buferšķīdums (Solarbio, P1020-500), TRIzols (MAN0001271), CaM un -aktīna augšpus un lejpus primeri nodrošināja Guangzhou Invitrogen Co. Reversās transkripcijas komplekts (nr. RR037A) un cDNS sintēzes komplekts (nr. 10000068167) nodrošināja Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Hloroforms, izopropanols, 75% uretāns un Visi šķīdumi bija analītiski tīri, un tos ražoja Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultratīru ūdeni ražoja Milli-Q sistēma (18,2 MΩ, Millipore, MA, ASV).

2.2. Eksperimentālie instrumenti

Enzīmu marķieris (Thermo, modelis 3530911931), automātiskā plākšņu mazgātāja (modelis HBS- 4009), digitālā displeja spiedes un vilkšanas spēka mērītājs (modelis VICTOR- 50N), ātrgaitas sasaldēšanas centrifūga (modelis Sigma 3k15). ), ultramikro spektrofotometrs (modelis B-50Q), gēnu pastiprinātājs (modelis L96G), reāllaika fluorescences kvantitatīvais PCR (modelis StepOne), plūsmas citometrs (modelis AC66051710132), parafīna mikrotoms (modelis Laikalympus), mikroskops (O , modelis BS-53) un tīra ūdens instruments (modelis F7JA36507).

2.3. Paraugu sagatavošana UPLC-Q-TOF-MS un farmakoloģiskajiem eksperimentiem

WCD tika apstrādāts no tās pašas partijasCistanche tuksnesismūsu laboratorijā. WCD pagatavošanai sausos CD gabaliņus (5 mm biezi) (100 g) ielej ar rīsu vīnu (30 ml), tvaicēja augstā spiedienā (1,25 kPa) 4 stundas un pēc tam žāvēja 55 grādos.

Rupjos CD un WCD pulverus iemērc 1 0 reizes 95% etanolā 0,5 stundas, 3 reizes ekstrahēja ar atteci katru reizi 1 stundu un filtrēja, un filtrātus 3 reizes apvienoja. Etanols tika iegūts pazeminātā spiedienā, un ekstrakts tika iegūts ievadīšanai. Ekstraktu (1 ml) pievienoja 50% metanolam, palielinot kopējo tilpumu līdz 20 ml, un uzglabāja 4 grādu temperatūrā satura analīzei.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. UPLC-QqQ-MS nosacījumi CD un WCD ekstraktu analīzei

2.4.1. LCThMS analītiskie nosacījumi

Datu iegūšanai un apstrādei tika izmantota UPLC-MSThMS sistēma ar MassLynx 4.1 Analyst programmatūru. Analītiskā kolonna bija Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) 40 grādu C temperatūrā. Kustīgā fāze bija 0,1% skudrskābes ūdens šķīdums (A) un acetonitrils, kas satur 0,1% skudrskābes (B). Elucijas gradients bija 0.{15}}–1.00 min ar 3% B, 1,01–2.00 min ar 3%–11,5% B, 2,01–3.{29 }} min ar 12% B, 3,01–4.00 min ar 15% B, 4,01–5.{39}} min ar 20% B, 5,01–6.00 min ar 22 % B, 6,01–8.{49}} min ar 25% B un 8,01–9.{54}} min ar 10% B. Plūsmas ātrums bija 0,3 mLTh min, un injekcijas tilpums bija 1,0 μL.

Negatīvo jonu režīmā tika izmantots Waters trīskāršais četrkāršais masas spektrometrs (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, ASV), kas aprīkots ar elektrosmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu. Desolvatācijas gāze bija slāpeklis ar plūsmas ātrumu 500 LThh 250 grādu temperatūrā. Visi atklātie savienojumi tika mērīti vairāku reakciju monitoringa (MRM) režīmā; 1. tabulā parādīti enerģijas parametri, bet 2. tabulā parādītas analizēto komponentu kalibrēšanas līknes.

2.4.2. References vielu sagatavošana

Tubulozīds A (302 mg), ehinakozīds (300 mg), 2′-acetilakteozīds (2,34 mg), akteozīds (2,45 mg), izoakteozīds (0,61 mg), cistanozīds F ( 2,14 mg), salidrosīds (3,39 mg), genipozidīnskābe (2,84 mg), ajugols (1,58 mg) un katalpols (2,39 mg) tika izšķīdināti metanolā, lai sagatavotu izejas šķīdumu. Izejas šķīdums tika atšķaidīts ar metanolu, lai iegūtu atbilstošās koncentrācijas darba standartšķīdumiem. Visi sagatavotie šķīdumi pirms lietošanas tika uzglabāti 4 grādu temperatūrā.

