Obakunons mazina aknu fibrozi, pastiprinot GPx antioksidantu iedarbību-4 un inhibējot EMT

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

Abstract:Obakunons, limonīna triterpenoīds, kas iegūts no Phellodendronchinense Schneid vai Dic-tamnus dasycarpusb Turcz auga, izraisa dažādus farmakoloģiskus efektus, piemēram, pretiekaisuma, pretaudzēju, antioksidācijas un pretplaušu fibrozes efektus. Tomēr oba-konusa antifibrotiskā iedarbība un detalizētais aknu fibrozes pamatā esošais mehānisms joprojām nav skaidrs. Aknu fibroze ir novājinoša slimība, kas apdraud cilvēku veselību. Transformējošais augšanas faktors (TGF)-/P-Smad ir galvenais fibrozes ceļš, ko raksturo epitēlija-mezenhimālās transformācijas (EMT) un kolagēna nogulsnēšanās, ko pavada pārmērīgi skābekļa brīvie radikāļi. Nrf-2 darbojas kā galvenais antioksidatīvais regulators, kas veicina dažādu ar antioksidantiem saistītu gēnu izpausmes. Glutationa peroksidāze-4(GPx-4) ir glutationa peroksidāžu saimes loceklis, kas tieši inhibē fosfolipīdu oksidāciju, lai mazinātu oksidatīvo stresu. Šajā pētījumā mūsu mērķis bija izpētīt mugurkaula lomu peles aknu fibrozes modelī, ko inducē oglekļa tetrahlorīds (CCl4), un aknu zvaigžņu šūnās (LX2 šūnu līnija), kas inficētas ar TGF-. Obakunons demonstrēja spēcīgu uzlabojošu ietekmi uz aknu fibrozi gan aktivētā LX2, gan peļu aknu audos ar samazinātu -SMA, kolagēna1 un vimentīna līmeni. Obakunons arī ievērojami nomāca TGF-/P-Smad signālus un EMT procesu. Tikmēr obakunonam bija spēcīga antioksidācijas iedarbība, samazinot reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmeni abos modeļos. Mugurkaula antioksidanta iedarbība tika attiecināta uz GPx-4 un Nrf-2 aktivizēšanu. Turklāt mugurkaula terapeitiskā iedarbība uz LX2 šūnām tika ievērojami samazināta in vitro plus ar GPx-4 antagonistu RSL3, paralēli atkārtoti paaugstinātajam ROS līmenim.puritāni c vitamīnsTādējādi mēs parādām, ka mugurkauls spēj vājināt aknu fibrozi, pastiprinot GPx-4 signālu un kavējot TGF-/P-Smad ceļu un EMT procesu.

Atslēgvārdi:mugurkauls;aknu fibroze; EMT;aknu zvaigžņu šūnas; GPx-4;TGF- ;oksidatīvais stress

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

1. Ievads

Hronisku hepatītu parasti izraisa vīrusu hepatīts, bezalkoholiskais steatoze, alkoholiskais hepatīts un autoimūns hepatīts. Pastāvīgs aknu bojājums var beigties ar aknu fibrozi vai pat aknu vēzi, kas nāvējoši ietekmēja cilvēka veselību [1]. Aknu fibroze ir brūču nedzīstošas ​​reakcijas veids nepārtrauktu traumu faktoru ietekmē, ko raksturo pārmērīga ekstracelulārās matricas (ECM) uzkrāšanās un rētu veidošanās [2]. Aknu zvaigžņu šūnas (HSC) parasti atrodas miera stāvoklī normālos apstākļos, tās tika aberranti aktivizētas hronisku aknu bojājumu gadījumā, un tām bija augsta ECM proliferācija un sekrēcijas [3], kas apzīmētas kā miofibroblasti [4]. Izpratnei par HSC aktivācijas mehānismu ir liela nozīme jaunu terapeitisko līdzekļu izstrādē aknu fibrozes ārstēšanai.

