Ⅰ daļa Dzelzs helātu veidotājs, PBT434, modulē starpšūnu dzelzs apriti smadzeņu mikrovaskulārajās endotēlija šūnās

Abstrakts

Dzelzs un citi pārejas metāli, piemēram, varš un mangāns, ir būtiski smadzeņu darbības atbalstam, tomēr pārmērīga uzkrāšanās ir citotoksiska. Šī metālu, īpaši dzelzs, pārmērīga uzkrāšanās ir raksturīga vairākiem neiroloģiskiem traucējumiem; tie ietver Alcheimera slimību, Parkinsona slimību, Frīdriha ataksiju un citus traucējumus, kas izpaužas ar neirodeģenerāciju un ar to saistīto dzelzs uzkrāšanos smadzenēs. Dzelzs plūsmas pārvaldība ar hematoencefālisko barjeru nodrošina pirmo aizsardzības līniju pret pārmērīgu dzelzs uzkrāšanos normālā fizioloģijā un šajos patoloģiskajos apstākļos. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka dzelzs helātu veidotājs PBT434, kas pašlaik tiek izstrādāts Parkinsona slimības un vairāku sistēmu atrofijas ārstēšanai, modulē cilvēka smadzeņu mikrovaskulāro endotēlija šūnu (hBMVEC) dzelzs uzņemšanu, veidojot ārpusšūnu Fe helātus.^{2 plus}. hBMVEC ārstēšana ar PBT434 palielina transferīna receptoru (TfR) un ceruloplazmīna (Cp) transkriptu pārpilnību. Western blot un ELISA analīzes atklāj arī atbilstošu olbaltumvielu pieaugumu. Šūnā PBT434 palielina labdarības, labilā Fe līmeni^{2 plus}; dati liecina, ka šis Fe^{2 plus}tiek atbrīvots no feritīna. Turklāt PBT434 pastiprina dzelzs izplūdi, iespējams, palielinoties citosola dzelzs saturam, kas ir dzelzs eksportētāja ferroportīna substrāts. PBT434 ātri un divvirzienu līdzsvaro hBMVEC hematoencefālisko barjeru. Šie rezultāti liecina, ka PBT434-dzelzs komplekss nav hBMVEC uzņemšanas substrāts un tādējādi atbalsta modeli, kurā PBT434 veidotu intersticiālo dzelzi helātus un kavētu dzelzs atpakaļsaistīšanu asins-smadzeņu barjeras endotēlija šūnās. kā arī kavē tā uzņemšanu citās neirovaskulārās vienības šūnās. Kopumā tas ir jauns un daudzsološs mehānisms terapeitiskai dzelzs helātu veidošanai.

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtukādas ir Cistanche priekšrocības

Ievads

Metālu helātu terapija (MCT) jau sen ir izmantota kā līdzeklis saindēšanās ar pārejas metāliem un būtisku metālu jonu metabolisma ģenētiskiem traucējumiem, kas izraisa metāla pārmērīgu uzkrāšanos [1–3]. Divi pēdējie piemēri ir vara hiperakumulācija Vilsona slimības gadījumā [4] un dzelzs pārmantotā hemohromatozes gadījumā [5]. Gan varš, gan dzelzs ir oksidatīvā stresa katalizatori un tādējādi ir citotoksiski koncentrācijās, kas pārsniedz šūnas un organisma spēju “pavadīt” šos redoksaktīvos pārejas metālus [6, 7]. Jo īpaši dzelzs uzkrāšanās ir plaši idiopātiska; patiesi, dzelzs līmeņa paaugstināšanās ir smadzeņu novecošanas pazīme [8–10]. Patoloģiski šī smadzeņu dzelzs uzkrāšanās ir raksturīga ar dzelzs metabolismu nesaistītu gēnu mutācijām [11–15], kā arī dažādām citām neirodeģeneratīvām slimībām, no kurām dažām nav specifiskas ģenētiskas saiknes, piemēram, novecošanās [16], Alcheimera slimība. 17], Frīdreiha ataksija [18] un Parkinsona slimība [19]. Kā grupu šādus traucējumus var uzskatīt par neirodeģenerāciju ar smadzeņu dzelzs uzkrāšanos (NBIA), lai gan šis saīsinājums parasti ir ierobežots ar tiem, kuriem ir noteikta ģenētiska saikne [11, 13, 14].

Dzelzs pārslodzes gadījumā mērķis ir “attīrīt” organismu no liekā dzelzs, ko izraisa šūnu dzelzs uzņemšanas vai izplūdes defekts. Šeit mērķis ir izkonkurēt fizioloģiskos dzelzs helātus ar zālēm; Mērķa zāles ir savienojums, kam ir laba farmakokinētika un augsta afinitāte pret melno dzelzi. Tā kā ķermenis ir pārsātināts ar būtisko metālu, nav lielas bažas par deficīta izraisīšanu ārstēšanas laikā. Smadzeņu slimību ārstēšanai ar dzelzs helātu terapiju nepieciešama cita stratēģija. Tā nav sistēmiskas dzelzs pārslodzes problēma, bet gan dzelzs uzkrāšanās patoloģijas zonās ar postošām pakārtotām sekām. Piemēram, ar vecumu saistīta dzelzs uzkrāšanās Parkinsona slimības (PD) gadījumā potenciāli veicina ar oksidatīvo stresu saistītos šūnu bojājumus [20]. Pārmērīgs labilais dzelzs daudzums veicina nepareizu -sinukleīna salocīšanu nigrālajos neironos. Augstas afinitātes helātu izmantošana var izraisīt zināmu smadzeņu dzelzs slodzes samazināšanos, bet noteikti izraisīs dzelzs deficītu, kas vismaz gados vecākiem cilvēkiem ir kontrindicēts, ņemot vērā šai vecuma grupai raksturīgo sistēmisko dzelzs deficītu [21]. . Helātu veidotājs ar optimālu afinitāti var samazināt dzelzs uzkrāšanos, kā arī ar to saistīto oksidatīvo stresu, ko izraisa pārmērīga labila dzelzs un pamata slimības procesi.

