1. daļa: Cistanche Tubulosa feniletanoīda glikozīdi izraisa hepatocelulārās karcinomas šūnu apoptozi un uzlabo pretvēža efektu
Mar 25, 2022
Kontaktpersona: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, PhD1 un Jinyao Li, PhD1
Abstrakts
Cistanche tubulosa ir ķīniešu augu izcelsmes zāļu veids, un tam ir dažādas bioloģiskas funkcijas. Iepriekšējie pētījumi ir pierādījuši, kaCistanche tubulosa feniletanoīdu glikozīdi(CTPG) piemīt pretvēža iedarbība uz dažādām audzēja šūnām. Tomēr CTPG pretvēža iedarbība uz HepG2 un BEL-7404 hepatocelulārās karcinomas (HCC) šūnām joprojām ir nenotverama. Mūsu pētījums parādīja, ka CTPG būtiski inhibēja HepG2 un BEL-7404 šūnu augšanu, izraisot šūnu cikla apstāšanos un apoptozi, kas bija saistīta ar MAPK ceļu aktivizēšanu, ko raksturo p38, JNK, p38 fosforilācija, un ERK1/2 un no mitohondriju atkarīgais ceļš, ko raksturo mitohondriju membrānas potenciāla samazināšanās. Citohroma c izdalīšanos un kaspāzes -3, -7, -9 un PARP šķelšanos pēc tam palielināja ārstēšana ar CTPG. Turklāt CTPG ievērojami nomāca HepG2 migrāciju, samazinot matricas metaloproteināzes-2 un asinsvadu endotēlija augšanas faktoru līmeni. Interesanti, ka CTPG ne tikai uzlaboja splenocītu proliferāciju, bet arī samazināja cisplatīna izraisīto splenocītu apoptozi. H22 audzēja peles modelī CTPG kombinācijā ar cisplatīnu vēl vairāk kavēja H22 šūnu augšanu un samazināja cisplatīna blakusparādības. Kopumā CTPG inhibēja HCC augšanu, izmantojot tiešu pretvēža efektu un netiešu imunitāti uzlabojošu efektu, un uzlaboja cisplatīna pretvēža efektivitāti.
Atslēgvārdi Cistanche tubulosa feniletanoīdu glikozīdi, apoptoze, MAPK ceļš, no mitohondrijiem atkarīgs ceļš, cisplatīns, imūnsistēmas uzlabošana
Cistanche ir pretvēža iedarbība.
Noklikšķiniet uz Cistanche produktiem un Cistanches
Ievads
Tika prognozēts, ka 2018. gadā aknu vēzis ir sestais visbiežāk diagnosticētais vēzis un ceturtais galvenais vēža izraisīto nāves cēlonis visā pasaulē — Dienvidaustrumāzijā (Mongolijā, Kambodžā un Vjetnamā) katru gadu reģistrēti aptuveni 841 000 jauni gadījumi un 782 000 nāves gadījumu. .1 Ķīnā aknu vēzis bija trešais galvenais ar vēzi saistītās nāves cēlonis 2015. gadā.2 Vairāk nekā 90 procenti primāro aknu vēža gadījumu ir hepatocelulārā karcinoma (HCC) visā pasaulē. Pašlaik galvenās HCC ārstēšanas metodes ir hepatektomija, aknu transplantācija un perkutāna ablācija. Diemžēl šīs ārstēšanas metodes ir efektīvas 30 procentiem pacientu, kuriem diagnosticēts agrīns aknu vēzis, savukārt pacientiem, kuriem diagnosticēts progresējošs aknu vēzis (40 procenti), ir jāpaļaujas uz paliatīvo ārstēšanu, lai pagarinātu dzīvildzi.3,4 Sorafenibs kombinācijā ar aknu vēzi. arteriālā ķīmijembolija ir svarīga un izplatīta paliatīvā terapija lielākajai daļai pacientu ar progresējošu HCC Āzijas un Klusā okeāna reģionā.5 Sorafenibs, ko FDA apstiprināja 2006. gadā progresējoša aknu vēža ārstēšanai, ir daudzkārtējs kināzes inhibitors, kas inhibē audzēja šūnu proliferāciju un asinsvadus. ražošanu un veicina audzēja šūnu apoptozi. Sorafenibs ievērojami pagarina pacienta dzīvildzes laiku par 3 līdz 5 mēnešiem, bet tam ir nopietnas blakusparādības, un tas ir cieši saistīts ar zāļu rezistences rašanos.6 Tāpēc ir steidzami jāizstrādā jaunas zāles vai stratēģijas HCC ārstēšanai.
