Mediālās entorhinālās garozas ievades hipokampā optoģenētiskā inhibīcija īsā laika periodā tieši pēc mācīšanās izjauc kontekstuālo baiļu atmiņas veidošanos

Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Abstrakts

Laika asociācijas veidošanāsatmiņaun kontekstam specifiskas bailesatmiņaTiek uzskatīts, ka ir nepieciešama mediāla entorhinālā garoza (MEC) ievadehipokampsmācību pasākumu laikā. Tomēr tas, vai MEC ievades ir iesaistītas arī atmiņas veidošanā pēcapmācības periodā, vēl nav tieši pārbaudīts. Lai pārbaudītu šo iespēju, mēs optoģenētiski inhibējām aksonus un termināļus, kas radušies no divpusējiem muguras MEC ierosinošiem neironiem muguras daļā.hipokamps5 minūtes uzreiz pēc konteksta baiļu kondicionēšanas (CFC). Pelēm, kas ekspresē eNpHR3.{2}}, bija ievērojami mazāka sasalšana, salīdzinot ar kontroles pelēm, kuras izguves testa laikā kondicionētā kontekstā 1 dienu pēc mācīšanās ekspresēja tikai EGFP. Turpretim tāda pati MEC ievades optoģenētiskā inhibīcija, kas veikta 30 minūtes pirms izguves testa, neietekmēja sasalšanu izguves testa laikā, izslēdzot iespēju optiskās inhibīcijas nespecifiskai kaitīgai ietekmei uz izguves procesu. Šie rezultāti apstiprina, ka kontekstuālās baiļu atmiņas veidošanai ir nepieciešama MEC ievade hipokampā pēcmācību periodā.

Atslēgvārdi: Mediālā entorinālā garoza, Hipokamps, Kontekstuālā baiļu kondicionēšana

Min Soo Kang un Jin-Hee Han

Hipokampa-entorhinālā garozas sistēma ir izšķiroša epizodiskaiatmiņaveidošanās [1]. Pierādījumi liecina, ka ievade no mediālā entorinālā garozas III slāņa (MECIII) uzhipokamps, galvenokārt attiecībā uz CA1 apakšlauku, ir izšķirošs temporālai asociatīvai mācīšanai, piemēram, izsekot bailēm, bet ne kontekstuālai un aizkavētu baiļu kondicionēšanai [2, 3]. Turpretim mediālā entorinālā garozas slāņa II (MECII) šūnu optoģenētiskā inhibīcija CFC laikā, kas projicējas uz dentate gyrus (DG) un CA3, bet ne šūnas, kas projicējas uz CA1, pasliktina atmiņas veidošanos [4]. Tiek uzskatīts, ka MECII ievade DG vai CA3 ir nepieciešama kontekstuālo baiļu apguvei. Ne tikai mācīšanās procesā, bet arī MEC ievade hipokampā ir iesaistīta unikālos fizioloģiskās aktivitātes modeļos, kas tiek novēroti hipokampā atpūtas un miega laikā, piemēram, viļņošanās un zobainās tapas, kas ir saistītas aratmiņakonsolidācijas process [5–10]. Tāpēc MEC ievadehipokampsvar būt nozīme atmiņas veidošanā pēcmācību periodā. Tomēr šī iespēja vēl nav pārbaudīta. Lai pārbaudītu, vai MEC ievade hipokampā ir nepieciešama pēcapmācības periodā, mēs pieņēmām optoģenētisku pieeju MEC ievades aktivitātes apklusināšanai 129/C57Bl/6 hibrīdpelēm [11, 12]. Lai manipulētu ar MEC ievadi, abpusējā abpusē tika ievadīts adeno-associated vīruss (AAV), kas satur gēnus, kas kodē eNpHR3.{9}} un sapludināts ar fluorescējošu proteīnu EYFP zem CaMKII promotora (AAV-CaMKII — eNpHR3.{13}}EYFP). MEC mērķauditorijas atlase uz II un III slāni (0,5 µL katrā pusē; AP: – 4,65 mm; ML:±3,4 mm; DV: – 3,3 mm) (1.a att.). Kā kontroli mēs injicējām AAV, kam trūkst eNpHR3.0 (AAV CaMKII -EGFP), kas ekspresē tikai fluorescējošu proteīnu. AAV ekspresija bija ierobežota ar MEC II un III slāņiem, kas nosūta projekciju uz hipokampu (1.b attēls). Hipokampā MEC aksonu projekcijas, kas izsaka EYFP, tika konstatētas DG un CA3, kuru izcelsme ir MECII, kā arī CA1, kura izcelsme ir MECIII (1.a attēls). Trīs nedēļas pēc AAV injekcijas operācijas peles atkal tika anestēzijas optiskās šķiedras implantu operācijai.

