Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Imane Bensāda, Blēzs Robins3, Džoila Peresa, Jans Salemkūrs, Anna Čipona, Marine Camus, Mathilde Lemoine, Lea Guyonnet, Helēna Lazareta, Emanuels Letavernjē, Kerola Henika, Pjērs Luiss Tara un Olīvija Lenuāra.

“Université de Paris, PARCC, Inserm, Paris, Francija; un Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cite, Parīze, Francija

Proteīnūrijas spēcīgā paredzamā vērtība hronisku glomerulopātiju gadījumā ir stingri noteikta, kā arī angiotenzīna ll patogēnā loma, veicinot glomerulārās slimības progresēšanu ar mainītu glomerulārās filtrācijas barjeru, podocītu traumu un glomerulu rētu veidošanos. Šeit mēs noskaidrojām, ka hroniska angiotenzīna Il izraisīta hipertensija kavē autofagijas plūsmu peles glomerulos. Atg5 (gēns, kas kodē proteīnu, kas saistīts ar autofagiju) dzēšana īpaši podocītos izraisīja paātrinātu angiotenzīna I izraisītu podocitopātiju, pastiprinātu albuminūriju un glomerulosklerozi. Tas norāda, ka šajā stāvoklī autofagija ir galvenais podocīta aizsardzības mehānisms. Angiotenzīna-Il izraisītā kalpaīna aktivitāte podocītos kavē autofagijas plūsmu. Podocīti no pelēm ar endogēnā kalpaīna inhibitora kalpastatīna transgēnu ekspresiju sākotnēji parādīja augstāku podocītu autofagiju, kas bija rezistenta pret angiotenzīna Il atkarīgo inhibīciju. Arī ilgstoša autofagija ar kalpastatīnu ierobežoja podocītu bojājumus un albuminūriju. Šie atklājumi liecina, ka hipertensijai ir patogēna ietekme uz glomerulāro struktūru un funkciju, daļēji aktivizējot kalpaīnus, kas izraisa podocītu autofagijas bloķēšanu. Šie atklājumi atklāj oriģinālu mehānismu, ar kuru angiotenzīna Il mediētā hipertensija inhibē autofagiju, kalcija izraisītu kalpaīna piesaisti ar patogēnām sekām kalpastatīna aktivitātes nelīdzsvarotības gadījumā. Tādējādi kalpaīna izraisītas autofagijas samazināšanās novēršana var būt daudzsološa jauna terapeitiskā stratēģija nefropātijām, kas saistītas ar augstu renīna-angiotenzīna sistēmas aktivitāti.

Cistanchedeserticola novēršnieresslimība

Tulkošanas paziņojums

Ņemot vērā autofagijas izšķirošo lomu attīstībānieresslimības, autofagijas farmakoloģiskā modulācija varētu būt daudzsološa stratēģija vairāku nieru slimību profilaksei un ārstēšanai. Paralēli tika konstatēts, ka kalpaīna aktivitātes pārmērīgai aktivizēšanai podocītos ir kaitīga ietekme uz podocītu darbību, savukārt tās kaitīgie darbības mehānismi netika identificēti. Šeit mēs sniedzam pierādījumus tam, ka kalpaīns saista angiotenzīna Il kaitīgo darbību ar kaitīgo autofagijas blokādi podocītos un liecina, ka kalpaīna inhibīcija varētu būt daudzsološs terapeitiskais mērķis podocītu slimībām, daļēji saglabājot podocītu autofagiju.

Hipertensija ir otrajā vietā aiz diabēta kā galvenais progresējošas slimības cēlonishroniskanieresslimība- un pat neliels asinsspiediena paaugstināšanās ir neatkarīgs riska faktors nieru slimības beigu stadijā. Arvien vairāk eksperimentālo pētījumu ir uzsvēruši podocītu nozīmi attīstībānieresievainojums. Progresējošs podocītu zudums un mikrovaskulāras izmaiņas parādās agri, funkcionāliem nierēm samazinoties eksperimentālai hipertensīvai nefropātijai. Pacientiem tika pierādīts, ka dzīvotspējīgo podocītu izdalīšanās ar urīnu ir jutīgs un specifisks preeklampsijas marķieris, un pacientiem ar nefrosklerozi bija ievērojami mazāks glomerulāro podocītu blīvums nekā nieru donoriem. Turklāt angiotenzīna II (Eņģeļa) patogēnā loma glomerulārās slimības progresēšanas veicināšanā ir labi pierādīta ne tikai hipertensīvos apstākļos, bet arī vairākās glomerulārās slimībās.

