2. daļa: Akteozīds nomāc RANKL mediētu osteooklastoģenēzi, kavējot C-Fos indukciju un NF-KB ceļu un vājinot ROS veidošanos

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Seung-Youp Lee1,2., Keun-Soo Lee3.¤, Sea Hyun Yi2., Sung-Ho Kook, Jeong-Chae Lee22,3*

Lūdzu, noklikšķiniet šeit atpakaļ uz 1. daļu

AkteozīdsInhibē makrofāgu veikto kaulu rezorbciju. Akteozīds arī novērsa RANKL izraisītu kaulu rezorbciju atkarībā no devas, ko mēra ar in vitro modeļa sistēmu (3.A att.). Kaulu rezorbcija tika ievērojami kavēta, kad BMM tika inkubēti ar 1 mM akteozīdu (3.B att.). Apstrāde ar 10 mM akteozīdu gandrīz pilnībā mazināja RANKL izraisīto bedru veidošanos ar BMM. Līdzīgi akteozīds samazināja kaulu rezorbciju RANKL stimulētajās RAW264.7 šūnās (S2A un B att.). Akteozīda spēja kavēt kaulu rezorbciju bija atkarīga no ārstēšanas laika, salīdzinot ar RANKL stimulāciju. Akteozīds (10 mM), kas pievienots 4 dienas pēc RANKL stimulācijas, nesamazināja bedrīšu veidošanos BMM, bet nomāca izveidoto osteoklastu skaitu (3. C attēls). Šis atšķirīgais rezultāts daļēji bija saistīts ar bedres laukumu, kas jau izveidojās pēc 4 dienām ilgas RANKL stimulācijas veidošanās (3. att.).

CISTANČU EKSTRAKTS

AkteozīdsLejupregulē agrīnos RANKL signalizācijas ceļus

RANKL izraisa 3 labi zināmu MAPK un NF-kB aktivāciju osteoklastu prekursoros, un šī aktivizēšana ir nepieciešama agrīnai osteoklastu diferenciācijai. Lai saprastu iespējamos mehānismus, ar kuriemakteozīdskavē osteoklastoģenēzi, mēs pētījām ietekmiakteozīdspar MAPK un NF-kB aktivizēšanu makrofāgos. BMM un RAW264.7 šūnas tika iepriekš apstrādātas ar 10 mM akteozīdu 2 stundas un pēc tam stimulētas ar 100 ng / ml RANKL 30 minūtes. MAPK fosforilācija tika pārbaudīta ar Western blotēšanu un imunometrisko analīzi. RANKL izraisīja p38, ERK un JNK fosforilēšanos BMM (4.A att.) un RAW264.7 šūnās (4.B att.). Akteozīds novērsa šo RANKL izraisīto p-p38, p-ERK un p-JNK pieaugumu. Šo rezultātu apstiprināja imunometriskā analīze, kas iepriekšēja apstrāde ar 10 mM akteozīdu ievērojami kavēja fosforilēto MAPK līmeni šajos makrofāgos (4. att. C). Ārstēšana ar RANKL palielināja NF-kB saistīšanos ar DNS, bet akteozīds inhibēja RANKL izraisītu NF-kB-DNS saistīšanās aktivāciju (5.A attēls). Šī inhibīcija bija izteiktāka BMM nekā RAW264.7 šūnās. Akteozīds arī samazināja RANKL stimulēto p65 un IkBa fosforilēšanos BMM un RAW264.7 šūnās (5.B un C att.). 10 mM akteozīda pievienošana gandrīz pilnībā kavēja gan IkBa noārdīšanos, gan aktivizēšanos BMM (5.B att.). Lai vēl vairāk apstiprinātu, ka NF-kB aktivācija ir iesaistīta akteozīda darbībā, kB promotora-luciferāzes konstrukcijas tika īslaicīgi transfekētas RAW264.7 šūnās. Šūnām, kas tika inkubētas ar 100 ng/ml RANKL, bija 3- reizes lielāka kB promotora aktivitāte, ko ievērojami vājināja 10 mM akteozīds (5. att.).