Cistanche tubulosaunCistanche efekti

Viens helātu veidotājs, kas apstiprināts lietošanai pārliešanas izraisītas dzelzs pārslodzes ārstēšanā talasēmijas pacientiem, ir deferiprons (DFP, zīmols Ferriprox) [5, 22]. DFP ir izmantots arī Frīdreiha ataksijas [23] un Parkinsona slimības [24, 25] ārstēšanā. Metaanalīzē ir pierādīts, ka DFP nodrošina ievērojamu dzelzs satura samazināšanos miokardā, kā arī lielāku sirds aizsardzību pacientiem ar talasēmiju nekā deferoksamīns, klasiskais dzelzs helātu veidojošais līdzeklis [5]. No otras puses, DFP ātri metabolizējas aknās [26], un jaunākie pētījumi liecina, ka tas helātus veido Fe2 plus no dzelzs atkarīgo histona lizīna demetilāžu aktīvajā vietā, un šī aktivitāte korelē ar iepriekš neatpazītu citotoksicitāti [27]. Šis atklājums uzsver galveno ierobežojumu dzelzs helātu terapijas izmantošanā, proti, zāļu konkurenci par fizioloģiski būtisku dzelzi neatkarīgi no tā, vai tas atrodas dzelzs noliktavā vai proteīnā, kas satur protezējošu dzelzs veidu. Tomēr, piemēram, DFP ir pierādījis savu efektivitāti Parkinsona slimības 2. fāzes izmēģinājuma ārstēšanā, par ko liecina gan analītiskie (samazināta smadzeņu dzelzs slodze ar T2- svērto MRI), gan uzvedības rādītāji (kognitīvā un motoro neironu funkcija) [ 24, 25].

Tomēr DFP radniecība pret Fe3 plus joprojām rada bažas. Stabilā DFP-dzelzs suga ir trisa komplekss [Fe(DFP)3] 0 [28]. Lai gan šī kompleksa neitralitāte ir ideāli piemērota, lai mobilizētu dzelzi no šūnas, tā stabilitātes konstante ~1037 padara DFP par īstu dzelzs savācēju; šajā kontekstā ir paredzama tā dzelzs enzīma, piemēram, lizīna demetilāzes, inhibīcija [27]. Šīs bažas atspoguļo nepieciešamību izstrādāt dzelzs helātus, kam ir DFP membrānas caurlaidība, bet ievērojami vājāka afinitāte gan pret Fe2 plus, gan pret Fe3 plus. Šī pēdējā īpašība ierobežo protēžu metāla zāļu attīrīšanu un helātu veidojošā aģenta termodinamisko potenciālu, lai katalizētu dzelzs dzelzs autooksidāciju, kas izraisa reaktīvo skābekļa veidu veidošanos. Būtībā spēcīgi dzelzs dzelzs helātu veidotāji katalizē Fe2 plus prooksidanta īpašību [29]. Šajā pētījumā mēs ziņojam, kā šāds dzelzs helātu veidotājs ar mērenu dzelzs un dzelzs afinitāti modulē dzelzs plūsmu smadzeņu mikrovaskulārajās endotēlija šūnās, kas veido asins-smadzeņu barjeru (BBB).

Cistanche tabletes

Šīs zāles, PBT434 [5,7-dihloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroksi-3-metilhinazolin-4 (3H)-ons, 1.A attēls] , veido bis-dzelzs kompleksu ar log stabilitātes konstantēm ~ 11 un ~ 15 Fe^{2 plus}un Fe^{3 plus}, attiecīgi [30]. PBT434 novērsa substantia nigra pars compacta (SNpc) neironu zudumu, samazināja nigrālo-sinukleīna uzkrāšanos, samazināja ar PD slimības modeli saistīto dzelzs saturu vidussmadzenēs un izglāba motorisko veiktspēju divos Parkinsona slimības peles modeļos bez acīmredzamas sistēmisko dzelzs krājumu izsīkšanas. [30]. PBT434 ir iedarbīgs arī vairāku sistēmu atrofijas (MSA) peļu modeļos [30, 31] — motora traucējums, kas pēc izskata ir līdzīgs Parkinsona slimībai, bet kam raksturīga nepareiza -sinukleīna salocīšanās un sekojoša uzkrāšanās, kas izraisa glia citoplazmas ieslēgumu veidošanos, kas ir raksturīga iezīme. slimības patoloģija [32]. Zīmīgi, ka PBT434 samazināja oksidatīvā stresa marķierus peles PD modeļos [30], norādot, ka 1) PBT434 mērķēja uz dzelzs krājumiem, kas citādi tika sagatavoti, lai darbotos kā prooksidanti, un 2) PBT434 nepastiprināja šo topošo oksidācijas izraisīto citotoksicitāti. PBT434 ir apmierinoši pabeidzis 1. fāzes pētījumu [33].

