Kā ehinakozīds novērš Parkinsona slimību

Kontaktpersona: emily.li@wecistanche.com

Ⅰ daļa: autofagijas regulēšanas mehānisms MPTP izraisītām PD pelēm, izmantojot ehinakozīda MTOR signalizācijas ceļu

Abstract:

Mērķis: šī pētījuma mērķis bija izpētīt ietekmiehinakozīds(ECH) par ar autofagiju saistītiem indikatoriem, izmantojot mTOR signalizācijas ceļu, īpaši ietekmi uz autofagijas substrāta P62 un -sinukleīna klīrensu, kas ir galvenie patoloģiskie produkti.Parkinsona slimība(PD), lai nodrošinātu jaunas stratēģijas PD ārstēšanai (Parkinsona slimība). Metodes: Subakūtas PD peles modelis(Parkinsona slimība)tika noteikts, intraperitoneāli ievadot 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridīnu (MPTP). Pirmkārt, tika novērtēti neiro-uzvedības simptomi katras grupas pelēm, un monoamīna neirotransmiteri striatumā katrā grupā tika mērīti ar augstas veiktspējas šķidro fāzi. Imunofluorescences dubultā krāsošana tika pieņemta, lai novērotu tirozīna hidroksilāzes (TH), -sinukleīna un LC3 ekspresiju. Transmisijas elektronu mikroskops tika izmantots, lai novērotu ultrastruktūras izmaiņas substantia nigra un autofagosomu veidošanos. Pēc tam ar Western blot tika noteiktas TH, -sinukleīna, Beclin 1, LC3, P62, mTOR un augšup esošā proteīna AKT ekspresijas. Rezultāti: Salīdzinot ar modeļa grupu, neiro-uzvedības funkcija ievērojami uzlabojāsECH (Ehinakozīds)grupa (P < {0}},01),="" kopā="" ar="" palielinātu="" th,="" da="" un="" dopac="" ekspresiju="" smadzenēs="" (p="">< 0,01).="">ECH (Ehinakozīds)grupā, kamēr Beclin 1 un LC3-II ekspresijas palielinājās (P < 0.01), P62 un -sinukleīna ekspresijas līmenis ievērojami samazinājās (P < 0,01).ECH (Ehinakozīds)varētu paaugstināt izdzīvošanas signāla p-AKT / AKT ekspresijas līmeni un samazināt mTOR ekspresiju. Secinājums:ECH (Ehinakozīds)varētu palielināt autofagiju, kavējot mTOR ekspresiju, tādējādi veicinot -sinukleīna klīrensu un autofagijas substrāta P62 degradāciju un iedarbojoties uz neiroprotektīvu efektu.

Atslēgvārdi: Parkinsona slimība, MPTP,ehinakozīds, -sinukleīns, P62, autofagija, mTOR