Transformējošais augšanas faktors (TGF-) veicina iekaisuma reakcijas, stimulējot interleikīna-1 (IL-1) un interleikīna-6(IL-6) ekspresiju monocītos [5]. Turklāt tas izraisa vēža metastāzes, izmantojot epitēlija-mezenhimālo transformāciju (EMT) un audzēja imūnsistēmu [6-8]. EMT attiecas uz dinamisku fizioloģisko procesu, kurā epitēlija šūnas zaudē savu polaritāti un transformējas mezenhimālās šūnās, piemēram, fibroblastos un miofibroblastos, tādējādi izraisot fibrozes attīstību [9]. EMT rašanās vienmēr ir saistīta ar E-kadherīna pazeminātu regulēšanu un mezenhimālo šūnu marķieru, piemēram, N-kadherīna un gliemežu, regulēšanu [10]. TGF- -Smad aktivācija ir viens no galvenajiem intracelulārajiem ceļiem EMT, kā arī miofibroblastu veidošanā [11].

Oksidatīvais stress tiek uzskatīts par vienu no galvenajiem fibrozes cēloņiem saistībā ar reaktīvo skābekļa sugu (ROS) pārprodukciju[12]. Augsts ROS līmenis izraisa strukturālus bojājumus biomolekulām, piemēram, olbaltumvielām, lipīdiem un DNS, galu galā izraisot šūnu bojājumus un fibrozes veicināšanu [13]. Oksidatīvā stresa apstākļos Nrf-2-Keep-1 dimērs tiek atdalīts, kodolrespirācijas faktors-2(Nrf-2) tiek transportēts kodolā un inducē dažādu antioksidantu enzīmi, saistoties ar antioksidantu atbildes elementiem (ARE), samazina ROS līmeni[14]. Glutationa peroksidāze-4 (GPx-4) ​​darbojas kā antioksidanta proteīns ar glutationa peroksidāzes aktivitāti, galvenokārt atbildot par fosfolipīdu oksidācijas un ROS ražošanas kavēšanu ferroptozes procesā [15].sistanchePētījumi ar pelēm liecina, ka fibroze pastiprinās pēc Nrf-2 vai GPx-4 zaudēšanas [16,17].

Cistanche var novērst novecošanos

Pašlaik aknu fibrozes ārstēšanai ir pieejamas vairākas zāles, tostarp tās, kurām piemīt pretiekaisuma [18], antioksidantu [19] un peroksisomu proliferatora aktivēto receptoru (PPAR) agonistu [20] īpašības. Nesenā pētījumā prof. Yu atklāja, ka pacientiem ar aknu cirozi ir augstāks lipīdu oksidācijas līmenis, salīdzinot ar veselām kontrolēm klīniskajos paraugos [21]. Vairāki antioksidanti, piemēram, resveratrols[19] un ursolskābe |13, ir pierādījuši labu ietekmi uz fibrozi. Šie pierādījumi kumulatīvi liecina, ka antioksidācija ir daudzsološa stratēģija pretfibrozes ārstēšanai.

Pirfenidons (PFD) ir piridīna zāles idiopātiskas plaušu fibrozes (IPF) ārstēšanai, bet vairākos pētījumos tam ir arī laba terapeitiskā iedarbība uz aknu fibrozi [22,23]. Tādējādi šajā pētījumā PFD ir izvēlēts kā pozitīvas kontroles zāles. Obakunons (Oba) ir dabisks limonoīds savienojums, kas iegūts no tādiem rūsas augiem kā Phellodendri un Dictamnus-dasycarpus [24], kam piemīt dažādas bioloģiskas īpašības, piemēram, pretiekaisuma |25, antioksidācijas [26] un pretaudzēju īpašības [27]. Nesenie ziņojumi atklāja, ka Oba ir spēcīgs Nrf-2 agonists, kas efektīvi mazināja plaušu fibrozi ar CCL4 indukciju un H, O2 izraisīto MDA-MB-231 šūnu oksidatīvo bojājumu. Vēl svarīgāk ir tas, ka Oba nav toksisks pelēm [28]. Tomēr nav ziņots par Oba ietekmi uz aknu fibrozi, jo īpaši par GPx-4, kas mediē antifosfolipīdu oksidāciju, TGF- -Smad signālus un EMT procesu. Šeit mēs plānojam izpētīt Oba ietekmi uz aknu fibrozi un definēt pamatā esošos molekulāros mehānismus.