Šeit sniegtais darbs tika izstrādāts, lai noskaidrotu PBT434 ietekmi uz dzelzs apriti smadzeņu barjeras šūnās, mikrovaskulārajās endotēlija šūnās, kas kopā ar pamatā esošo glia veido asins-smadzeņu barjeru. Šajos pētījumos ir izmantota labi apstiprināta iemūžināta endotēlija šūnu līnija gan vienslāņu, gan transwell kultūras formātos [34–37]. Šo pētījumu galvenais mērķis bija noteikt dzelzs uzņemšanas un izplūdes kinētiku no šīm šūnām un to modulāciju ar PBT434. Transwell BBB modelis tika izmantots arī, lai demonstrētu divvirzienu PBT434 transcelulāro plūsmu pāri endotēlija šūnu barjerai. Modelis molekulārā izteiksmē parādīja, ka PBT434 kavē dzelzs uzņemšanu helātu veidošanās ceļā, vienlaikus stimulējot dzelzs izplūdi. Šūnu attēlveidošanas pētījumi liecina, ka PBT434 piekļūst tam pašam labilajam dzelzs baseinam, ko zondē klasiskais Fe^{2 plus}helātu veidojošais aģents, 2,2'-bipiridīns vai bipiridils, un fluorescējoša zonde dzelzs dzelzs noteikšanai. Rezultāti liecina par iespējamu PBT434 darbības mehānismu, kas ietver sistēmiskā dzelzs uzņemšanas kavēšanu BBB un sekojošu smadzeņu dzelzs sekvestrāciju intersticiālajā telpā.

Rezultāti

1. PBT434 nav citotoksiskas ietekmes uz smadzeņu mikrovaskulārajām endotēlija šūnām

Lai noteiktu atbilstošu PBT434 darba koncentrāciju diapazonu mūsu in vitro šūnu kultūrā, mēs izmantojām MTT testu, lai uzraudzītu hBMVEC mitohondriju funkciju, reaģējot uz PBT434. Pamatojoties uz iepriekšējiem ziņojumiem [30], 24 stundas tika apstrādāti ar PBT434 koncentrāciju diapazonu līdz 100 μM. Nevienā pārbaudītajā koncentrācijā mēs nenovērojām būtiskas hBMVEC dzīvotspējas izmaiņas (2. attēls).

2. PBT434 tiek ātri uzņemts un pārvietots pāri hBMVEC barjerai

PBT434 ir perorāli bioloģiski pieejams medikaments, kas var viegli iekļūt BBB, kā redzams pētījumos ar pelēm un cilvēkiem [30, 38, 39]. Mēs uzraudzījām PBT434 uzkrāšanos hBMVEC, kas audzēts monoslāņos, izmantojot 14C marķētu PBT434 kā radiotraceri. Dati norādīja, ka pirmajā fāzē 14C-PBT434 ātri līdzsvarojās starp uzņemšanas vidi un šūnu. Šai sākotnējai uzņemšanai sekoja papildu lēna uzkrāšanās 3 stundu laikā, kuras ātrums bija 30, 1 ± 9, 8 pmol/mg/h (3.A attēls). Uzņemšanas protokolā uzņemšana tiek apturēta un šūnas tiek mazgātas 4 °C temperatūrā pirms apstrādes 14C-PBT434 uzkrāšanai (metodes). Atsevišķā eksperimentā mēs pārbaudījām 14C-PBT434 izplūdi no hBMVEC pēc 30 minūšu ielādes perioda. Izplūdes protokolā šūnas tiek mazgātas 25 °C temperatūrā. Dati 3.B attēlā liecina, ka 25 °C mazgāšanas laikā tika zaudēti aptuveni 92 procenti no šūnās uzkrātā 14C-PBT434 (sk. 550 pmol 14C-PBT434/mg proteīna 3A 30 minūtēs līdz 43 pmol 14C-PBT434 proteīns pie t=0 3B). Turpinājās lēns atlikušā 14C-PBT434 zudums (3.B attēls). Dati liecina par diviem hBMVEC PBT434 uzkrāšanās un izplūdes aspektiem. Plūsma pāri plazmas membrānai strauji sasniedz līdzsvaru, kas šķietami ir uzņemšanas vai izplūdes laikā. Tomēr abos procesos ir vēl viens lēnāks process. Tas liek domāt, ka šūnā daļa šūnas PBT434 atrodas lokalizācijā/stāvoklī, kas ir kinētiskā līdzsvara stāvokļa attiecībās ar frakciju, kas ir līdzsvarā ar ārpusšūnu vidi. 3.B attēlā norādītajā kinētiskajā analīzē tika noteikts, ka šo PBT434 kopumu šūnu lizātā pārstāvēja 27 ± 4 pmol/mg proteīna, kad šūnas tika apstrādātas ar 20 μM reaģentu.