AkteozīdsNomāc iekaisuma citokīnu veidošanos un TNF-a, c-Fos un NFATc1 ekspresiju RANKL stimulētos makrofāgos TNF-a, IL-1b un IL-6 ir svarīgi osteoklastu veidošanā un funkcija, ko mediē NF-kB signalizācija RANKL stimulētos makrofāgos. RANKL stimulēja šo citokīnu veidošanos, un šī produkcija tika ievērojami samazināta ar 10 mM akteozīda pirmapstrādi BMM (6.A att.). Līdzīgi akteozīds mazināja RANKL izraisīto citokīnu, izņemot IL-6, ražošanu RAW264.7 makrofāgos (S3. att.). Lai izprastu akteozīda iedarbības molekulāros mehānismus osteoklastoģenēzē, mēs tālāk pētījām akteozīda ietekmi uz TNF-a, c-Fos un NFATc1 ekspresiju. RANKL palielināja šo faktoru mRNS ekspresiju BMM un RAW264.7 šūnās (6.B un C att.). Iepriekšēja apstrāde ar 10 mM akteozīdu ievērojami kavēja RANKL izraisīto šo faktoru ekspresiju abos gadījumos

BMM un RAW264.7 šūnas. Iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu arī ievērojami samazināja c-Fos un NFATc1 proteīna līmeni RANKL stimulētos BMM (6. D attēls). Šie rezultāti liecina, ka akteozīds samazina RANKL inducējošos osteoklastu veidošanās mediatorus gēnu un olbaltumvielu līmenī.

CISTANŠES EKSTRAKTS: AKTEOZĪDS

Akteozīds samazina intracelulāro ROS veidošanos BMM atkarībā no devas

Tā kā ir zināms, ka intracelulārā ROS ražošana ir saistīta ar RANKL stimulētu osteoklastoģenēzi, mēs pētījām, vai akteozīds kavē ROS veidošanos RANKL mediētās osteoklastu diferenciācijas laikā, izmantojot šūnu caurlaidīgu, oksidāciju jutīgu krāsu DCFH-DA. Plūsmas citometrijas analīze parādīja, ka vidējais fluorescences signāls, kas raksturīgs DCF BMM, pēc stimulācijas ar RANKL bija acīmredzami nobīdīts pa labi, salīdzinot ar neapstrādātajām kontroles šūnām (7.A att.). Šī maiņa bija līdzīga gadījumam, kad pēc RANKL stimulācijas tika novēroti RAW264.7 makrofāgi (dati nav parādīti). BMM apstrāde ar akteozīdu samazināja DCF signāla intensitāti atkarībā no devas. Iepriekšēja apstrāde ar 10 mM akteozīdu gandrīz pilnībā samazināja intracelulāro ROS līmeni, kas veidojas osteoklastu diferenciācijas laikā, līdz neapstrādātajiem kontroles līmeņiem (7.B att.).

Perorāla akteozīda ievadīšana kavē osteoporozes bioķīmisko marķieru izmaiņas un kaulu zudumu pelēm ar olnīcu izņemšanu

