Floretīns nomāc neiroiekaisumu ar autofagijas mediētu Nrf2 aktivāciju makrofāgos

Kontaktpersona:tina.xiang@wecistanche.com

Abstrakts

Fons: Makrofāgiem ir divējāda loma neiroiekaisuma traucējumos, piemēram, multiplās sklerozes (MS) gadījumā. Tie ir iesaistīti bojājumu rašanās un progresēšanā, bet var arī veicināt bojājumu izzušanuiekaisumsun bojāto audu atjaunošana. Šajā pētījumā mēs pētām, vai un kāfloretīns, flavonoīds, kas bagātīgi atrodas ābolos un zemenēs, samazina makrofāgu iekaisuma fenotipu un nomācneiroiekaisums.

Metodes: transkripcijas izmaiņas peles kaulu smadzenēs iegūtajos makrofāgos pēc floretīna iedarbības tika novērtētas ar lielapjoma RNS sekvencēšanu. Pamatceļi, kas saistīti ar iekaisumu, oksidatīvā stresa reakciju un autofagiju, tika apstiprināti, izmantojot kvantitatīvus PCR, fluorescējošus un absorbcijas testus, ar kodolfaktoru eritroīdu 2-saistīto faktoru 2 (Nrf2) nokautas peles, Western blot un imunofluorescenci. Eksperimentālais autoimūnā encefalomielīta (EAE) modelis tika izmantots, lai pētītu floretīna ietekmi uz neiroiekaisumiem in vivo un apstiprinātu pamatā esošos mehānismus.

Rezultāti: Mēs parādām, ka floretīns samazina makrofāgu iekaisuma fenotipu un ievērojami nomāc neiroinflammāciju EAE. Floretīns veicina tā iedarbību, aktivizējot Nr2 signalizācijas ceļu. Nrf2 aktivācija tika attiecināta uz 5'AMP aktivētās proteīna kināzes (AMPK) atkarīgo autofagijas aktivāciju un sekojošu ar kelch līdzīgu ECH saistītā proteīna 1 (Keap1) degradāciju.

Secinājumi: Šis pētījums paver nākotnes perspektīvas floretīnam kā terapeitiskai stratēģijai neiroiekaisuma traucējumiem, piemēram, MS.

Izmēģinājuma reģistrācija: Nav piemērojams.

Atslēgvārdi: floretīns, makrofāgi, neiroiekaisumi, multiplā skleroze, autoimunitāte

Noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk informācijas

Fons

Aktīviem multiplās sklerozes (MS) bojājumiem ir raksturīgi daudzimakrofāgi[1-5]. Agrīnie pētījumi parādīja, ka makrofāgi MS bojājumos pieņem iekaisumu veicinošu fenotipu, tādējādi veicinotneiroiekaisums, demielinizācija un neirodeģenerācija. Slimību veicinošās efektoru funkcijas ietver no centrālās nervu sistēmas (CNS) iegūto antigēnu uzrādīšanu autoreaktīvām T šūnām un iekaisuma mediatoru, piemēram, pro-iekaisuma citokīnu, reaktīvo skābekļa sugu (ROS) un slāpekļa oksīda (NO) ražošanu. 6,7]. Pavisam nesen tika atklāts, ka makrofāgiem ir arī labvēlīgas funkcijas MS bojājumos, jo tie var pārveidot savu fenotipu par tādu, kas parasti ir saistīts ar imūnsupresiju un CNS atjaunošanos. Šim aizsargājošajam fenotipam ir raksturīga samazināta pro-iekaisuma mediatoru ražošana, pretiekaisuma mediatoru un augšanas faktoru ražošana, kā arī antioksidantu ceļu, piemēram, ar kodolfaktora eritroīdo 2-saistītā 2. faktora (Nrf2) ceļa, aktivizēšana. [8-14]. Tā kā makrofāgu iekaisuma stāvoklis ir saistīts ar MS progresēšanu un hronisku aktīvu bojājumu attīstību, makrofāgu virzīšana uz labvēlīgu fenotipu tiek uzskatīta par daudzsološu stratēģiju MS progresēšanas ierobežošanai [15].

