​2. daļa: ehinakozīds palielina spermas daudzumu žurkām, mērķējot uz hipotalāma androgēnu receptoru

Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 un Xiaoying Zhang1,2

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai skatītu 1. daļu

Eksperimentējiet ārstēšana.

Eksperimentējiet 1. Peles tika nejauši sadalītas sešās grupās, katrā grupā septiņas peles (n=7).ECH(Ehinakozīds no cistanche)(CAS: 82854-37-3; Chengdu Preferred Biotechnology Co., Ltd, Sichuan, Ķīna) tika ievadīts, izmantojot intragastrālo zondi, un tika ievadīts testosterona propionāts (TP, CAS: 57-85-2; KingYork, Tjandzjiņa, Ķīna). ar intramuskulāru injekciju vienu reizi dienā 14 dienas saskaņā ar šādu eksperimentālo plānu: Kontroles grupa: normāls fizioloģiskais šķīdums (10 ml/kg), ECH_(L)grupa (5 mg/kg), ECH_(M)grupa (20 mg/kg), ECH_(H)grupa (80 mg/kg), TP (15 mg/kg) un enzalutamīds (AR inhibitors, vienu reizi dienā katru otro dienu 14 dienas; 20 mg/kg; CAS: 915087- 33-1; Aladdin, Šanhaja, Ķīna).

Pēc 2 nedēļu ilgas ārstēšanas peles tika anestēzētas ar dietilēteri, lai savāktu asins paraugus hormonu līmeņa analīzei. Pēc tam peles tika sadalītas, lai atdalītu hipotalāmu, encefalonu un hipofīzi, sēklinieku un astes epididīmu. Spermas kvalitātes novērtēšanai astes epididymis paraugi tika ievietoti normālā fizioloģiskā šķīdumā ar 5% BSA, un hipotalāmu, encefalonu, hipofīzi un sēkliniekus sasaldēja šķidrā slāpeklī un uzglabāja -80 grādu temperatūrā turpmākiem pētījumiem.

Eksperimentējiet 2. Peles tika nejauši sadalītas 1 0 grupās, pieci dzīvnieki katrā grupā. ECH (20 mg/kg) tika ievadīts iekšķīgi, un peles katrā grupā tika anestēzētas ar dietilēteri laika punktos 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 6 h, 9 h un 12 h pēc ievadīšanas paraugu ņemšanai.

Tika savākta plazma un atklāta sirds. Parastā fizioloģiskā šķīduma perfūzija kreisajos kambaros tika veikta ar infūzijas aparātu, līdz aknas un plaušas tika blanšētas. Pēc tam tika savākti hipotalāmi un sēklinieki, lai noteiktu ECH koncentrāciju audos(Ehinakozīds no cistanche).

Eksperimentējiet 3. Peles tika nejauši sadalītas 4 grupās, pa septiņām katrā grupā. ECH(Ehinakozīds no cistanche)un BPA (CAS: 80-05-7; Aladdin, Šanhaja, Ķīna) tika ievadītas, izmantojot intragastrālo zondi vienu reizi dienā 6 nedēļas saskaņā ar šādu eksperimentālo plānu: normāla grupa (kukurūzas eļļa, 10 ml/kg, bw/ d), modeļu grupa: BPA grupa (BPA 200 mg/kg, bw/d, kukurūzas eļļa) un eksperimentālā grupa: BPA plus ECH grupa (BPA 200 mg/kg; ECH 20 mg/kg).

Pēc 42 ārstēšanas dienām peles tika anestēzētas ar dietilēteri, un asins paraugi tika savākti hormonu līmeņa analīzēm. Sēklinieks un cauda epididymis tika atdalīti un savākti. Cauda epididymis tika izmantots spermas kvalitātes novērtēšanai, un sēklinieks tika sasaldēts šķidrā slāpeklī un uzglabāts -80 grādu temperatūrā turpmākai izmeklēšanai.

7. attēls. Ceļi, ko regulē ar HPG asi saistītais hormons un olbaltumvielas vīriešu reprodukcijā, kā to paredz Pathway ontology datu bāze un KEGG Pathway datu bāze.