2. Rezultāti

2.1. Oba inhibēta TGF- -inducēta Lx-2 aktivācija

Since the activated HSCs (aHSCs)played a critical role in liver fibrosis [3], we first observed the effects of Oba on liver fibrosis in aHSCs. In this experiment, we used the Cell Counting Kit-8(CCK8) to detect the toxicity of Oba on LX-2 cells, a type of human HSCs line. We found that LX-2 cells survival was not significantly affected by Oba at the concentration range of 10 to 160 uM during 24/48/72 h treatment (Figure 1A). Then, the LX-2 cells were stimulated with 10 ng/mL TGF-β for 24 h and then treated with Oba or not. the protein expression of α-Smooth muscle actin (α-SMA) was effectively inhibited at concentrations of >20 uM Oba. Interesanti, ka, palielinoties Oba koncentrācijai, a-SMA inhibīcijas efekts būtiski nepalielinājās (1.B attēls).kas ir cistancheTādējādi mēs izvēlējāmies 20 μM koncentrāciju nākamajam eksperimentam, un PFD kalpoja kā pozitīvā kontrole. Oba efektīvi inhibēja -SMA, kolagēna-1, vimentīna un saistaudu augšanas faktora (CTGF) proteīna līmeni (1.C attēls) aHSC [3,4]. Turklāt Oba samazināja -SMA, kolagēna -1 un vimentīna mRNS ekspresijas līmeni (1. D attēls). Imunofluorescences rezultāti vēl vairāk apstiprināja, ka Oba acīmredzami samazināja -SMA pozitīvos iekrāsošanās signālus (salīdzinājumā ar TGF-grupu, jo sarkano šūnu skaits samazinājās pēc apstrādes ar Oba) Lx{11}} (1. attēls). Šie rezultāti liecina, ka Oba labi kavē Lx-2 aktivāciju.

2.2. Oba inhibētie TGF-/Smad signāli, EMT process un izteiktā pretiekaisuma iedarbība

Lai definētu molekulāros mehānismus, kas ir pamatā iepriekš minētajiem antifibrozes efektiem, tika novēroti TGF-receptoru, P-Smad un -SMA proteīnu ekspresijas līmeņi, kurus Oba būtiski inhibēja aHSC (2.A attēls). Turklāt proteīns N-kadherīna un gliemežu ekspresijas līmeņi tika samazināti, savukārt E-kadherīna proteīna ekspresijas līmenis tika veicināts (attēls 2B), norādot, ka tika bloķēts arī EMT ceļš [3]. Turklāt mēs atklājām, ka Oba izraisīja pazeminātu IL-6 līmeni (2. C attēls).Pretnovecošanās cistancheLai tālāk novērtētu Oba ietekmi uz iekaisumu, mēs vispirms stimulējām HepG-2 šūnas (cilvēka hepatocelulārās karcinomas šūnu līnijas veidu) ar 20 nmol CCl4, kam sekoja apstrāde ar 20 uM Oba. Šie rezultāti parādīja, ka Oba var samazināt IL-6 mRNS un proteīna ekspresijas līmeni CCl4-stimulētajā HepG-2 (2.D attēls). Kopumā oba demonstrēja vairākus pretfibrozes efektus. inhibējot TGF-/Smad signālus un EMT procesu, kā arī pretiekaisuma.

