1. DAĻA ehinakozīds izraisa žurku plaušu artēriju vazorelaksāciju, atverot NO-cGMP-PKG-BKCa kanālus un samazinot intracelulāro Ca2 plus līmeni

Kā ehinakozīds izraisa venozo relaksāciju?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Farmakoloģijas nodaļa, Dzīvības zinātņu un biofarmācijas skola, Šeņjanas Farmācijas universitāte, Šeņjana 110016, Ķīna; 2 Augstkalnu medicīnas pētniecības centrs, Qinghai Universitātes Medicīnas koledža, Sjiņinga 810001, Ķīna; 3 Farmācijas skola, Qinghai University for Nationalities, Xining 810007, Ķīna; 4 Qinghai ieceļošanas un izbraukšanas inspekcijas un karantīnas birojs, Xining 810001, Ķīna

Mērķis:Ilgstoša plaušu vazokonstrikcija, kas piedzīvota lielā augstumā, var izraisīt plaušu hipertensiju (PH). Šī pētījuma galvenais mērķis ir izpētīt vazorelaksējošo iedarbībuehinakozīds(ECH), feniletanoīda glikozīds no Tibetas garšauga Lagotis brevituba Maxim unCistanche tubulosa, par plaušu artēriju un tās iespējamo mehānismu.

Metodes:Plaušu arteriālie gredzeni, kas iegūti no Wistar žurku tēviņiem, tika suspendēti orgānu kamerās, kas piepildītas ar Krebs-Henseleit šķīdumu, un izometriskais spriegums tika mērīts, izmantojot spēka devēju. Intracelulārais Ca2 plus līmenis tika mērīts kultivētās žurku plaušu artēriju gludās muskulatūras šūnās (PASMC), izmantojot Fluo 4-AM.

Rezultāti: ECH(30–300 μmol/L) atslābināja žurku plaušu artērijas, kuras iepriekš sarauca noradrenalīns (NE) no koncentrācijas atkarīgā veidā, un šo efektu varēja novērot gan neskartā endotēlija, gan endotēlija atkailinātos gredzenos, bet ar ievērojami zemāku maksimālo reakciju un augstāks EC50 endotēlija atkailinātos gredzenos. Šo efektu ievērojami bloķēja L-NAME, TEA un BaCl2. Tomēr IMT, 4-AP un Gli neinhibējaECH- izraisīta relaksācija. Ekstracelulāros Ca2 plus nesaturošos apstākļos maksimālā kontrakcija tika samazināta līdz 24,54 procentiem ±2,97 procentiem un 10,60 procentiem ±2,07 procentiem gredzenos, kas apstrādāti attiecīgi ar 100 un 300 μmol/L ECH. Ekstracelulārā kalcija pieplūduma apstākļos maksimālā kontrakcija tika samazināta līdz 112,42 procentiem ±7,30 procentiem, 100,29 procentiem ±8,66 procentiem un 74,74 procentiem ±4,95 procentiem gredzenos, kas apstrādāti attiecīgi ar 30, 100 un 300 μmol/l ECH. Pēc tam, kad šūnas tika ielādētas ar Fluo 4-AM, vidējā fluorescences intensitāte bija zemāka šūnās, kas apstrādātas arECH(100 μmol/L) nekā ar NE.

Secinājums: ECHnomāc NE izraisītu žurku plaušu artērijas kontrakciju, samazinot intracelulāro Ca2 plus līmeni, un inducē tās relaksāciju caur NO-cGMP ceļu un atver K plus kanālus (BKCa un KIR).

Atslēgvārdi:Tibetas garšaugs;ehinakozīds; plaušu hipertensija; liels augstums; vazorelaksācija; NĒ; BKCa; KIR; artērijas gredzens; plaušu artēriju gludās muskulatūras šūnas.

