1. daļa Cistanches Herba ķīmiskā un ģenētiskā diskriminācija, pamatojoties uz UPLC-QTOF/MS un DNS svītrkodiem
Mar 03, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Abstrakts
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), kas pazīstams kā "Tuksneša žeņšeņs", ir pārsteidzoša ārstnieciska iedarbība uz spēku un barošanu, īpaši nieres nostiprināšanai, lai stiprinātu jaņ. Tomēr Cistanches Herba, Cistanche deserticola un Cistanche tubulosa, divu augu izcelsme atšķiras farmakoloģiskās iedarbības un ķīmisko sastāvdaļu ziņā. Lai diskriminētu Cistanches Herba augu izcelsmi, šajā pētījumā vispirms tika izmantota kombinēta ķīmisko un ģenētisko metožu sistēma – UPLC-QTOF/MS tehnoloģija un DNS svītrkodēšana. Rezultāti liecināja, ka tika iegūti trīs potenciālie marķieru savienojumi (kampneozīda II, cistanīda C un cistanozīda A izomērs), lai ar PCA un OPLS-DA analīzēm atšķirtu abu izcelsmi. DNS svītrkodēšana ļāva precīzi atšķirt divas izcelsmes. NJ koks parādīja, ka divi izcelsme ir sagrupēti divās kladēs. Mūsu atklājumi liecina, ka abām Cistanches Herba izcelsmēm ir atšķirīgs ķīmiskais sastāvs un ģenētiskās variācijas. Šis ir pirmais ziņotais divu Cistanches Herba izcelsmes novērtējums, un atklājums atvieglos kvalitātes kontroli un tās klīnisko pielietojumu.
Ievads
Cistanches Herba(Rou Cong Rong), kas pazīstams kā "tuksneša žeņšeņs", ir cēlies no žāvētiem sulīgiem kātiemCistanche deserticolaYC Ma unCistanche tubulosa(Schrenk) Parūka saskaņā ar Ķīnas farmakopeju (2010. gada izdevums), un tā ir populāra ar to, ka tā tonizē nieres-iņ, uzlabo dzīvības būtību un atslābina zarnas. PašlaikCistanches Herbagalvenokārt izplatīts sausos un siltos tuksnešos Ķīnas ziemeļrietumos, īpaši Sjiņdzjanas un Iekšējās Mongolijas provincēs. Tomēr divas izcelsmesCistanches Herbaatšķiras pēc to farmakoloģiskās aktivitātes un ķīmiskajām sastāvdaļām. Tu et al. pētīja trīs Cistanche sugu novārījumu (C. deserticola, C. tubulosa, Cistanche salsa) un atrada toC. tubulosauzrādīja zemāko efektu Yang deficīta peles modelī [1]. Džans et al. salīdzināja farmakoloģisko aktivitāti starpC. deserticola, C. tubulosa,unC. salsa,un atklāja, ka šīm sugām ir tādas ārstnieciskas funkcijas kā pretnoguruma un hipoksijas tolerance, bet ne tādā pašā mērā [2]. Iepriekšējie pētījumi ziņoja par ķīmisko komponentu un norādīja uz ķīmiskās sastāvdaļas un augu izcelsmes satura atšķirībuCistanches Herba[3]. Kas attiecas uz klīnisko pielietojumu un apriti tirgū, kā toniku,C. tubulosaJapānā tradicionāli tiek izmantots kā asinsriti veicinošs līdzeklis un impotences, sterilitātes, lumbago un ķermeņa vājuma ārstēšanā [4–8]. Līdz ar to ir ļoti svarīgi atšķirt divas izcelsmesCistanches Herbakvalitātes kontrolei un klīniskai lietošanai. Tomēr pētījumi nav vērsti uz divu iemeslu diskriminācijuCistanches Herba. Lai identificētu ģints, ir izmantotas daudzas pētītas metodes, tostarp mikroskopija, ultravioleto un infrasarkano staru noteikšana, vienkāršā secību atkārtojumu metode.Cistancas, bet ne tikai divām izcelsmēm, īpaši [9–20]. Šeit mēs kopīgi izmantojām ķīmiskās un molekulārās metodes, lai atšķirtu divus Cistanches Herba izcelsmi, UPLC QTOF / MS (ultra veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju, kas apvienota ar kvadrupola lidojuma laika masas spektrometriju) un DNS svītrkodi. UPLC-QTOF/MS nodrošina informāciju ātrāk un efektīvāk, salīdzinot ar citām metodēm. UPLC-QTOF/MS augstā