Uztura sastāvdaļas veicina makrofāgu darbību un neiroinflammāciju [16]. Jo īpaši arvien vairāk tiek atzīts, ka flavonoīdu saime satur daudzsološus savienojumus, kas ietekmē patogēnos ceļus un modulē imūno šūnu, piemēram, makrofāgu, fenotipu [17, 18]. Flavonoīdi veido vienu no lielākajām fitoelementu grupām, kas satur vairāk nekā 8000 fenola savienojumu ar daudzveidīgu bioaktivitāti. Vairākiem flavonoīdu saimes pārstāvjiem piemīt pretiekaisuma un antioksidatīva iedarbība uz makrofāgiem [19-21]. Flavonoīds floretīns ir dihidrohalkonu loceklis, un tas ir sastopams bieži patērētos augļos, piemēram, ābolos un zemenēs. Ir zināms, ka floretīnam piemīt imūnmodulējošas īpašības, un to plaši izmanto ādas kopšanai, jo tam piemīt antioksidatīvas īpašības [22-24]. Turklāt floretīns ir glikozes transportētāja (GLUT) inhibitors, kas ietekmē makrofāgu fenotipu, jo makrofāgu aktivāciju veicina GLUT [25, 26]. Kopumā šīs īpašības padara floretīnu par daudzsološu savienojumu, lai modulētu makrofāgu fenotipu un neiroiekaisumu. Šajā pētījumā mēs parādām, ka floretīns virza makrofāgus uz mazāk iekaisuma fenotipu un mazina neiroinflammāciju eksperimentālajā autoimūnā encefalomielīta (EAE) modelī. RNS sekvencēšana un funkcionālie eksperimenti identificēja Nrf2 ceļu kā šī floretīna izraisītā aizsargājošā makrofāgu fenotipa centru un virzītājspēku. Tika konstatēts, ka no AMPK atkarīga autofagijas iekārtu aktivizēšana un sekojoša SQSTMl/p62-mediēta (turpmāk tekstā — p62) Keapl, adaptera, kas veicina proteasomu Nrf2 degradāciju, degradācija ir pamatā Nrf2 aktivācijai makrofāgos. Šie atklājumi liecina, ka floretīnu var izmantot neiroinflammatorisku traucējumu terapeitiskās stratēģijās.

Metodes

Antivielas un ķīmiskie reaģenti

Floretīns(Sigma Aldrich) tika izšķīdināts 50 mM KOH līdz 15 mM izejas šķīdumam un uzglabāts -20 grādu temperatūrā. Papildu atšķaidījumi tika veikti RPMI1640 (Gibco) barotnē. Ārstēšanai in vivo floretīns tika izšķīdināts 1 N NaOH, pēc tam pH tika noregulēts līdz 7, 2 ar 1 N HCL, un šķīdumu tālāk atšķaida fizioloģiskā ūdenī, lai iegūtu koncentrāciju 50 mg / kg. BML-275 (1 μM, Santa Cruz Biotechnology) tika pievienots 1 stundu pirms floretīna apstrādes, lai kavētu AMPK aktivāciju. Bafilomicīns A1 (BAF, 0, 1 μM, InvivoGen) tika pievienots 2 stundas pirms savākšanas, lai bloķētu autofagosomu un lizosomu saplūšanu. Lipopolisaharīds (LPS, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich) tika izmantots, lai stimulētu šūnas iekaisuma fenotipēšanai. Lai izraisītu ROS veidošanos, tika izmantots forbola 12-miristāta 13-acetāts (PMA, 100 ng/ml, Sigma-Aldrich). Western blotam tika izmantotas šādas antivielas: peles anti- -aktīns (1:10,000;sc-47778, Santa Cruz Biotechnology), peles anti-GAPDH (1:{{29). }};AB_2537659, Invitrogen), trušu anti-AMPK (1:1000;5831S, šūnu signalizācijas tehnoloģija), trušu antifosforilētais AMPK (1:1000; 2535S, šūnu signalizācijas tehnoloģija), trušu anti-LC3 (1: 1000; L7543, Sigma-Aldrich), truša anti-p62 (1: 1000; 23214, šūnu signalizācijas tehnoloģija). Imunofluorescencei tika izmantotas šādas antivielas: žurku anti-CD3 (1:150; MCA500G, Bio-Rad), žurku anti-F4/80 (1:100; MCA497G, Bio-Rad), trušu anti-LC3 (1:1000). ;L7543, Sigma-Aldrich), trušu anti-p62 (1:500;23214, šūnu signalizācijas tehnoloģija), trušu anti-Keap1 (1:500;60027-1-Ig, Proteintech Europa), trušu anti-TMEM119 (1) :100, ab209064, Abcam). Atbilstošās sekundārās antivielas tika iegādātas no Invitrogen.