2.3. Oba pretfibrozes iedarbība bija atkarīga no uzlabotās antioksidantu kapacitātes, aktivizējot GPXx-4

In order to further define the underlying molecular mechanisms of Oba in aHSCs, we discovered that Oba activated the Nrf-2/Keap-1 pathway and reduced the protein expressions of Nox-2 (Figure 3A).In addition, we found that Oba increased the protein expression level of GPx-4(Figure 3B). To validate the importance of the GPx-4-mediated signal, RSL3, which is an inhibitor of GPx-4 [29], was selected to deal with Lx-2. Examination by using the CCK8 （Figure 3C）revealed that at concentrations of RSL3>{{0}},75 μM, Lx-2 šūnu dzīvotspēja bija ievērojami samazināta; tāpēc tika izvēlēts 0.75-μM RLS, lai iejauktos GPx-4 ekspresijā. Western blot rezultāti parādīja, ka, pievienojot RSL3 aHSC, GPx-4 proteīna ekspresija tika samazināta un visi profibrotiskie marķieri, tostarp -SMA un vimentīns, tika ievērojami mainīti, norādot uz GPx -4 nozīmi Oba pretfibrozes efekta starpniecībā (3D attēls). Tikmēr Oba acīmredzami samazināja aHSC ROS līmeni ar ROS fluorescējošiem detektoriem, un šo efektu acīmredzot bloķēja RSL3 (attēls). Šie dati liecināja, ka zemākais fosfolipīdu ROS līmenis, ko mediē GPx-4, bija galvenais pretfibrozes līdzeklis. Obas signāls.

2.4. Oba mazina CCl4-inducētu peles aknu fibrozi

CCl4-inducēta aknu fibroze ir viens no visbiežāk izmantotajiem peļu modeļiem aknu fibrozes pētīšanai [3]. Histoloģiskā līmenī Oba ievērojami atviegloja aknu patoloģiju, par ko liecina uzlabotie kolagēna nogulsnēšanās gadījumi, kas norādīti ar Masson krāsošanu un anti-SMA krāsošanu. (4.A–D attēls). Pēc tam tika noteikts alanīna transamināzes (ALT)/aspartāta transamināzes (AST) līmenis serumā, lai pārbaudītu aknu bojājumu līmeni, salīdzinot ar CCL4 pelēm, zemas devas Oba grupa un PFD grupa ievērojami samazināja ALAT līmeni (p<0.05)(figure 4e).="" expectedly,="" oba="" inhibited="" the="" protein="" expression="" levels="" of="" collagen-1,="" ctgf,="" and="" α-sma="" in="" mouse="" fibrotic="" livers,="" which="" were="" consistent="" with="" the="" immunohistologic="" results="" (figure="" 4f).="" these="" in-vivo="" results="" illustrated="" that="" oba="" significantly="" improved="" the="" ccl4-induced="" mouse="" liver="">

2.5. Oba uzlaboja GPx-4 izpausmi, samazināja iekaisumu, ar EMT saistītu proteīnu ekspresiju un samazināja lipīdu oksidācijas līmeni CCl4-izraisītās aknu fibrozes gadījumā

Kā parādīts 5.A attēlā, Oba inhibēja IL-6 olbaltumvielu ekspresiju un EMT rašanos peļu fibrotiskajās aknās ar samazinātu gliemežu un N-kadherīna līmeni, bet augstāku E-kadherīna līmeni. Turklāt Nrf{4}} un GPx-4 proteīnu ekspresija acīmredzami palielinājās pēc apstrādes ar vidējām un lielām Oba devām (5.B attēls).cistanche benefíciosImūnhistoķīmiskās krāsošanas (IHC) rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar modeļa grupu, GPx-4 pozitīvo šūnu (brūno) skaits Oba grupās ar lielu un vidēju devu ir ievērojami palielināts (5.C, E attēls). Pēc tam mēs pārbaudījām oksidatīvā stresa līmeni peļu aknās un atklājām, ka, salīdzinot ar kontroli, modeļa grupas ROS fluorescences intensitāte bija acīmredzami augstāka. No otras puses, pēc ārstēšanas ar Oba ROS līmenis tika ievērojami samazināts (attēls 5D, F).