selektivitāte un jutība ir ļāvusi to izmantot gan kvantitatīvās, gan kvalitatīvās analīzēs, kā arī metabolītu analīzē un sarežģītu savienojumu identificēšanā tradicionālajā ķīniešu medicīnā [21–22]. Lai identificētu potenciālos marķieru savienojumus, tiek izstrādāta arī galveno komponentu analīze (PCA) un ortogonālā projekcija uz latentās struktūras diskriminācijas analīzi (OPLSDA). DNS svītrkodēšana, vienkāršāka un universālāka molekulāro marķieru tehnoloģija, izmanto DNS fragmentu, lai identificētu sugas vai ģintis. Tas ir objektīvs, precīzāks un vieglāk izpildāms nekā tradicionālās identifikācijas metodes un citas molekulāro marķieru tehnoloģijas. Turklāt DNS svītrkodi ir veiksmīgi izmantoti, lai identificētu dzīvniekus un augus, tostarp ārstniecības augus [23–26]. Šī pētījuma mērķis ir izveidot zinātnisku metožu sistēmu, kombinētu UPLC-QTOF/MS un DNS svītrkodēšanu, lai diskriminētu divas augu izcelsmesCistanches Herba.
Cistancē veselas saknes
Materiāli un metodes
Ētikas paziņojums Mēs apstiprinām, ka lauka pētījumos netika iesaistītas apdraudētas vai aizsargājamas sugas. GPS koordinātas ir iekļautas informācijas paraugā, lūdzu, skatiet 1. tabulu."
Augu materiāli un reaģenti
Cistanches Herba sulīgie stublāji tika savākti no savvaļas tuksneša reģioniem Iekšējā Mongolijā, Cjinhajas provincēs, Sjiņdzjanas Uiguru autonomajā reģionā, Ķīnas Tautas Republikā (1. tabula). Visi pētījuma paraugi tika savākti savvaļas tuksneša reģionos, nevis privātajā zemē, kur nekādas īpašas atļaujas nebija vajadzīgas. Kātu botāniskās identitātes apstiprināja Dr Linfang Huang. Vaučeru paraugi tika deponēti Ārstniecības augu attīstības institūtā. UPLC analīzei tika izmantots augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) acetonitrils (Merck KGaA, Darmštate, Vācija) un skudrskābe (Tedia, ASV). Dejonizēts ūdens tika attīrīts, izmantojot Milli-Q sistēmu (Millipore, Bedford, MA, ASV). Visas pārējās ķīmiskās vielas bija analītiskas kvalitātes.
Parauga sagatavošana
Cistanches Herba paraugi (1.0 g, 65-siets) tika pārnesti 50- ml koniskajā kolbā un pievienoti 50 ml 70 procentu metanola. Pēc 30 minūšu mērcēšanas istabas temperatūrā 30 minūtes tika veikta ultraskaņa (35 kHz). Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 10, 000 apgr./min 10 minūtes, supernatants tika uzglabāts 4 °C temperatūrā un filtrēts caur 022- mm membrānu pirms injekcijas UPLC-QTOF/MS sistēmā analīzei.
UPLC-QTOF/MS
UPLC analīzei tika izmantotas šādas sistēmas/parametri: Waters Acquity sistēma (Waters), kas aprīkota ar bināro šķīdinātāja padeves sūkni, automātisko paraugu ņemšanas ierīci un PDA detektoru, kas savienots ar Waters Empower 2 datu staciju; ultraskaņa (250 W, 50 kHz, Kunshan Ultrasonic Instrument Co., Džedzjana, Ķīna); un elektronisko analītisko bilances modeli AB135-2 (Mettler Toledo., Greifensee, Cīrihe, Šveice). Tika izmantota Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonna (1,7 mm, 2,16100 mm, Waters) un Waters C18 aizsargkolonna (tas pats materiāls, ūdeņi), un to temperatūra tika uzturēta 30 uC. Kustīgā fāze bija 0,1 procenta skudrskābes ūdens šķīdums (A) un acetonitrils (B) ar gradienta programmu: 0–3 min, 10–22 procenti B; 3–4 min, 22–23 procenti B; 4–6 min, 23–35 procenti B; 6–8 min, 35–37 procenti B; 8–11 min, 37–42 procenti B; 11–12 min, 42–48 procenti B; 12–15 min, 48–50 procenti B ar plūsmas ātrumu 0,3 ml/min. Injekcijas tilpums bija 5 ml.
