Ⅱ DAĻA: Metformīna sagatavošana un pēckondicionēšana, lai samazinātu Lshēmijas reperfūzijas bojājumus izolētā ex vivo žurku un cūku nieru normotermiskā aparāta perfūzijas modelī
Mar 26, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Tobias M. Huink, Leonie H. Venemala, Rene A. Posma, Nynke J.de Vries, Andrie C. Westerkampl un citi.
IEVADS
Nieru transplantācija ir izvēles ārstēšana pacientiem ar nieru slimību beigu stadijā. Diemžēl pieprasījums ir lielāks nekā orgānu pieejamība.2 Šī trūkuma dēļ arvien vairāk tiek izmantoti suboptimālas kvalitātes orgāni, kas iegūti pēc asinsrites izraisītas nāves (DCD) donoriem.5 DCD donoru nieres ir vairāk pakļautas išēmijas-reperfūzijas bojājumiem (IRl). kas ir saistīts ar ievērojami lielāku aizkavētas transplantāta funkcijas sastopamību, kas ietekmē gan īstermiņa, gan ilgtermiņa iznākumu.45 IRI izraisa asins plūsmas traucējumi un tai sekojoša reoksigenācija, kā rezultātā veidojas reaktīvas skābekļa sugas (ROS), ierosinot kaitīgu šūnu reakciju kaskādi.67 Išēmijas smagums cieši korelē ar agrīnu nieru transplantāta mazspēju pēc nieres transplantācijas un veicina saslimstības palielināšanos. Tāpēc siltā išēmija (W) orgānu izņemšanas un implantācijas laikā un aukstā išēmija saglabāšanas laikā ir jāsamazina līdz minimumam. Mašīnu perfūzijas stratēģijām var būt galvenā loma IRI samazināšanā, piegādājot skābekli orgānu ziedošanas išēmiskās fāzes laikā. Turklāt tā nodrošina platformu iespējamo aizsarglīdzekļu pievienošanai pirms reperfūzijas (priekškondicionēšana) vai reperfūzijas laikā (pēckondicionēšana), un tā ir piemērota metode, lai novērtētu īslaicīgu nieru darbību un ievainojumus.{10}}
Biguanīdsmetformīnsir visvairāk lietotais perorālais antihiperglikēmiskais līdzeklis, lai ārstētu pacientus ar 2. tipa cukura diabētu. Darbības mehānisms un pleiotropā iedarbībametformīnsgalvenokārt rodas kompleksa 1 inhibēšanas rezultātā mitohondriju elpošanas ķēdē.{1}} Tāpēcmetformīnsvar vājināt IRI, pārsniedzot glikozes līmeni pazeminošo darbību, un tas ir ierosināts kā orgānu aizsargājošs līdzeklis apstākļos, kuros notiek IRI, piemēram, transplantācijas gadījumā.15,16
Šī pētījuma mērķis bija novērtēt priekškondicionēšanas un pēckondicionēšanas potenciālo labvēlīgo ietekmi armetformīnsuz IRI divos dažādos izolētos ex vivo normotermiskās mašīnas perfūzijas (NMP) modeļos, izmantojot žurku un cūku nieres.
NOURISH NIERES:PŪĶA ZĀĻU CISTANČE
METODES
Žurku pētījums
Dzīvnieki.Tika izmantoti Lūisa žurku tēviņi, kas sver 270-300 g (Harlan Laboratories, Boxmeer, Nīderlande). Groningenas Universitātes Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja apstiprināja pētījuma protokolu (DEC6708C). Dzīvnieki saņēma aprūpi saskaņā ar Nīderlandes likumu par eksperimentiem ar dzīvniekiem, ievērojot Nacionālā veselības institūta laboratorijas dzīvnieku aprūpes principus.