Piezīmes: regulētie procesi tiek attēloti ar dažādu krāsu un formu foniem, un regulējošie notikumi tiek parādīti, izmantojot bultiņas un līnijas.

Ar katru proteīnu saistītās atsauces balstījās uz Pathway ontology datu bāzi un KEGG Pathway datu bāzi, un tās nav uzskaitītas.

Spermas kvalitātes noteikšana. Spermas suspensijas sagatavošana. Cauda epididimīdi tika sasmalcināti 5 ml parasta fizioloģiskā šķīduma ar 5 procentiem BSA un inkubēti 5 minūtes 37 grādos, lai ļautu to saturam izplatīties barotnē.

Spermas skaits: saskaņā ar Yokoi (2003) aprakstīto metodi atšķaidīto spermas suspensiju (1:10; v/v; spermas suspensija/10 procenti metanola) pārnesa uz katru hemocitometra skaitīšanas kameru un ļāva nostāvēties 5 min un pēc tam skaitīts gaismas mikroskopā (Nikon, Instruments Inc., Japāna) ar X200 palielinājumu.

Spermas dzīvotspēja: kopā 20 μL spermas suspensijas tika sajaukti ar vienādu tilpumu eozīna-nigrozīna traipu 2 minūtes; nenokrāsotie spermatozoīdi tika skaitīti gaismas mikroskopā ar 200x palielinājumu.

Spermas kustīgums: kopumā 10 μL spermas suspensijas tika uzliktas uz stikla priekšmetstikliņa un tika reģistrētas kā kustīgas vai nekustīgas gaismas mikroskopā ar 200x palielinājumu.

Hormonu līmeņa noteikšana. Testosterona (T) un LH līmenis tika kvantitatīvi noteikts serumā, encefalonā, kā arī hipofīzes un sēklinieku homogenātos, izmantojot radioimūntesta (RIA) komplektus (Pekinas Ķīnas un Apvienotās Karalistes Bioloģiskās tehnoloģijas institūts, Pekina, Ķīna). Īsumā paraugiem vai standartam (100 μL) tika pievienotas anti-testosterona vai anti-LH IgG antivielas (100 μL) un 125-I-konjugētās anti-peles antivielas un tika sajauktas uz šūpuļa nakti 4 grādu temperatūrā. Pēc trīs reizes mazgāšanas ar PBS-Tween 20 (500 μL) maisījumus centrifugēja (3500 apgr./min) 4 grādos 15 minūtes. Nogulšņu CPM vērtības tika novērtētas ar radioimūntesta instrumentu (Beijing Sino-western Technology Co. Ltd, CN202M/KZ4GC-1200, Pekina, Ķīna), un T un LH koncentrācijas tika aprēķinātas pēc standarta formulas. līkne. T un LH variācijas koeficients ir attiecīgi 2,8 procenti un 3,2 procenti izlases grupās un 2,1 procenti un 2,8 procenti standarta grupās.

Gēnu ekspresiju noteikšana ar reālā laika kvantitatīvo PCR. Kopējā RNS tika izolēta no saldētiem sēklinieku un encefalona, ​​kā arī hipofīzes audiem, izmantojot RNA Simple Total RNS komplektu (Tiangen, Pekina, Ķīna). Kvantitatīvā reāllaika PCR (q RT-PCR) tika veikta cDNS amplifikācijai, izmantojot 2 × SYBR Green I PCR Master Mix (Vazyme, Nanjing, Ķīna). PCR procedūra sastāvēja no 95 grādiem 30 sekundes, kam sekoja 35 cikli 95 grādu 15 sekundes, 58 grādus 30 sekundes un 72 grādus 30 sekundes. Kušanas līknes analīze tika veikta PCR produktiem, lai pārbaudītu primera specifiku un produkta tīrību. Katrai plāksnei tika veikta disociācijas līkne, lai apstiprinātu viena produkta ražošanu. Tika aprēķināts katras mRNS relatīvais daudzums. Pētījumā izmantotie PCR primeri ir parādīti 2. tabulā.