2.5. Dzīvnieku modeļu sagatavošana un grupēšana

SD žurku tēviņi (180–220 g) tika iegādāti no Liaoning Changsheng Biotechnological Co., Dzīvnieku atļaujas numurs: SCXK (Liao) 2015–0001. Visām žurkām tika nodrošināta brīva piekļuve pārtikai un ūdenim 25 grādu temperatūrā un 30–50% relatīvajā mitrumā. Pirms eksperimentiem dzīvnieki tika izmitināti 7 dienas.

Simts žurkas tika nejauši sadalītas 10 grupās: tukšās kontroles (BC) grupa, modeļa kontroles (MC) grupa, pozitīvās kontroles (PC) grupa, rīsu vīna kontroles (WC) grupa, CD lielas devas (CD) -HD) grupa, CD vidējas devas (CD-MD) grupa, CD mazas devas (CD-LD) grupa, WCD lielas devas (WCD-HD) grupa, WCD vidējas devas (WCD-MD) grupa un WCD mazo devu (WCD-LD) grupa. CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD un CD-LDThWCD-LD devas bija attiecīgi 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) un 1,37 gTh (kg ∙ d). Deva PC grupai bija 1,646 gTh (kg ∙ d), bet WC grupai - 1 mLTh100 g 40 dienas. 6. dienā pēc ievadīšanas žurkām subkutāni injicēja kortikosterona ūdens suspensiju (kortikosterona + 0.1% dimetilsulfoksīds + 0.1% Tween-80 + 0.9% nātrija hlorīds), izņemot BC grupai [18]. Kortikosterona koncentrācija bija 5 gThL, un deva bija 0,1 mLTh100 g. BC grupas žurkām tika ievadīts parastais fizioloģiskais šķīdums + 0,1% dimetilsulfoksīds + 0,1% Tween- 80 + 0,9% nātrija hlorīds injekcijas veidā tādā pašā devā.

2.6. HPA asu funkciju noteikšana

2.6.1. Svara, temperatūras un turēšanas jaudas pārbaude

Svara tests tika veikts ik pēc 3 dienām, un temperatūra tika mērīta ik pēc 6 dienām. eksperimenta laikā. 39. dienā pakaļējās ekstremitātes maksimālais spēks tika mērīts ar satvēriena mērītāju. Žurkas tika novietotas uz gludām platformām, liekot to pakaļējai ekstremitātei satvert stabu. Žurkas instinktīvi satver jebkuru priekšmetu, lai novērstu kustību atpakaļ, kad asti velk, līdz vilkšanas spēks pārsniedz satvērienu. Kad žurka zaudēja saķeri, priekšpastiprinātājs varēja automātiski reģistrēt maksimālo saķeres spēku.

2.6.2. T, CRH, AKTH, CORT un kortizola līmeņa noteikšana serumā

Vienu stundu pēc pēdējās ievadīšanas žurkas tika anestēzētas, intraperitoneāli ievadot uretāna šķīdumu (20 gTh100 ml). Pēc tam asins paraugi tika savākti, centrifugēti pie 3500 apgriezieniem 15 minūtes, lai iegūtu serumu, un uzglabāti -20 grādu temperatūrā. T, CRH, ACTH, CORT un kortizola koncentrācijas tika mērītas ar žurku ELISA komplektiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.6.3. Mikroskopa novērojumi

Virsnieru dziedzeru audu morfoloģiskā struktūra tika novērota ar HE krāsošanu. Virsnieru audi tika fiksēti 10% paraformaldehīdā, dehidrēti etanolā, padarīti caurspīdīgi ar ksilola šķīdumu, iestrādāti ar parastajām metodēm, sagriezti līdz 4 μm biezām šķēlītēm, atvaskoti ar ksilola šķīdumu, hidratēti ar etanola gradientu un pēc tam iekrāsoti ar hematoksilīnu un eozīnu. krāsošanas šķīdums. Pēc tam, kad plāksne tika padarīta caurspīdīga ar ksilolu, tā tika noslēgta ar neitrālu gumiju un tika novērota mikroskopā.