Cistanchevar uzlabotatmiņa

Optiskās šķiedras tika implantētas muguras hipokampā (AP: -20 mm; ML: ±1,3 mm; DV: -1,5 mm), lai ar 561-nm lāzeru optiski nomāktu dorsālās MEC ievades. Optisko šķiedru gali atradās tieši virs CA1 stratum lakunozes-molekulārā slāņa, un tāpēc 561-nm lāzers varēja aptvert gan MECII aferentus DG molekulārajā slānī/CA3 stratum radiatum, gan MECIII aferentus CA1 stratum lakunozes-molekulārajā slānī ( 1. papildu fails: S1 att.). Nedēļas atveseļošanās periodā pēc implanta operācijas peles 3 dienas piedzīvoja šķiedru pieradināšanu. Tie tika savienoti ar gaismu izvadošu optisko plākstera vadu un ievietoti pieradināšanas būrī uz 5 minūtēm bez gaismas piegādes. Pēc 3 dienu pieradināšanas EGFP un eNpHR3.{21}} peles tika apmācītas lietot CFC.

Peles iekļuva kondicionēšanas kamerā un saņēma pēdas triecienu ({{0}},5 mA, 2 s) pēc 3 minūtēm. Vienu minūti pēc pēdas trieciena peles nekavējoties tika pārvietotas uz pieradināto būru un 5 minūtes saņēma nepārtrauktu 561-nm gaismu (5 mW šķiedras galā) (1.b attēls). Pēc inhibīcijas pēc mācīšanās peles atgriezās savos mājas būros. Lai pārbaudītu, vai kontekstuālā atmiņa ir pareizi izveidota, tika pārbaudīta ilgtermiņa atmiņa (LTM). Peles atkārtoti iekļuva kondicionēšanas kamerā 24 stundas pēc CFC. Sasalšanas līmeņi tika mērīti kā LTM indekss, uzraudzīts 3 minūtes. Pelēm eNpHR3.0 grupā bija ievērojami mazāks apsaldējums, salīdzinot ar pelēm EGFP kontroles grupā (1.c att.), kas liecina par 24-h LTM deficītu pēc MEC ievades inhibīcijas hipokampā. Šis sasalšanas samazinājums nebija saistīts ar optiskās kavēšanas procesa nespecifisku kaitīgo ietekmi. Kad tā pati optiskā inhibīcija tika nodrošināta 30 minūtes pirms LTM testa, starp grupām nebija būtiskas sasalšanas atšķirības (1.d, e att.).

Lielākā daļa MEC aferento ir vērsti uz hipokampu, ir zināms, ka MEC sūta projekcijas uz mediālajām prefrontālajām garozas zonām, piemēram, prelimbisko un infralimbisko garozu [13]. Tā kā AAV ekspresija MEC bija nejauša, iespējams, ka mūsu optiskā inhibīcija ietekmēja MEC aksonus, kas iet caur hipokampu, ja tādi ir, lai radītu ietekmi uz kontekstuālās bailes atmiņas veidošanos. Lai izslēgtu šo iespēju, mēs retrogrādi iezīmējām MEC neironus, kas izvirzīti uz hipokampu. Mēs injicējām CAV2-Cre vīrusu hipokampā, ko retrogrādā veidā uztver neironi, kas projicējas uz hipokampu caur aksonu galiem (1. f attēls).

AAV-Ef1 - DIO-eNpHR3.0-EYFP vai AAV-Ef1 -DIO-EYFP tika ievadīts MEC, tāpēc MEC neironi, kas ir uzņēmuši CAV2-Cre, var express eNpHR3.{10}}EYFP vai EYFP (1. papildu fails: S2. att.). Desmit, mums izdevās inhibēt MEC ievadi hipokampā tūlīt pēc CFC. Līdzīgi kā iepriekšējie rezultāti, šajā stāvoklī optiskā kavēšana traucēja konteksta baiļu atmiņas veidošanos (1.g, h att.). Tādējādi šie dati vēl vairāk pastiprina mūsu secinājumu, ka MEC ievade hipokampā ir būtiska kontekstuālās atmiņas veidošanai pēcmācību periodā. Viens no ierobežojumiem šajā pētījumā ir telpiskās specifikas trūkums izmantotajā optiskajā inhibīcijā.