Peles

Savvaļas tipa (WT) C57BL / 6JOlaHsd peles tika iegādātas no Envigo. Dzīvnieki tika baroti ar regulāru uzturu un tika izmitināti Haseltas Universitātes Biomedicīnas pētījumu institūta dzīvnieku iestādē. Visi eksperimenti tika veikti saskaņā ar institucionālajām vadlīnijām, un tos apstiprināja Haseltas Universitātes ētikas komiteja eksperimentiem ar dzīvniekiem.

Šūnu kultūra

No kaulu smadzenēm iegūtsmakrofāgi(BMDM) tika izolēti no WT un Nrf2 knockout (KO) C57BL/6JOlaHsd pelēm, iegādātas no Envigo un saskaņā ar MTA nodrošinātas RIEN BRC attiecīgi prof S. Kerdine-Römer [27,28]. BMDM tika iegūti, kā aprakstīts iepriekš [29]. Īsāk sakot, stilba kaula un augšstilba kaula kaulu smadzeņu šūnas no 12-nedēļu vecām WT un Nrf2 KO C57BL/6JOlaHsd pelēm tika kultivētas 10- cm Petri plāksnēs koncentrācijā 10 × 106 šūnas/ plāksne RPMI1640 barotnē, kas papildināta ar 10 procentiem teļa augļa serumu (FCS, Gibco), 50 U/ml penicilīnu (Invitro-gen), 50 V/ml streptomicīnu (Invitrogen) un 15 procentiem L929-kondicionētu barotni (LCM). ). Pēc diferenciācijas BMDM tika atdalīti 37 grādos ar 10 mM EDTA PBS (Gibco) un kultivēti (0,5 × 10 grādu šūnas/ml) RPM1640, kas papildināts ar 10 procentiem FCS, 50 U/ml penicilīna, 50 V/ml streptomicīna un 5 procentiem LCM ( 37 grādi C,5 procenti CO2).Mikrogliju kultūras tika izolētas no pēcdzemdību P1-3 C57BL/6/OlaHsd mazuļu smadzenēm. Pēc smadzeņu stumbra, dzīslenes pinuma un smadzeņu apvalku noņemšanas smadzenes tika mehāniski atdalītas un fermentatīvi sagremotas 15 minūtes ar 1 × tripsīnu (Gibco) 37 grādu temperatūrā. Pēc tam šūnu suspensija tika iesēta DMEM barotnē ar augstu glikozes līmeni (Sigma), kas papildināta ar 30 procentiem LCM, 10 procentiem FCS, 50 V/ml penicilīna un 50 V/ml streptomicīna T75 kultivēšanas kolbās. Divas līdz 3 dienas vēlāk tika veikta pilnīga barotnes maiņa. Jauktās glia kultūras sakrata (230 apgr./min., 3h, 37 grādi) pēc 6-7 dienām, lai iegūtu tīras mikroglia kultūras.

