Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu

I-Fang Wang, 1,2 Yihan Wang, 2 Yi-Hua Yang, 1,3,4 Guo-Jen Huang, 5,6 Kuen-Jer Tsai, 3,4,* un Che-Kun James Shen1,2,7 ,*

1 Neironu reģeneratīvās medicīnas institūta absolvents, Medicīnas zinātnes un tehnoloģiju koledža, Taipejas Medicīnas universitāte, Taipeja 11031, Taivāna

2 Molekulārās bioloģijas institūts, Academia Sinica, Taipeja 11529, Taivāna

3 Klīniskās medicīnas institūts, Medicīnas koledža, Nacionālā Čeng Kunga universitāte, Tainana 70403, Taivāna

4 Klīniskās medicīnas pētniecības centrs, Nacionālā Čenkungas universitātes slimnīca, Medicīnas koledža, Nacionālā Čengkungas universitāte, Tainaņa 70403, Taivāna

5 Biomedicīnas zinātņu katedra un absolventu institūts, Medicīnas koledža, Chang Gung University, Taoyuan 33302, Taivāna

6 Neirozinātnes pētniecības centrs, Chang Gung Memorial Hospital, Linkou 33302, Taivāna

7 Vadošais kontakts

*Sarakste: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-JT), ckshen@tmu.edu.tw (C.-KJS)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche var uzlabot atmiņu

KOPSAVILKUMS

Fenotipiskā variācija ir būtisks priekšnoteikums šūnu un organisma evolūcijai dabiskās atlases ceļā. Lai gan stohastiskā gēnu ekspresijas loma ģenētiski identisku šūnu fenotipiskajā daudzveidībā ir labi pētīta, nav daudz zināms par saistību starp stohastisko gēnu ekspresiju un dzīvnieku individuālās uzvedības variācijām. Mēs parādām, ka noteikta miRNS (miR-466f-3p) tiek pārregulēta atsevišķu inbred peļu daļas hipokampā, veicot Morisa ūdens labirinta uzdevumu. Būtiski, ka miR- 466f-3p pozitīvi regulē neironu morfoloģiju, funkcijas un telpisko mācīšanos, unatmiņapeļu spējas. Mehāniski miR-466f-3p apspiež MEF2A tulkojumu, kas ir negatīvs mācīšanās regulators/atmiņa. Visbeidzot, mēs parādām, ka dažādi hipokampu miR-466f-3p regulējumi izriet no nejaušinātas hipokampu cikliskās AMP (cAMP) atbildes elementu saistīšanas (CREB) fosforilēšanas indivīdiem. Šis telpiskās mācīšanās modulācijas konstatējums unatmiņaIzmantojot randomizētu hipokampu signālu asi pēc neironu stimulācijas, tas parāda, kā audu gēnu ekspresijas izmaiņas izraisa dažādu dzīvnieku uzvedību.

IEVADS

Fenotipu atšķirības starp indivīdiem nodrošina evolucionāras priekšrocības, jo tās nodrošina populācijas daudzveidību, uz kuru iedarbojas dabiskā atlase (Pavlicev et al., 2011). Ģenētiskā izcelsme un vides faktori veicina šādu dabisko variāciju rašanos (Bendesky un Bargmann, 2011). Eksperimentāli inbred peles bieži tika izmantotas, lai pētītu vidējo fenotipu un uzvedības molekulāro un šūnu bāzi, lai samazinātu ģenētisko atšķirību ietekmi starp pārbaudītajiem indivīdiem (Casellas, 2011). Tomēr ir parādītas audu transkripta pārpilnības atšķirības starp atsevišķām izogēnām pelēm. Gēni, kuriem ir ļoti mainīgs ekspresijas līmenis, bieži ir saistīti ar imūno funkciju, stresa reakcijām un hormonālo regulējumu, ti, procesiem, kas ir jutīgi pret vides norādēm (Vedell et al., 2011). Daži no šiem pētījumiem ir arī parādījuši, ka atšķirības gēnu ekspresijā vai šūnu signalizācijā ar vai bez vides faktoru, piemēram, mātes laizīšanas, barības vielu piegādes dzemdē vai stresa izraisītas noturības pret uzņēmību, ietekmes (Bale, 2015; Danchin et al. ., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen et al., 2011), var izraisīt atšķirības fenotipos un uzvedībā (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Telpiskā mācīšanās unatmiņasmadzeņu kontrolēto veidojumu var iedalīt divās sistēmās: (1) egocentriskā navigācija, kas izmanto paškustību un iekšējās norādes, un (2) alocentriskā navigācija, kas galvenokārt ietver hipokampu un tuvējās smadzeņu struktūras, ko stimulē distālās norādes ārpus organismiem (Ekstrom). et al., 2014). Telpiskās mācīšanās spējas unatmiņaļauj lielākajai daļai dzīvnieku sugu pakāpeniski pielāgot savu uzvedību, lai pielāgotos telpiski un laikā mainīgā vidē, kas ir ļoti svarīga to izdzīvošanai. To var novērtēt laboratorijas dzīvniekiem, izmantojot uzvedības paradigmas, piemēram, Morisa ūdens labirintu (MWM) (Vorhees and Williams, 2014). Jo īpaši ir pierādīts, ka ģenētiski identiskiem inbrediem grauzējiem ir fenotipiskas atšķirības telpiskajā izglītībā unatmiņa(Tsai et al., 2002), taču šīs uzvedības variācijas pamatā esošie mehānismi palika nezināmi.