Glomerulārā hipertensija izraisa glomerulāro kapilāru stiepšanos, endotēlija bojājumus un paaugstinātu glomerulāro proteīnu filtrāciju, izraisot glomerulu kolapsu un glomerulosklerozi. Tas arī tieši iedarbojas uz glomerulārām struktūrām, izraisot signālu regulējošas reakcijas, kuru mērķis ir kompensēt. Aktivizēta sistēmiskā un lokālā renīna-angiotenzīna-aldosterona sistēma (RAAS) veicina mezangiālo hiperplāziju un asinsvadu caurlaidības faktoru sintēzi. Vienlaikus podocīti parāda kalcija signālus un maina savu formu uz AnglI 1. tipa receptoru (AT1)-28šie adaptīvie mehānismi, kas ir atkarīgi no stimulācijas.24-28 ilgtermiņā kļūst slikti adaptīvi, beidzot izraisot glomerulosklerozi. AT1 veicina ievērojamu RAAS iesaistīšanos asinsspiedienā un sāls un ūdens homeostāzē. Angiotenzīnu konvertējošā enzīma inhibitorus un AT1 blokatorus klīniski izmanto hipertensijas un sirds mazspējas ārstēšanai pacientiem. Interesanti, ka abiem blokatoriem ir arī aizsargājoša iedarbība uznieresfunkciju.

Tika pierādīts, ka autofagija ir būtiska šūnu homeostāzes uzturēšanai, īpaši postmitotiskajos un īpaši podocītos.{0}} Autofagija ir ar cll9olisosomām saistīta noārdīšanās sistēma ilgstošiem citoplazmas proteīniem un disfunkcionālām organellām55, un tā ietver proteīnu un organellu sekvestrāciju. autofagosomās. Autofagosomu veidošanās ir atkarīga no vairāku gēnu, tostarp Mapllc3a/b, Berlin 1 un Atgs, indukcijas. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka autofagiskā ceļa disregulācija ir saistīta ar patoģenēzi.nieresnovecošanās un vairākasnierestādas slimības kā akūts nieru bojājums, policistiska nieru slimība, novecošana un diabētiskā nefropātija.

Autofagijas regulēšana podocītos, fizioloģiska un, galvenokārt, patoloģiskā kontekstā, nav labi zināma. Nesen mēs parādījām, ka podocītu autofagija ir neatkarīga no rapamicīna (mTOR) regulēšanas mehāniskā mērķa fizioloģiskos apstākļos, padarot šo šūnu tipu par izņēmumu. AT1 aktivācija stimulē proteīnu sintēzi un olbaltumvielu apriti šūnās. Tādējādi mēs pamatojām, ka RAAS aktivizēšana var ietekmēt arī olbaltumvielu apgrozījuma stimulāciju un proteostāzi.

Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz AnglI signālu lomu podocītu autofagijas regulēšanā. Mēs identificējām kalcija aktivētās proteāzes kalpaīnus, kas mediē AnglI hronisku bloķējošo iedarbību uz podocītu autofagiju. Turklāt mēs noskaidrojām, ka endogēnais kalpaīna inhibitors kalpastatīns spēja novērst no AngI atkarīgo autofagijas inhibīciju un podocītu bojājumus hipertensijas laikā.

Šie atklājumi atklāj oriģinālu mehānismu, saskaņā ar kuru AnglI izraisīta hipertensija inhibē autofagiju, kalcija izraisītu kalpaīna piesaisti ar patogēnām sekām kalpastatīna aktivitātes nelīdzsvarotības gadījumā.