Cistanche var ārstēt Parkinsona slimību

Ievads

Parkinsona slimība (PD)ir hroniska un progresējoša neirodeģeneratīva slimība. Tipiska PD patoloģiska iezīme(Parkinsona slimība)ir Lūija ķermeņu veidošanās, un -sinukleīns un ubikvitīns ir Levija ķermeņu galvenās sastāvdaļas. Arvien vairāk pierādījumu liecina, ka autofagijas regulēšanas traucējumi galu galā noved pie nepareizi salocītu proteīnu un ievainotu organellu uzkrāšanās.54 Autofagijas-lizosomu ceļš var ne tikai noārdīt olbaltumvielas, kuras nevar noārdīt ubikvitīna-proteasomas ceļā, bet arī šo ceļu. var noārdīt -sinukleīnu. Tāpēc autofagijas regulēšana var nodrošināt jaunu stratēģiju PD ārstēšanai (Parkinsona slimība). Autofagija ir galvenais intracelulāro agregātu degradācijas ceļš, un mTOR kināze ir galvenā autofagijas regulēšanas vieta. Tāpēc teorētiski un praktiski ir svarīgi noskaidrot saistību starp PD(Parkinsona slimība) un autofagiju, ko regulē mTOR signalizācijas ceļš. Tā kā -sinukleīna noārdīšanās galvenokārt ir atkarīga no autofagijas-lizosomu sistēmas, kuras mērķis ir novērst patoloģiskas olbaltumvielas, neiroprotektīvu zāļu izstrāde, kas spēj regulēt autofagiju, var sniegt norādījumus neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanai. ECH (Ehinakozīds) ir C35H46O20 molekulārā formula. Tā ir ķīniešu medicīnas Cistanche feniletanoīdu glikozīdu galvenā sastāvdaļa. Pirmo reizi Stoll et al to izolēja no saknesEchinaceaAngustifolia DC.ECH (Ehinakozīds)ir plašs farmakoloģisko efektu klāsts. Tam ir pretiekaisuma, antioksidantu, nervu aizsardzība, mācīšanās un atmiņas uzlabošana, aknu aizsardzība, imūnsistēmas regulēšana un pretaudzēju iedarbība. Šis pētījums, sākot no PD galvenajiem patoloģiskajiem mehānismiem(Parkinsona slimība), kuru mērķis ir izpētīt neiroprotektīvās iedarbības regulēšanuECH (Ehinakozīds)peles PD(Parkinsona slimība)modelis, ko izraisa MPTP no autofagijas-lizosomu ceļa.

Materiāli un aparāti

Eksperimentālais dzīvnieks

Eksperimentālajā grupā bija 108 C57BL/6J peļu tēviņi ar SPF pakāpi, astoņas nedēļas veci, sver 20–22 g, četras peles katrā būrī, turētas 22–25 grādu temperatūrā. Peles nodrošināja Ķīnas Zinātņu akadēmijas Šanhajas Laboratorijas dzīvnieku centrs, kas atrodas Naņdzjinas Ķīnas medicīnas universitātē, un dzīvnieki saņēma humānu aprūpi saskaņā ar Nacionālo veselības institūtu vadlīnijām SPF klases telpā ar temperatūru 22–2 25 grādi, relatīvais mitrums 55 procenti un zem 12-stundu diennakts ritma. Pelēm bija brīvs ēdiens un ūdens.

Galvenie reaģenti

MPTP (Sigma Company), pelēm anti-TH monoklonālā antiviela (Sigma Company), Alexa Fluor 555 anti-trušu antiviela (Biyuntian Institute of Biotechnology), Alexa Fluor 488 anti-trušu antiviela (Biyuntian Biotehnoloģijas institūts), HRP -kazas anti-trušu sekundārā antiviela (Bijuntijas Biotehnoloģijas institūts), truša poliklonālā - sinukleīna antiviela (Cell Signaling Technology Company), HRP-kazas sekundārā antiviela pret pelēm (Bijuntijas Biotehnoloģijas institūts),ECH(Ehinakozīds) (Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), trušu anti-p-AKT (Ser473) antivielas (Šūnu signalizācijas tehnoloģiju uzņēmums), Rapamicīns (Šūnu signalizācijas tehnoloģiju uzņēmums), hlorokvīns (Sigma uzņēmums), Wortmannin (Sigma Company), trušu poliklonālais LC3 antiviela (Abcam Company), trušu poliklonālā P62 antiviela (Enzo Life Science Company), pelēm monoklonālā aktīna antiviela (Santa Cruz Company), Beclin 1 poliklonālā antiviela (Abcam Company).

Informācija par materiāliem:

MPTP (Amerika, Sigma Company), pelēm anti-TH monoklonālā antiviela (America, Sigma Company), trušu poliklonālā-sinukleīna antiviela (Amerika, Cell Signaling Technology Company), HRP-kazu sekundārā antiviela pret pelēm (Ķīna, Biyuntian Biotehnoloģijas institūts ),ECH(Ehinakozīds) (Ķīna, Chengdu Linghangzhe Biotechnology Co., Ltd.), trušu anti-p-AKT (Ser473) antivielas (Amerika, šūnu signalizācijas tehnoloģiju uzņēmums), rapamicīns (Amerika, šūnu signalizācijas tehnoloģiju uzņēmums), hlorokvīns (Amerika, uzņēmums Sigma), Wortmannin (Amerika, Sigma Company), trušu poliklonālā LC3 antiviela (America, Abcam Company), truša poliklonālā P62 antiviela (America, Enzo Life Science Company), pelēm monoklonālā - aktīna antiviela (America, Santa Cruz Company), Beclin 1 poliklonālā antiviela ( Amerika, uzņēmums Abcam).