3. Diskusija

Fibroze ir intīma slimība pasaulē. Neatkarīgi no etioloģijas, ieskaitot vīrusu infekciju, alkoholisko vai bezalkoholisko hepatītu un autoimūnās atbildes reakcijas, visi beidzas ar fibrozi hroniska aknu bojājuma dēļ [1]. HSC aktivizēšana ir galvenais aknu fibrozes pamatā esošais notikums. HSC tiek aktivizēti ar dažādu fibrogēnu faktoru un ECM nogulsnējumu novirzēm [2, 3]. Tiek ziņots, ka iepriekš minētajos procesos ir iesaistīta ar TGF- - saistīta kanoniskā Smad aktivācijas signalizācija, EMT process, kā arī ar IL-6- saistīts hronisks iekaisums [3,4]. Lai novērtētu Oba pretfibrozes ietekmi uz aknu fibrozi, pirmkārt, mēs koncentrējamies uz tā ietekmes uz Lx-2 aktivāciju, ko inducē TGF-, un pēc tam pārbaudām tā in vivo antifibrozi, izmantojot CCl4-inducētās aknu fibrozes peļu modelis.

Oba ir dabisks limonoīdu savienojums [24], un tā bioloģiskā iedarbība galvenokārt ietver pretiekaisuma [25], antioksidanta [26] un pretaudzēju [27] funkcijas. Nesen tika atklāts, ka Oba ir spēcīgs un efektīvs Nrf{6}} agonists un iedarbojas uz pelēm pret plaušu fibrozi [28]. Tomēr joprojām trūkst pierādījumu par tā anti-aknu fibrozes iedarbību un saistītajiem molekulārajiem mehānismiem. Šeit Oba inhibēja pārmērīgu -SMA, kolagēna 1 un CTGF ekspresiju Lx-2 modeļos, kas stimulēti ar TGF-. Uzlaboto EMT signalizāciju arī efektīvi nomāc Oba.

Ir apstiprināts, ka oksidatīvais stress ir nozīmīgs fibrozes veicinātājs [12]. Reaktīvās skābekļa sugas (ROS) ir vispārīgs termins oksidētām molekulām vai joniem ar bioloģisku aktivitāti, un dažādu ROS pārprodukcija hepatocītos var izraisīt tā nāvi un izraisīt aknu fibrozi [13]. Gluži pretēji, miera stāvoklī esošie HSC tiek aktivizēti pēc aknu šūnu bojājumiem, un pārmērīga ROS pastiprina vairāk HSC aktivācijas un beidzas ar aknu fibrozi [12]. Tāpēc pārspīlētā oksidatīvā stresa mazināšana kļūst par efektīvu fibrozes ārstēšanu.

Nrf-2 ir būtisks antioksidatīvā stresa regulators, aktivētais fosforilētais Nrf-2 tiek pārvietots uz kodolu, lai virzītu pakārtoto antioksidantu proteīnu GST, HO1[15] augšupregulāciju. Tiek ziņots, ka daudziem dabiskajiem Nrf2 ķīmiskajiem aktivatoriem, piemēram, terc-butilhidrohinonam un kurkumīnam, piemīt pretfibrozes iedarbība. No visiem antioksidantiem proteīniem glutationa peroksidāze-4(GPx-4) ir glutationa peroksidāžu saimes (GPx1-8) loceklis, un tā veicina redoksu līdzsvaru, samazinot glutationa [ 30-32]. Ir pierādīts, ka augstākas glutationa peroksidāzes -7 izpausmes inhibēja bezalkoholisko taukaino aknu slimību, samazinot ROS veidošanos [33]. GPx-4 samazināja fosfolipīdu peroksīdu uz lipīdu membrānas, lai aizsargātu šūnas no oksidatīviem bojājumiem J15]. Kazuya Tsubouchi et al. konstatēja, ka GPx-4 ekspresija ir samazināta peles plaušu fibrozes audos, ko inducē bleomicīns, un fibroze ir smagāka, ja tiek izslēgts GPx-4 gēns. Turklāt lipīdu peroksidācija un TGF-/P-Smad ceļš plaušu fibroblastos ievērojami uzlabojas, kad GPx-4 gēns ir izsmelts [17]. Nesen vairāk pierādījumu apstiprināja, ka fosfolipīdu izcelsmes ROS ir iesaistīti īpašā šūnu nāvē, ko sauc par ferroptozi. GPx-4 inhibitors RSL3 tiek izmantots arī kā ferroptozes induktors [21,34].