METODES

Dzīvnieki

Kalpastatīna transgēnās (CST18) peles laipni apgādāja Dr. E. Letavernjē. Peles ar podocītiem specifisku Atg5 traucējumu) tika ģenerētas, kā iepriekš aprakstīts gēns (Nphs2.cre Atg5'o), krustojot Nphs2.cre peles ar Ag5lxlomice5 uz C57BL6/J fona. Nphs2.cre Atg5'oxlox peles un kontroles metiena biedru tēviņi , vecumā no 10 līdz 12 nedēļām. Hipertensijas modelis tika ierosināts ar AnglI (Sigma-Aldrich, A9525) sc infūziju devā 1 ug/kg/min 4 līdz 6 nedēļas caur osmotiskie minisūkņi (Alzet Corp, 2006. gada modelis). Sūkņi tika implantēti mugurā starp lāpstiņām un gurniem. Peles pārtikā saņēma papildu sāli (3% NaCl). Atgsloxilox (savvaļas tipa [WT]) peles tika izmantotas kā kontroles. visos pētījumos. Attiecībā uz deoksikortikosterona acetāta (DOCA) sāli ar nefronu samazināšanas modeli pieaugušiem peļu tēviņiem tika veikta vienpusēja kreisās puses nefrektomija. Divas nedēļas pēc nefrektomijas tās saņēma DOCA granulas ar 21-dienas atbrīvošanu (Innovative Research of America), kas tika implantētas sc. Otrā granula tika implantēta 3 nedēļas pēc pirmā implanta. Visas peles re saņēma 0,9% NaCl dzeramajā ūdenī ad libitum un tika nogalināti pēc 6 nedēļu DOC ievadīšanas.6 Eksperimenti tika veikti saskaņā ar Francijas veterinārajām vadlīnijām un Eiropas Kopienas formulētajām vadlīnijām izmantošanai eksperimentos ar dzīvniekiem (L358-86/609EEC). un tos apstiprināja Francijas Pētniecības ministrija un vietējās universitātes pētniecības ētikas komiteja (APAFIS-7646 un -22373).

Primārās podocītu kultūras eksperiments

Diferencēti primārie podocīti tika kultivēti, kā aprakstīts iepriekš./Īsumā, tikko izolētā nieru garoza tika sajaukta un sagremota ar kolagenāzi I (Gibco, {{0}}) Roswell Park Memorial Institute 1640 (Life Technologies,{{2). }}). Pēc tam audi tika izlaisti caur 70 μm un 40 μm šūnu sietiem (BD Falcon, 352340 un 352350). Glomeruli, kas pielipa 40 um šūnu sietiņam, tika noņemti ar fosfātu buferšķīdumu (PBS; Life Technologies, 10010023) un 0,5% liellopu seruma albumīna (Eurobio, HALALB07-65), kas injicēti zem spiediena, un pēc tam tika mazgāti divas reizes. PBS. Svaigi izolēti glomeruli tika izklāti 6-iedobju trauciņos Rosvelas parka memoriālajā institūtā 1640 (Gibco, 61870036), kas papildināti ar 10% teļa augļa serumu un 1% penicilīna/streptomicīna (Life Technologies, 15140122), lai ļautu izdalīties no glomeruliem. un augt. Podocītu bagātināšana tika pārbaudīta ar Western blot analīzi, kā iepriekš (papildu attēls S1). Podocīti tika kultivēti bez bafilomicīna Al (100 nmol/, Sigma-Aldrich, B1793) klātbūtnē 4 stundas. Imunofluorescences eksperimentiem primārie podocīti tika uzklāti uz 4 trauku etiķetēm (Dutcher, 055071). Pēc tam podocīti tika fiksēti 4% paraformaldehīdā 10 minūtes un apstrādāti imunofluorescencei.