Lai pārbaudītu PBT434 transcelulāro plūsmu, mēs izmantojām labi apstiprinātu in vitro BBB modeli, izmantojot transwell membrānas apikālo pusi [35, 36, 40, 41]. Šo transwell kultūru barjeras īpašības tika pārbaudītas, kvantitatīvi nosakot to transendoteliālo elektrisko pretestību (TEER) un necaurlaidību pret FITC marķētu dekstrānu (S1 attēls). Mēs salīdzinājām 14C-PBT434 uzņemšanu luminālajā (vai apikālajā, asiņu pusē) (4.A attēls) ar uzņemšanu abluminālajā (vai bazolaterālajā, smadzeņu pusē) (4C attēls). Tajā pašā eksperimentā atbilstošā izplūde (transcelulārā plūsma) tika kvantitatīvi noteikta pēc 14C-PBT434 parādīšanās izplūdes kamerā (4. att. B un D paneļi). Šo procesu ātrumi ir norādīti 1. tabulā. Masas dati, kas parādīti 4. attēlā (B un D panelis), parāda, ka PBT434 neto plūsma pāri šim modelim hematoencefālisko barjerai bija vienāda abos virzienos. Bazālajā kamerā bija uzkrāti 976 ± 185 pmol 14C-PBT434 (4.B attēls) un 1033 ± 210 pmol kvantitatīvi noteikts bazālajā kamerā (4.D attēls). Šī gandrīz ekvivalence atspoguļojās arī ļoti līdzīgos PBT434 izplūdes ātrumos abās barjeras membrānās (1. Tomēr šajā barjeras modelī bazolaterālajā membrānā bija ievērojami lielāks PBT434 uzņemšana, ko ilustrē aptuveni 50% lielāks savienojuma zudums no bazālās kameras (4.C attēls), kas atbilst aptuveni 40% lielākam šķietamās šūnu uzņemšanas ātrumam. (1. tabula). Paredzams, ka spēcīgāka uzņemšana izraisīs lielāku uzkrāšanos. Šūnu analīze pēc 3 stundām parādīja, ka tās saglabāja ~ 6 μM PBT434 neatkarīgi no plūsmas virziena. Vērtības bija 8,1 ± 1,3 μM (no apikāla līdz bazālam) un 4,7 ± 1,2 μM (no pamatnes līdz apikālam). Kā minēts iepriekš, šī analīze seko šūnu mazgāšanai pirms līzes un kopējā šūnu proteīna un 14C-PBT434 kvantitatīvās noteikšanas. Turklāt barotne apikālajā kamerā saturēja RPMI plus 10 procentus FBS un 10 procentus NuSerum, turpretim bazālajā, “smadzeņu” kamerā bija tikai RPMI (metodes). Saprātīgs secinājums bija tāds, ka lielāka “uzņemšana” bazālajā membrānā atspoguļoja PBT434 šūnu virsmas adsorbciju, ko apikālajā kamerā ierobežoja olbaltumvielu komponentu klātbūtne serumā. Pēc šūnu mazgāšanas PBT434 uzkrāšanai šis adsorbētais materiāls (kas reģistrēts kā “uzņemšana”) tika noņemts. Šī plūsmas eksperimenta atkārtošana, bet ar serumu bazālajā kamerā, parādīja, ka serums patiešām nomāc šo iespējamo šūnu virsmas PBT434 adsorbciju (S2 attēls).

3. PBT434, atšķirībā no bipiridila, neierobežo labilā dzelzs intracelulāro pieejamību.

Tā kā PBT434 ir mērenāka afinitāte pret dzelzi, salīdzinot ar klasiskajiem dzelzs helātu veidotājiem, piemēram, deferipronu vai bipiridilu, mēs pārbaudījām, kā šī atšķirība atspoguļojās PBT434 iedarbībā uz hBMVEC šūnu labilā dzelzs baseinu (LIP). Lai to izdarītu, mēs izmantojām caurlaidīgo Fe^{2 plus}-specifiska fluorescējoša krāsviela FerroOrange, kas reaģē ar labdarības citoplazmas dzelzi. Mēs novērojām ievērojamu fluorescences ablāciju šūnās, ja tās tika apstrādātas ar bipiridilu, kas atbilst LIP helātu veidošanai ar šo augstas afinitātes dzelzs dzelzs helātu un tādējādi bloķē fluorescējošā dzelzs indikatora darbību (5.A attēls). Turpretim PBT434 nekonkurēja ar FerroOrange par Fe^{2 plus}, uzvedība atbilst tās mērenākai afinitātei [30]. Rezultāti parādīja, ka PBT434, bet ne PBT434-met neaktīvais atvasinājums, izraisīja ferooranžā pieejamā Fe palielināšanos par 34 ± 9 procentiem.^{2 plus}kas liecina, ka šis helātu veidojošais līdzeklis mobilizēja dzelzi šūnā bez vienlaicīgas toksicitātes. Tālāk sniegtie dati liecina, ka šī dzelzs ir iegūta no feritīna.