RNS sekvencēšana

Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar floretīnu (50 μM) 20 stundas un LPS stimulētas (100 ng / ml) 6 stundas. Šūnu līze tika veikta, izmantojot Qiazol Lysis reaģentu (Qiagen). RNS tika ekstrahēta no šūnām, izmantojot RNeasy mini komplektu (Qiagen). Pēc tam paraugus apstrādāja Genomics Core Leuven (Beļģija). Bibliotēkas sagatavošana tika veikta ar Lexogen QuantSeq komplektu, lai izveidotu ar Illumina saderīgas bibliotēkas. Bibliotēkas tika sekvencētas Illumina HiSeq4000 sekvencēšanas sistēmā. Savienojumu apzinošā izlīdzināšana tika veikta ar STAR v2.6.1b[30]. Nolasījumu kvantitatīvā noteikšana katram gēnam tika veikta ar HT-seq Count v2.7.14. Uz skaitīšanu balstīta diferenciālās izteiksmes analīze tika veikta ar R balstītu (The R Foundation for Statistical Computing, Vīne, Austrija) Bioconductor pakotni DESeq2. Atšķirīgi ekspresētu gēnu saraksts tika atlasīts ap<0.05 and="" used="" as="" an="" input="" for="" the="" core="" analysis="" by="" qiagen's="" ingenuity="" pathway="" analysis="" (ipa).="" all="" rna="" sequencing="" (rna-seq)="" data="" discussed="" in="" this="" publication="" have="" been="" deposited="" in="" ncbi's="" gene="" expression="" omnibus(edgar="" et="" al,="" 2002)="" and="" are="" accessible="" through="" geo="" series="" accession="" number="">

Kvantitatīvā reversās transkripcijas PCR

Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar floretīnu (50 μM) 20 stundas un LPS stimulētas (100 ng/ml) 6 stundas. Līze tika veikta, izmantojot Qiazol Lysis reaģentu (Qiagen). RNS tika ekstrahēta, izmantojot RNeasy mini komplektu (Qiagen). RNS koncentrācija un kvalitāte tika noteikta ar nanopilienu spektrofotometru (Isogen Life Science). cDNS sintēze tika veikta, izmantojot Quanta qScript cDNA SuperMix (Quanta Biosciences) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. qPCR tika veikta ar StepOne-Plus" reāllaika PCR sistēmu (Applied Biosystems), izmantojot SYBR zaļo maisījumu, kas satur 1 × SYBR green (Applied Biosystems), 0,3 μM primerus (Integrated DNA Technologies), 12,5 ng cDNS bez ūdens un nukleāzes. Gēnu ekspresijas kvantitatīvai noteikšanai tika izmantota salīdzinošā Ct metode Dati tika normalizēti pēc stabilākajiem atsauces gēniem ciklīna A un hipoksantīna fosforiboziltransferāzes 1. Praimeru sekvences ir pieejamas pēc pieprasījuma.

Reaktīvo skābekļa sugu noteikšana

Šūnas 2 stundas iepriekš apstrādāja ar floretīnu (50 uM). Pēc tam šūnas tika stimulētas ar PMA (15 min, 100 ng/ml), un ROS ražošana tika mērīta, izmantojot fluorescējošu zondi 2',7'-dihlordihidrofluoresceīna diacetātu pie 10 μM PBS 30 minūtes. Fluorescence tika mērīta, izmantojot fluorescences FLUOstar optima mikroplašu lasītāju (BMG Labtech, Ortenberg, Vācija) (ierosme: 495 nm, emisija: 529 nm).

Slāpekļa oksīda mērījumi

Šūnas tika iepriekš apstrādātas ar floretīnu (50 μM) 2 stundas. Pēc tam šūnas tika stimulētas ar LPS (24 stundas, 100 ng / ml). NO tika netieši uzraudzīts, izmantojot Griess reaģenta nitrītu mērīšanas komplektu (Abcam). Īsumā, nitrāts reaģē ar sulfanilamīdu un N-(1-naftil)etilēndiamīna dihidrohlorīdu, veidojot rozā azo krāsvielu. Pēc tam šī azoatvasinājuma absorbcija tika mērīta pie 540 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (iMark, Bio-Rad).