UPLC/MS analīze tika veikta ar QTOF Synapt G2 HDMS sistēmu (Waters, Manchester, UK), kas aprīkota ar elektrosmidzināšanas jonizācijas (ESI) avotu, kas darbojas negatīvo jonu režīmā. N2 tika izmantots kā desolvatācijas gāze. Desolvatācijas temperatūra tika iestatīta uz 45{{10}}uC ar plūsmas ātrumu 800 l/h, un avota temperatūra tika iestatīta uz 120 uC. Kapilārais un konusa spriegums tika iestatīts attiecīgi uz 2500 un 40 V. Dati tika savākti no 50 līdz 1200 Da ar 0.{11}}s skenēšanas laiku un 0.{13}} starpskenēšanas aizkavi 15-min analīzes laikā. Argons tika izmantots kā sadursmes gāze ar spiedienu 7,06661023 Pa. Visi MS dati tika savākti, izmantojot LockSpray sistēmu, lai nodrošinātu masas precizitāti un reproducējamību. Leicīna-enkefalīna [MH]-jons pie m/z 554,2615 tika izmantots kā bloķēšanas masa negatīvā ESI režīmā.
Datu analīze
Tika analizēti UPLC-QTOF/MS dati par Cistanches Herba paraugiem, lai identificētu iespējamos diskriminējošos mainīgos. ES neapstrādāto datu maksimuma atrašana, izlīdzināšana un filtrēšana tika veikta, izmantojot Marker Lynx lietojumprogrammu pārvaldnieku, versiju 4.1 (Waters, Manchester, Apvienotā Karaliste). Izmantotie parametri bija šādi: aiztures laiks (tR) 0–15 min, masa 50–1200 Da, aiztures laika pielaide 0,02 min un masas pielaide no 0,02 Da. Tika izmantoti trīs paraugi, kas savākti no katras ģeogrāfiskās atrašanās vietas (n=3). Modeļa izveidošanai kopā tika izmantoti 6339 mainīgie.
DNS svītrkodēšana: DNS ekstrakcija, PCR amplifikācija un sekvencēšana
Paraugus, kas ņemti no žāvētiem gaļīgajiem C. deserticola un C. tubulosa (30 mg) stublājiem, berzēja 2 minūtes ar frekvenci 30 r/s. DNS tika ekstrahēta saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Tiangen). Konkrēti, protokols tika modificēts tā, ka hloroforms tika aizstāts ar hloroforma: izoamilspirta maisījumu (24:1 tādā pašā tilpumā) un buferšķīdumu GP2 ar izopropanolu (tāds pats tilpums). Saberztais pulveris tika ievietots 1,5 ml Ependorfa mēģenēs, pievienots 700 ml 65 uC iepriekš uzkarsēta GP1 un 1 ml b-merkaptoetanola, lai sajauktu, izmantojot virpuļošanu 10–20 sekundes, un inkubētu 60 minūtes 65 ° C temperatūrā; Pievieno 700 ml hloroforma: izoamilspirta (24:1) maisījuma, centrifugē 5 minūtes pie 12000 apgr./min (,134006g); Ielejiet supernatantu jaunā mēģenē, pievienojot 700 ml izopropanola, maisot 15–20 minūtes; Visu maisījumu ievada centrifūgas kolonnā CB3 un centrifugē 40 sekundes pie 12000 apgr./min. Izmetot filtrātu un pievienojot 500 ml GD (pirms lietošanas pievienojot kvantitatīvu bezūdens etanolu), centrifugēt ar ātrumu 12000 apgr./min 40 sekundes; izmetot filtrātu un pievienojot 700 ml PW (pirms lietošanas pievienojot kvantitatīvu bezūdens etanolu), lai nomazgātu membrānu, centrifugēt 40 s pie 12000 apgr./min; Izmetot filtrātu un pievienojot 500 ml PW, centrifugējiet 