Jaunu atmiņu veidošanās ir sarežģīts process, kam nepieciešama no aktivitātes atkarīga gēna transkripcija, jaunu proteīnu sintēze un

1. attēls. Korelācija starp telpiskās mācīšanās variāciju unatmiņaspēja un miR{0}}f-3p indukcija

(A) MWM uzdevums savvaļas tipa inbred C57BL / 6J pelēm. Kreisais panelis: GLN peļu (punkti) un PLN peļu (kvadrātveida) MWM veiktspēja. No kopumā 289 pārbaudītajām pelēm 180 tika iedalītas kategorijās GLN un 109 kāPLN. Labais panelis:MWMuzdevuma pārbaude (n=47 un 30viena grupa). Histogrammā tiek salīdzināti četru kvadrantu un platformas reģiona pentīna mērījumi. P, trūkstošās platformas vieta; T, mērķa zona bez P; R, labā zona; O, pretējā zona; L, kreisā zona. (B) miRNS ekspresijas RT-qPCR analīze. Sešu miRNS, kas atrodas miR-466-669 klasterī un miR-132-3p, kā ar smadzenēm bagātinātu pozitīvo kontroli, relatīvie ekspresijas līmeņi tika analizēti un normalizēti ar iekšējo kontroles U6 snRNS no GLN un PLN peles hipokampa. (n=9–18 vienai grupai). I, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3lpp.

precīzi noregulēts specifisks neironu tīkls kāatmiņaengrammas, lai izveidotu jaunus neironu savienojumus un noturīgu plastiskumu (Asok et al., 2019). Hipokampu engrammas, kas ir retas neironu populācijas dentate gyrus (DG), attēlo neironu ansambļus, kam ir paaugstināta aktivitāte pēcatmiņaveidošanās. Lai gan DG engram neironiem ir ļoti atšķirīgs gēnu ekspresijas modelis (Rao-Ruiz et al., 2019), pamatā ir engramm specifiskie molekulārie mehānismiatmiņakonsolidācija joprojām lielā mērā nav zināma. Ir zināms, ka dažādi faktori un signalizācijas ceļi pozitīvi vai negatīvi regulē mācīšanos unatmiņaprocesi ir identificēti (Abraham et al., 2019; Humeau and Choquet, 2019). Tostarp cikliskā AMP (cAMP)-reakcijas elementu saistošā proteīna (CREB) aktivētā forma stimulē gēnu transkripciju, reaģējot uz aktivitātes atkarīgu intracelulārā Ca2 plus palielināšanos neironos (Kandel, 2012). No otras puses, nometne/PKApathway nomāc myocyteenhancer factor 2 (MEF2) transkripcijas aktivitāti, novēršot tā līdzrepresora HDAC5 kodoleksportu un koaktivatora NFAT kodolimportu (Belfield et al., 2006). Turklāt, atšķirībā no CREB, MEF2A aktivitāte ierobežoatmiņaveidošanās (Cole et al., 2012). Papildus olbaltumvielu faktoriem mikroRNS (miRNS) ir iesaistītas arī neironu funkciju, tostarp mācīšanās un atmiņas, regulēšanā (McNeill un Van Vactor, 2012). miRNS ir mazas (22 nt) nekodējošas RNS, kas galvenokārt darbojas kā gēnu ekspresijas pēctranskripcijas regulatori, izmantojot sekvences specifisku bāzu savienošanu ar to atpazīšanas vietām 30 netulkotajos specifisko mRNS reģionos (30 UTR) (Daugaard and Hansen, 2017). miRNS piedalās virknē signalizācijas ceļu postmitotiskos neironos, un tie veicina no aktivitātes atkarīgos šūnu procesus, tostarp dendrītu augšanu un sazarošanos, sinapses veidošanos un nobriešanu. Regulējot gēnu ekspresiju, tiem ir arī svarīga loma ilgstošās sinaptiskās plastiskuma formās, kas ir pamatāatmiņaveidošanās, izguve un konsolidācija (Chen and Shen, 2013; Wang et al., 2012b).