Lai izpētītu akteozīda ietekmi uz kaulu masas zudumu, mēs sagatavojām osteoporozes dzīvnieku modeli ar ovariektomiju. Eksperimenta periodā nebija būtiskas atšķirības ķermeņa svarā starp OVX un Sham pelēm (dati nav parādīti). OVX grupai bija ievērojami augstāks IL-1b un IL-6 līmenis serumā nekā viltus grupā (8. attēls). Ovariektomijas izraisīto šo iekaisuma citokīnu palielināšanos mazināja perorāla akteozīda ievadīšana (AC grupa). OVX grupā ievērojami palielinājās kaulu apmaiņas marķieru, piemēram, ALP, kalcija, TRAP5b un OC, līmenis serumā. No šiem osteoporozes marķieriem paaugstināts kalcija, TRAP5b un OC līmenis OVX pelēm acīmredzami tika inhibēts ar akteozīdu, bet ārstēšana ALP līmeni serumā nemainīja. Vidējā maksimālā lūzuma slodze līdz labā augšstilba kaula vidum bija ievērojami zemāka OVX grupā nekā Sham grupā (9.A att.). Ārstēšana ar akteozīdu palielināja maksimālo lūzumu skaitu atpakaļ līdz pat fiktīvu grupai. Kad augšstilba kaula kortikālais kauls tika izgriezts un novērots ar optisko mikroskopiju, OVX grupā parādītās osteoporozes pazīmes bija gandrīz pilnībā izzudušas AC pelēm (9.B att.). Lai pārbaudītu akteozīda ietekmi uz OVX izraisītas osteoporozes modeli, ar mikro-CT tika analizēti KMB un kaulu morfoloģiskie parametri vieglā proksimālā augšstilba kaula trabekulārā. Kā parādīts 9.C attēlā, OVX pelēm tika konstatētas izmaiņas augšstilba kaula trabekulārajā arhitektūrā, bet šīs izmaiņas mazināja ārstēšana ar akteozīdu. Mikro-CT analīzes rezultāti atklāja, ka KMB, kas ir kaulu stipruma rādītājs, bija ievērojami samazināts OVX pelēm (9. D attēls). Salīdzinot ar Sham grupu, OVX pelēm bija arī būtiskas izmaiņas BV / TV, Tb. Sp un Tb. N, bet ne Tb.Th. OVX peles perorāla ārstēšana ar akteozīdu būtiski novērsa KMB, kā arī BV/TV un Tb.N izmaiņas.

Akteozīds neietekmē osteoblastoģenēzi kaulu smadzeņu šūnās

Akteozīda loma osteoblastiskajā diferenciācijā tika tālāk pētīta, izmantojot kaulu smadzeņu šūnas. Kā parādīts 10.A attēlā, apstrāde ar DAG palielināja ar alizarīna sarkano iekrāsoto šūnu skaitu, un to nemainīja pirmapstrāde ar 10 mM akteozīdu. Klāt esošās krāsvielas daudzums liecināja, ka kombinētais akteozīds unDAG apstrāde nemainīja mineralizāciju (10.B att.). Līdzīgi DAG izraisīto intracelulārā kalcija satura (10. att. C) un mRNS līmeņa (10. D att.) palielināšanos kauliem specifiskos marķieros, piemēram, Runx2, osterix, BSP un OC, iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu neietekmēja.

cistanche akteozīda iedarbība

Diskusija

Kaulu remodelāciju stingri regulē līdzsvars starp kaulu veidošanos ar osteoblastiem un kaulu rezorbciju, ko veic osteoklasti. Ilgstoša un pārmērīga kaulu rezorbcija izraisa skeleta aprites nelīdzsvarotību, kā rezultātā rodas kaulu rezorbcijas slimības. Lai izpētītu akteozīda ietekmi uz osteoklastoģenēzi, mēs izmantojām divus makrofāgus, primāri kultivētus BMM un RAW264.7 šūnas.

Šīs šūnas tika stimulētas ar RANKL, lai tās diferencētu osteoklastos akteozīda klātbūtnē un bez tā. Mēs pirmo reizi parādījām, ka akteozīds kavē osteoklastu diferenciāciju un veidošanos. Pats akteozīds pārbaudītajās koncentrācijās neizraisīja primāri kultivēto makrofāgu dzīvotspējas samazināšanos gan augšanas, gan diferenciācijas apstākļos.

Ārstēšana ar akteozīdu arī samazināja nobriedušu osteoklastu rezorbcijas aktivitāti. Šie rezultāti liecina, ka akteozīds nomāc osteoklastisko veidošanos no makrofāgiem un osteoklastu rezorbcijas aktivitāti. Mūsu kultūras sistēmas rezultāti, kas neietvēra osteoblastus vai stromas šūnas, arī liecina, ka akteozīds novērš osteoklastu veidošanos, tieši iedarbojoties uz osteoklastu prekursoriem.