Tradicionālā ķīniešu medicīna (TCM) viena pati vai kombinācijā ar citām stratēģijām ir izmantota HCC ārstēšanai, un tā ir pierādījusi klīniskus ieguvumus, tostarp ilgāku dzīvildzi, uzlabotu dzīves kvalitāti, samazinātu nevēlamo blakusparādību skaitu un tā tālāk.7,8Cistancheir TCM, kas satur feniletanoīdu glikozīdus (PhG), iridoīdus, lignīnu un polisaharīdus, kam ir dažādas bioloģiskas funkcijas, piemēram, antioksidācijas, pretiekaisuma, pretnovecošanās, atmiņas uzlabošanas un imūnsistēmas uzlabošanas funkcijas.9 PhG ir uzskatītas par Cistanche galvenās aktīvās sastāvdaļas, un tām ir vairākas funkcijas, tostarp antioksidācija, pretiekaisuma, antiapoptozes, hepatoaizsardzība un neiroaizsardzība.{7}} Mūsu grupa ziņoja, kaCistanchetubulosa feniletanoīdu glikozīdi(CTPG) varētu kavēt melanomas B16-F10 šūnu, barības vada karcinomas Eca-109 šūnu un HCC H22 šūnu augšanu, izmantojot ārējos vai iekšējos signalizācijas ceļus in vitro vai in vivo; turklāt CTPG bija imūnstimulējoša iedarbība.13-15
Šajā pētījumā mēs pētījām CTPG pretvēža iedarbību un mehānismu uz HepG2 un BEL-7404 šūnām in vitro, analizējām CTPG imūnmodulējošo funkciju in vitro un in vivo un tālāk novērtējām CTPG terapeitisko efektu kombinācijā ar ķīmijterapiju. zāļu cisplatīns uz HCC H22 audzēja pelēm in vivo. Mēs atklājām, ka CTPG var kavēt HepG2 un BEL-7404 šūnu augšanu, izmantojot no mitohondrijiem atkarīgu apoptozi un MAPK signālu ceļu. CTPG ievērojami kavēja HepG2 šūnu migrāciju, samazinot matricas metaloproteināzes-2 (MMP-2) un asinsvadu endotēlija augšanas faktora (VEGF) līmeni. Turklāt CTPG veicināja imūno šūnu proliferāciju un aktivizēšanu un uzlaboja peļu imunitāti. Svarīgi, ka CTPG kombinācijā ar cisplatīnu var vēl vairāk kavēt H22 šūnu augšanu in vivo un samazināt cisplatīna blakusparādības.
Cistanche uzlabo imunitāti.
Materiāli un metodes
Dzīvnieki
Apmēram 6 līdz 8 nedēļas veci BALB/c, Kunmingas peles un C57BL/6 peļu mātītes tika iegādātas no Sjiņdzjanas Medicīnas universitātes Dzīvnieku laboratorijas centra (Urumci, Sjiņdzjana, Ķīna) un tika izmitinātas Sjiņdzjanas Universitātes dzīvnieku novietnē ar istabas temperatūru. (RT) 25±3 grādi un 12/12 stundu gaismas-tumsas periods.
Šūnu līnijas un šūnu kultūra
Peles H22 šūnas tika iegādātas no Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Uhaņa, Hubeja, Ķīna), un cilvēka HCC HepG2 un BEL{2}} šūnas tika iegūtas no Sjiņdzjanas bioloģisko resursu un gēnu inženierijas galvenās laboratorijas, Sjiņdzjanas Universitāte (Urumči, Sjiņdzjana, Ķīna) un kultivēta RPMI 1640 barotnē (Gibco, ASV) vai Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnē (DMEM) (Gibco), kas satur 10 procentus termiski inaktivēta liellopu augļa seruma (MRC, Ķīna), 1 procentu L- glutamīns (100 mM), 100 U/ml penicilīna un 100 ug/ml streptomicīna 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2.
Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfija (HPLC)
Galvenie CTPG savienojumi (Upbio Tech Co., Ltd., Šanhaja, Ķīna) tika kvalificēti un kvantificēti ar HPLC, kā ziņots iepriekš.13 Tika izmantota ZORBAX SB-C18 kolonna (250 × 4,6 mm; 5 μm). un kustīgā fāze sastāvēja no 0,2% skudrskābes šķīduma un metanola ar gradientu no 23% līdz 31%. Kopā tika ievadīts 10 μL paraugs un noteikts pie 330 nm. Lai analizētu CTPG komponentus, tika izmantoti ehinakozīda un akteozīda standarti (Yuanye, Šanhaja, Ķīna).
ehinakozīds
Šūnu dzīvotspējas analīze
CTPG pretvēža iedarbība uz HepG2 un BEL{1}} šūnām tika novērtēta, izmantojot MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolija bromīds). HepG2 un BEL-7404 šūnas tika ievietotas 96-iedobju plāksnēs (5 × 104 šūnas/iedobē) un apstrādātas ar 0, 200, 400 un 600 ug/mL CTPG attiecīgi 24 un 48 stundas pēc 24 stundu inkubācijas 37 grādu temperatūrā. Apmēram 35 ug/ml cisplatīna (Yuanye) tika izmantota kā pozitīva kontrole. Pēc tam katrai iedobei pievienoja 100 μL MTT (0,5 mg/ml, atšķaidīts ar barotni bez FBS barotnes) un kultivēja 3 stundas 37 grādu temperatūrā un 5% CO2. Pēc inkubācijas plāksnes centrifugēja ar ātrumu 1200 apgr./min 7 minūtes, barotni noņēma un katrā iedobē pievienoja 200 ug/ml DMSO, lai izšķīdinātu izveidotos formazāna kristālus. OD490 vērtības tika mērītas ar 96-iedobes mikroplašu lasītāju (Bio-Rad Laboratories, CA, ASV). Lai novērtētu CTPG ietekmi uz splenocītiem, šūnas tika izolētas no C57BL/6 pelēm un izklātas 96-iedobju plāksnēs ar blīvumu 1 × 105 šūnas/iedobē. Splenocīti tika apstrādāti ar 0, 200, 400 un 600 ug/ml attiecīgi 24, 48 un 72 stundas. Šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta pēc šādas formulas: Šūnu dzīvotspēja (procenti)=(OD apstrādāta/OD neapstrādāta) × 100 procenti.
Ki noteikšana-67
Ki{{0}} noteikšana tika veikta saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu.16 Īsumā, BEL-7404 šūnas tika apstrādātas ar dažādu koncentrāciju (0, 200, 400 un 600 ug/ml) CTPG. vai cisplatīns (35 ug/ml). Pēc 24 stundām šūnas tika novāktas un mazgātas ar PBS, pēc tam fiksētas un permeabilizētas ar Foxp3 krāsošanas bufera komplektu (eBioscience, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Intracelulārā krāsošana tika veikta, izmantojot FITC konjugētu Ki{10}} antivielu (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV) 15 minūtes RT. Paraugi tika analizēti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur, CA, ASV).
Šūnu apoptozes un šūnu cikla analīze
HepG2 un BEL-7404 šūnas tika iesētas ar blīvumu 2,5 × 105 šūnas/trauciņā un inkubētas 37 grādu temperatūrā nakti. Pēc apstrādes ar dažādu koncentrāciju CTPG vai kaspāzes inhibitoru (Z-VAD-FMK) vai kaspāzes -3 inhibitoru (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Ķīna) (Beyotime, Ķīna) šūnas tika tripsinizētas un novāktas, centrifugējot. CTPG ārstēšana. Pēc 24 stundām apoptoze tika noteikta ar plūsmas citometriju. Īsāk sakot, savāktās šūnas tika mazgātas ar aukstu PBS (Gibco) un atkārtoti suspendētas aneksīnu saistošā buferšķīdumā ar 2,5 μL aneksīna V-FITC un 5 μL PI-PE krāsošanas šķīdumu (Solarbio, Pekina, Ķīna), un pēc tam šūnas tika inkubētas RT. tumsā 15 minūtes. Šūnu cikla sadalījuma analīzei šūnas tika novāktas pēc apstrādes ar CTPG un fiksētas aukstā 70% etanolā 4 grādu temperatūrā 30 minūtes. Šūnas tika iekrāsotas ar PI (BD Biosciences) tumsā 30 minūtes. Paraugus analizēja ar plūsmas citometru (BD FACSCalibur). Šūnu apoptozes un ar ciklu saistītu proteīnu ekspresijas līmeņi tika noteikti ar Western blot.