Western blot

Šūnas tika apstrādātas ar floretīnu (5{{10}} μM) un LPS (100 ng/ml) 1 stundu vai 24 stundas, lai noteiktu attiecīgi AMPK aktivāciju vai p62, LC3 un Keapl proteīna līmeni. Šūnas tika lizētas, izmantojot RIPA buferšķīdumu (150 mM NaCl, 1 procents Triton X-100, 0,5 procenti nātrija deoksiholāta, 1 procents SDS, 50 mM Tris), un atdalītas ar nātrija dodecilsulfāta poliakrilamīda gēla elektroforēzi. Gēli tika pārnesti uz PVDF membrānu (VWR), un bloti tika bloķēti uz 1 stundu 5% liellopu seruma albumīna ar Tris buferšķīdumu, kas satur 0,1% Tween-20 (TBS-T). Membrānas tika zondētas ar primārajām antivielām nakti 4 °C temperatūrā, mazgātas ar TBS-T un inkubētas ar atbilstošo sekundāro mārrutku peroksidāzi iezīmēto antivielu 1 stundu istabas temperatūrā (RT). Imunoreaktīvie signāli tika noteikti ar pastiprinātu hemiluminiscenci (ECL Plus, Thermo Fisher), izmantojot Amersham Imager 680 (GE Healthcare Life Sciences). Joslu blīvumi tika noteikti, izmantojot ImageJ.

Imunofluorescence

Muguras smadzeņu kriosekcijas tika žāvētas gaisā un fiksētas ledusaukstā acetonā 10 minūtes - 20 grādu temperatūrā. Peļu BMDM tika kultivēti uz stikla vāka priekšmetstikliņiem un fiksēti ledusaukstā metanolā 10 minūtes -20 grādos. Sekcijas un BMDM tika bloķētas 30 minūtes, izmantojot Dako proteīna bloku (Agi-lent). Pēc tam tos nakti inkubēja 4"C temperatūrā ar primārajām antivielām, nomazgāja un inkubēja ar atbilstošām sekundārajām antivielām 1 stundu RT. Muguras smadzeņu audu attēli tika uzņemti, izmantojot Nikon Eclipse 80i mikroskopu (10x objektīvs) un NIS. Elements BR 3.10 programmatūra (Nikon). P62, LC3 un Keapl iekrāsotie BMDM attēli tika uzņemti, izmantojot Zeiss LSM 880 konfokālo mikroskopu, un tika koriģēti Airyscan (63× objektīvs).P62-un LC3- Pozitīvie punkti tika noteikti ar pusautomātiskās punktu analīzes attēluJ. Īsāk sakot, pēc tam, kad attēls tika izveidots binārs un šūnas tika atlasītas ar roku, punktus tika analizēti katrā šūnā. P62 un Keapl kolokalizācija tika veikta, izmantojot kolokalizācijas konveijeru programmā CellProfiler [31 Attēlos redzamie attēli ir digitāli uzlaboti.

Experimental autoimmune encephalomyelitis model Eleven-week-old C57BL/6JOlaHsd mice were immunized subcutaneously with 200 ng of myelin oligodendrocyte glycoprotein peptide(MOG35-55)emulsified in 100 ul complete Freund's supplemented with 4 mg/ml of Mycobacterium tuberculosis(EK2110, Hooke Laboratories). Im-mediately after MOG immunization and after 24 h, mice were intraperitoneally injected with 50 ng pertussis toxin (EK2110 kit, Hooke Laboratories) to induce EAE.EAE animals were treated daily with phloretin or vehicle(50 mg/kg, intraperitoneal (ip)) after 6 days of immunization (prophylactic setup)or after disease onset(clinical score>1, terapeitiskā iekārta). Peles katru dienu tika nosvērtas un novērtētas, lai noteiktu slimības neiroloģiskās pazīmes saskaņā ar ražotāja peles EAE vērtēšanas rokasgrāmatu: 0: nav klīnisku simptomu,0.5: astes gals ir mīksts, 1: ļengana aste , 1,5: astes un pakaļkājas novājēšana 2: ļengana aste un pakaļkāju vājums, 2,5: ļengana aste un pakaļkāju vilkšana, 3: ļengana aste un pilnīga pakaļkāju paralīze, 3,5: ļengana aste un pilnīga pakaļkāju paralīze kājas un pele nespēj noturēties uz sāniem, 4: diafragmas paralīze, 5: nāve no EAE.