Tālāk mēs sniedzam pierādījumus par cēloņsakarību starp stohastisko audu gēnu ekspresiju un individuālajām uzvedības atšķirībām dzīvniekiem. Jo īpaši mēs parādām, ka hipokampu CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A ass stohastiskā aktivizēšana modulē telpiskās mācīšanās individuālās variācijas unatmiņaspēja inbred pelēm.

REZULTĀTI

Telpiskās mācīšanās individuāla variācija unatmiņaspēja ir saistīta ar miR-466f-3p indukciju no noteikta miRNS klastera

Identificēt miRNS, kas iesaistītas mācīšanās regulēšanā unatmiņaveidošanā, mēs izmantojām MWM uzdevumu, lai atšķirtu inbred savvaļas tipa C57BL/6J peles ar labu vai sliktu mācīšanās un atmiņas spēju (1.A attēls). Mēs definējām peles, kuras pēdējā (6.) sesijā paveica uzdevumu 30 s laikā, kā “labi izglītojamie” (GLN), savukārt peles, kuras pēdējā sesijā nevarēja atrast platformu 30 s laikā, tika uzskatītas par “sliktām mācībām”. (PLN). Kā parādīts 1.A attēlā (kreisais panelis), 62 procenti peļu piederēja GLN grupai (180 no 289 pelēm), kas uzrāda ievērojamu aizbēgšanas latentuma samazināšanos no 98,1 s (1. sesija) līdz 21,8 s (6. sesija). Turpretim atlikušo 38% peļu, PLN grupas (109 no 289 pelēm), bēgšanas latentums starp pirmo un sesto sesiju bija tikai mēreni samazināts (no 111,8 s pirmajā sesijā līdz 82,1 s 6. sesijā). . Zondes tests, kas liecināja, ka peles patiešām bija apguvušas uzdevumu sešu sesiju laikā, arī parādīja, ka GLN peles platformas reģionā palika ilgāk nekā PLN peles (1.A attēls, kreisais stieņu pāris labajā panelī).

Pēc tam mēs analizējām RNS no GLN un PLN peļu hipokampa, izmantojot miRNS mikroarray hibridizāciju (n=4 katrā grupā). Kopumā mēs novērojām salīdzinoši nelielas atšķirības hipokampu miRNS ekspresijas profilos no GLN un PLN pelēm. Tomēr mēs atzīmējām, ka 10 populārākās miRNS, kuru ekspresijas līmenis bija augstāks GLN pelēm nekā PLN pelēm (dati nav parādīti), tika iegūtas no viena un tā paša grauzējiem specifiskā miRNS klastera, miR-466-669, kas atrodas 10. intronā. mSfmbt2 gēns (skatīt zemāk). Pamatojoties uz reversās transkripcijas kvantitatīvās polimerāzes ķēdes reakcijas (RT-qPCR) analīzi par atlasīto miRNS ekspresijas līmeņiem klasterī, mēs izvēlējāmies miR-466f-3p turpmākai izpētei (1.B attēls). Šīs miRNS vidējā ekspresija GLN peļu hipokampā bija 1{12}}reizi augstāka nekā PLN pelēm. Proti, vidējais hipokampu miR-466f-3p līmenis bija līdzīgs PLN grupā, mājas būra (HC) kontroles grupā un peldēšanas kontroles grupā (1. C attēls), tādējādi izslēdzot ar vingrinājumiem saistītos efektus laikā. peldēšana un vēl vairāk atbalstot domu, ka miR-466f-3p tika ierosināts telpiskās mācīšanās unatmiņaveidošanās.