2.6.4. Baksa, Bcl-2, kaspāzes-3, Fas un FasL proteīna ekspresijas imūnhistoķīmiskā krāsošana virsnieru dziedzeros

Formalīnā fiksētās, parafīnā iestrādātās žurku virsnieru sekcijas tika deparafinētas un rehidrētas pēc sagriešanas 4 μm biezumā. Lai bloķētu endogēnās peroksidāzes aktivitāti, sekcijas tika iepriekš inkubētas ūdeņraža peroksīda blokā 1 0 min. Sekcijas tika iegremdētas 0,01 M citrātā (pH 6,0) un karsētas līdz vārīšanās temperatūrai. Procedūru atkārto pēc 5-10 minūtēm. Pēc atdzesēšanas sekcijas tika mazgātas ar PBS (pH 7, 2–7, 6) 1–2 reizes, atstātas istabas temperatūrā apmēram 5 minūtes un mazgātas ar PBS (pH 7, 2–7, 6) 2–3 reizes. Istabas temperatūrā pievienoja 5% BSA bloķējošo šķīdumu, un sekcijas šķidruma pārpalikums tika sakrata 20 minūtes vēlāk. Tika pievienotas atšķaidītas primārās antivielas, kas bija specifiskas FasTh FasL, Bcl-2ThBax un kaspazei-3 (1:100 atšķaidīta ar PBS), un inkubēja 37 grādu temperatūrā 1 stundu vai 4 grādus nakti. Sekcijas tika mazgātas 2–3 reizes ar PBS (pH 7,2–7,6). Pēc tam tika pievienots biotinilēts kazas anti-peļu IgG, un sekcijas tika žāvētas 20–37 grādu temperatūrā 20 minūtes un mazgātas ar PBS (pH 7, 2–7, 6) 4 reizes 5 minūtes. Pēc rūpīgas mazgāšanas PBS, sekcijas 30 minūtes inkubēja ar reaģentu A un B maisījumu, 45 minūtes inkubēja ar PBS un visbeidzot 30 minūtes attīstīja ar DAB substrātu (DAKO), pirms tās tika nedaudz iekrāsotas ar hematoksilīnu, dehidrētas, un uzstādīts.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS SAJŪTAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Imūno funkciju noteikšana

2.7.1. Imūno orgānu indeksa aprēķins

Vienu stundu pēc pēdējās ievadīšanas žurkas tika anestēzētas, intraperitoneāli ievadot uretāna šķīdumu (20 gTh100 ml), un pēc tam liesa un aizkrūts dziedzeris tika noņemti un nekavējoties nosvērti sterilā pārsegā. Liesas vai aizkrūts dziedzera svara koeficienti (%) � liesas vai aizkrūts dziedzera svars (mg) Ķermeņa svars (g).

2.7.2. T limfocītu apakšgrupu noteikšana perifērās asinīs

Splenocīti un hemocīti tika inkubēti ar monoklonālajām antivielām anti-CD4 (PE) un anti-CD8 (FITC) 30 minūtes tumsā. Pievienoja 2 ml eritrocītu lizāta, un šķīdumu sajauca ar virpuļošanu. Šķīdumu atstāja tumsā 10 minūtes un centrifugēja 5 minūtes. Supernatants tika izmests, un pēc tam šķīdumu 3 reizes nomazgāja ar ledusaukstu PBS un atkārtoti suspendēja PBS permeabilizējošā šķīdumā. Vismaz 10,{11}} šūnas tika analizētas ar plūsmas citometriju 1 stundas laikā pēc katras Mab krāsošanas.

2.7.3. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- un IFN-c līmeņa noteikšana serumā

Vienu stundu pēc pēdējās ievadīšanas žurkas tika anestēzētas, intraperitoneāli ievadot uretāna šķīdumu (20 gTh100 ml), un asinis tika ņemtas no vēdera aortas. Asinis tika centrifugētas pie 3500 apgriezieniem 15 minūtes, lai iegūtu serumu, un uzglabātas -20 grādu temperatūrā. IL-10, IL-6, IL-2, TNF- un IFN-c koncentrācija tika noteikta ar žurku ELISA komplektiem saskaņā ar ražotāja norādījumiem.

2.8. CaM ekspresija hipotalāmā un hipofīzes audos

Kopējo RNS no hipotalāma un hipofīzes audiem ekstrahēja TRIzol. Reversā transkripcija tika veikta ar 10 μL kopējās RNS saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Vienādi cDNS daudzumi tika analizēti, izmantojot qPCR dsDNS saistošas ​​krāsas (Promega, ASV) un CFX 96 reāllaika PCR sistēmas (Bio-Rad, ASV) klātbūtnē, lai apskatītu dažādus gēnus sākotnējās aktivizācijas apstākļos plkst. 95 grādi 10 minūtes, 40 denaturēšanas cikli 95 grādos 15 sekundes un atlaidināšanas pagarināšana 60 grādos 1 minūti.

CaM un -aktīna grunti ir norādīti 1. tabulā, un -aktīns tika izmantots kā iekšējā kontrole. Katrs paraugs tika normalizēts, izmantojot kritisko sliekšņu (Ct) atšķirību starp mērķa gēnu un aktīnu. Rezultāta aprakstīšanai tika izmantots šāds vienādojums: ΔΔCt � (Ct mērķa gēns − Ct -aktīna gēns) eksperimentālā grupa − (Ct mērķa gēns − Ct -aktīna gēns) kontroles grupa. Pēc tam tika salīdzināti katra parauga mRNS līmeņi, izmantojot ekspresijas 2- ΔΔCt mērķa gēnu. Katras grupas rezultāti tika aprēķināti vidēji (3. tabula).