Statistiskā analīze

GraphPad Prism tika izmantots, lai statistiski analizētu datus, kas ir attēloti kā vidēji ± sem D'Agostino un Pīrsona omnibus normalitātes tests tika izmantots, lai pārbaudītu normālu sadalījumu. Normāli sadalītiem datiem tika izmantots divu virzienu nepāra Studenta t-tests (ja nepieciešams, ar Velča korekciju). Mann-Whitney analīze tika izmantota datiem, kas neizturēja normalitātes testu.p-vērtības<0.05 were="" considered="" to="" demonstrate="" significant=""><><0.01,><0.001 and="" *p=""><>

Rezultāti

Transkripcijas izmaiņas, kas saistītas ar makrofāgu apstrādi ar floretīnu

Lai noteiktu iespējamo pretiekaisuma iedarbību un noteiktu floretīna ārstēšanas pamatā esošos mehānismus makrofāgos, mēs veicām RNS lielapjoma sekvencēšanu (papildu 1. att.). Ar floretīnu apstrādāto aktivēto makrofāgu ceļu analīze parādīja, ka atšķirīgi ekspresēti gēni bija pārāk pārstāvēti kanoniskajos ceļos, kas saistīti ariekaisums, piemēram, iNOS(z-score:-2.449), maksas uztvērējs(z-score:-2.236), interferona signalizācija (z-score:- 2), un akūtās fāzes reakcijas ceļš (z score:- 1.633) (1. A, B att.). Līdzīgi kā kanoniskā ceļa analīzē, RNS-seq datu augšupējā analīze paredzēja, ka floretīns samazina galveno pro-iekaisuma transkripcijas regulatoru aktivāciju, piemēram, IRF7 (z-score: 2,229), IRF1 (z-score: -2). 025) un STAT1 (z rezultāts:-2.022) (1. D attēls). Papildus makrofāgu pro-iekaisuma ceļu mazināšanai, ar floretīnu apstrādāto makrofāgu RNS-seq analīze parādīja, ka, starp citiem ceļiem, floretīns spēcīgi aktivizēja Nrf2 ceļu (z-score: 1,897), par ko liecina Nrf{35}}saistītā regulējuma regulēšana. gēni, piemēram, mafG un starpniekserveris (1.A, C att.). Vēl vairāk, Nrf2 (NFE2L2) tika identificēts kā visvairāk aktivētais augšējais transkripcijas regulators (z-score: 2,801), un ROS līmeņa regulēšana tika identificēta kā viena no visvairāk regulētajām bioloģiskajām funkcijām ar floretīnu apstrādātajos BMDM (z-score: 2,008). )(1. D, E att.). Kopumā atklājumi liecina, ka floretīns aktivizē Nrf2 un nomāc makrofāgu iekaisuma fenotipu.