Lai iegūtu vairāk informācijas, lūdzu, sazinieties ar:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola ir daudz efektu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

Ievads

Ilgstoša plaušu vazokonstrikcija, kas piedzīvota lielā augstumā, var izraisīt plaušu hipertensiju (PH) un mediālu hipertrofiju[1], kas ir identificētas kā galvenais labā kambara hipertrofijas un sirds mazspējas cēlonis[2]. Personām, kas īslaicīgi vai pastāvīgi dzīvo lielā augstumā, var būt viegla vai mērena plaušu hipertensija, un tiem, kuriem ir lielāka jutība pret hipoksiju, var būt pārspīlēta plaušu vazokonstrikcija, kas izraisa dažādas augstkalnu slimības, kas saistītas ar ievērojamu saslimstību un mirstību, piemēram, augstkalnu plaušu tūska un sirds slimības[3].Ehinakozīds(ECH) (1. attēls) ir afeniletanoīda glikozīdsatrodami dažādos ķīniešu augos, piemēram, Tibetas garšaugā Lagotis brevituba Maxim unCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim ir Lagotis spp. suga, kas pieder pie Scrophulariaceae un plaši aug vairāk nekā 3000 metru augstumā Qinghai-Tibetas plato.ECHTam ir dažādas vēlamas farmakoloģiskas īpašības, piemēram, antioksidatīvas, pretiekaisuma, neiroprotektīvas, hepatoprotektīvas un slāpekļa oksīda (NO) radikāļu attīrīšanas īpašības[6]. Tas var arī izraisīt no endotēlija atkarīgu relaksāciju žurku krūšu aortas gredzenos un izārstēt sirds un asinsvadu slimības[7]. Tomēr, cik mums ir zināms, nav veikts pētījums, kas pētītu tā ietekmi uz asinsvadu tonusu plaušu artērijās. Šī pētījuma mērķi ir šādi: (1) izpētīt, vai ECH in vitro inducē asinsvadu relaksāciju žurku plaušu artērijās, kas iepriekš noslēgtas ar noradrenalīnu (NE), un vai šī ietekme, ja tāda ir, ir atkarīga no endotēlija vai iedarbojas tieši uz asinsvadu gludajiem muskuļiem. ; (2) izpētīt ECH ietekmi uz ekstracelulāro kalcija pieplūdumu un intracelulāro kalcija izdalīšanos žurku plaušu artēriju gludās muskulatūras šūnās (PASMC); un (3) identificēt iespējamos ceļus un K plus kanālus, kas iesaistīti ECH izraisītā relaksācijā.

materiāli un metodes

Reaģenti

ECH laipni nodrošināja Dr. Peng-fei TU no Pekinas Universitātes (Pekina, Ķīna) ar vairāk nekā 98 procentu tīrību, kas noteikta ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju. Dimetilsulfoksīds (DMSO) tika iegādāts no Solar Science & Technology Co, Ltd (Pekina, Ķīna); NE, acetilholīns (ACh, lielāks vai vienāds ar 99 procentiem), indometacīns (IMT), Nω-nitro-L-arginīna metilestera hidrohlorīds (L-NAME), tetraetilamonija hlorīds (TEA), bārija hlorīds (BaCl2), {{ 9}}aminopiridīns ({{10}}AP) un glibenklamīds (Gli) no Sigma Chemical Co (St Louis, MO, ASV); augsta glikozes Dulbecco modificētā Eagle barotne (DMEM), liellopu augļa serums (FBS) un tripsīns no Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, ASV); peles anti-žurka primārā gludās muskulatūras aktīna (-SMA) antiviela un kazas anti-peļu sekundārā antiviela no Boshide Biotech Co, Ltd (Uhaņa, Ķīna); Fluo kalcija indikatori (Fluo 4-AM) no Invitrogen Corp (Carlsbad, CA, ASV); un visi neorganiskie sāļi no Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Pekina, Ķīna). IMT tika izšķīdināts DMSO un 5% NaH2PO4, Gli, Fluo 4-AM un ECH tika izšķīdināts DMSO, un visi pārējie reaģenti tika izšķīdināti Krebs-Henseleit (KH) vai PBS šķīdumā. Sākotnējie eksperimenti parādīja, ka DMSO mazāk nekā 0,1% (v/v) neietekmēja izolētu plaušu artēriju gredzenu spriedzes attīstību.