Tādējādi nav skaidrs, cik lielā mērā un tieši kur hipokampu ķēdē plaši izplatītās MEC ievades tika nomāktas ar optisko kavēšanu mūsu stāvoklī. Var būt nepieciešama precīza MEC ievades inhibīcija, kas vērsta uz noteiktu apakšlauku, piemēram, hipokampa CA1 vai DG, lai noskaidrotu mehānismu, ar kuru MEC ievades veicina kontekstuālās bailes atmiņas veidošanos turpmākajā pētījumā. Lai gan šajā pētījumā mēs nepārbaudījām MEC ievades optiskās inhibīcijas ietekmi uz hipokampu dažādos laika punktos pēc konteksta baiļu kondicionēšanas, iepriekšējos pētījumos ziņots par smadzeņu darbību pēcapmācības laika atkarīgu lomu no hipokampa atkarīgo atmiņu konsolidācijā, piemēram, kontekstuāla baiļu kondicionēšana. Piemēram, izmantojot optoģenētisko stratēģiju, iepriekšējais pētījums mākslīgi manipulēja ar lēnā viļņa miega (SWS) indukciju dažādos laika punktos pēc dažādiem mācību uzdevumiem, un izrādījās, ka pastāv kritisks laika logs (30 minūšu laikā), kura laikā SWS inducēts. ar gaismu var uzlabot no hipokampu atkarīgās atmiņas [14].

1. att. MEC ievades kavēšana hipokampā tūlīt pēc nopelnīšanas pasliktina ilgtermiņa kontekstuālās baiļu atmiņas veidošanos. a Abpusējās AAViniection un optiskā uzgaļa implantācijas vietas shematisks attēlojums (eft). Reprezentatīvi conkocalmikroscopk attēli, kuros redzama EGFP un eNpHR0-EYFP izteiksme MEC augšpusē) un hipokampā (apakšā). Zvaigznīte norāda optiskās šķiedras gala aptuveno pozīciju. b Uzvedības shēma. histogramma, kas parāda sasalšanas līmeni testeNpHR30 laikā ap (3589主 3,21 procenti ,n=】1】) uzrādīja ievērojami mazāku dārgakmeni, salīdzinot ar EGFP kontroles grupu (53,13±265 procenti ,n=12) LTM tests.**lpp<00005; students="" t-test.behavior="" scheme.e="" histogram="" shoving="" freezing="" level="" during="" the="" test.enphr3.0(5031±290%,n="1l)and" egfp(4831±427%,n="10group" showed="" similar="" feinglevelin="" utm="" tes.p="">005:Studentu t-test.nav nozīmīgs,f CAV un AAV inigctign stratēģija vai MEC neironu izplatīšanās uz hipokampu retrogrāds marķējums(f) Divpusējas CW injekcijas AW injekcijas un optiskā uzgaļa implanta vietas (pa labi) uzvedības shēmas shematisks attēlojums. h Histogramma, kas parāda sasalšanas līmeni testa laikā. Grupa eNpHR3.0 (33,71±4,06 procenti ,n=11) ​​uzrādīja ievērojami zemāku sasalšanas līmeni, salīdzinot ar EYFP kontroles grupu (50,13±3,18 procenti ,n=12) LIM testā. .** lpp<0005; student's="" t-test="" data="" are="" presented="" as="">

Interesanti, ka cits pētījums ar žurkām parādīja, ka tiešās entorinālās projekcijas (temporoammoniskais, TA) selektīvie elektrolītiskie bojājumi uz hipokampu zonu CA1 24 h, bet ne 3 nedēļas pēc Morisa treniņa ūdens labirintā traucēja telpiskās atmiņas veidošanos tālvadības pultī. laikā, kas liecina, ka MEC-hipokampa mijiedarbība caur TA ievades ceļu šajā laika periodā ir nepieciešama sistēmu konsolidācijai [15]. Ņemot vērā šos atklājumus, ļoti iespējams, ka MEC ievadei hipokampā ir no laika atkarīga loma nesenās un attālās kontekstuālās baiļu atmiņas veidošanā.

