1. daļa: Cistanche Herba cistanozīds mazina hipoksijas izraisītus vīriešu reproduktīvos bojājumus, nomācot oksidatīvo stresu
Mar 26, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fenqi Yan1*, Xiaoliang Dou1*, Guangfeng Zhu1*, Mingyuan Xia1, Yahui Liu3, Xiaozi Liu3, Guojun Wu2, HeWang1, Bo Zhang1, Qiuju Shao4, Yong Wang1
Abstract:Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka hipoksija ir vīriešu neauglības cēlonis, un hipoksija var būt saistīta ar oksidatīvo stresu (OS). Cistanosīds (Cis) ir feniletanoīda glikozīdu savienojums, ko var iegūt no CistanchesHerba un kam ir dažādas bioloģiskas funkcijas. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt Cis aizsargājošo ietekmi uz hipoksijas izraisītiem reproduktīvajiem bojājumiem un izpētīt īpašos pamatā esošos mehānismus. Tika izveidoti šūnu un dzīvnieku hipoksijas eksperimentālie modeļi, un tika novērtēta dažādu Cis apakštipu aizsargājošā iedarbība uz vīriešu reproduktīvo sistēmu gan in vitro, gan in vivo. Rezultāti liecināja, ka hipoksija būtiski samazināja GC-1 šūnu dzīvotspēju, pateicoties šūnu cikla apstādināšanai un apoptozes aktivācijai, kas bija saistīta ar palielinātu OS. Turklāt Cis uzrādīja spēcīgu antioksidantu iedarbību gan in vitro, gan in vivo, būtiski atjaunojot antioksidantu enzīmu aktivitātes. un reaktīvo skābekļa sugu (ROS) līmeņa pazemināšana, vienlaikus palielinot šūnu dzīvotspēju un samazinot apoptozi. Svarīgi, ka visi šeit pētītie Cis apakštipi (Cis-A, Cis-B, Cis-C un Cis-H) uzrādīja noteiktu antioksidantu iedarbību, starp kuriem Cis-B ietekme bija visnozīmīgākā. Šis pētījums parāda, ka Cis ievērojami mazina hipoksijas izraisītas OS kaitīgo ietekmi, ietekmējot antioksidantu enzīmu aktivitātes sēkliniekos un GC{7}}šūnās.
Atslēgvārdi: Cistanosīds, hipobariskā hipoksija, vīriešu neauglība, oksidatīvais stress, reproduktīvā aizsardzība
svaigs cistanche augs
Ievads
Pašlaik aptuveni 48,5 miljoni (15 procenti) reproduktīvā vecuma pāru visā pasaulē ir skarti ar neauglību [1], tostarp 40-50 procenti gadījumu ir saistīti ar vīriešu neauglību [2], kas ir cieši saistīta ar vidi un dzīvesveidu. faktoriem. Pierādījumi liecina, ka zīdītāju sēklinieku jutīgums pret zemu skābekļa spiedienu ir dažu vīriešu neauglības formu cēlonis [3]. Kā parādīts iepriekšējos pētījumos, spermatoģenēze tiek traucēta un samazināta, pakļaujoties hipobāriskajai hipoksijai [4-7].
Lai izpētītu pamatā esošo mehānismu, pētījumi ir parādījuši, ka hipobariskās hipoksijas iedarbība palielina reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos [8, 9]. ROS ir svarīga loma vīriešu reproduktīvajā sistēmā. Zemā līmenī tie ir nepieciešami spermas kapacitātei, akrosomu reakcijai un spermatozoīdu un olšūnu saplūšanai[10]. Tomēr pārmērīga ROS var izraisīt spermatozoīdu/mitohondriju DNS bojājumus un plazmas membrānas peroksidatīvus bojājumus, kas savukārt ir galvenie etioloģiskie faktori palielinātam vīriešu neauglības riskam [11, 12]. Tādējādi hipoksijas izraisītas ROS uzkrāšanās varētu būt viens no vīriešu neauglības cēloņiem.