RANKL aktivizē MAPK, tostarp p38, ERK un JNK. Šīs trīs kināzes ir iesaistītas agrīnā osteoklastu diferenciācijā, un tādējādi to inhibēšana farmakoloģiski vai ar dominējošu negatīvu JNK transfekciju nomāc RANKL izraisītu osteoklastoģenēzi [29]. Mūsu rezultāti atklāja, ka pirmapstrāde ar akteozīdu inhibēja visas šīs kināzes, norādot uz nespecifisku MAPK pazeminātu regulēšanu. Šis rezultāts daļēji atšķīrās no iepriekšējā ziņojuma, ka EGCG, galvenais pretiekaisuma savienojums zaļajā tējas sastāvā, īpaši vājināja JNK aktivāciju, neietekmējot ERK vai p38 aktivāciju RANKL stimulētos BMM [7]. Ir ziņots, ka paeonols, pretiekaisuma savienojums, kas iegūts no ķīniešu auga, inhibē ERK un p38, bet ne JNK, fosforilāciju RANKL stimulētajās RAW264.7 šūnās [30]. Turpretim silibinīns, jauns inhibitors kaulos, vājināja RANKL izraisītu p38, ERK un JNK aktivāciju [31]. Šie atklājumi liecina, ka anti-resorbcijas savienojumu ietekme uz MAPK aktivāciju ar RANKL ir atkarīga no savienojuma, lai gan visi trīs MAPK ir iesaistīti agrīnā osteoklastoģenēzē.

Ņemot vērā novērojumu, ka akteozīds vājināja p-JNK

līmeņi RANKL stimulētajos BMM, pat pie 1 mM, JNK, nevis p38 MAPK vai ERK bloķēšana, šķiet, bija specifiskāks notikums akteozīdu mediētajā anti-osteoklastoģenēzē šūnās. Lai gan akteozīds tādā pašā koncentrācijā nesamazināja osteoklastu skaitu BMM, apstrādājot ar akteozīdu, ievērojami samazinājās bedres veidošanās. Mēs arī atklājām, ka pirmapstrāde ar SP600125, JNK specifisku farmakoloģisku inhibitoru, dramatiski novērsa osteoklastu veidošanos (dati nav parādīti). Kopumā šie atklājumi liecina, ka JNK mediētā signalizācija ir cieši saistīta ar akteozīdu mediētu osteoklastoģenēzes nomākšanu, ko stimulē RANKL.

NF-kB signalizācija regulē šūnu notikumus, tostarp apoptozi, šūnu cikla progresēšanu, šūnu adhēziju, citokīnu veidošanos un izdzīvošanu makrofāgos [32]. NF-kB signalizācija ir nepieciešama arī osteoklastu attīstībai, par ko liecina osteopetrozes parādīšanās NF-kB nokautām pelēm [33, 34]. Tāpēc tiek ierosināts, ka NF-kB inhibēšana ir efektīvs mērķis pretresorbcijas līdzekļiem, lai samazinātu osteoklastu aktivitāti un ārstētu osteoporozi. NF-kB apakšģimenes proteīnu pēctranslācijas modifikācija ir būtiska NF-kB aktivitātes modulēšanai. Jo īpaši p65 apakšvienības un IkB kināzes fosforilēšana ir būtiska, lai NF-kB izraisītu osteoklastoģenēzi [7]. Mūsu pašreizējie atklājumi parādīja, ka RANKL stimulācija palielināja NF-kB DNS saistīšanās aktivitāti un p65 apakšvienības un IkBa fosforilāciju gan BMM, gan RAW264.7 šūnās. Iepriekšēja apstrāde ar akteozīdu inhibēja šos RANKL izraisītos palielinājumus, kā rezultātā tika samazināta NF-kB aktivitāte. Līdz ar to šie rezultāti liecina, ka papildus MAPK NF-kB signalizācija ir galvenais akteozīda mērķis, inhibējot osteoklastu diferenciāciju un veidošanos no RANKL stimulētiem makrofāgiem.