Kalpaīna aktivitātes tests

Intracelulārā kalpaīna aktivitāte tika noteikta primārajos podocītos, kā aprakstīts iepriekš. Kopā 100,000 šūnas tika kultivētas 24-iedobēs audu kultūras traukos Roswell Park Memorial Institute 1640, kas papildinātas ar 10 procentiem teļa augļa seruma un 1 procentu penicilīna/streptomicīna. Pēc norādītā kultivēšanas perioda barotne tika aizstāta ar Krebs-Ringer HEPES bikarbonāta (KRH) šķīdumu (pH 7,4), kas satur 4 mM CaCl2, ar vai bez 10 uM kalpaīna inhibitora-1, un pirms pievienošanas inkubēja 10 minūtes. 50 mM kalpaīna substrāta N-sukcinil-Leu-Leu-Val-Tyr-7-amino-4-metikoumarīna (Sigma-Aldrich, S6510). Pēc 90-minūtes inkubācijas perioda cal-pain aktivitāte tika noteikta kā starpība starp fluorescenci (mērīta pie 360 ​​nm ierosmes un 430 nm emisijas) ar un bez kalpaīna inhibitora-1.

Western blot

Primārie podocīti tika saskrāpēti ar 80 ul radioimunoprecipitācijas testa buferšķīduma, kas satur fosfatāzi un proteāzes inhibitoru. Olbaltumvielu koncentrācija tika mērīta ar BCA Protein Assay Kit (Merck Biochemistry, 71285). Divdesmit mikrogramiem olbaltumvielu tika veikta elektroforēze uz Criterion XT saliekamā gēla (12 procenti Bis-Tris, Bio-Rad, 3450124). Olbaltumvielas tika pārnestas uz polivinilidēna difluorīda membrānu (Thermo Fischer Scientific, 88518). Pēc 5% piena bloķēšanas Tris buferšķīdumā 0,1% Tween (TBS-T), membrānas tika inkubētas ar trušu poliklonālo anti-LC3 (1:1000, Cell Signaling Technology, 2575), trušu poliklonālo anti-ATG5. (1:2000,Cell Signaling Technology,2630),jūrascūciņas poliklonālā anti-sekvestosoma 1 (SQSTM1)/P62 (1:10 000, PROGEN, GP62), trušu poliklonālais antikalpaīna 1 domēns IV (1:1000, Abcam,ab39170 ), truša poliklonālais anti-kalpaīna 2 aminoterminālais I domēna gals (1:1000, Abcam, ab39165), peles monoklonālais IgG1 anti-kalpaīns 4 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, sc-32325), trusis anti-podocīna (1:1000, Abcam, ab50339), jūrascūciņu anti-nefrīna (1:500, PROGEN, GP-N2) un žurku monoklonālās antitubulīna (1:5000, Abcam, ab6160) antivielas. Pēc mazgāšanas membrānas inkubēja ar mārrutku peroksidāzi saistītu antivielu (1:2000, Cell Signaling Technology, 7074, 7076, 7077). Konkrētu signālu noteikšana tika veikta, izmantojot ECL ķīmisko luminiscences komplektu (Bio-Rad, 170-5070) LAS 4000 ierīcē (Fuji). Kvantitatīvai noteikšanai tika izmantota densitometrijas analīze ar ImageJ programmatūru (Nacionālie veselības institūti).

Asinsspiediena mērījumi un fizioloģiskie novērtējumi

Sistoliskais asinsspiediens pelēm tika reģistrēts, izmantojot astes manžetes metodi (Visitech Systems Inc., BP-2000). No katras peles tika veikti desmit mērījumi, un pēc tam tika noteikta vidējā vērtība. Sistoliskais asinsspiediens tika mērīts sākumā (12 nedēļu vecumā) un pēc tam katru nedēļu līdz ārstēšanas perioda beigām. Visas peles tika ievietotas vielmaiņas būros ar brīvu piekļuvi ūdenim 6-stundu urīna savākšanai. Kreatinīna un plazmas urīnvielas koncentrācijas urīnā tika analizētas spektrofotometriski, izmantojot kolorimetrisko metodi (Olympus, AU400). Albumīna izdalīšanās ar urīnu tika mērīta, izmantojot īpašu ar enzīmu saistītu imūnsorbcijas testu albumīna kvantitatīvai noteikšanai peles urīnā (Crystal Chem, 80630).