Cistanches Herba, daudzgadīgs parazītu ārstniecības augs, ir plaši izplatīts sausos apgabalos [13], un to plaši izmanto tā farmakoloģiskās aktivitātes dēļ [14-17]. No visa efektīvā Cistanches Herba satura PhG ir uzskatīti par galveno aktīvo sastāvdaļu. Līdz šim no Cistanches augiem ir izolēti 34 PhG [13]. Cistanosīds (Cis), anaktīvs PhG, kas izolēts no Cistanches Herba, ir saņēmis uzmanību tā antioksidanta iedarbības dēļ.
Ņemot vērā Cis antioksidantu iedarbību un ROS lomu hipoksijas izraisītā vīriešu neauglībā, Cis tiek uzskatīts par potenciālu zāļu kandidātu hipoksijas izraisītas vīriešu neauglības ārstēšanai. Tomēr daži ziņojumi ir aplūkoti no Cistanches Herba iegūtās Cis antioksidanta iedarbības hipoksijas izraisītas vīriešu neauglības ārstēšanā vai iesaistītajiem signalizācijas ceļiem. Šajā pētījumā tika izveidoti in vitro un in vivo hipoksijas eksperimentālie modeļi un novērtēti dažādu Cisu ietekmes komponenti.
Cistanche ir areproduktīvās ražošanas efekts.
materiāli un metodes
Šūnu kultūra un reaģents
Peļu spermatogoniju šūnu līnija GC-1spg(GC-1) tika iegādāta no American TypeCulture Collection (ATCC) un kultivēta DMEM (Invitrogen, ASV), kas papildināta ar 10% liellopu augļa serumu, 1% L- glutamīns (100 mM), penicilīns (100 U/ml) un streptomicīns (100 ug/ml) 37 grādu temperatūrā mitrinātā inkubatorā ar 5 procentiem CO2. Cis (Cis-A, B, C, H) iegādājās no Chengdu Gelipu Biotechnology Co., Ltd. (Ķīna).
Šūnu dzīvotspējas tests
Šūnu dzīvotspēja tika pārbaudīta ar šūnu skaitīšanas komplekta{{0}}testu (CCK-8). Īsāk sakot, GC-1 šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs ar proporciju 1,5 × 103 katrā iedobē un kultivētas 37 grādu temperatūrā 24 stundas. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar dažādu koncentrāciju (20 procenti, 15 procenti, 10 procenti, 5 procenti) skābekļa vai dažādu koncentrāciju (2 μM, 0,2 μM, 0,02 μM) Cis (Cis-A, Cis-B, Cis-C). , Cis-H) nepieciešamo laiku. Pēc tam supernatants tika izmests, un šūnu dzīvotspēja tika noteikta, izmantojot CCK-8 komplektu (DojindoJapan). Katras iedobes absorbcija tika mērīta pie 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (BioRad USA). Visbeidzot, šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta pēc šādas formulas:
Šūnu dzīvotspēja=(ODeksperimentālā grupa — ODtukšā grupa)/(ODkontroles grupa — ODtukšā grupa) × 100 procenti.
Western blot analīze
Savāktās šūnas vai audi tika homogenizēti RIPA buferšķīdumā, lai ekstrahētu olbaltumvielas (RIPA BeyotimeĶīna; Kokteilis Roche Šveice). Supernatanti tika savākti, un olbaltumvielu koncentrācija tika pārbaudīta ar BCA metodi (Beyotime). Aptuveni 40 ug ekstrahēto proteīnu no katra parauga tika atdalīti ar SDS-PAGE un elektriski pārnesti uz nitrocelulozes (NC) filtra membrānu (BeyotimeChina). NC filtru membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku pienu 1,5 stundas un inkubētas ar specifiskām antivielām (anti-PARP 1:1000, anti-Caspase-3 1:1000, anti-Bcl-2 1:1000, anti-Bax1: 1000, anti-GAPDH 1:1000; visas antivielas tika iegādātas no Cell Signaling Technology, ASV) nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc tam visas NC membrānas tika inkubētas ar atbilstošo mārrutku peroksidāzes konjugētu sekundāro antivielu 1, 5 stundas istabas temperatūrā un attēlotas ar attēlveidošanas sistēmu (Tannon, Ķīna).