Papildus NF-kB signalizācijai c-Fos/c-Jun/NFATc1 ceļam ir galvenā loma osteoklastu attīstībā, tāpēc šo proteīnu trūkums var apturēt osteoklastoģenēzi [35,36]. Šajā pētījumā mēs atklājām, ka akteozīds novērsa RANKL izraisīto c-Fos un NFATc1 ekspresiju mRNS un olbaltumvielu līmenī. JNK ir c-Jun kināze, kas ir nepieciešama NFATc1 ekspresijai un osteoklastoģenēzei, reaģējot uz RANKL [29].

TheJNK/c-Jun ceļa bloķēšana ar nevēlamu inhibitoru samazināja RANKL izraisīto osteoklastu veidošanos un c-Fos un NFATc1 ekspresiju [7]. Mūsu rezultāti un iepriekšējie atklājumi liecina, ka JNK mediētās signalizācijas inhibēšana ar akteozīdu ir cieši saistīta ar RANKL mediētās c-Fos un NFATc1 novēršanu.ekspresija, kas nomāc osteoklastu diferenciāciju makrofāgos. Atšķirības akteozīda iedarbībā uz BMM un RAW264.7 šūnām ir vismaz daļēji saistītas ar atšķirībām jutībā pret JNK inhibīciju.

TNF-a var izraisīt osteoklastoģenēzi neatkarīgi no RANKL-RANK signalizācijas [37]. IL-1 ir spēcīgs mediators patoloģiskai kaulu iznīcināšanai, ko izraisa estrogēna deficīts vai iekaisums [7]. I tipa IL-1 receptoru vai IL-1 signālu pārtraukšana var novērst olnīcu izņemšanas [38] vai reimatoīdā artrīta [39] izraisīto kaulu zudumu. Šis pētījums parādīja akteozīda spēju samazināt iekaisuma citokīnu, piemēram, TNF-a, IL- 1b un IL-6 veidošanos makrofāgos. Tiek uzskatīts, ka akteozīds kavē iekaisuma citokīnu veidošanos, nomācot p38 kināzes un ERK signālu pārraidi, jo ERK1/2, p38 MAPK vai abu aktivizēšana ir nepieciešama šo citokīnu lipopolisaharīdu izraisītai ražošanai makrofāgos [40, 41]. Tika ziņots, ka luteolīns, iekaisuma savienojums, arī nomāc iekaisuma mediatoru veidošanos, inhibējot p38 MAPK aktivāciju [42]. Šajā pētījumā mēs arī atklājām, ka akteozīds mazināja kaulu zudumu pelēm, kurām veikta olnīcu izņemšana, par ko liecina atjaunotais maksimālais lūzuma spēks labā augšstilba kaula vidusdaļā un osteoporotiskā kortikālā kaula izzušana. Perorāla akteozīda lietošana samazināja olnīcu izņemšanas izraisīto IL-1b un IL-6 līmeņa paaugstināšanos serumā, bet ne ALP. Paaugstināto kalcija, TRAP un OC līmeni serumā OVX inhibēja arī perorāla ārstēšana ar akteozīdu, kas liecina, ka akteozīds mazina kaulu veidošanai raksturīgo biomarķieru izmaiņas, kā arī rezorbciju. Tā kā osteoporozei raksturīgs samazināts masas blīvums un trabekulārā kaula mikroarhitektūras pasliktināšanās, OVX izraisītais trabekulārā kaula zudums un morfometrisko parametru izmaiņas tika ievērojami kavētas, lietojot perorāli akteozīdu. Šie atklājumi liecina, ka akteozīdu var izmantot kā pretresorbcijas līdzekli osteoporozes ārstēšanai, novēršot nelīdzsvarotu osteoklastu aktivāciju. Tomēr osteoblasti ir galvenais faktors, kas ir atbildīgs par jaunu kaulu veidošanos. Tādējādi, lai veicinātu kaulu veidošanos, ir nepieciešams līdzeklis, kas spēj palielināt osteoblastu proliferāciju vai diferenciāciju [30]. Turpretī mēs noskaidrojām, ka akteozīds neietekmēja osteoblastu diferenciāciju vai mineralizāciju ar DAG apstrādātajās kaulu smadzeņu šūnās. Kopumā mūsu rezultāti liecina, ka akteozīdam ir pretrezorbcijas efekts, bet tas tieši neietekmē kaulu veidošanos. Ir nepieciešami detalizētāki eksperimenti, kuros analizēti kauliem raksturīgie parametri in vivo un in vitro, lai noskaidrotu, vai akteozīds labvēlīgi ietekmē osteoblastoģenēzi.