Eksperimentālā projektēšana, orgānu izguve un saglabāšana.Pavisam 31 žurka tika sadalīta 6 grupās (n=5-6 katrā grupā; 1. attēls). Visās grupās išēmisku bojājumu izraisīšanai tika izmantotas 15 minūtes W un 24 stundas aukstuma. Iepriekšēja sagatavošana tika veikta, ievadot 300 mg/kgmetformīns(1,1-dimetilbiguanīda hidrohlorīds; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), kas izšķīdināts fizioloģiskā šķīdumā (0,9 procenti NaCl) vai tikai fizioloģiskā šķīdumā, izmantojot orālo zondi 12 un 2 stundas pirms nefrektomijas. Sāls šķīdums, 30 mg/lmetformīnsvai 300 mg/lmetformīnstika pievienots perfūzātam kā pēckondicionēšanas līdzeklis. Tika izvēlēta koncentrācija 300 mg/kg ķermeņa svara, jo šī deva radīja serumumetformīnskoncentrācija, kas atbilst tai, kas konstatēta cilvēkiem uzturēšanas laikāmetformīnsterapija.17
Nieru ieguve tika veikta ar nelielām izmaiņām DCD procedūrā, kā aprakstīts iepriekš.18 Īsāk sakot, žurkas tika anestēzētas ar 2–5% izoflurāna, un laparotomija tika veikta, izmantojot viduslīnijas griezumu. Antikoagulācija, izmantojot 500 SV heparīnu (Leo Pharma, Ballerup, Dānija), tika ievadīta caur dzimumlocekļa muguras vēnu. Pēc 15 minūtēm WI tika veikta kreisās nieres nefrektomija. Nieru artērija un urīnvads tika kanulēti. Nieres in situ izskaloja ar 10 ml fizioloģiskā šķīduma (37 grādi) un 5 ml 4 grādu Viskonsinas universitātes (UW) aukstuma šķīduma (Bridge to Life, Columbia, SC). Pēc izņemšanas nieres vēlreiz izskaloja ar 5 ml UW un uzglabāja UW 24 stundas 4 grādu temperatūrā.
Normotermiskā aparāta perfūzija.Žurku NMP metode ir plaši aprakstīta agrāk.18 Īsumā, NMP tika veikta 90 minūtes, izmantojot rullīšu sūkni (Ismatec ISM404, Cīrihe, Šveice). Perfūzijas spiediens tika iestatīts uz 102 mmHg, ko kontrolēja nieru artērijā. Kontroles grupā perfūzijas šķidrums sastāvēja no 100 ml William's Medium E, kas papildināts ar 30 mmol/l HEPES, 50 g/l albumīna un 7 mmol/l kreatinīna (visi Sigma-Aldrich). Eksperimentālajās grupās 30 vai 300 mg/lmetformīnstika pievienots perfūzātam. Perfūzijas šķidrums tika piesātināts ar 95 procentiem skābekļa un 5 procentiem oglekļa dioksīda ar plūsmu 0,5 l/min. Perfūzijas šķidruma temperatūra tika uzturēta 37 grādu līmenī, izmantojot ūdens vannu un siltummaini (Julabo, Seelbach, Vācija). Plūsma tika reģistrēta ik pēc 10 minūtēm, izmantojot kalibrētu plūsmas sensoru (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Pēc NMP nieru biopsijas nekavējoties tika iegremdētas 4% formaldehīdā vai ātri sasaldētas šķidrā slāpeklī un pēc tam uzglabātas -80 grādu temperatūrā.
1. attēlsEksperimentālo grupu shematisks attēlojums. Grupas satur 5–7 nieres. HMP, hipotermiskā aparāta perfūzija; NMP, normotermiskā aparāta perfūzija; WIT, silts išēmijas laiks.
Cūku pētījums
Dzīvnieki.Nīderlandes Landrases cūku nieres tika savāktas no kaututuves. Dzīvnieki tika apdullināti un atasiņoti saskaņā ar vietējām standarta procedūrām. Asiņošanas laikā traukā, kurā bija 25,000 SV nefrakcionēta heparīna (Leo Pharma), tika savākts aptuveni 1 litrs asiņu. Tā kā tika izmantots kautuvju atkritumu materiāls, nebija vajadzīgs dzīvnieku ētikas komitejas apstiprinājums.
Eksperimentālā projektēšana, orgānu izguve un saglabāšana.Lai izraisītu išēmisku traumu, tika izmantots 30 minūšu WI. Pēc šī perioda nieres tika izskalotas ar 180 ml fizioloģiskā šķīduma 4 grādu temperatūrā. Tūlīt pēc skalošanas tika paņemta kortikālā biopsija (Invivo, Best, Nīderlande) un uzglabāta 4% buferētā formaldehīdā. Lai nodrošinātu transportēšanu no lopkautuves uz laboratoriju un kā konservēšanas paņēmienu, nieru artērija tika kanulēta un nieres tika pievienotas pulsējošas spiediena kontrolētas hipotermiskās perfūzijas (HMP) iestatījumam (Kidney Assist Transport; Organ Assist, Groningena, Nīderlande ). Nieres tika perfūzētas 4 grādos, izmantojot 500 ml UW mašīnas perfūzijas šķīdumu 3 stundas (Bridge to Life, Londona, Apvienotā Karaliste), pievienojot vai bez 2 mg pievienošanas.metformīns, ar vidējo arteriālo spiedienu 25 mmHg. Skābeklis (100 procenti) tika piegādāts skābekļa aparātam (Hilite LT1000; Medos Medizintechnik AG, Stolberga, Vācija) ar fiksētu plūsmas ātrumu 0,1 l/min.