Mūsu pētījumā ir interesanti, ka tik īss optoģenētiskās inhibīcijas periods (5 minūtes) pēc treniņa bija pietiekams, lai pasliktinātu konteksta atmiņas veidošanos. Viena interpretācija ir tāda, ka mūsu rezultāti var atspoguļot daļēju konsolidācijas notikumu bloku, kas nepieciešams normālai atmiņas veidošanai. Saskaņā ar šo kontu mūsu stāvoklī atmiņa bija daļēji traucēta. Vēl viena iespēja ir tāda, ka šajā īsajā laika posmā, kas nepieciešams kontekstuālās baiļu atmiņas veidošanai, var notikt kāds kritisks notikums. Viena iespēja ir tāda, ka MEC ievade var būt izšķiroša, lai hipokampā izraisītu viļņus vai zobainus tapas, kas ir saistīti ar iepriekš piedzīvotu notikumu atkārtošanos [7, 9, 10, 16], un MEC ievades optoģenētiskā inhibīcija var izjaukt šādus aktivitātes modeļus. Alternatīvi, īslaicīga MEC ievades kavēšana varēja ietekmēt turpmāko lēno viļņu miegu, kam ir arī izšķirošs laika logs no hipokampa atkarīgas atmiņas konsolidācijas ziņā [14].

Atsauces

1. Eihenbaums H. Kortikālā-hipokampālā sistēma deklaratīvai atmiņai. Nat Rev Neurosci. 2000;1(1):41–50.

2. Suh J, Rivest AJ, Nakashima T, Tominaga T, Tonegawa S. Entorhinālā garozas slāņa III ievade hipokampā ir ļoti svarīga laika asociācijai

3.atmiņa. Zinātne. 2011;334(6061):1415–20.Kitamura T, Pignatelli M, Suh J, Kohara K, Yoshiki A, Abe K, et al. Salas šūnas kontrolē laika asociācijas atmiņu. Zinātne. 2014;343(6173):896–901.

4. Kitamura T, Sun C, Martin J, Kitch LJ, Schnitzer MJ, Tonegawa S. Entorhinal garozas okeāna šūnas kodē īpašus kontekstus un virza kontekstam specifisku baiļu atmiņu. Neirons. 2015;87(6):1317–31.

5. Buzsaki G, Horvath Z, Urioste R, Hedtke J, Wise K. Augstas frekvences tīkls

6.oscilācija hipokampā. Zinātne. 1992;256(5059):1025–7.Bragin A, Jando G, Nadasdy Z, Vanlandeghem M, Buzsaki G. Dentate EEG spikes and related interneuron populations bursts in the hippocampal hilar region of the rat. J Neirofiziols. 1995;73(4):1691–705.

7. Chrobak JJ, Lorincz A, Buzsaki G. Physiological patterns in the hippocampal-entorhinal cortex system. Hipokamps. 2000;10(4):457–65.

8. Girardeau G, Zugaro M. Hipokampu viļņi un atmiņas konsolidācija. Curr Opin Neurobiol. 2011;21(3):452–9.

9. Yamamoto J, Tonegawa S. Tieša mediālā entorhinālā garozas ievade uz hipokampu CA1 ir ļoti svarīga ilgstošai klusai nomoda atkārtošanai. Neirons. 2017; 96(1): 217–27.

10. Nokia MS, Gureviciene I, Waselius T, Manila H, Penttonen M. Hippocampal electric stimulation disrupts associative learning when targeted at dentate spikes. J Physiol-London. 2017;595(14):4961–71.

11. Wehner JM, Silva A. Celmu atšķirību nozīme mācīšanās un atmiņas procesu novērtējumos nullmutantos. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 1996;2(4):243–8.

12. Vetere G, Kenney JW, Tran LM, Xia F, Steadman PE, Parkinson J u.c. Smadzeņu mēroga baiļu atmiņas tīkla hemoģenētiskā iztaujāšana pelēm. Neirons. 2017;94(2):363–74.

13. Insausti R, Herrero MT, Witter MP. Žurku entorinālā garoza: citoarhitektoniskās apakšnodaļas un kortikālo aferentu izcelsme un izplatība. Hipokamps. 1997;7(2):146–83.

14. Lu Y, Zhu ZG, Ma QQ, Su YT, Han Y, Wang X u.c. Kritiskais laika logs selektīvai hipokampu atmiņas konsolidācijas ierosināšanai ar īsu lēna viļņa miega epizodi. Neiroloģijas biļetens. 2018;34(6):1091–9.

15. Remondes M, Šūmans EM. Kortikālās ievades loma hipokampu zonā CA1 ilgtermiņa atmiņas konsolidācijā. Daba. 2004;431(7009):699–703.

16. O'Neill J, Boccara CN, Stella F, Schoenenberger P, Csicsvari J. Mediālās entorinālās garozas virspusēji slāņi atkārtojas neatkarīgi no hipokampa. Zinātne. 2017;355(6321):184–8.