Eksperimentālie dzīvnieki

Visas procedūras un protokolus apstiprināja Qinghai Universitātes Medicīnas koledžas Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja. Wistar žurku tēviņi, 6–8 nedēļas veci, 250–300 g ķermeņa svara, tika iegādāti no Landžou Universitātes Dzīvnieku centra (Lanžou, Ķīna) un tika turēti ar standarta laboratorijas diētu un krāna ūdeni ad libitum apkārtējās vides temperatūrā 22±. 2 grādi un relatīvais mitrums 45–55 procenti visu eksperimentu laikā.

In vitro plaušu artēriju perfūzija

Žurku plaušu artēriju gredzenu sagatavošana

Žurkas, kas sver 250–300 g, tika anestēzētas, intraperitoneāli ievadot nātrija pentobarbitālu (40 mg/kg), un pēc tam to sirdis un plaušas tika izņemtas un nekavējoties iegremdētas ledusaukstā KH šķīdumā, kas satur (mmol/l) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 un 11,1 glikozes (pH 7,4). Intrapulmonārās artērijas (diametrs 0, 7–1, 5 mm) tika izgrieztas bez apkārtējiem saistaudiem un adventīcijas un pēc tam sagrieztas aptuveni 2–3 mm garos gredzenos. Gredzeni tika suspendēti orgānu kamerās, kas pildītas ar 10 ml KH šķīduma 37 grādu temperatūrā un gāzēti ar 95% O2–5% CO2 [8], un izometriskais spriegums tika mērīts, izmantojot spēka devēju (JH-2, Space Medico). -Inženierzinātņu institūts, Pekina, Ķīna)

Asinsvadu gredzena aktivitātes novērtējums un endotēlija funkcijas novērtējums

Kuģa gredzeniem ļāva līdzsvaroties 2 stundas ar 400 mg bazālo spriegumu, šajā laikā KH šķīdums tika mainīts ik pēc 15 minūtēm; tad kamerā tika pievienots 1 μmol/L NE, lai novērtētu katra gredzena aktivitāti, nosakot kontrakcijas procentu. Pirms un pēc eksperimentālā protokola tika izmērīts kontrakcijas procents (2.A un 2.B attēls). Dažos gredzenos endotēlijs tika noņemts, viegli berzējot intimālo virsmu ar smalku tērauda stiepli, un integritāte tika kvalitatīvi novērtēta pēc ACh izraisītās relaksācijas pakāpes (10 μmol/L) NE izraisītā kontraktilā tonusa procentos (1). μmol/L). Ja relaksācija ar ACh bija lielāka par 80 procentiem, endotēlijs palika labā stāvoklī; ja relaksācija bija mazāka par 30 procentiem, endotēlijs tika iznīcināts (2.A un 2.B attēls)[9].

Žurku PASMC izolēšana un kultūra

Distālās plaušu artērijas tika izolētas no žurku plaušu daivām, un endotēlijs un adventīcija tika rūpīgi noņemti. Pēc tam, kad audi tika sasmalcināti {{0}} mm gabalos, tie tika nekavējoties pievienoti kolbām, aptuveni četras stundas tika turēti 37 grādu temperatūrā un 5% CO2 mitrinātā inkubatorā un pēc tam kultivēti ar DMEM ar augstu glikozes saturu. papildināts ar 20 procentiem FBS, 100 V/ml penicilīna un 100 V/ml streptomicīna aptuveni piecas dienas. Puse barotnes tika aizstāta ar svaigu barotni, kad šūnas parādījās. Kad šūnas sasniedza 80 procentu saplūšanu, tās savāca ar 0,125 procentiem tripsīna un iesēja kolbās (attiecība 1:2), kas saturēja DMEM ar augstu glikozes saturu, kas papildināts ar 10 procentiem FBS, 100 V/ml penicilīna un 100 U/ml streptomicīna. . Visiem eksperimentiem tika izmantotas šūnas ar trim līdz astoņām pasāžām.