Western blot. AR ekspresijas analīzei citoplazmas un kodolproteīna ekstrakcija un izolēšana tika veikta, izmantojot citoplazmas un kodolproteīna ekstrakcijas komplektu (Beyotime, Nanjing, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Citoplazmas un kodolproteīnu koncentrācijas tika novērtētas, izmantojot Bradford Protein Assay Kit (Beyotime, Jiangsu, Ķīna). Olbaltumvielu paraugi (80 ug) tika palaisti uz 12% un 5% SDS-PAGE gēla un pārnesti uz PVDF membrānām. Pēc bloķēšanas membrānas tika inkubētas ar anti-AR IgG antivielām (1:1,000; Bioss; Pekina, Ķīna) un peles poliklonālajām anti-GAPDH antivielām (1:1,000; Wuhan Boster). BioloģiskāTehnoloģija, Uhaņa, Ķīna) vai peles poliklonālās anti-Lamin b1 antivielas 2 stundas. Membrānu trīs reizes nomazgāja ar TBST un inkubēja ar HRP konjugētu trušu anti-peles IgG antivielu (1:5, 000; Bioss; Pekina, Ķīna). Signāls tika vizualizēts, izmantojot ChemiDoc attēlveidošanas sistēmu (Tanon-3,500, Šanhaja, Ķīna).

Augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas (HPLC) tests. Asinis tika savāktas heparinizētās stikla mēģenēs. Plazma tika atdalīta ar tūlītēju centrifugēšanu ar ātrumu 6, 000 apgr./min 10 min un uzglabāta –20 grādu temperatūrā turpmākam eksperimentam. Hipotalāmu un sēklinieku paraugi no katra laika punkta tika apvienoti un homogenizēti ar metanolu. Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 10, 000 apgr./min pie 4 grādiem 10 minūtes, supernatants tika koncentrēts ar N2 un atlikums tika izšķīdināts 50 μL metanola un filtrēts caur 0,45 μm filtru. Desmit μl parauga filtrētā šķidruma tika ievadīti HPLC sistēmā analīzei.

Standarta līkne sastāvēja no paraugiem, kas satur 50, 100, 250, 500 un 750 ng/ml ECH.(Ehinakozīds no cistanche)(Chengdu Pufei De Biotech Co., Ltd, Sičuaņa, Ķīna). Attiecīgi tika sagatavoti plazmas kvalitātes kontroles paraugi ar 75 ng/ml (zems), 150 ng/ml (vidējs) un 300 ng/mL (augsts) ECH, lai izmērītu metodes precizitāti un precizitāti.

Hromatogrāfija tika veikta ar HPLC sistēmu (D2{{10}}00 Elite series, Hitachi, Japāna), kas savienota ar UV detektoru (L-2400, Hitachi, Japāna). Atdalīšana tika veikta uz Thermo-C18 (250 mm × 4,6 mm id, 4,6 μm daļiņas) kolonnas, kas tika turēta 25 grādu temperatūrā. Kustīgā fāze bija gradients, kas sagatavots no 0,1% fosforskābes, kas satur 0,04% trimetilamīna (komponents A) un metanolu (komponents B). Lineārais gradients bija šāds: 70–90 procenti A 0-2 min, 60–70 procenti A 2–6 minūšu laikā, 55–60 procenti B 6–8 minūtēs un pēc tam atgriezās pie 90 procentiem A pie 8 min uzreiz. Plūsmas ātrums bija 0,8 ml/min. UV detektors tika darbināts pie 332 nm. Pīķa laukums tika novērtēts kā analītiskais mērījums.

Farmakokinētikas pētījumi ar pelēm. ECH iespiešanās(Ehinakozīds no cistanche)hipotalāmam un sēkliniekos tika veikta farmakokinētiskā analīze ar Drug and Statistics programmatūru (Narkotiku un statistika, Ķīnas Matemātiskās farmakoloģijas profesionālā komiteja). Farmakokinētiskie parametri tika noteikti, izmantojot beznodalījumu metodi, pamatojoties uz statistisko momentu teoriju. Sākotnējie farmakokinētiskie parametri, tostarp laiks līdz maksimālās konstantes sasniegšanai (Tmax), maksimālā koncentrācija (Cmax), eliminācijas ātruma konstante (Ke), eliminācijas pusperiods (T0.5), laukums zem līknes (AUC{). Tālākai analīzei tika iegūti {4}}–12), šķietamais izkliedes tilpums (Vc) un klīrenss (CL). Smadzeņu/plazmas attiecības tika aprēķinātas, pamatojoties uz plazmas un smadzeņu AUC0-t vērtībām.