Iepriekš tika pierādīts, ka PBT434 atjauno noplicinātu ferroportīna proteīna ekspresiju ar MPTP ārstētām pelēm līdz tādam līmenim, kāds ir nebojātām pelēm [30]. Šis rezultāts, kā arī intracelulārās dzelzs iekrāsošanās palielināšanās, reaģējot uz PBT434, liecināja par iespējamu ietekmi uz šūnu dzelzs reakcijas sistēmu un ar dzelzi saistīto proteīnu darbību. Lai to novērtētu, mēs vispirms veicām kvantitatīvu PCR (qPCR) analīzi par PBT434 ietekmi uz vairāku ar dzelzi apstrādājošo proteīnu transkriptu pārpilnību (6. attēls). Kamēr dzelzs izplūdes proteīna, ferroportīna (Fpn) un divu citoplazmas dzelzs šaperonu, PCBP1 un 2, transkripti netika ietekmēti, transferīna receptora (TfR) un feroksidāzes, ceruloplazmīna (Cp) mRNS pārpilnība saglabājās. mainīt. TfR un Cp transkripti palielinājās attiecīgi par 2,8 un 3{13}}reizēm. Transferrīna receptoru (TfR) ekspresija ir saistīta ar uz dzelzi reaģējošo elementu (IRE)/dzelzs regulējošā proteīna (IRP) sistēmu [42–44]. TfR mRNS palielināšanās liecina, ka PBT434 konkurē ar PCBP1-atkarīgo dzelzs piegādi, lai izveidotu Fe, S klasteru, kas pārvērš regulējošo IREBP no RNS saistoša proteīna par citozola akonitāzi [45]. Tādējādi PBT434 novirza šo regulējošo modulāciju uz RNS saistīšanos un atbilstošu TfR mRNS degradācijas inhibīciju. Šūnu dzelzs deficīta gadījumā Cp ekspresiju daļēji regulē HIF-1 [46]. HIF-1 funkcijas palielināšanās izriet no tā hidroksilēšanas notriekšanas ar prolilhidroksilāzes aktivitāti no dzelzs atkarīgā reakcijā [47]. Tāpat kā IREBP gadījumā, šķiet, ka PBT434 samazina dzelzs daudzumu, kas kalpo kā HIF-1 hidroksilēšanas un noārdīšanās kofaktors. Šajā modelī šī transkripcijas aktivatora līdzsvara stāvokļa līmeņa paaugstināšanās palielina Cp transkripciju.

Izmantojot ELISA analīzes un Western blotēšanas kombināciju, mēs pārbaudījām ar dzelzi saistītu proteīnu ekspresiju PBT434 vai PBT434-met apstrādātā hBMVEC; WB analīžu piemēri ir doti 7A attēlā. Dati parādīja, ka TfR monomēra un dimēra daudzums ievērojami palielinājās par 24 stundām, tāpat kā Cp (7.B un 7.C attēls). Abi palielinājumi bija paralēli PBT434-atkarīgajam attiecīgo transkriptu palielinājumam (6. attēls). Turpretim dzelzs izplūdes proteīna Fpn ekspresija bija nejutīga pret ārstēšanu ar PBT434 (7.D attēls).

Mēs izmantojām ELISA kā papildu metodi, lai kvantitatīvi noteiktu locījuma izmaiņas, ko norāda Western blot dati. Tādējādi hBMVEC 24 stundas apstrādāja ar PBT434, un šūnu lizāti tika pārbaudīti ar ELISA TfR noteikšanai (8.A attēls). Reaģējot uz ārstēšanu ar PBT434, TfR palielinājums, kas kvantitatīvi noteikts ar ELISA, bija līdzvērtīgs tam, ko nodrošina Western blot analīze (7.B attēls). ELISA tika izmantota arī, lai novērtētu izdalīto un ar GPI saistīto Cp proteīnu pārpilnību, izmantojot HepG2 šūnas kā pozitīvu kontroli. Attiecībā uz Cp, kas izdalīts augšanas barotnē, šī pieeja bija ierobežota, jo sCp pārpilnība gan HepG2, gan hBMVEC kondicionētajā barotnē bija šī testa apakšējā jutības robeža vai zem tās (S3 attēls). Tomēr tas ļāva novērtēt GPI-Cp pārpilnību. Šajā metodē šūnas tika apstrādātas ar fosfatidilinozitolam specifisko fosfolipāzi C (PI-PLC), kas sašķeļ GPI enkuru; šādi kondicionētā barotne tika koncentrēta un analizēta ar Cp-ELISA. Lai gan šī pieeja parādīja, ka PBT434 palielināja GPI-Cp daudzumu HepG2 šūnās, tai atkal neizdevās noteikt nevienu Cp, ko izdala PI-PLC (8.B attēls). ELISA arī nodrošināja tiešu metodi feritīna kvantitatīvai noteikšanai. Lai to izdarītu, hBMVEC 24 stundas tika ielādētas ar 1 uM Fe-citrātu, kam sekoja apstrāde bez PBT434 vai tās klātbūtnē vēl 1 stundu. Iegūtie šūnu lizāti tika pakļauti feritīna ELISA analīzei (8.C attēls). Atšķirībā no TfR pieauguma, apstrāde ar PBT434 samazināja feritīna (Ft) proteīnu par ~ 18 procentiem. Patiešām, šis Ft proteīna zudums bija redzams tikai pēc 1 stundas apstrādes ar reaģentu. Šī rezultāta laika raksturu var saistīt ar labdarības Fe2 plus pieaugumu, kas minēts iepriekš pēc 30 minūšu ilgas ārstēšanas ar PBT434. Kā minēts vēlāk, feritīna samazināšanās ir pierādīta pēc apstrādes ar citiem šūnu caurlaidības Fe2 plus helātus veidojošiem līdzekļiem [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plus}uzņemšanu kavē kompleksa veidošanās ar PBT434