PASMC identificēšana ar imūnhistoķīmiju

PASMC bija pozitīvi attiecībā uz imūnķīmisko krāsošanu, kad tika novērotas tipiskas "kalna un ielejas" pazīmes. Šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs ar stikla segstikliņiem. Kad šūnas sasniedza 80 procentu saplūšanas, tās tika fiksētas 4 procentu paraformaldehīdā, 15 minūtes bloķētas ar 3 procentu ūdeņraža peroksīdu un pēc tam inkubētas ar peles anti-žurku primāro SMA antivielu nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc trīs reizes mazgāšanas PBS 10 minūtes šūnas tika inkubētas ar kazas anti-peles sekundāro antivielu istabas temperatūrā 45 minūtes, vēlreiz trīs reizes nomazgātas PBS 10 minūtes un vizualizētas ar diaminobenzidīnu.

Intracelulārā kalcija koncentrācijas noteikšana žurku PASMC

PASMC tika iesēti {{0}}iedobju plāksnēs ar stikla segstikliņiem. Kad šūnas sasniedza 80 procentu saplūšanu, barotne tika aizstāta ar serumu nesaturošu DMEM. Divdesmit četras stundas vēlāk šūnas tika ielādētas ar 7 μmol/L Fluo 4-AM 37 grādu temperatūrā 30 minūtes mitrinātā atmosfērā ar 5 procentiem CO2. Krāsas atlikums tika mazgāts ar Henksa līdzsvarotā sāls šķīduma (HBSS) šķīdumu, kas satur šādu (mmol/l): 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 un 5,56 D-glikozes, bez fenolsarkanā. Šūnas, kas bija ielādētas ar Fluo 4-AM, tika pakļautas vienam no trim apstrādes apstākļiem: (1) kontroles grupai (kongrupai), kurā šūnas tika inkubētas ar DMEM, kas nesatur serumu; (2) NE grupa, kurā šūnas 10 minūtes tika inkubētas ar serumu nesaturošu DMEM, kas papildināts ar 1 μmol/L NE; un (3) NE plus ECH (100 μmol/L) grupa (NE plus ECH100 grupa), kurā šūnas tika inkubētas ar serumu nesaturošu DMEM, kas papildināts ar 1 μmol/L NE 10 minūtes un 100 μmol/L ECH. uz 20 min. Fluorescences intensitāte tika novērota un fotografēta ar fluorescences mikroskopiju (IX71, Olympus, Tokija, Japāna)[11]. Katram paraugam tika savākti seši redzes lauki (200 ×). Intracelulārā kalcija koncentrācija tika kvantitatīvi noteikta, mērot vidējo fluorescences intensitāti, izmantojot Image Pro-Plus 6.0 programmatūru.

Statistiskā analīze

Dati tika izteikti kā vidējais ± SD. Ja atbilstoša, nozīmīga atšķirība tika novērtēta ar Daneta testu vai Stjudenta-Ņūmena-Kīla testu vairākiem salīdzinājumiem pēc vienvirziena dispersijas analīzes (ANOVA). P varbūtības līmenis<0.05 was="" considered="">