1.C attēlā dati atklāj, ka hipokampu miR-466f-3p ekspresijas līmeņi vairāk nekā 42 procentiem GLN peļu bija vismaz 1.{5}}reizi augstāki nekā vidējais ekspresijas līmenis HC kontroles pelēm, savukārt 15 procentiem PLN peļu līmenis bija uz pusi mazāks nekā HC pelēm. Aptuveni 25 procentiem GLN peļu un 55 procentiem PLN peļu bija līdzīgs miR-466f{{10}}p (0.8- līdz 1.{14}} reizes attiecībā pret HC). Pīrsona korelācijas izkliedes diagramma, kas parāda pozitīvu korelāciju starp miR-466f-3p līmeni un procentuālo ilgumu platformā zondes testa laikā, ir parādīts 1.D attēlā. Mēs arī veicām miR-466f-3p un U6 mazo kodola RNS (snRNS) in situ hibridizāciju (ISH) smadzeņu šķēlēs gan GLN, gan PLN pelēm (1. attēls). MiR- 466f-3p signālu statistiskā analīze, izmantojot ISH, apstiprināja, ka miR-466f- 3p indukcija patiešām bija lielāka GLN peļu ĢD, salīdzinot

PLN pelēm, savukārt, salīdzinot U6 snRNS signālus, atšķirība netika atrasta (labā histogramma, 1. E attēls). Lai gan miR-466-3p signāli nebija vienādi starp atsevišķām granulu šūnām DG, tie joprojām ievērojami un visuresoši palielinājās GLN peļu hipokampā, salīdzinot ar PLN pelēm. Tāpēc miR-466f-3p indukcija nenotika tikai nelielā šūnu daļā, piemēram, engrammas neironos. Šie dati liecina, ka miR-466f-3p regulēšana MWM uzdevuma laikā ir cieši saistīta ar labāku telpisko mācīšanos unatmiņaiespēja starp ievērojamu daļu GLN peļu.

Mēs arī analizējām vairāku smadzenēm specifisku miRNS vidējos ekspresijas līmeņus ar RT-qPCR. Tostarp miR-132-3p tika pārregulēts peles hipokampā pēc MWM uzdevuma, taču mēs nenovērojām būtiskas atšķirības starp GLN un PLN grupām (VII joslu pāris, 1.B attēls). MiR-335-5p un miR-22 ekspresijas līmeņi GLN, PLN un HC grupās bija līdzīgi (S1A attēls). Tādējādi, atšķirībā no miR-466f-3p, šo miRNS hipokampu ekspresija MWM treniņa laikā nav saistīta ar telpisko mācīšanos unatmiņapeļu spējas.

miR-466f-3p augšupregulācija veicina neirīta izaugšanu un dendrīta mugurkaula veidošanos