40 sekundes pie 12000 apgr./min. Izmet filtrātu un centrifugē 2 minūtes pie 12000 apgr./min, lai noņemtu atlikušo mazgāšanas buferšķīdumu PW; Centrifugēšanas kolonnas CB3 pārvietošana tīrā 1,5 ml Ependorfa mēģenē un žāvēšana istabas temperatūrā 3–5 minūtes; Centrifugējiet 2 minūtes ar ātrumu 12000 apgr./min, lai iegūtu kopējo DNS. Polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) praimeri tika balstīti uz iepriekš ziņotajām sekvencēm [4, 5]. PCR reakcijas maisījumos bija 2-mL DNS veidnes, 8.5- ml ddH2O, 12.5-mL 26Taq PCR Master Mix (Beijing TransGen Biotech Co., Ķīna), 1/{{57 }}mL uz priekšu/reversu (F/R) praimeri (2,5 mM), gala tilpumā 25 ml. PCR amplifikācija tika veikta, kā aprakstīja Kress et al. [4]. PCR reakcijas primers bija fwd PA: GTTATGCATGAACGTAATGCTC (59- 39) un rev TH: CGCGCATGGTGGATTCACAATCC (59-39). PCR produkti tika atdalīti un atklāti ar 1% agarozes gēla elektroforēzi. PCR produkti tika attīrīti saskaņā ar ražotāja protokolu un tieši pakļauti sekvencēšanai.
Galvenais efektīvais cistanche savienojums: akteozīds
Rezultāti
Provizoriskā pīķa piešķiršana pēc UPLC-QTOF/MS Reprezentatīvās C. deserticola un C. tubulosa hromatogrammas no dažādiem ražošanas apgabaliem ir parādītas 1. attēlā. Pirkstu nospiedumu hromatogramma norādīja uz līdzībām starp Cistanches Herba paraugiem. Kopumā tika konstatēti 23 kvalificēti masas maksimumi un 16 pīķi tika identificēti, saskaņojot aiztures laikus un masas spektrus ar iepriekš ziņotajiem (2. tabula) [29–35]. Pīķi 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, 15, 16, 17, 20, 21, 22 un 23 provizoriski tika identificēti kā cistanozīds F, musaenozīda skābe, cistanbulozīds C1/C2, kampneozīds II. , kampneozīda II izomērs, ehinakozīds, cistanīds A, akteozīds, izoakteozīds, siringalīds A-39-aL-ramnopiranozīds, cistanīds C, 29-acetilakteozīds, osmantusīds B, cistanīds D, tubulozīds A un attiecīgie cistancīnsīds A . Tika noteikts, ka ķīmiskās sastāvdaļas galvenokārt ir feniletanoīdu glikozīdi (PhG), savukārt viens savienojums, musaenozīda skābe, bija iridoīds polisaharīds. PhG ir galvenie aktīvie savienojumi nieru deficīta ārstēšanā, kā arī antioksidanta un neiroprotektīva iedarbība [36]
C. deserticola un C. tubulosa PCA
PCA tika izmantots, lai atšķirtu dažādu augu sugu paraugus. PCA ir nepārraudzīta daudzfaktoru datu analīzes metode, kuras mērķis ir vizualizēt līdzības un/vai atšķirības sekundāro metabolītu sastāva daudzfaktoru datos [37]. Divkomponentu PCA modelis kumulatīvi veidoja 46,04 procentus no variācijas (PC1, 36,43 procenti; PC2, 9,61 procenti). 2. attēlā parādīts, ka 24 paraugi tika sagrupēti divās grupās PCA rādītājos, kas attēloti atbilstoši sugu izcelsmei, norādot, ka C. deserticola un C. tubulosa ķīmiskais sastāvs būtiski atšķīrās.
Galvenais efektīvais cistanche savienojums: ehinakozīds