cistanche ekstrakta pulvera piedevas
Šūnu cikla noteikšana
Lai analizētu šūnu ciklu, tika veikts plūsmas citometriskais tests (FCM). Šūnas tika apstrādātas dažādos apstākļos 72 stundas un novāktas. Pēc tam šūnas tika mazgātas ar PBS, fiksētas 75% etanolā un iekrāsotas ar propiidiumiodīdu (PI). Katram paraugam tika savāktas 1 × 104 šūnas un analizētas ar plūsmas citometriju (FACSCalibur, BD Biosciences). Pēc tam tika aprēķināta G1/S/G2 fāzes šūnu proporcija un proliferācijas indekss [fāze (S plus G2)/fāze (G1 plus S plus G2) × 100 procenti].
Ki-67 krāsošana
Šūnas tika kultivētas konfokālā traukā un apstrādātas ar hipoksiju vai dažādiem Cis apakštipiem 72 stundas. Pēc visu šūnu fiksēšanas ar 4% paraformaldehīdu tās inkubēja ar anti-Ki-67 antivielu (1:200, šūnu signalizācijas tehnoloģija). Pēc tam visas šūnas tika inkubētas ar atbilstošu CY-3-konjugētu anti-trušu IgG antivielu (1:200, Boster, Ķīna) un DAPI šķīdumu (1,0 ug/ml, Beyotime). Fluorescence tika novērota ar Fluoview FV1000 konfokālo mikroskopu (Olympus, Japāna).
ROS noteikšana
FCM tika ieviests, lai izmērītu intracelulāro ROS līmeni, izmantojot DCFH-DA. Piekarinātās šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs un pakļautas dažādiem apstrādei. Pēc 72 stundu ilgas apstrādes šūnas tika suspendētas serumu nesaturošā DMEM ar 10 μM DCFH-DA (Beyotime). Pēc tam ROS saturs tika noteikts ar fluorescences aktivētu šūnu šķirošanu Beckman Coulter Flow CytometrySystem ar ierosmes viļņa garumu 488 nm un emisijas viļņa garumu 525 nm [18].
Lipīdu peroksidācijas (LPO) noteikšana
Lai noteiktu LPO, tika veikts tiobarbitūrskābes reaktīvo vielu (TBARS) tests. Visas darbības tika veiktas saskaņā ar instrukcijām (Sigma USA). Koncentrācijas tika aprēķinātas, izmantojot molāro ekstinkcijas koeficientu 1,56 × 105 / (M · cm), kas tika iegūts, izmantojot malondialdehīdu kā standartu. Rezultātus izsaka kā MDA ekvivalentu nmol/mg proteīna.
Fermentu aktivitāšu noteikšana
Fermentu aktivitātes tika pārbaudītas, izmantojot testu komplektus, tostarp glutationa reduktāzi (GR), glutationa peroksidāzi (GPx) un superoksīda dismutāzi (SOD). Visas darbības tika veiktas saskaņā ar piegādātajām instrukcijām (Nan Jing Jian Cheng BioengineeringInstitute China).
Dzīvnieki un eksperimentālais protokols
Nobrieduši Wistar žurku tēviņi (180-220 g, 8 w veci) tika iegūti no Ceturtās Militārās medicīnas universitātes Siaņas, Ķīnas dzīvnieku centra. Dzīvnieku izmantošanas atļauja tika iegūta no Universitātes Ētikas komitejas (atsauces numurs). : 20190506). Eksperiments ar dzīvniekiem tika veikts saskaņā ar universitātes vadlīnijām par laboratorijas dzīvnieku aprūpi un izmantošanu.