Normotermiskā aparāta perfūzija.Nieres tika atkārtoti perfūzētas, izmantojot ex vivo NMP iestatījumu 4 stundas, kas tika aprakstīts iepriekš. Mūsu pētījumā, palielinot devasmetformīnsvai sāls šķīdums tika pievienots, izmantojot infūzijas sūkni. Īsāk sakot, pēc HMP nieru artērija tika kanulēta un izskalota. Urīnvads tika kanulēts urīna savākšanai. Pēc tam nieres nosvēra, paņēma biopsiju un uzglabāja 4% buferētā formaldehīdā turpmākai analīzei. Pēc tam nieres ievietoja ex vivo spiediena kontrolētā NMP ķēdē. NMP tika veikts ar 500 ml samazinātu leikocītu (BioR 02 plus; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Vācija) autologām, skābekli saturošām (oglekļa, plūsma 0,5 l/min) asinīm 4 stundas pie vidējā arteriālā spiediena 80 mmHg. Citi savienojumi, kas pievienoti perfūzijas šķidrumam, ir norādīti S1 tabulā. Eksperimentālajā grupā,metformīnsizšķīdināts Ringera laktāta šķīdumā (20 mg/ml; Baxter, Utrehta, Nīderlande) tika ievadīts, izmantojot infūzijas sūkni, ko kontrolē pēc pasūtījuma izgatavotas programmatūras, kurā varēja definēt infūzijas profilus (Alaris; CareFusion, Rolle, Šveice). NMP laikā ik pēc 30 minūtēm. , infūzijas ātrums tika palielināts saskaņā ar iepriekš noteiktu grafiku (S2 tabula). Šis grafiks tika balstīts uz cilvēka farmakokinētikas datiem, kas liecina, kametformīnsklīrenss ir četras reizes lielāks nekā kreatinīna klīrenss.19 Kontroles grupā nieres tika perfūzētas, nepievienojotmetformīns. Katram eksperimentam plūsma tika reģistrēta, izmantojot clampon plūsmas zondi (ME7PXL; Transonic Systems), kas tika pievienota caurulei tuvu nieru artērijai. Šī plūsmas zonde ir kalibrēta izmantotajām caurulēm. NMP laikā ik pēc 15 minūtēm tika savākts urīns un aizstāts ar atbilstošu Ringera laktāta šķīduma tilpumu, kas arī tika reģistrēts. Perfūzijas šķidruma temperatūra tika uzturēta 37 grādu līmenī, izmantojot integrētu siltummaini, kas savienots ar ūdens vannu (Julabo). Asins un urīna paraugi tika ņemti pēc 15 un 60 minūtēm un katru nākamo stundu bioķīmiskām analīzēm. Kad NMP bija pabeigts, tika ņemtas biopsijas un uzglabātas 4% buferētā formaldehīdā vai ātri sasaldētas un uzglabātas -80 grādu temperatūrā turpmākai analīzei.
UZLABOJIET NIERU FUNKCIJU CISTANŠES PIEDĀVĀJUMS
Abi pētījumi
Bioķīmiskās analīzes.Perfūzāta un urīna paraugi tika centrifugēti (1300 g 10 minūtes žurku modelī un 1,000 g 12 minūtes cūku modelī, abi 4 grādu temperatūrā), un supernatants tika uzglabāts {{7} } grāds . Groningenas Universitātes Medicīnas centra laboratorijas centrs, izmantojot standarta bioķīmiskās analīzes, noteica laktāta dehidrogenāzi (LDH), aspartāta aminotransferāzi (ASAT) un kreatinīnu attiecīgi perfūzā un kreatinīnu urīnā. Žurku urīnā izdalītā proteīna daudzums tika mērīts, izmantojot Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), savukārt kopējā olbaltumvielu koncentrācija cūku urīnā tika mērīta, izmantojot standarta bioķīmiskās analīzes Laboratorijas centrā.
Reāllaika kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcija.Reāllaika polimerāzes ķēdes reakcija (PCR) tika veikta saskaņā ar standarta procedūrām Tagman Applied Biosystems 7900HT RealTime PCR sistēmā, kā aprakstīts iepriekš.20 Asinsvadu tonusa regulēšanā iesaistīto gēnu fragmentu amplifikācija (endotelīns 1 (EDN-1), kodē ET-1), endotēlija slāpekļa oksīda sintāze (eNOS) un Krüpelam līdzīgais faktors 2 (KLF-2), endotēlija aktivācija (Von Vilebranda faktors (wWF), asinsvadu šūnu adhēzijas molekula 1 (VCAM). -1) un IL-6), un karstuma šoka proteīns 70 (HSP-70) tika veikts ar praimeru komplektiem, kas norādīti S3 tabulā. Īsāk sakot, kopējā RNS tika iegūta no nieru sekcijām, izmantojot TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). No žurkām iegūtā cDNS tika izmantota kā iekšēja atsauce PCR laikā, lai pārbaudītu praimera efektivitāti. Gēnu ekspresija tika normalizēta ar vidējo -aktīna mRNS saturu. Rezultāti tika izteikti kā 2- △ACT, kur CT vērtība ir starpība starp cikla sliekšņa vērtībām.