Eksperimentos mēs atklājām, ka Oba izmantoja antioksidantu spēju, paaugstinot Nrf-2 un GPx-4 un samazinot Nox-2. Proti, Oba pretfibrozes iedarbība tika ievērojami vājināta, kad GPx-4 gēnu inhibēja RSL3, GPx-4 inhibitors. Konsekventi tika informēts arī par Oba ārstēšanas samazināto ROS līmeni. Šie in vitro novērojumi ļoti apstiprināja, ka GPx-4-mediētā antifosfolipīdu ROS bija būtiska Oba aizsargājošajai iedarbībai.

Lai apstiprinātu iepriekš minētos Oba antifibrozes ārstēšanas rezultātus LX2 šūnās, tika pārbaudīta arī CCl4-inducēta peles aknu fibroze. CCl4 ir hepatotropas indes veids, mikrosomāla enzīma P450 izraisīta degradācija radīja ļoti reaktīvus brīvos radikāļus, lai iznīcinātu šūnu membrānas integritāti, savukārt, izraisot virkni aknu darbības traucējumu un traumu, kas galu galā pārvēršas par aknu fibrozi [35]. Mūsu eksperimentā Oba bija laba ārstnieciska iedarbība uz CCl izraisītu aknu fibrozi. Tas mazināja aknu bojājumus ar zemāku ASAT līmeni, kolagēna šķiedru saišķu laukums kļuva mazāks, un proteīnu ekspresija a-SMA, CTGF, kolagēns-1, gliemežnīca, N-kadherīns un IL{10 }} visi tika samazināti. Lai gan antioksidantu signalizācija, Nrf-2 un GPx-4 proteīnu ekspresija arī bija paaugstināta, augstākais ROS līmenis samazinājās. Šie rezultāti vēl vairāk apstiprināja Oba in vitro pretfibrozes iedarbību un saistīto signalizāciju, īpaši EMT un antioksidantu iedarbības kavēšanu ar Nrf-2 un GPx-4.

Kopumā mēs secinājām, ka Oba, izmantojot dažādus mehānismus, atviegloja TGF{0}}inducēto HSC aktivāciju un CCl4-inducēto aknu fibrozi. Pirmkārt, Oba inhibēja klasisko TGF-/Smad ceļu, EMT un IL-6 ražošanu. Otrkārt, tam bija lieliska antioksidanta spēja, uzlabojot Nrf-2 un GPx-4 izteiksmes. GPx-4mediētā anti-fosfolipīdu ROS galvenokārt veicināja tā antifibrozi. Tāpēc Oba var kalpot kā ķīmiskais reģents fibrozes profilaksei un ārstēšanai.

Oba uzrādīja zināmu dziedinošu efektu uz CCl{0}}inducēto aknu fibrozi C57 pelēm. Oba varēja pazemināt fibrozes proteīna biomarķieru ekspresiju, piemēram: -SMA, CTGF utt. Tikmēr Oba samazināja I-6, E-kadherīna utt. proteīnu ekspresiju. Interesanti, ka Mid-Oba liecina par labākiem rezultātiem salīdzinājumā ar zemu Oba un augstu Oba līmeni šo proteīnu relatīvās ekspresijas ziņā, lai gan tas nav statistiski nozīmīgs. Tomēr tas norādīja, ka optimālā deva varētu būt izšķirošs faktors šajā procesā, un mēs izpētīsim šo parādību nākamajā eksperimentā. Turklāt mēs atklājām, ka zemāka ROS un aknu fibrozes pakāpe ar augšupregulējošām Nrf-2 un GPx-4 izpausmēm. Tāpēc mēs uzskatām, ka Oba varētu atvieglot aknu fibrozi, regulējot Nrf{12}} un GPx-4. Tomēr PFD varētu būt labāka terapeitiskā iedarbība nekā Oba gan in vivo, gan vitro. Tomēr Oba bija labāks par PFD antioksidanta efekta ziņā, tas veicina iespēju atrast jaunas zāles pret aknu fibrogēno iedarbību no antioksidanta puses un sniedz nelielu ieguldījumu cilvēka veselībā.