Visām žurkām tika atļauts pielāgoties aptuveni vienu nedēļu pirms eksperimenta sākuma. Pēc aklimatizācijas žurkas nejauši tika sadalītas 6 grupās ar 5 dzīvniekiem katrā grupā. Kontroles grupas žurkas tika audzētas normālā spiedienā (PO2: 20 procenti; gaisa spiediens: 101,3 kPa), savukārt žurkas modeļa un cisternas grupās tika audzētas zema spiediena skābekļa kamerā (iekšējais spiediens 61,6 kPa, kas atbilst 4000 metru augstumā virs jūras līmeņa; PO2: 14,55 procenti), lai imitētu hipoksisku vidi augstkalnā. Visām žurkām bija brīva piekļuve pārtikai un ūdenim plastmasas būros 22±2 grādu temperatūrā un mitruma apstākļos ar automātisku 12-h gaismas/tumsas ciklu. Žurkas, kas tika ārstētas ar modeli un Cis grupām, palika hipobariskos apstākļos, bet ik pēc 96 stundām tika pārvietotas uz normobariskiem apstākļiem, un tajā laikā tām tika nodrošināta barība un ūdens, un būri tika iztīrīti. Pārejas ilgums no hipobariskā uz hipobarisko bija aptuveni 2 stundas. Visas ārstēšanas grupas 8 nedēļas tika ārstētas ar atbilstošo Cis (8 mg/kg/d), izmantojot orālo zondi, savukārt kontroles un modeļa žurkas tika apstrādātas ar vienādu ūdens daudzumu.
Pēc 8 nedēļām žurkas tika nogalinātas anestēzijā. Sēklinieki, epididīms un sēklas pūslīši tika atdalīti un nosvērti, un organindekss tika aprēķināts pēc šādas formulas: (orgāna/dzīvnieka svars) × 100 procenti. Pēc tam tika savākti spermatozoīdi epididīmā un pārbaudīta to kustība un akrosomeenzīma aktivitāte. Līdzīgi tika savākti sēklinieku audi histopatoloģiskajiem pētījumiem un ROS, LPO un antioksidantu enzīmu aktivitātes noteikšanai.
Dzīvas spermas ātruma novērtējums
Epididīms tika iegriezts ar ķirurģiskām šķērēm, un spermas suspensija tika sagatavota normālā fizioloģiskā šķīdumā. Lai novērtētu dzīvās spermas ātrumu, 5 μL spermas suspensijas rūpīgi sajauca ar vienādu tilpumu eozīna-Ystain. Pēc tam spermas tika skaitītas gaismas mikroskopā. Dzīvās spermas līmenis tika novērtēts, aprēķinot gan iekrāsotu (mirušo spermu), gan nekrāsotu spermu (dzīvu spermu).
Cistanche tubulosa pulverispalielinadzīvās spermas likmes.
Lai iegūtu plašāku informāciju, lūdzu, noklikšķiniet šeit.
Spermas akrosomu enzīmu aktivitātes noteikšana
Spermas akrosomu enzīmu aktivitātes tests tika izmantots, lai novērtētu spermas akrosomenzīmus [19]. Rezultāti katrā grupā tika aprēķināti, izmantojot šādu formulu: Akrosomu enzīmu aktivitāte (μIU)=(ODExperimentgroup — ODBlank group)/(247,5×10) × 106.
Statistiskā analīze
Visi kvantitatīvie dati ir izteikti kā vidējais ± SD un tika analizēti, izmantojot SPSS 22.0 programmatūru. Neatkarīgā Studenta t-tests tika izmantots, lai salīdzinātu datus starp divām grupām. *P< 0.05="" and="" **p="" <="" 0.01="" were="" considered="" statistically="" significant="">