Šis pētījums izceļ akteozīda inhibējošo ietekmi uz osteoklastu diferenciāciju un kaulu rezorbciju, nomācot MAPK un vairākus transkripcijas faktorus, piemēram, NF-kB, c-Fos un NFATc1. Dati liecina par diviem iespējamiem mehānismiem, ar kuriem akteozīdam ir šīs priekšrocības.

CISTANŠES EHINAKOZĪDS UN AKTEOZĪDS VAR ārstēt osteoporozi

Atsauces

1. RhoJ, Takami M, Choi Y (2004) Osteoimunoloģija: imūnās un skeleta sistēmas mijiedarbība. Molekulas un šūnas 17: 1–9.

2. Del Fattore A, Capannolo M, Rucci N (2010) Kauli un kaulu smadzenes: tas pats orgāns. Bioķīmijas arhīvs Biofizika 503: 28–34.

3. Rachner TD, Khosla S, Hofbauer LC (2011) Osteoporoze: tagadne un nākotne. Lancet 377: 1276–1287.

4. Sturge J, Caley MP, Waxman J (2011) Kaulu metastāzes prostatas vēža gadījumā: jaunās terapeitiskās stratēģijas. Nature Reviews Clinical Oncology 8: 357–368.

5. Goltzman D (2002) Atklājumi, zāles un skeleta slimības. Nature Reviews Drug Discovery 1: 784–796.

6. Rodan GA, Martin TJ (2002) Terapeitiskās pieejas kaulu slimībām. Zinātne 289: 1508–1514.

7. Lee JH, Jin H, Shim HE, Kim HN, Ha H u.c. (2010) Epigallokatehīna-3- gallāts kavē osteoklastoģenēzi, samazinot c-Fos ekspresiju un nomācot kodolfaktora-kappaB signālu. Molekulārā farmakoloģija 77: 17–25.

8. Kim HN, Lee JH, Jin WJ, Ko S, Jung K u.c. (2012) MS-275, benzamīda histona dezacetilāzes inhibitors, novērš osteoklastoģenēzi, samazinot c-Fos ekspresiju, un nomāc kaulu masas zudumu pelēm. European Journal of Pharmacology 691: 69–76.

9. Kim T, Ha H, Shim KS, Cho WK, MaJY (2013) Yijung-tang anti-osteoporotiskā iedarbība žurku modelī ar olnīcu izņemšanu, ko izraisa osteoklastu diferenciācijas kavēšana. Journal of Ethnopharmacology 146: 83–89.

10. Nakanishi A, Litsuka N, Tsukamoto J (2013) Zivju eļļa nomāc kaulu rezorbciju, inhibējot osteoklastoģenēzi, samazinot M-CSF, PU.1, MITF un RANK ekspresiju žurkām ar olnīcu izņemšanu. Molekulārās medicīnas ziņojumi 7: 1896–1903.

11. Bar-Shavit Z (2007) Osteoklasts: daudzkodolu, hematopoētiskas izcelsmes, kaulus resorbējoša osteoimūna šūna. Journal of Cellular Biochemistry 102: 1130–1139.

12. Takahashi N, Maeda K, Ishihara A, Uehara S, Kobayashi Y (2011) Osteoklastoģenēzes regulēšanas mehānisms ar RANKL un Wnt signāliem. Frontiers in Bioscience 16: 21–30.