Western Blot
Western blot tika veikts saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu.17HCC tika apstrādāti ar CTPG 24 stundas. Pēc divreiz mazgāšanas ar ledusaukstu PBS, visas pielipušās un peldošās šūnas tika savāktas un 20 minūtes lizētas RIPA līzes buferšķīdumā (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) uz ledus. Pēc centrifugēšanas pie 12000 apgr./min 4 grādiem 10 minūtes proteīna koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Tāda pati olbaltumvielu koncentrācija tika atdalīta ar 12% SDS-PAGE un pārnesta uz PVDF membrānām. Pēc mazgāšanas ar PBST buferšķīdumu (PBS ar 0,05 procentiem Tween{11}}), membrānas tika bloķētas ar 5 procentiem beztauku pienu 37 grādu temperatūrā 1 stundu un pēc tam inkubētas ar primārajām antivielām (Cell Signaling Technology, MA, ASV). atbilstošos atšķaidījumos nakti 4 grādos. Pēc 3 reizes mazgāšanas ar PBST membrānu inkubēja ar attiecīgajām HRP konjugētajām sekundārajām antivielām (eBioscience) 2 stundas 37 grādu temperatūrā. Mērķa proteīni tika atklāti, izmantojot ECL testa komplektu (Beyotime). Pelēktoņu skenēšanas dati tika iegūti ar attēlu J.
Mitohondriju membrānas potenciāla analīze (Δψm)
Δψm noteica ar membrānu caurlaidīgu JC-1 krāsvielu (Beyotime). Īsumā, HepG2 un BEL-7404 šūnas tika apstrādātas ar dažādām CTPG koncentrācijām (0, 200, 400 un 600 ug/ml) 24 stundas. Visas šūnas tika savāktas un mazgātas ar JC-1 mazgāšanas buferi. Šūnas tika iekrāsotas ar JC-1 fluorescējošo zondi saskaņā ar ražotāja norādījumiem 20 minūtes RT. Pēc divreiz mazgāšanas ar PBS visi paraugi tika analizēti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 krāsošana
Hoechst 33342 krāsošana tika veikta saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu.16 Kodolu morfoloģiskās izmaiņas tika pārbaudītas, izmantojot membrānu caurlaidīgu DNS saistošo krāsvielu Hoechst 33342 (Beyotime). Īsumā, šūnas tika inokulētas 6-iedobes plāksnē ar koncentrāciju 1 × 105 šūnas/iedobē 2 ml barotnē. Sasniedzot 70–80 procentu saplūšanu, šūnas 24 stundas apstrādāja ar 200, 400 un 600 ug/ml CTPG vai cisplatīna. Šūnas tika mazgātas ar PBS un fiksētas ar 4% ledusaukstu paraformaldehīdu 4 grādu temperatūrā 10 minūtes. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas tika iekrāsotas ar Hoechst 33342 4 grādu temperatūrā 10 minūtes. Paraugi tika novēroti ar fluorescences apgriezto mikroskopu (Nikon Eclipse Ti-E, Japāna).
cistanche ekstrakts
Migrācijas tests
HCC šūnu migrācija tika noteikta, izmantojot brūču dzīšanas testu. Īsāk sakot, HepG2 šūnas (2 × 104 iedobē) tika iesētas 24-iedobes plāksnē. Pēc 80 procentu saplūšanas sasniegšanas katras iedobes centrs tika vienreiz saskrāpēts ar 20 μl pipetes galu. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas tika apstrādātas ar cisplatīnu (35 ug / ml) vai dažādu koncentrāciju (0, 200, 400 un 600 ug / ml) CTPG 37 grādos. Pēc 24 stundām katra parauga attēli tika uzņemti mikroskopā (Nikon Eclipse Ti-E). Šūnu migrācijas vidējie attālumi tika analizēti ar attēlu J. Brūču dzīšanas procentuālais daudzums tika aprēķināts pēc vienādojuma: brūču dzīšana ( procenti )=(1-skrāpējuma laukums norādītajā laika punktā/skrāpējuma laukums 0 stundās) × 100 procenti . Ar šūnu migrāciju saistīto proteīnu MMP-2 un VEGF ekspresijas līmeņi tika noteikti ar Western blot.