Ehinakozīda ārstēšanaParkinsona slimība

Eksperimentālās metodes

Eksperimentālo dzīvnieku grupēšana

108 C57BL/6J peles tika nejauši sadalītas sešās grupās ar 18 pelēm katrā grupā. Sīkāka informācija bija šāda: parastā kontroles grupa (parastā sāls šķīduma grupa, N grupa), modeļu grupa (MPTP grupa, M grupa),ECH(Ehinakozīds) grupa (MPTP plusECH (Ehinakozīds), EH grupa), inducētā autofagijas grupa (MPTP plus Rapamicīna grupa, RA grupa), autofagijas inhibitoru A grupa (MPTP plusECH (Ehinakozīds)plus hlorokvīna grupa, CQ grupa), autofagijas inhibitora B grupa (MPTP plusECH (Ehinakozīds)plus Wortmannin grupa, WO grupa). MPTP deva bija 30 mg/kg/d, nepārtraukti injicējot 7 dienas.ECH (Ehinakozīds) tika ievadīts 30mg/kg/d, intragastrāli.9

Eksperimentālo dzīvnieku un medikamentu modelēšana

N grupai un EH grupai tika dots normāls sāls šķīdums unECH(Ehinakozīds) trīs dienas pirms modelēšanas, attiecīgi, līdz septiņām dienām pēc modelēšanas. Rapamicīns, 10 wortmannīns11 un hlorokvīns tika ievadīti septiņas dienas pēc kārtas pēc pēdējās MPTP injekcijas. Rapamicīna injekcijas astes vēnā deva tika aprēķināta kā 2 mg/kg/d. Hlorokvīna intraperitoneālās injekcijas deva pelēm bija 50 mg / kg dienā. Wortmannīna injekcijas astes vēnā deva pelēm bija 0,7 mg/kg/d (1. papildu attēls).

Neirouzvedības novērojumi

Saskaņā ar literatūru12 ar nelielām modifikācijām paštaisītā ierīce stabu pārbaudei bija šāda: Ierīce bija 55 cm gara, 1 cm diametrā PV caurule ar diametru 2 cm sfērisku projekciju staba augšpusē. ierīci kā piestiprināšanas punktu pelēm. Ierīce tika pārklāta ar melnu lenti, lai novērstu peles nokrišanu. Katra pele testa laikā tika novietota uz sfēriskā izvirzītā punkta ar galvu uz augšu. Tika reģistrēts laiks no novietotās stieņa augšdaļas līdz galvai, lai pagrieztos uz leju (T-pagrieziens), un kopējais laiks no novietotās stieņa augšdaļas, lai uzkāptu līdz caurules apakšai, lai nolaistos (T-kopā).

Spontānā darbība

Spontāna aktivitāte, kas pazīstama arī kā atklātā lauka aktivitāte, ir izplatīts rādītājs retas aktivitātes noteikšanai pēc MPTP traumas.13 Šajā pētījumā tika izmantota atklāta lauka eksperimenta video analīzes sistēma. Konkrētās darbības bija šādas: Pirms eksperimenta četras vienas grupas peles tika ievietotas novērošanas kastē (garums 25 cm, platums 25 cm un augstums

25 cm), lai pielāgotos 30 minūtes. Pēc tam tie tika nepārtraukti ierakstīti video 30 minūtes. 30-minūšu novērošanas laika logā vertikālo kustību skaits (Audzēšanas skaits) tika skaitīts atsevišķi trīs nepārtrauktos piecu minūšu intervālos. Video analīzes sistēma automātiski analizēja peles darbību trajektoriju un ieguva 30-minūtes kopējo attālumu (Kopējais attālums) kā horizontālās kustības indikatoru.