Ņemot vērā PBT434 ātro līdzsvarošanu hBMVEC 30 minūšu laikā, salīdzinot ar lēno, divfāzu uzņemšanu un Fe2 plus līdzsvarošanu 24 stundu laikā [49], mēs izvirzījām hipotēzi, ka PBT434 un Fe2 plus nebija vienāds uzņemšanas mehānisms. Lai to pārbaudītu, monoslāņus inkubēja ar radioaktīvi iezīmētu 55Fe2 plus bez PBT434 vai PBT{10}}met, un tika uzraudzīta 55Fe2 plus uzņemšana 3 stundu laikā (9.A attēls). PBT434 ievērojami samazināja 55Fe2 plus uzņemšanas ātrumu, kā arī samazināja kopējo 55Fe2 plus uzkrāšanos šūnu lizātos (9.C attēls). Šis efekts netika novērots ar PBT{21}}met. PBT434 un 55Fe uzņemšanas ātruma salīdzinājums liecina, ka PBT434 un Fe2 plus tiek uzņemti pa atsevišķiem transporta ceļiem. Turklāt 55Fe uzņemšanas kavēšana PBT434 klātbūtnē, bet ne PBT{30}}met, liecina, ka ārpusšūnu PBT434-dzelzs komplekss nav ligands dzelzs dzelzs transportētājiem hBMVEC, proti, ZIP8, un ZIP14.

Cistanche piedevas

Lai turpinātu pētīt PBT434 lomu dzelzs uzkrāšanā, mēs pārbaudījām tā iepriekšējas iedarbības ietekmi uz 55Fe2 plus uzņemšanu. Šūnām, kas iepriekš apstrādātas ar PBT434 un kuras pēc mazgāšanas tika pakļautas 55Fe2 plus iedarbībai, pēc 3 stundām palielinājās 55Fe2 plus uzņemšanas un uzkrāšanās ātrums (9. attēls, B un D panelis). Šī palielinātā uzkrāšanās tika saglabāta vismaz 24 stundas. Šie dati liecina, ka šūnu iepriekšēja iedarbība uz PBT434 īslaicīgi pastiprina dzelzs uzņemšanu. Negaidīti arī PBT{14}}met pirmapstrāde uzrādīja gan uzņemšanas, gan uzkrāšanās palielināšanos (9.B attēls), taču šī ietekme nebija tik nozīmīga vai noturīga kā PBT434.

Mēs esam parādījuši, ka dzelzs uzņemšanu no 59Fe-transferrīna atbalsta dzelzs reducēšana un fero caurlaidība plazmas membrānā [50, 51]. Viens no eksperimentāliem rezultātiem, lai atbalstītu šo TBI dzelzs uzņemšanas modeli, bija šīs uzņemšanas samazināšanās, inhibējot ārpuscitoplazmas ferireduktāzes aktivitāti; Vēl viens rezultāts bija ferozīna, spēcīga dzelzs dzelzs helātu veidotāja, TBI dzelzs uzņemšanas kavēšana par 60 procentiem [50]. Šī pēdējā stratēģija tika izmantota, lai pierādītu, ka PBT434, bet ne PBT, arī kavēja TBI dzelzs uzņemšanu (10. attēls).

5. PBT434 stimulē no Fpn atkarīgo 55Fe2 plus izplūdi

PBT434 ir aptuveni 20 procenti no deferiprona spējas radīt acīmredzamu Fe2 stimulāciju un izplūdi no neironu šūnām [30]. Mēs novērtējām 55Fe2 plus izplūdi no hBMVEC PBT434 neesamības vai klātbūtnes gadījumā kontroles šūnās vai šūnās, kas apstrādātas ar mini-hepcidīnu PR73. Hepcidīns ir peptīdu hormons, kas atrodams gan sistēmiski, gan smadzeņu intersticijā, kas saistās ar Fpn un ir vērsts uz transportētāju, lai noārdās. Hepcidīna ietekme uz Fpn dzelzs eksporta funkciju ir plaši pētīta [52–54]. Iepriekš mēs esam parādījuši, ka Fe2 plus izplūde no hBMVEC ir atkarīga no Fpn [35, 49]. PR73 EC50 ir ~ 4 nM Fpn degradācijai GFP reportiera testā [55]. hBMVEC monoslāņos tika ielādēts ar 55Fe2 plus 24 stundas bez PR73 vai tā klātbūtnes. Pēc tam 55Fe izplūde tika kvantitatīvi noteikta 5 stundu laikā, nepārtraukti trūkstot PR73 vai klātbūtnē kombinācijā ar PBT434 neesamību un klātbūtni (11. attēls). Kamēr PR73 nomāca 55Fe izplūdi gan no kontroles, gan ar PBT{31}}apstrādātajām kultūrām, PBT434 daļēji nomāca inhibīciju minihepcidīna dēļ. Ja nebija PBT434, dzelzs izplūde no PR73-apstrādātajām kultūrām tika samazināta par ~75%, savukārt ar PBT434-apstrādātajām kultūrām samazināšanās bija tikai ~50% (11. attēls un 2. tabula). No šiem rezultātiem var izdarīt divus secinājumus. Pirmkārt, Fpn iznīcināšana ar PR73 samazina 55Fe izplūdi gan PBT434 klātbūtnē, gan bez tās. Otrkārt, jebkurā gadījumā PBT434 atbalsta ievērojamu, kaut arī nelielu dzelzs izplūdes stimulāciju.

Atsauces

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Sintētiskie un dabiskie dzelzs helātu veidotāji: terapeitiskais potenciāls un klīniskā izmantošana. Future Med Chem. 2009. gads; 1(9):1643–70.

2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Jaunas perspektīvas dzelzs helātu terapijā neirodeģeneratīvo slimību ārstēšanai. Farmaceitiskie izstrādājumi (Bāzele). 2018. gads; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Metālu helātu terapija un Parkinsona slimība: kritisks pārskats par termodinamikas kompleksu veidošanos starp attiecīgajiem metāla joniem un daudzsološām vai iedibinātām zālēm. Biomolekulas. 2019. gads; 9(7).