4. Materiāli un metodes

4.1. Ķīmiskās vielas un reaģenti

Oba (nr. B20553, tīrība ir lielāka vai vienāda ar 98 procentiem) un RSL3 (nr. S81241, tīrība ir lielāka vai vienāda ar 98 procentiem) tika iegādātas no YUANYE Bio-Technology Co., Ltd. (Šanhaja, Ķīna) un izšķīdinātas. dimetilsulfoksīdā (DMSO) (nr. R21950; YUANYE) līdz koncentrācijai attiecīgi 72,64 mg/ml un 6 mmol. Pēc filtra sterilizācijas iegūtais šķīdums tika saglabāts -20 ° C temperatūrā. Šķīdums tika pievienots barotnei, lai sasniegtu galīgo DMSO koncentrāciju<1%. tgf-β="" was="" purchased="" from="" peprotech="" china="" (suzhou,="" china).="" ccl4="" was="" purchased="" from="" jiangsu="" qiangsheng="" chemical="" (jiangsu,="" china).="" a="" ros="" fluorescence="" probe="" kit="" was="" purchased="" from="" applygen(beijing,="" china).="" trizol,="" sybr="" premix="" ex="" taq="" reagents,="" revertaid="" first="" strand="" cdna="" synthesis="" kit,="" ripa,="" bca="" protein="" assay="" kit,="" and="" sds-page="" kit="" were="" purchased="" from="" thermo="" fisher="" scientific(waltham,="" ma,="" usa).="" the="" cell="" counting="" kit-8="" (cck8)was="" purchased="" from="" saint-bio="" (shanghai="" china).="" the="" primers="" were="" designed="" and="" synthesized="" by="" tsingke="" (xi'an,="" china).dapi,="" goat="" anti-mouse="" igg="" h&l(alexa="" fluor="" 594)(ab150120),="" anti-alpha="" smooth="" muscle="" actin="" antibody(ab7817),="" anti-vimentin="" antibody="" (ab20346),="" anti-il-6="" antibody="" (ab233706),anti-collagen-1="" antibody="" (ab34710),anti-smad3="" (phospho)="" antibody="" (ab52903),="" and="" anti-nox2/gp91phox="" antibody(ab80508)="" were="" purchased="" from="" abcam(cambridge,="" ma,="" usa).="" e-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (20874-1-ap),="" n-cadherin="" polyclonal="" antibody="" (22018-1-ap),="" gpx4="" antibody="" (14432-1-ap),β-actin="" polyclonal="" antibody(20536-1-ap),="" nrf2="" polyclonal="" antibody="" (16396-1-ap),="" and="" keap1="" polyclonal="" antibody="" (10503-2-ap)="" were="" purchased="" from="" proteintech="" (rosemount,="" min,="" usa).ctgf="" polyclonal="" antibody(wl02602)="" and="" snail="" polyclonal="" antibody="" (wlo1863)were="" purchased="" from="" wanleibio="" (shenyang,="">

4.2. Šūnu kultūras un eksperimentālais dizains

Cilvēka aknu zvaigžņu šūnu līnija Lx-2 un cilvēka aknu vēža šūnu līnija Hepg-2 (visas iegūtas no Ķīnas Ceturtās Militārās medicīnas universitātes Farmācijas departamenta) tika kultivētas Dulbecco Modified Eagle Medium ( DMEM), kas papildināts ar 10 procentiem liellopu augļa seruma un 1 procentu penicilīna (Thermo Fisher Scientific) un streptomicīnu (Thermo Fisher Scientific), un pēc tam uztur 37C temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2 un 95 procentiem gaisa. Lai novērtētu Oba ietekmi uz Lx-2 šūnu dzīvotspēju, Lx-2 tika pārklāta ar 1 × 10* šūnām/iedobē 96-iedobes plāksnē un inkubēta 24 stundas pirms pievienošanas. no Obas. Pēc tam Lx-2 apstrādāja ar dažādām Oba koncentrācijām (10, 20, 40, 80 un 160 wM un kultivēja 24, 48 vai 72 stundas. Šūnu dzīvotspēju pārbaudīja CCK8. Lai novērtētu Oba ietekme uz Lx-2 aktivāciju, Lx-2 tika iepriekš kultivēta ar serumu nesaturošu barotni 12 stundas, kam sekoja stimulēšana ar TGF- (10 ng/ml, 24 h) un apstrāde ar Oba vai PFD. Lai novērtētu Oba ietekmi uz iekaisumu, Hepg-2 stimulēja ar CCl4 (20 nm, 8 h) un apstrādāja ar 20 μM Oba. Kultivēšanas beigās šūnas tika savāktas un pakļautas Western blotēšana un reāllaika qPCR analīze.