Gaitas analīze

Gaitas analīze: saskaņā ar literatūru14 tika izmantota paštaisīta gaitas analīzes iekārta. Šī ierīce bija šāda: Koka celiņš (garums 42 cm, platums

4,5 cm un augstums 12 cm), viens gals bija atvērts, otrs gals veda uz vāveres būri. Vāveres būris bija pārklāts ar melnu audumu. Peles pēdu apakšā tika iemērkta zila tinte. Pēc tam pele tika novietota celiņa atvērtajā galā. Pele dabiski pārcēlās uz vāveres būra galu, kas bija pārklāts ar melnu audumu. Tika izmērīti attiecīgi trīs garākie priekšējās un pakaļējās ekstremitātes soļi, un tika ņemtas vidējās vērtības.

Rotarod tests

Pele tika novietota uz mainīga ātruma rotācijas stieņa, un tā ātrums tika noregulēts, lai piecu minūšu laikā palielinātos no četrām kārtām minūtē līdz 40 kārtām minūtē. Laiks no rotācijas rotācijas sākuma līdz peles kritumam no rotarod katru reizi tika reģistrēts kā kritiena latentums. Monoamīna neirotransmiteru satura noteikšana striatumā ar augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas elektroķīmijas noteikšanu (HPLC-ECD)

Paraugu ņemšana un apstrāde

Peles tika eitanāzētas, un striatums tika ātri atdalīts uz ledus un nosvērts. Atbilstoši attiecībai 1 ml 5 procentu perhlorskābes pret 0,1 g smadzeņu (slapjš svars), katras grupas paraugi tika ievietoti glāzē, kurā bija atbilstošs perhlorskābes tilpums, un homogenizēti vircas mēģenē. . Homogenātu centrifugēja zemā temperatūrā ar ātrumu 13,000 apgr./min 20 minūtes. Tika ņemts supernatants, un centrifugēšana tika atkārtota. Supernatants tika ievietots zemas temperatūras ledusskapī turpmākai noteikšanai. HPLC-ECD nosacījumi bija šādi. Tika pieņemta Couloehemlll 5300 elektroķīmiskā hromatogrāfija. Noteikšanas līdzekļi bija 5020 un 504 mārciņas smagas šūnas ar hromatogrāfisko kolonnu MD-150 (3,0*150 mm; 3 um), MDTM-2 kustīgo fāzi un 2uA jutību. Plūsmas ātrums tika iestatīts uz 0,6 ml/min, elektroda potenciāls tika iestatīts uz 220 mV, un kolonnas temperatūra tika iestatīta uz 30 grādiem. Injekcijas tilpums bija 20 ul (vispirms atšķaidīts desmit reizes).

Tika konstatēts šādu neirotransmiteru saturs: dopamīns (DA), dihidroksifeniletiķskābe (DOPAC), augsta vanilskābe (HVA), norepinefrīns (NE), {{0}}hidroksitriptamīns (5-HT), 5-Hidroksiindoletiķskābe (5-HIAA). TH, -sinukleīna, LC3 un p62 imūnfluorescējošā krāsošana Peles (n=6 katrā grupā) tika eitanāzētas dziļā anestēzijā (5% hlorhidrāta) un perfūzijas ar 0,9% nātrija hlorīda, kam seko 4 procenti paraformaldehīda caur kreiso sirds kambari. Smadzenes tika ātri izņemtas un pēcfiksētas 24 stundas, pēc tam pārnestas uz fosfātu buferšķīdumu (PBS), kas satur 30 procentus saharozes 4 °C temperatūrā, līdz tās nogrima. Audi tika iestrādāti parafīnā, un koronālās sekcijas (30 µm) tika izgrieztas cauri substantia nigra pars compacta (SNc; no –2,8 līdz –3,8 mm astes līdz bregmai), izmantojot kamanu mikrotomu. Sekcijas tika atvaskots un hidratēts, un endogēnā peroksidāze tika dzēsta ar 0,3 procentiem H2O2 30 minūtes. Pēc karstuma izraisītas antigēna iegūšanas priekšmetstikliņus 30 minūtes inkubēja ar 0,5 procentiem Triton-X100, pēc tam ar 5 procentiem liellopu seruma albumīna. Pēc tam sekcijas inkubēja ar anti- -sinukleīna antivielu, anti-TH antivielu, anti-LC3 antivielu, anti-p62 antivielu un attiecīgajām fluorescējošām sekundārajām antivielām nakti 4 °C temperatūrā. Pēc trīs piecu minūšu mazgāšanas PBS. , sekcijas vienu stundu inkubēja biotinilētā sekundārajā antivielā, kam sekoja avidīna-biotīna komplekss 30 minūtes. Peroksidāzes aktivitāte tika vizualizēta ar 33-diaminobenzidīnu.