ECH-ovalbumīna (ECH-OVA) sintēze un identifikācija. Kopā 9,8 mg ECH(Ehinakozīds no cistanche)un 1.0 mg butāndiola anhidrīda tika izšķīdināti 2 ml piridīna, maisot 12 stundas istabas temperatūrā. Maisījumu koncentrēja ar N2, un atlikumu apvienoja ar 10,8 mg N-hidroksisukcinimīda (NHS) un 19,3 mg dicikloheksilkarbodiimīda (DCC) un 12 stundas, maisot istabas temperatūrā, izšķīdināja 4 ml N,N-dimetilformamīda (DMF). . Pēc centrifugēšanas pie 2,000 g 5 minūtes 4 grādu temperatūrā supernatants tika pievienots 5 ml PBS, kurā bija izšķīdināti 14,4 mg ovalbumīna (OVA). Jauno maisījumu maisīja 24 stundas 4 grādu temperatūrā. Pēc tam reakcijas šķīdumu trīs dienas dializēja pret PBS. ECH-OVA klātbūtne tika apstiprināta ar UV spektriem (Shimadzu Scientifc Instruments, Inc. Columbia, MD USA) viļņa garumā no 190 līdz 400 nm, kā arī ar denaturēšanas PAGE.

Netiešā ELISA (iELISA). Mikrotitrēšanas plāksne tika pārklāta ar ECH-OVA (2 ug/100 μL) un inkubēta nakti 4 grādu temperatūrā. Plate trīs reizes tika mazgāta ar PBST un divas reizes ar PBS; un tika pievienoti 5 procenti PBSM (PBS, kas satur 5 procentus vājpiena), lai bloķētu nesaistītās vietas 37 grādu temperatūrā uz 2 stundām. Pēc tam, kad plāksnes tika mazgātas ar PBST un PBS, iedobes tika sadalītas 4 grupās; eksperimentālā grupa, 1 ug AR kopējā proteīna/100 μL; pozitīva grupa, truša anti-OVA antiviela (1:1,000); negatīva grupa, 1 ug liellopu seruma albumīna; un tukša grupa, kas satur PBS. Pēc 1,5 h inkubācijas plāksnes nomazgāja un pozitīvajai grupai pievienoja 100 μL uz iedobi ar trušu HRP konjugētu IgG (1:1, 000), pievienoja 100 μL uz iedobi anti-AR. (1:1,000) pārējām grupām. Pēc 1,5 h inkubācijas plāksnēm pievienoja ar trušu HRP konjugētu IgG (1:5, 000) atšķaidījumu. Pēc inkubācijas 37 grādu temperatūrā 1 stundu plāksnes trīs reizes mazgāja ar PBST un divas reizes ar PBS. Pēc tam pievienoja TMB un inkubēja 10 minūtes tumsā istabas temperatūrā un pievienoja 2 M H2SO4, lai apturētu reakciju. Absorbcija tika nolasīta pie viļņa garuma 450 nm.

Molekulārā dokstacija. Tika veikts molekulārās dokstacijas pētījums, lai izpētītu savienojuma ECH saistīšanās režīmu(Ehinakozīds no cistanche)uz cilvēka androgēnu receptoru (AR), izmantojot Autodock vina 1.1.2 (http://vina.scripps.edu). AR trīsdimensiju (3D) struktūra (PDB ID: 2YHD) tika lejupielādēta no Protein Data Bank (//www.rcsb.org/pdb/home/hone.do). ECH 3D struktūra tika iegūta, izmantojot programmatūru ChemBioDraw Ultra 14.{8}} un ChemBio 3D Ultra 14.{11}}. Lai ģenerētu dokstacijas ievades failus, tika izmantota AutoDockTools 1.5.6 pakotne (http://mgltools.scripps.edu). AR meklēšanas režģis tika identificēts kā centrs x: 36,141, centrs y: 8,513 un centrs z:

21.304 ar izmēriem izmērs x: 15, izmērs y: 15 un izmērs z: 15. Izsmeļošā vērtība tika iestatīta uz 20. Vina dokstacijā tika izmantoti noklusējuma parametri, ja tas nebija minēts. Tika izvēlēta vislabākā poza, kas tika novērtēta pēc Vina dokstacijas rezultāta, un tika vizuāli analizēta, izmantojot PyMOL 1.7.6 programmatūru (http://www.pymol.org).

Datu analīze un statistikas metodes. Dati tika analizēti, izmantojot statistikas programmatūru SPSS 19.0 (SPSS Inc., Čikāga, IL, ASV). Salīdzināšanai starp grupām tika izmantota vienvirziena ANOVA. Tika noteikti Tukey salīdzināšanas testi attiecībā uz būtiskām atšķirībām starp grupām. Rezultāti tika izteikti kā vidējā ± standarta novirze (SD), izmantojot Graph Pad Prism programmatūru v.7 (GraphPad Software, Inc, Kalifornija, ASV).

Ētikas apstiprinājums un piekrišana dalībai. Ētisks apstiprinājums šim pētījumam tika iegūts no Anyangas Tehnoloģiju institūta Ētikas komitejas.

Atsauces

1. Cano, SN, Misra, M. & Ackerman, KE Vingrinājumi, treniņi un hipotalāma-hipofīzes-gonādu ass vīriešiem un sievietēm.Priekšpuse. Horm. Res. 47, 27–43 (2016).

2. Papadopoulos, V. & Miller, WL Mitohondriju loma steroidoģenēzē. Labākā prakse. Res. Cl. En. 26, 771–790 (2012).

3. Rone, MB et al. Dinamiskā mitohondriju proteīna kompleksa identificēšana, kas veicina holesterīna importu, tirdzniecību un metabolismu uz steroīdu hormonu. Mol. Endokrinols. 26, 1868–1882 (2012).

4. Shibari, S., Ylonen, H. & Palme, R. Kortikosterona un testosterona metabolītu ekskrēcija un mērīšana banku pelēs (Myodes glareolus). Ģenerālkomp. Endokrinols. 243, 39–50 (2017).

5. O'Hara, L. et al. Hipofīzes androgēnu receptoru signalizācija regulē prolaktīnu, bet ne gonadotropīnus peles tēviņiem. PloS viens. 10, e0121657 (2015).

6. Amador, AG, Parkening, TA, Beamer, WG, Bartke, A. & Collins, TJ Sēklinieku LH receptori un cirkulējošo hormonu līmenis trīs peļu modeļos iedzimtām slimībām (Tfm/y, lit/lit un hyt/hyt). Endokrinols. Exp. 20, 349–58 (1986).

7. Bulldan, A., Dietze, R., Shihan, M. & Scheiner-Bobis, G. Neklasiskā testosterona signalizācija, kas tiek mediēta caur ZIP9, stimulē claudin ekspresiju un ciešu savienojumu veidošanos Sertoli šūnās. Šūna. Signāls. 28, 1075–85 (2016).

8. Walker, WH Testosterona signalizācija un spermatoģenēzes regulēšana. Spermatoģenēze. 1, 116–20 (2011).

9. Cao, C. & Kindscher, K. The Medicinal Chemistry of Echinacea Species (ed. Kindscher, K.) 127–145 (Springer, 2016).

10. Jiang, ZH, Jian, W., Li, XP & Zhang, XYEhinakozīdsunCistanche tubulosa (Schenk) R. Vaits uzlabo bisfenola A izraisītos sēklinieku un spermas bojājumus žurkām, izmantojot dzimumdziedzeru asi regulētus steroidogēnos enzīmus. J. Ethnopharmacol. 193, 321–328 (2016).