Lai apstiprinātu, ka miR-466f-3p patiešām tika izteikts neironos, mēs veicām miRNA ISH kombināciju ar NeuN un MAP2 imūnfluorescences (IF) krāsošanu primārajos hipokampu neironos. Rezultāti parādīja, ka līdzīgi kā citām miRNS (Cohen et al., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p galvenokārt tika izteikts neironu somas reģionā ar dažiem papildu signāliem. dendritos (S2A attēls). Lai izprastu molekulāro un šūnu pamatu augšupregulēta miR-466f-3p saistībai ar mācīšanos unatmiņaveidošanās, mēs vispirms īslaicīgi pārmērīgi ekspresējām miR-466f-3p kopā ar dsRed saplūšanas polipeptīdu, ko kontrolē ubikvitīna promotors no pFUGW-miR-466f-3p- dsRed plazmīda DIV10 primārajos hipokampu neironos (S2B attēls). Izmantojot miRNA ISH, mēs apstiprinājām, ka miR-466f-3p signāls ir spēcīgāks miR-466f-3p pārmērīgas ekspresijas grupā, salīdzinot ar vektora kontroli vai mutantu miR{{ 12}}f-3p grupa (bultiņas, S2B attēls). Paralēli mēs izveidojām arī platformu, lai izpētītu miR-466f-3p funkcijas zuduma ietekmi miR-466f-3p inhibīcijas dēļ, izmantojot miR-sūkli, kas atrodas 30 UTR EGFP mRNS, kas ekspresēts no pFUGW-miR-sūklis-EGFP plazmīdas (S2C attēls). EGFP reportieris sūkļa plazmīdā kalpoja gan kā transfekcijas efektivitātes indikators, gan šūnu miRNS aktivitātes sensors (Kluiver et al., 2012). Ievērojamā daļā transfektēto HEK293T šūnu EGFP signāls samazinājās pēc koekspresijas ar savvaļas tipa miR-466f-3p, bet ne ar mutantu miR-466f{{32. }}p, jo tiek kavēta EGFP mRNS translācija, saistoties miR-466f-3p ar miR-sūkli 30 UTR (salīdziniet četrus kreisos attēlus un divas his-programmas, S2C attēls) . Turpretim mēs nenovērojām samazinātu EGFP signālu pēc kontroles sūkļa līdzekspresijas, kas kodē astoņas šifrētās secības kopijas no pFUGW-SCR-sponge-EGFP plazmīdas ar miR-466f-3p vai tā mutants (salīdziniet četrus labos attēlus un divas histogrammas).

Kā parādīts 2.A attēlā, miR-466f-3p ārpusdzemdes ekspresija izraisīja neironu morfoloģiskas izmaiņas, jo īpaši pastiprinātu neirīta izaugumu salīdzinājumā ar kontroles neironiem, kas transficēti ar dsRed ekspresējošo vektoru pFUGW- dsRed vai mutanta miR-466f-3p-izpaužoša plazmīda pFUGW-mut-miR- 466f-3p-dsRed. Kvantifikācijas dati parādīja, ka vidējais dendrīta zaru skaits uz vienu neironu būtiski neatšķīrās starp miR-466f-3p pārmērīgi ekspresējošo grupu (II josla) un vektora vai mutanta kontroli (I un III josla) (labajā pusē) augšējā histogramma, 2.A attēls). Tomēr vidējais kopējais dendrīta garums un primāro dendrītu vidējais garums palielinājās pēc miR-466f-3p pārmērīgas ekspresijas (salīdzināt II joslu ar I un III joslu, 2.A attēla labā apakšējā histogramma). Paralēli mēs inhibējām endogēno miR-466f-3p, izmantojot miR-sūkli. Kā redzams, nebija būtisku atšķirību dendrīta zaru skaitā starp miR-466f-3p-inhibīcijas un kontroles grupām (salīdzināt IV joslu ar I un V joslu, labā augšējā histogramma, 2.A attēls) , bet miR-466f-3p-inhibīcijas grupa uzrādīja ievērojamu vidējā kopējā dendrīta garuma, kā arī primāro un sekundāro dendrītu vidējo garumu samazināšanos salīdzinājumā ar citām grupām (salīdziniet IV joslu ar I un V, labā apakšējā histogramma 2.A attēlā). Turklāt IF krāsošana parādīja, ka miR- 466f-3p pārmērīga ekspresija, bet ne inhibīcija, arī palielināja dendritisko muguriņu blīvumu (2.B attēls, augšējie paneļi un apakšējā kreisā histogramma). Mēs arī veicām postsinaptiskā blīvuma proteīna 95 (PSD-95) kopkrāsošanu un saskaitījām kolokalizēto dendritisko muguriņu blīvumu, lai noteiktu precīzu ierosinošo sinapsu skaitu (2.B attēls, apakšējā labajā histogrammā), kas atklāja, ka miR{{40 }}f-3p pārmērīga ekspresija palielināja PSD-95-pozitīvo muguriņu blīvumu salīdzinājumā ar citām kontroles grupām. Tomēr miR-466f-3p inhibīcija būtiski nemainīja PSD-95-pozitīvo muguriņu blīvumu attiecībā pret kontroles grupu blīvumu (2.B attēls, apakšējā labajā histogrammā). Kopā šie dati liecina, ka, ja nav neironu stimulācijas, miR-466f-3p inhibīcija pati par sevi neietekmē ierosinošo sinapsu blīvumu vai kopējo dendritisko muguriņu.