4.3. Dzīvnieki un eksperimentālais dizains

C57 peļu tēviņi, kas sver 20± 0,5 g (Ceturtās Militārās medicīnas universitātes laboratorijas dzīvnieku centrs), tika izmitināti atbilstošos apstākļos 25 grādi ± 2 grādi temperatūrā un 12-h gaismas/tumsas ciklā. brīva pieeja ūdenim un pārtikai. Katrs eksperiments šajā pētījumā tika veikts saskaņā ar protokoliem, ko apstiprinājusi Ceturtās Militārās medicīnas universitātes dzīvnieku aprūpes komiteja. C57 peles tika nejauši sadalītas 6 grupās (n=6 katrā grupā) šādi: i) viltus kontroles grupa, i) modeļa grupa, ii) augsta Oba grupa (CCl4 plus 6 mg/kg Oba), io )vidēja Oba grupa (CCl4 plus 3 mg/kg Oba）, ø）zema Oba grupa (CCl4 plus 1,5 mg/kg Oba）) un vi） PFD grupa (CCl4＋ PFD). Modeļa grupa tika apstrādāta ar CCl4 (30 procenti CCl4/olīveļļa, 5 ml/kg intraperitoneāla injekcija) trīsreiz nedēļā 6-nedēļas periodā, lai izraisītu aknu fibrozi. Pārējās grupas tika barotas ar dažādām Oba vai PFD devām un vienādiem tilpumiem CCil4 intraperitoneālās infekcijas 6-nedēļas periods. C57 tika ievadīts vienāds daudzums olīveļļas CCl4 vietā, izmantojot ipas a fiktīvu kontroli. Katrs šajā rakstā minētais eksperiments tika veikts saskaņā ar protokoliem, ko apstiprinājusi Ceturtās Militārās medicīnas universitātes Dzīvnieku komiteja Rūpes.

4.4.Rietumu blotēšana

C57 aknas vai kultivētās šūnas tika homogenizētas vai lizētas RIPA buferšķīdumā, izmantojot audu pārklāšanas aparātu vai šūnu nokasīšanu (Service, KZ-2). Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta, izmantojot BCA Protein Assay Kit. Lizāts tika centrifugēts (4 grādi, 12, 000 apgr./min, 5 minūtes), un supernatants tika savākts. Darbības soļi tika ievēroti, kā ziņots iepriekš [14]. Paraugi tika skenēti ar hemiluminiscējošās attēlveidošanas un analīzes sistēmu (Beijing Sage Creation Science Co, MiniChemi 610).

4.5. Reāllaika qPCR analīze

C57 aknas vai kultivētās šūnas tika homogenizētas vai lizētas Trizol reaģentā, izmantojot audu pārklāšanas aparātu, lai iegūtu kopējo RNS. Kopējā RNS tika reversi transkribēta cDNS, izmantojot RevertAid First Strand cDNS sintēzes komplektu. -aktīns tika izmantots iekšējai atsaucei. RT-qPCR tika veikta ar 7500 reāllaika qPCR sistēmu (Applied Biosystems) ar SYBR Premix Ex Taq reaģentiem. Izmantotie cilvēka gēnu primeri ir uzskaitīti 1. tabulā.

Šis raksts ir izvilkts no Molecules 2021, 26, 318. https://doi.org/10.3390/molecules26020318 https://www.mdpi.com/journal/molecules