Splenocītu proliferācija un apoptoze
Proliferācijas analīzei splenocīti tika izolēti no 3 C57BL/6 pelēm un iekrāsoti ar CFSE (eBioscience). Ar CFSE iezīmētās šūnas tika inokulētas 24-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 106 šūnas 1 ml barotnes katrā iedobē un apstrādātas ar dažādu koncentrāciju CTPG (200, 400 un 600 ug/ml) vai kombinētas ar 35 ug. /mL cisplatīna 72 stundas. Plūsmas citometrijas analīze tika veikta pēc krāsošanas ar CD3-APC un CD19-PE (BD Biosciences). Apoptozes analīzei splenocīti tika inokulēti 24-iedobju plāksnēs ar blīvumu 2 × 106 šūnas 1 ml barotnē katrā iedobē un apstrādāti ar dažādu koncentrāciju CTPG (200, 400 un 600 ug/ml) vai kombinēti ar cisplatīnu 24 stundas. Plūsmas citometrijas analīze tika veikta pēc krāsošanas ar 2,5 μL aneksīna V-FITC un 5 μL PI-PE šķīduma.
CTPG drošības novērtējums un imūnstimulējošās aktivitātes in vivo
Lai novērtētu CTPG imūnstimulējošās aktivitātes in vivo, 6 līdz 8 nedēļu vīriešu Kunmingas peles tika nejauši sadalītas 7 grupās (5 peles/grupa). Subkutāna injekcija (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitoneāla injekcija (ip, 200, 400 mg/kg) un intragastriska ievadīšana (ig, 200, 400 mg/kg) tika veiktas ik pēc 2 dienām, kopā 7 reizes. , kamēr kontroles grupa nesaņēma nekādu ārstēšanu. Peles ir svērušas katru otro dienu, un peļu statuss tika novērots katru dienu. Pēc CTPG apstrādes peļu orgāni tika atdalīti un nosvērti. Orgānu indeksi tika aprēķināti pēc formulas: orgānu indekss=orgāna svars (mg)/ķermeņa svars (g). Splenocīti tika savākti, skaitīti un iekrāsoti ar anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC vai anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Paraugi tika noteikti ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur).
CTPG kombinācijā ar cisplatīnu pretvēža efektivitāte pelēm ar audzēju H22 Apmēram 6 līdz 8 nedēļas veciem BALB/c peļu tēviņiem subkutāni injicēja H22 šūnas (1.0 × 106 vienai pelei 100 μL PBS). Kad audzēja tilpums sasniedza aptuveni 60 mm3, audzēju nesošās peles tika nejauši sadalītas 4 grupās (6 peles/grupā) un ārstētas ar cisplatīnu (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatīnu (4 mg/kg) plus CTPG ( 400 mg/kg) vai bez ārstēšanas (kontroles grupa). Audzēja pelēm intraperitoneāli injicēja CTPG attiecīgi 5., 7., 9., 11. un 13. dienā. Cisplatīns tika intravenozi injicēts 7. un 11. dienā. Audzēja tilpums un ķermeņa svars tika mērīti katru otro dienu. Audzēja tilpums tika aprēķināts šādi: Audzēja tilpums (V)=a × b2/2, kurā a un b apzīmē attiecīgi garāko un īsāko audzēja diametru, ko mēra ar nonija kalibru. 20. dienā orgāni un audzēji tika izolēti un nosvērti. Splenocīti tika savākti, skaitīti un iekrāsoti ar anti-CD3-APC un anti-CD19-PE vai anti-CD4-FITC un anti-CD8-APC vai anti-CD11b-PE un anti-Gr-1-APC vai anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC un anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Pēc tam šūnu frekvences un skaits tika analizētas ar plūsmas citometriju (BD FACSCalibur).
Cistanche pastiprina pretvēža iedarbību un uzlabo imunitāti.
Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, noklikšķiniet uz attēla.
Statistiskā analīze
Visi dati tika izteikti kā vidējā ± vidējā standarta kļūda (SEM). Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot vienas/divvirzienu dispersijas analīzi (ANOVA), izmantojot Prism5.{2}} programmatūru. P<.05 was="" considered="" statistically="">