Histoloģija

Nieres tika novāktas un fiksētas 4% ar PBS buferētā formalīnā. Parafīnā iestrādātās sekcijas (3-um biezas) tika iekrāsotas ar Masona trihromu, lai novērtētu nieru morfoloģiju. Anomālijas nierēs tika klasificētas, pamatojoties uz komponentu anomāliju klātbūtni un smagumu, tostarp glomerulosklerozi, mezangiālo paplašināšanos, tubulāru atrofiju vai ģipsi un fibrozi. Sklerotisko glomerulu īpatsvars tika novērtēts, aklo izmeklējot vismaz 50 glomerulus katrā nieru sekcijā.

Nieru sekciju un primāro podocītu imūnfluorescences krāsošana

Fiksētie primārie podocīti tika bloķēti TBS-T 3 procentu liellopu seruma albumīnā un inkubēti nakti 4 grādu temperatūrā ar primārajām antivielām jūrascūciņu anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C) un trušu anti-zaļo. fluorescējošais proteīns (GFP; 1:500, Abcam, ab290). Pēc TBS-T skalošanas ar fluoroforu konjugētas sekundārās antivielas pret jūrascūciņu IgG AF594-konjugētās antivielas (Jackson ImmunoResearch,706-585-148) un ēzeļa anti-truša IgG AF488-konjugētās antivielas( Invitrogen, A21206) tika piemērots. Attēli tika uzņemti, izmantojot Zeiss 2 fluorescējošo mikroskopu, AxioCam HRc kameru un Axiovision 4.3 programmatūru.

Formalīnā fiksētām parafīnā iestrādātām (FFPE) nierēm sekcijas (3 um) tika deparafinētas un hidratētas, un antigēna iegūšana tika veikta karsētā citrāta buferšķīdumā (pH 6). Pēc tam sekcijas tika permeabilizētas ar Triton 0,1 procentiem (Euromedex) un bloķētas TBS-T3 procentu liellopu seruma albumīnā pirms antivielu inkubācijas uz nakti 4 grādu temperatūrā. Mēs izmantojām kazu anti-nefrīnu (1:100, PROGEN, GP-N2), jūrascūciņu anti-SQSTM1/P62 (1:1000, PROGEN, GP-62C), trušu anti-GFP (1:1000, Abcam, ab290), kazu anti-podokaliksīna (PODXL;1:1000, Bio-Techne,AF-1556) un trušu anti-Vilma audzēja 1 (WT1;1:100, Abcam, ab192) antivielas. Sekundārās antivielas bija Alexa 488- un Alexa 568-konjugētās antivielas no Invitrogen. Kodoli tika iekrāsoti zilā krāsā, izmantojot Hoechst. Priekšmetstikliņi tika uzstādīti, izmantojot fluorescējošu montāžas līdzekli (Dako, S3023). Mikrofotogrāfijas tika uzņemtas ar Zeiss Axiophot fotomikroskopu un Axiovision programmatūru. Pusautomātiskie kvantitatīvie mērījumi Fidži tika izmantoti, lai kvantitatīvi noteiktu nefrīna pozitīvo un PODXL plus laukumu glomerulārās sekcijās vismaz 30 glomerulos uz vienu peli. Podocītu skaits tika skaitīts kā WT1 plus kodolu skaits vienā glomerulārā sekcijā vismaz 30 glomerulos uz vienu peli.

Transmisijas elektronu mikroskopijas procedūra

Nelielus nieru garozas gabalus (1 mm) fiksēja 3% glutaraldehīda EM pakāpē (Electron Microscopy Sciences) 1 līdz 30 dienas un trīs reizes mazgāja PBS. Paraugi tika pēcfiksēti 1% osmija te-troksīda 0,1 M (elektronmikroskopijas zinātne) 0,1 M PBS (pH 7,4) un mazgāti ūdenī. Paraugi tika dehidrēti spirta kategorijās un 100 procentu propilēna oksīdā (elektronmikroskopijas zinātne). Sveķu infiltrācija tika veikta šādi: sajauciet Epikote 812 un propilēna oksīdu proporcijā 1:1 30 minūtes, pēc tam samaisiet Epikote 812 un propilēna oksīdu proporcijā 1:2 istabas temperatūrā uz nakti. Paraugi tika iestrādāti 4 mm želatīna kapsulās 100 procentu Epikote 812 un polimerizēti krāsnī, kas uzkarsēta līdz 60 °C. Īpaši plānas sekcijas tika izgrieztas ar ultramikrotomu UFC7 (Leica Microsystems GmbH) un uzliktas uz Gilder Grids 200 sieta (Electron Microscopy Science). Tie tika iekrāsoti ar 7 procentu uranilacetātu (LFG sadalījums) un Reinolda svina citrātu (LFG). Paraugi tika pārbaudīti JEM1011 transmisijas elektronu mikroskopā (JEOL) ar Orius SC1000 CCD kameru (Gatan), kas darbojās ar Digi-talMicrograph programmatūru (Gatan), lai iegūtu.

Kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas masīvs

Svaigi izolēti glomeruli tika sasaldēti QIAzol Lysis reaģentā (Qiagen) -80 pakāpē. Kopējā RNS ekstrakcija, izmantojot metodi, kuras pamatā ir fenols, tika apstrādāta saskaņā ar ražotāja ieteikumiem. cDNS tika sintezētas, izmantojot komplektu RT²First Strand Kit (Qiagen, 330401), un reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika veikta, izmantojot Custom RT²Profiler PCR masīvu. Qiagen, CLAM36771C) ar RT'SYBR Green qPCR Mastermix (Qiagen, 330502). Kvantitatīvās PCR plāksnes tika darbinātas ar Applied Bio-systems StepOnePlus cikleri. Katrs masīvs satur kvalitātes kontroli reversās transkripcijas efektivitātei un genoma DNS piesārņojumam. Kvantitatīvā PCR analīze tika veikta, izmantojot 2-△△ CT metodi ar GeneGlobe datu analīzes centra palīdzību (www. Qiagen. com/shop/genes-and-pathways/data-analysis-center-overview-page) un izteikts kā log2 reizes izmaiņas gēnu ekspresijā.

In silico proteomiskā analīze

Kalpaīna šķelšanās vietas in silico prognozēšana tika veikta ar DeepCalpain (http://deepcalpain.cancerbio.info/help.php), GPS-CCD (http://ccd.biocuckoo.org) un CaMPDB (http:// calpain.org/)tiešsaistes rīki. Peles proteīna aminoskābju secība tika iegūta no Uniprot (//www.uniprot.org). Rezultāti tiek atsākti S1 un S2 papildu tabulās.

Statistiskās analīzes

Visi grafiki attēlo atsevišķas vērtības un vidējo ± SEM. Statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad Prism programmatūru, versiju 9. Salīdzinājums starp 2 grupām tika veikts, izmantojot parametrisko Stjudenta t-testu, kad paraugi izturēja Andersona-Dārlinga un D'Agostino normalitātes testus un F testu dispersijas vienlīdzības noteikšanai. Pretējā gadījumā tika izmantots neparametrisks Mann-Whitney tests. Salīdzinājums starp vairākām grupām tika veikts, izmantojot 1-veidu vai 2-ceļu dispersijas analīzi, kam sekoja vairāku salīdzināšanas tests ar Sidaka korekciju. P vērtības<0.05 were="" considered="" significant.=""><><><>

1. attēls| Angiotenzīna I (Angel) un augsta sāls satura diētas (HSD) izraisīta hipertensija kavē glomerulāro autofagiju. (ac)

Podokaliksīna (PODXL; sarkans) un P62 (zaļš) imunofluorescence glomerulos (a, a') no savvaļas tipa (WT) pelēm, (b, B) no WT pelēm pēc 6 nedēļu ilgas Angel plus HSD un (c) no Nphs2.cre Atgsl/ox pelēm, kas parāda P62 uzkrāšanos podocītos hipertensijas laikā un podocītiem specifiskām ATG5- deficīta pelēm. Bultiņu galviņas norāda P62 plus punktus WT (a'). Kodoli tika iekrāsoti ar Hoechst (zilu). Attēlu apakšdaļas ar galveno norāda lielāku palielinājumu. Stieņi =50 μm. （d) Saistītā P62 plus kvantitatīvā noteikšana ir izteikta kā glomerulārās zonas procentuālā daļa.n =4 WT peles un n=5 WT ar Angel plus HSD un Nphs2.cre Atgsoxlo pelēm. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējie ± SEM. Manna-Vitnija tests:*P= 0.0159.