2. attēlsPerfūzijas un nieru funkcijas parametri, kas novērtēti žurku un cūku nieru normotermiskās mašīnas perfūzijas laikā un pēc tās. Žurku (a) un cūku (b) nieru kopējais kreatinīna klīrenss. Žurku un cūku nieru kopējā urīna ražošana (c, d) un kopējais olbaltumvielu daudzums, kas izdalīts ar urīnu (e, f). Dati ir parādīti kā vidējā ± vidējā standarta kļūda. Grupas satur 5–7 nieres. *P < 0.05="" un="" **p=""><>
Morfoloģiskā vērtēšana.Biopsijas, kas uzglabātas 4 procentu formaldehīdā, tika iestrādātas parafīnā un sagrieztas 4 μm šķēlēs. Pēc tam kupejas tika iekrāsotas ar Šifa periodisko skābi un novērtētas pēc proksimālās kanāliņu šūnu nekrozes (no vieglas līdz smagai: 1-5), tūskas (no vieglas līdz smagai:1-4) un proksimālo tubulāro šūnu vakuolācijas ( sākot no vieglas līdz smagas pakāpes: 1-4).21 Histopatoloģisko novērtējumu veica divi pētnieki. Neatkarīgs klīniskais patologs ar lielu pieredzi traumu histopatoloģisko pazīmju novērtēšanā pēc žurku un cūku orgānu mašīnas perfūzijas apstiprināja rezultātus.
Aprēķini.Intrarenālā asinsvadu pretestība (IVR) tika aprēķināta, dalot vidējo arteriālo spiedienu ar plūsmu (izteikta mmHg/mL min). Kreatinīna klīrenss tika aprēķināts, lai novērtētu glomerulārās filtrācijas ātrumu, izmantojot šādu vienādojumu: [kreatinīns urīnā]* urīna plūsma/[kreatinīns perfusātā].
Statistiskā analīze.Visi dati ir izteikti kā vidējā ± standarta kļūda. Salīdzinot divas grupas vienā laika punktā, atšķirības tika novērtētas, izmantojot nepāra Studenta t-testu. Kopējās urīna ražošanas, morfoloģisko rādītāju un gēnu ekspresijas atšķirības tika pārbaudītas, izmantojot dispersijas analīzi. Visi statistikas testi ir divpusēji, un P mazāks vai vienāds ar 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu. Visām analīzēm tika izmantota SPSS statistikas versija 23 (IBM, Armonk, NY). Laukums zem līknes (AUC) tika aprēķināts saskaņā ar trapecveida noteikumu, un to izmantoja, lai tuvinātu kopējo kreatinīna klīrensu, kopējo ar urīnu izdalīto olbaltumvielu daudzumu un kopējo ASAT un LDH līmeni perfūzā.
Piezīme: Tradicionālais ķīniešu ārstniecības augs cistanche (pazīstams arī kā "pūķa zāle" un "tuksneša žeņšeņs") aug tikai sausos un siltos tuksnešos. Kā viens no deviņiem nemirstīgajiem augiem Cistanche (cistanche tubulosa/cistanche deserticola/desertliving cistanche/cistanche salsa) satur bagātīgas efektīvas sastāvdaļas, piemēram, ehinakozīdu, akteozīdu, kopējos feniletanoīdu glikozīdus, flavonoīdus, šos dārgakmeņu polisaharīdus utt. barojošs ārstniecības augs un pārtikas materiāls cilvēku imunitātei, iekšējiem orgāniem un smadzeņu šūnām un neironiem uc Mūsdienu farmakoloģiskie pētījumi ir apstiprinājuši šādu cistanche iedarbību (citanche priekšrocības): uzlabo imunitāti; uzlabot seksuālo funkciju un nieru darbību; pret nogurumu; pretnovecošanas; uzlabot atmiņu; pret Parkinsona slimību; anti-Alcheimera slimība; antioksidācija; vieglums-aizcietējums; pretiekaisuma līdzeklis; veicināt kaulu augšanu, balinot ādu; aizsargāt aknas; utt.