4. Hedera P. Atjauninājums par Vilsona slimības klīnisko pārvaldību. Appl Clin Genet. 2017. gads; 10:9–19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Deferoksamīna, deferiprona un deferaziroksa salīdzinošā efektivitāte un drošība smagas talasēmijas gadījumā: 16 randomizētu kontrolētu pētījumu metaanalīze. PLoS One. 2013. gads; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalītiskie metāli, askorbāts un brīvie radikāļi: kombinācijas, no kurām jāizvairās. Radiat Res. 1996. gads; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oxidative Stress: A Key Modulator in Neurodegenerative Diseases. Molekulas. 2019. gads; 24(8).

8. Ašrafs A, Klārks M, So PW. Dzelzs vīra novecošana. Priekšējie novecošanās neirozi. 2018. gads; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrovic K, Loitfelder M u.c. R2* kartēšana smadzeņu dzelzs noteikšanai: asociācijas ar izziņu normālā novecošanā. Neirobiols novecošana. 2015. gads; 36(2):925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Dzelzs, smadzeņu novecošanās un neirodeģeneratīvi traucējumi. Nat Rev Neurosci. 2004. gads; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. NBIA sindromu klasifikācija un molekulārā patoģenēze. Eur J Paediatr Neurol. 2018. gads; 22(2):272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Neirodeģenerācija ar smadzeņu dzelzs uzkrāšanos: atjauninājums par patogēniem mehānismiem. Front Pharmacol. 2014. gads; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Neirodeģenerācija ar smadzeņu dzelzs uzkrāšanās traucējumiem: vērtīgi modeļi, kuru mērķis ir izprast dzelzs nogulsnēšanās patoģenēzi. Farmaceitiskie izstrādājumi (Bāzele). 2019. gads; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neirodeģenerācija ar smadzeņu dzelzs uzkrāšanos: ģenētiskā daudzveidība un patofizioloģiskie mehānismi. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015. gads; 16:257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neirodeģenerācija ar smadzeņu dzelzs uzkrāšanos: pārskats. Irāna J Child Neirol. 2014. gads; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S u.c. Neiroferritinopātijas cilmes šūnu modelēšana atklāj dzelzi kā novecošanās un ferroptozes noteicēju neironu novecošanas laikā. Ziņojumi par cilmes šūnām. 2019. gads; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Dzelzs un Alcheimera slimība: no patoģenēzes līdz terapeitiskām sekām. Priekšējie neiroķi. 2018. gads; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Dzelzs loma Frīdreiha ataksijā: ieskats pētījumos par cilvēka audiem un šūnu un dzīvnieku modeļiem. Priekšējie neiroķi. 2019. gads; 13:75.

19. Pušmans A. Jauni gēni, kas izraisa iedzimtu Parkinsona slimību vai parkinsonismu. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Targeting iron metabolism in drug discovery and delivery. Nat Rev Drug Discov. 2017. gads; 16(6): 400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Anēmijas izplatība 65 gadus veciem un vecākiem cilvēkiem Amerikas Savienotajās Valstīs: pierādījumi par augstu neizskaidrojamas anēmijas līmeni. Asinis. 2004. gads; 104 (8): 2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C u.c. Ārstēšana ar deferaziroksu, deferipronu un desferrioksamīnu galvenajiem talasēmijas pacientiem: sirds dzelzs un funkciju salīdzinājums, kas noteikts ar kvantitatīvās magnētiskās rezonanses attēlveidošanu. Hematoloģiskā. 2011. gads; 96(1):41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A u.c. Deferiprons Frīdreiha ataksijas gadījumā: 6-mēneša randomizēts kontrolēts pētījums. Ann Neirol. 2014. gads; 76(4):509–21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C u.c. Smadzeņu dzelzs helātu veidošanās ar deferipronu 2. fāzes randomizētā dubultmaskētā, placebo kontrolētā Parkinsona slimības klīniskajā pētījumā. Zinātnes Republika 2017; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C u.c. Dzelzs helātu kā terapeitisku līdzekli Parkinsona slimības ārstēšanai. Antioksīda redoksa signāls. 2014. gads; 21(2):195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA u.c. 1,2-dimetil- un 1,2-dietil-aizvietotā 3-hidroksipiridīna-4- urīna metabolisma profili cilvēkiem un žurkām. Zāļu vielmaiņa un dispozīcija. 1992. gads; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A u.c. Deferiprons: Panselektīvs histona lizīna demetilāzes inhibīcijas aktivitātes un struktūras aktivitātes attiecību pētījums. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Nesenie notikumi ir vērsti uz perorāli aktīviem dzelzs helātu veidojumiem. Talasēmijas ziņojumi. 2014. gads; 4 (2).