Angel plus augsta sāls diētas izraisīta hipertensija inhibēja podocītu autofagiju

Podocīti uzrāda augstu autofagijas līmeni in vivo, par ko liecina spēcīga GFP ekspresija transgēnās pelēs ar GFP saplūšanu ar LC3 (GFP-LC3 pelēm), kas ir galvenais autofagijas marķieris (papildu attēls S2A). Autofagija ir dinamisks process ar pastāvīgu autofagosomu veidošanos un autofagolizosomu degradāciju. Autofagosomu degradācijas bloķēšana ar hlorokvīnu izraisīja GFP plus punktu uzkrāšanos, norādot uz augstu autofagisko plūsmu podocītos (papildu attēli S2A un B). Apstiprinājumu, ka GFP plus punkti bija autofagosomas, parādīja dubultā imūnfluorescence GFP un SQSTM1 / P62, kas ir autofagijas degradēts šaperona proteīns (papildu attēls S2C un D). Atkal ārstēšana ar hlorokvīnu izraisīja GFP plus P62 plus punktu uzkrāšanos, parādot svarīgu autofagisko plūsmu podocītos. Visbeidzot, augsta autofagiskā plūsma tika saglabāta in vitro, kā to parāda GFP un P62 ekspresija primārajos podocītos, kas izolēti no GFP-LC3 pelēm, un spēcīga GFP plus un P62 plus punktu uzkrāšanās, ārstējot ar bafilomicīnu Al, kas ir vēl viens autofagosomu degradācijas bloķētājs (papildu attēls S2E- H).

Pēc tam tika novērtēta hipertensijas spēja modulēt podocītu autofagiskās reakcijas pelēm, kurām 6 nedēļas tika ievadītas AngII ar diētu ar augstu sāls saturu (HSD), un kontrolēm bez hipertensijas. Kā parādīts l attēlā, AnglI plus HSD izraisīja P62 uzkrāšanos glomerulos ar spēcīgu uzkrāšanos podocītos, tādējādi liekot domāt, ka Angl plus HSD bija atbildīgs par podocītu autofagijas blokādi (attēls zeme). Interesanti, ka P62 uzkrāšanās podocītos bija līdzīga tai, kas novērota pelēm, kurām trūkst podocītu autofagijas (Nphs2.cre Atg5'olox pelēm). Citā hipertensijas modelī, DOCA sāls modelī, mēs novērojām arī progresējošu P62 uzkrāšanos podocītos gar slimības gaita laikā (papildu attēls S3).

Atg5 dzēšana īpaši podocītos palielina albumīnūriju, podocītu zudumu un glomerulārus bojājumus Angel plus HSD modelī

Pēc tam mēs pārbaudījām, vai autofagijas blokāde tikai podocītos (Nphs2.cre Atg5laxlox pelēm) ietekmē glomerulāros bojājumus AnglI plus HSD modelī. Vispirms mēs apstiprinājām, ka Nphs2. cre Atg5 pelēm bija normāls asinsspiediens, normāla nieru darbība un nebija glomerulāru histoloģisku bojājumu līdz 10 mēnešu vecumam, kā ziņots iepriekš (Papildu lox (WT) un Nphs2.cre Atgslox S4 attēls).2 Pēc tam Atg5'cl pelēm tika ievadīts AngII ar HSD 6 nedēļas. Svarīgi, ka sistoliskais asinsspiediens bija līdzīgs 2 grupās pēc AnglI infūzijas pētījuma laikā (2.a attēls), lai gan asinsspiediena mērīšanai izmantotā astes manžetes metode, iespējams, nespēj atrisināt nelielas asinsspiediena atšķirības. Angl infūzija ar HSD ievērojami palielināja urīna albumīna un kreatinīna attiecību WT pelēm, un šī ietekme vēl vairāk palielinājās pelēm (2.b attēls). Hipertensīvām Nphs2.cre Atg5lox/lox Nphs2.cre Atgsoxlox pelēm arī bija ievērojami palielināta glomerulārā skleroze, salīdzinot ar WT metiena biedriem (2.c-e attēls). Saskaņā ar izmērīto proteīnūriju, pelēm ar podocītu deficītu ATG5 (attēls 2f-h) bija ievērojami biežāk sastopami proteīni un cauruļveida dilatācija.