Rezultāti ECH vazorelaksējošā iedarbība uz izolētu plaušu artēriju

Eksperimenta sākumā kumulatīvā ECH pievienošana no 30 līdz 300 μmol/L būtiski neietekmēja plaušu artērijas bazālo spriegumu. Kad NE izraisītā vazokonstrikcija sasniedza plato, ECH tika pievienots kumulatīvi (30–300 μmol/L) neskartam endotēlijam (E plus, 2.C attēls) vai no endotēlija atdalītiem gredzeniem (E–, 2.C attēls). Neskartos endotēlija gredzenos kumulatīvā ECH pievienošana paplašināja asinsvadus atkarībā no koncentrācijas, nodrošinot maksimālu

mammas relaksācijas procents 89,22 procenti ±0,32 procenti pie 300 μmol/L un EC50 51,60±0,57 μmol/L (2.A un 2C attēls). Līdzīgi gredzenos, kas atdalīti no endotēlija, ECH arī paplašināja asinsvadus atkarībā no koncentrācijas, bet ar ievērojami zemāku maksimālo reakciju - 67,72 procenti ± 1,69 procenti (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

ECH ietekme uz intracelulāro kalcija izdalīšanos un ekstracelulāro kalcija pieplūdumu

No endotēlija atdalītie gredzeni tika pakļauti 1 μmol / L NE iedarbībai, līdz tika sasniegta maksimālā kontrakcija. Āršūnu apstākļos, kas nesatur Ca2 plus, pirms eksperimentu uzsākšanas gredzeni tika līdzsvaroti Ca2 plus nesaturošā KH šķīdumā, kas satur 0,2 mmol/L EGTA. Pēc trīs mazgāšanas ar Ca2 plus un EGTA nesaturošu KH šķīdumu, gredzeni tika iepriekš inkubēti ar ECH (30, 100 un 300 μmol / L) 20 minūtes un pēc tam atkārtoti pakļauti 1 μmol / L NE. Ražoti gredzeni

nenoturīgas kontrakcijas, kas ātri atgriezās sākotnējā līmenī, salīdzinot ar sākotnējām kontrakcijām, ko izraisīja NE, kas kalpoja kā atsauce. Kontroles maksimālā kontrakcija bija 33,27 procenti ±2,94 procenti (3.A un 3.E attēls), taču tā tika ievērojami samazināta līdz 24,54 procentiem ±2,97 procentiem un 10,60 procentiem ±2,07 procentiem gredzenos, kas iepriekš apstrādāti ar 100 un 300 μmol/L (attiecīgi ECH).<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Dažādu inhibitoru loma ECH izraisītā žurku plaušu artēriju vazorelaksācijā

ECH izraisīta žurku plaušu artēriju vazorelaksācija tika pētīta šādu inhibitoru klātbūtnē vai bez tās: L-NAME (eNOS inhibitors), IMT (ciklooksigenāzes inhibitors), TEA (lielas vadītspējas Ca2 plus aktivēts K plus kanāla inhibitors), BaCl2 ( iekšējais taisngriezis K plus kanāla inhibitors), 4-AP (no sprieguma atkarīgs K plus kanāla inhibitors) un Gli (ATP jutīgs K plus kanāla inhibitors). Gredzeni tika maksimāli savilkti ar 1 μmol/L NE un pēc tam L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , tika pievienots attiecīgi BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) vai Gli (10 μmol/L). Kad tika sasniegts jauns plato, ECH tika pievienots kumulatīvā veidā no 30 līdz 300 μmol / L. Koncentrācijas-reakcijas līknes dažādu inhibitoru klātbūtnē ir parādītas 4. attēlā. ECH vazorelaksējošo efektu uz plaušu artēriju gredzeniem, kas saraujušies ar 1 μmol/L NE, būtiski bloķēja L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) un BaCl2 (1 mmol/L) ar maksimālo relaksāciju attiecīgi 64,41 procenti ±3,20 procenti, 84,38 procenti ±0,70 procenti un 75,27 procenti ±0,93 procenti (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Žurku PASMC identifikācija

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 procenti) (6.A attēls). Ar lielu palielinājumu citoplazmā tika skaidri novēroti brūni iekrāsoti miofilamenti (6.B attēls).

Cistancheehinakozīdsvar pretotiesapoptoze

ECH ietekme uz intracelulāro kalcija koncentrāciju žurku PASMC

NE (1 μmol/L) būtiski palielināja intracelulāro kalcija koncentrāciju (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">