29. Kosman DJ. Dzelzs metabolisms aerobos: dzelzs dzelzs hidrolīzes un dzelzs autoksidācijas pārvaldība. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL u.c. Jaunais savienojums PBT434 novērš dzelzs izraisītu neirodeģenerāciju un alfa-sinukleīna toksicitāti vairākos Parkinsona slimības modeļos. Acta Neuropathol Commun. 2017. gads; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, redaktori. PBT434 saglabā dopamīnerģiskos neironus, samazina alfa-sinukleīna oligomerizāciju un uzlabo motoru darbību transgēnās peles vairāku sistēmu atrofijas modelī. Neiroloģijas žurnāli; 2020: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ ASV.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: No pamata mehānismiem līdz eksperimentālajai terapijai. Parkinsonisma radniecīgi traucējumi. 2020. gads; 73:94–104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Daudzsološa slimību modificējoša terapija Parkinsona slimībai. Zinātnes tulkošanas medicīna. 2019. gads; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Salīdzinošs pētījums par četrām iemūžinātām cilvēka smadzeņu kapilāru endotēlija šūnu līnijām, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 un BB19, un kultivēšanas apstākļu optimizācija in vitro asins-smadzeņu barjeras modelis zāļu caurlaidības pētījumiem. CNS šķidrumi un barjeras. 2013. gads; 10(1):33.

35. McCarthy RC, Kosman dīdžejs. Gliju šūnu ceruloplazmīns un hepcidīns atšķirīgi regulē dzelzs izplūdi no smadzeņu mikrovaskulārajām endotēlija šūnām. PLoS One. 2014. gads; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Izšķīdušās vielas nesēji ZIP8 un ZIP14 regulē mangāna uzkrāšanos smadzeņu mikrovaskulārajās endotēlija šūnās un kontrolē smadzeņu mangāna līmeni. J Biol Chem. 2019. gads; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Baktēriju invāzija un transcitoze transficētās cilvēka smadzeņu mikrovaskulārās endotēlija šūnās. Mikrobu Patogs. 2001. gads; 30(1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Pirmais cilvēka pētījums par PBT434, jaunu mazu molekulu sinukleīna agregācijas inhibitoru (S4.001). Neiroloģija. 2019. gads; 92(15. papildinājums):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. 1. fāzes pētījums par PBT434, jaunu mazu molekulu sinuklīnu agregācijas inhibitoru, pieaugušajiem un gados vecākiem pieaugušajiem brīvprātīgajiem (4871). Neiroloģija. 2020. gads; 94(15. papildinājums):4871.

40. McCarthy RC, Kosman dīdžejs. C6 glioblastomas šūnu ceruloplazmīna ekspresijas aktivizēšana ar blakus esošajiem cilvēka smadzeņu endotēlija atvasinātajiem interleikīniem in vitro asins-smadzeņu barjeras modeļa sistēmā. Šūnu komunikācija un signalizācija: CCS. 2014. gads; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman dīdžejs. sAPP modulē dzelzs izplūdi no smadzeņu mikrovaskulārajām endotēlija šūnām, stabilizējot dzelzs dzelzs eksportētāju feroportīnu. EMBO ziņojumi. 2014. gads; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulation of Mammalian Iron Metabolism. Šūna. 2010. gads; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Džou ZD, Tan EK. Dzelzs regulējošā proteīna (IRP) - uz dzelzi reaģējošā elementa (IRE) signalizācijas ceļš cilvēka neirodeģeneratīvās slimībās. Molekulārā neirodeģenerācija. 2017. gads; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s{10}} PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Smadzeņu dzelzs metabolisms un tā traucējumi neiroloģisko slimību gadījumā. J Neironu transmisija. 2011. gads; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A u.c. PCBP1-BolA2 šaperona komplekss nodrošina dzelzi citozola [2Fe-2S] klastera komplektēšanai. Nat Chem Biol. 2019. gads; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Hipoksijas izraisītā faktora-1 nozīme ceruloplazmīna transkripcijas aktivācijā dzelzs deficīta dēļ. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Olbaltumvielu hidroksilēšana ar hipoksijas inducējamā faktora (HIF) hidroksilāzēm: unikāla vai visuresoša? Šūnas. 2019. gads; 8(5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM u.c. Ar feroportīnu saistīta feritīna dzelzs mobilizācija notiek pirms feritīna noārdīšanās ar proteasomu. Embo j. 2006. gads; 25(22):5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman dīdžejs. Ferroportīna un eksocitoplazmatiskās feroksidāzes aktivitāte ir nepieciešama smadzeņu mikrovaskulāro endotēlija šūnu dzelzs izplūdei. Bioloģiskās ķīmijas žurnāls. 2013. gads; 288(24):17932–40.

50. McCarthy RC, Kosman dīdžejs. BBB endotēlija šūnu dzelzs uzkrāšanās mehāniskā analīze. Biometāli. 2012. gads; 25(4):665–75.

51. Kosman dīdžejs. Metālu reducēšanas un metāloksidācijas telos eikariotu dzelzs un vara tirdzniecībā. Metalomika. 2018. gads; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA u.c. Feroportīna struktūras un funkciju analīze nosaka hepcidīna saistīšanās vietu un alternatīvu darbības mehānismu. Asinis. 2018. gads; 131(8):899–910.

53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidīns un dzelzs homeostāze. Biochim Biophys Acta. 2012. gads; 1823(9):1434–43.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T u.c. Hepcidīna izraisīta feroportīna endocitoze ir atkarīga no feroportīna ubikvitinācijas. Šūnu Metab. 2012. gads; 15(6):918–24.

55. Sēne E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tiola atvasinātie minihepcidīni saglabā bioloģisko aktivitāti. Bioorg Med Chem Lett. 2015. gads; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Bioķīmijas nodaļa, Džeikobsas Medicīnas un biomedicīnas zinātņu skola, Ņujorkas štata universitāte Bufalo, Bufalo, NY, Amerikas Savienotās Valstis