2.9. Statistiskā analīze

Visi dati tika analizēti, izmantojot SPSS programmatūru (versija 19.0, SPSS Institute Inc., Čikāga, IL). Atšķirības starp grupām tika analizētas ar vienvirziena atkārtotu mērījumu dispersijas analīzi (ANOVA). Rezultāti tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (SD), izmantojot GraphPad Prism programmatūru (6. versija.0, Sandjego, Kalifornija, ASV). Atšķirības, kuru P vērtība ir mazāka par 0,05, tika uzskatītas par statistiski nozīmīgām.

3. Eksperimentālie rezultāti

3.1. UPLC-QqQ-MSAnalīze

Lai sasniegtu vislabāko atdalīšanu, pīķa formu un īsu analīzes laiku, mūsu sākotnējā eksperimentā tika pētīti hromatogrāfiskie apstākļi, tostarp kolonna, kustīgā fāze un gradienta programma. Tipiskās hromatogrammas ar MRM režīmu ir parādītas 1. attēlā.

No 4. tabulas redzams, ka feniletanoīdu glikozīdu saturs WCD palielinājās salīdzinājumā ar CD saturu, īpaši ehinakozīdam un akteozīdam, savukārt iridoīdu saturs WCD tika samazināts.

3.2. HPA ass funkcijas noteikumi

3.2.1. Svara, temperatūras un turēšanas jaudas pārbaude

MC grupas un eksperimentālo grupu žurkām pēc kortikosterona ievadīšanas pakāpeniski parādījās nieru-jaņ deficīta simptomi. Simptomi, piemēram, svara zudums, hipotermija, matu spīduma zudums, gara kritums, reakcijas kavēšanās un ievērojams ūdens patēriņa un aktivitātes samazinājums, ievērojami uzlabojās CD un WCD grupās. Attēlā 2(a) parādītas svara izmaiņas. Katras narkotiku grupas svars palielinājās, īpaši CDHD un WCD-HD grupās. Vismazākais svara pieaugums bija MC grupā. Attēlā 2(b) parādītas temperatūras izmaiņas, kas bija viszemākās MC grupā, un temperatūra palielinājās WCD-HD, WCD-MD un WCD-LD grupās.

Attēlā 2 (c) parādīts, ka BC grupai un katrai eksperimentālajai grupai noturības jauda palielinājās, un WCD-MD grupa bija visaugstākā, kas parādīja, ka pēc ievadīšanas uzlabojās nieru-yang deficīta izraisītā vājuma pazīmes.

3.2.2. T, CRH, ACTH, CORT un kortizola līmeņi

3. attēlā parādīts, ka, salīdzinot ar BC grupu, T, CRH, AKTH un CORT līmenis žurku serumā samazinājās (P < 0.01) un kortizola līmenis samazinājās (P < 0.05) MC grupā. Salīdzinot ar MC grupu, T līmenis WCD-HD un WCD-MD grupās palielinājās (P < 0.01), CRH līmenis WCD-LD, WCD-MD un WC grupas uzlabojās (P < 0.01), AKTH saturs palielinājās CD-HD, WCD-MD un WCD-HD grupās (P < 0,01), CORT līmenis paaugstināts grupās. CD-MD, WCD-MD un WCD-HD grupās (P < 0,01) un paaugstināts CDHD un WCD-LD grupās (P < 0,05), un kortizola līmenis palielinājās katrā zāļu grupā.

3.2.3. Novērošanas ar mikroskopu rezultāti

Virsnieru dziedzeru audus var iedalīt garozas slānī un medulla slānī. Kortikālajos slāņos ietilpst lodveida, saišķu un retikulāri slāņi. Šūnās ir vairāk lipīdu, un medulla slānis sastāv galvenokārt no feohromocitomas šūnām un neliela daudzuma šķiedru audu. Kā parādīts 4. attēlā, mēs atklājām, ka BC grupā viss bija normāli, savukārt MC grupā virsnieru garozā bija acīmredzama hiperplāzija, šūnu atrofija un pieaugošs blīvums. Sīpolu sloksne sabiezēja, un caurspīdīgā fascikulārā zona, šaurā zona reticularis un mazākās šūnas parādīja nevienmērīgu krāsojumu un kapilāru sastrēgumu. PC grupā bija redzamas kortikālās un medulārās robežas. Lodveida un saišķu joslu šūnas tika izkārtotas vienmērīgi, un tika atjaunota morfoloģiskā struktūra. Tāda pati labāka atjaunošana tika novērota WCD grupās, un ietekme WCD-MD grupā bija labāka nekā WCD-HD un WCD-LD grupām. Virsnieru dziedzera morfoloģija CD grupās nebija tik laba kā WCD grupās.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA SEKSUĀLĀS FUNKCIJAS UZLABOŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%