Podocītu skaits vienā glomerulā bija ievērojami samazināts Nphs2.cre Atg5loxlox gadījumā (2.i-k attēls). Podocītu bojājums Nphs2.cre Atgsoxlo pelēm ar AngII infūziju plus HSD pat progresēja līdz fokālajai un segmentālajai glomerulosklerozei, kā liecina parietālās epitēlija šūnas (PEC) ekspresija. ) aktivācijas marķieris CD44 glomerulos (2l un m attēls). Elektronu mikroskopijas analīze atklāja nozīmīgas izmaiņas, kas saistītas ar ATG5 deficītu pēc hroniskas AngII infūzijas ar HSD, tostarp pēdas procesa izsvīdumu ... pelēm. Turpretim daži ultrahipertensīvi Nph2. cre Atg5'oxlx strukturālie defekti tika konstatēti podocītos no WT pelēm pat pēc 10 nedēļu ilgas AngII infūzijas ar HSD (2.n un o attēls), norādot, ka podocītu autofagiskā aktivitāte ir nepieciešama to rezistencei pret Angel plus HSD izraisītiem bojājumiem. Kopumā mūsu rezultāti liecināja, ka AnglIl plus HSD modelī autofagijas inhibīcija saasina podocītu bojājumus un zudumus un izraisa sekojošu fokālo un segmentālo glomerulosklerozi.

2. attēls|Atg5 dzēšana īpaši podocītos izraisa ievērojamu albuminūrijas, nieru bojājumu un podocītu zuduma palielināšanos pēc 6 nedēļu ilgas angiotenzīna Il (Angel) infūzijas un augsta sāls satura diētas (HSD). (a) Sistoliskais asinsspiediens Atgslo/b un Nphs2.cre Ataslo pelēm 36 dienu laikā, lietojot Angel plus HSD.n =9 peles vienam genotipam. Vērtības tiek parādītas kā vidējais ± SEM. Divvirzienu dispersijas analīze (ANOVA): ns. (bm),n =10 pelēs vienā genotipā. In (b,g,h,k) vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais ± SEM. (b) Angel plus HSD (turpinājums)

3. attēls| Kalpaīna ekspresija un aktivitāte podocītos. (a) Western blot analīze kalpaīna-1.kalpaīna-2 un kalpaīna-4 ekspresijai primārajos podocītos. Tubulīna ekspresija kalpo kā normalizācija. (b) Kalpaīna aktivitāte tika mērīta primārajiem podocītiem, kas tika ārstēti vai neapstrādāti ar angiotenzīnu ll (Angel; 100 nM) 24 stundas ar vai bez kalpeptīna (10 uM), n =5 neatkarīgi eksperimenti. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējie ± SEM. Vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA): apstrāde, P=0.0035. Sidaka vairākkārtējais salīdzināšanas tests:*P=0.0128 leņķim pret bāzlīniju," P=0.0056, ja Angll plus kalpeptīns pret Angll.(c) Kalpaīna aktivitāte tika mērīta primārajiem podocītiem no savvaļas tipa (WT) vai kalpastatīna transgēnām (CST') pelēm, kuras 24 stundas tika ārstētas vai neapstrādātas ar Angel (100 nM). n {{18} } neatkarīgi eksperimenti. Vērtības tiek parādītas kā atsevišķi diagrammas un vidējais ± SEM. Divvirzienu ANOVA, kas sapārots ārstēšanas genotipam. P= 0.0483. Sidaka daudzkārtējais salīdzināšanas tests:**P=0.0009 WT. Leņķis pret bāzes līniju,*P=0.0420 CST'9 Angll pret bāzes līniju, *P=0.0424 WT pret CST9 Angll.

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 2. daļu