Atklāšanaproteīnu, izmantojot Western Blot

SNc proteīns tika ekstrahēts (n {{0}} peles katrā grupā), atdalīts, izmantojot 12–15 procentus SDS-PAGE, un pārnests uz PVDF membrānām. Membrānas tika bloķētas ar 5% beztauku pienu 1,5 stundas istabas temperatūrā un inkubētas ar antivielām pret TH, sinukleīnu, p62, Beclin 1, LC3, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR un GAPDH 4 ° C temperatūrā nakti. . Nākamajā dienā membrānas noskaloja ar tris buferšķīdumu, kas satur 0, 1 procentus Tween 20, un 1, 5 stundas hibridizēja ar atbilstošām sekundārajām antivielām. Olbaltumvielas tika vizualizētas, izmantojot uzlabotu hemiluminiscenci, un imūnreaktīvās joslas tika analizētas ar attēlu analīzes programmatūru (Gel Doc 1000-UV; Bio-Rad, Richmond, CA), lai aprēķinātu -sinukleīna un TH joslu optisko blīvumu, kas normalizēts uz GADPH.

Informācija par antivielām: truša poliklonālā LC3 antiviela: 1:1000. Trušu poliklonālā P62 antiviela: 1:1000. Beclin 1 poliklonālā antiviela: 1:1000. Pelēm anti-TH monoklonālā antiviela: 1:1000. Trušu poliklonālās-sinukleīna antivielas: 1:1000.

Substantia Nigra ultrastruktūras novērošana ar transmisijas elektronu mikroskopu

Peles (n=6 katrā grupā) tika eitanizētas ar 5% hlorālhidrātu un caur kreiso kambari tika perfūzētas ar ledusaukstu PBS, kam sekoja 4% paraformaldehīda un 1% glutaraldehīda PBS. Smadzenes tika noņemtas un pēcfiksētas 2,5% glutaraldehīdā 4 °C temperatūrā sešas stundas. SNc tika sagriezts apmēram 1 mm3 blokos un fiksēts PBS, kas satur 2,5 procentus glutaraldehīda, un konservēts 4 ° C temperatūrā turpmākai apstrādei. Fragmenti tika pēcfiksēti 1% osmija tetroksīdā tajā pašā buferšķīdumā, dehidrēti ar šķirotiem spirtiem un iegulti Epon 812 (Shell Chemical Co., Hjūstona, Teksasa). Ultraplānas (50 nm) sekcijas tika sagrieztas, izmantojot ultramikrotomu, iekrāsotas, izmantojot uranilacetātu un svina citrātu, un analizētas caur transmisijas elektronu mikroskopu (Leica TCS SP2CLSM, Medicīnas skolas elektronu mikroskopijas centrs, Fudanas Universitāte).

Statistiskā analīze

Visi mērījumu dati šajā pētījumā tika izteikti vidējo ± standarta kļūdu veidā, un statistiskā analīze tika apstrādāta ar GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, Sandjego, CA) programmatūru. P<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" one-way="" analysis="" of="" variance="" (one-way="" anova)="" was="" used="" to="" test="" the="" statistical="" differences,="" and="" the="" comparison="" between="" multiple="" groups="" was="" analyzed="" by="" tukey's="" multiple="" group="">

SPIED ŠEIT, LAI DALĪTIES Ⅱ