Nrf2 ceļš kontrolē ar floretīnu apstrādāto makrofāgu fenotipu

Pēc tam mēs apstiprinājām floretīna pretiekaisuma iedarbību un noteicām, vai tas modulē makrofāgu iekaisuma fenotipu, iedarbojoties uz Nrf2. Samazināts ROS līmenis tika novērots ar floretīnu apstrādātiem WT BMDM, kas stimulēti ar PMA (2. att.). Turklāt ar floretīnu apstrādātos WT BMDM, kas stimulēti ar LPS, tika novērota samazināta NO ražošana un pro-iekaisuma gēnu NOS2, I-6, COX2 un I-12 mRNS līmenis (2.B, C att.). saistībā ar Nrf2 izšķirošo lomu mazāk iekaisuma fenotipa ierosināšanā, mūsu dati liecina, ka floretīns aktivizē Nrf2-reakcijas gēnus HO1 un NQO1 WT, bet ne Nrf2 KO BMDM, kas stimulēti ar LPS (2. att.). Turklāt floretīna apstrāde samazināja ROS veidošanos WT, bet ne Nrf2 KO BMDM (att. 2E). Tiek ziņots, ka ne tikai kontrolējot antioksidatīvās reakcijas, bet arī Nrf2 nomāc makrofāgu iekaisuma fenotipu [12]. Lai atbalstītu pēdējo, floretīns nespēja samazināt pro-iekaisuma gēnu NOS2, IL-6, COX2 ekspresiju. , un IL-12 aktivizētos Nrf2-deficītos BMDM (2. att. F). Kopumā šie rezultāti liecina, ka Nrf2 veicina floretīna izraisīto makrofāgu iekaisuma fenotipa maiņu.

Floretīns veicina AMPK aktivāciju

Floretīns ir precīzi definēts GLUT inhibitors, un jaunākie pētījumi uzsver GLUT mediētas glikozes uzņemšanas nozīmi makrofāgu aktivācijā [26,32]. Tādējādi mēs noteicām, vai floretīns var aktivizēt enerģijas sensoru AMPK, kas tiek aktivizēts zema enerģijas / glikozes līmeņa gadījumā. Mūsu rezultāti liecina, ka ārstēšana ar floretīnu izraisa AMPK fosforilēšanos un aktivāciju (3.A, B att.). Turklāt AMPK inhibitora BML-275 pievienošana lielā mērā novērš AMPK aktivāciju ar floretīnu apstrādātos BMDM (3.A un B att.). Vēl vairāk, mūsu atklājumi liecina, ka AMPK aktivācija ir būtiska, lai floretīns nomāktu ROS veidošanos, par ko liecina augstāks ROS līmenis BMDM, kas ārstēti gan ar floretīnu, gan ar AMPK inhibitoru, salīdzinot ar BMDM, kas ārstēti tikai ar floretīnu (3.C att.). Kopumā mūsu dati liecina, ka floretīna izraisītā AMPK aktivācija ir būtiska, lai virzītu makrofāgus uz mazāk iekaisuma fenotipu.

Floretīns stimulē autofagiju no AMPK atkarīgā veidā

Tā kā AMPK aktivācija ir saistīta ar katabolisko procesu aktivizēšanu, reaģējot uz barības vielu trūkumu [33], mēs pēc tam pētījām, vai floretīns var aktivizēt autofagiju. Autofagija ir konservēts katabolisks process, ko izraisa bads un citas stresa reakcijas, kas veicina vezikulās, ko sauc par autofagosomām, izdalīto intracelulāro kravu lizosomu noārdīšanos. RNS-seq analīze paredzēja autofagiju kā vienu no pakārtotajiem bioloģiskajiem procesiem, kas uzrādīja palielinātu aktivitāti ar floretīnu ārstētiem BMDM (z-score: 0.779) (4.A attēls). Turklāt ar floretīnu un autofagijas inhibitoru bafilomicīnu Al apstrādāto BMDM imūncitoķīmiskā analīze parādīja palielinātu autofagijas marķieru MAP1LC3/LC3 (ar mikrotubuliem saistītā proteīna 1 vieglā ķēde 3) un p62 uzkrāšanos, salīdzinot ar bafilomicīnu A1-(BMDM) ārstētiem BF. 4B-D), kas liecina par palielinātu autofagisko plūsmu, ārstējot ar floretīnu [34]. Pēc autofagijas indukcijas LC3 tiek pārveidots no LC3I formas uz lipīdu LC3I formu, kas korelē ar autofagosomu skaitu. Saskaņā ar to augstāks LC3II un p62 proteīna līmenis tika noteikts floretīna stimulētajos BMDM ar Western blot (4. E, F att.). Interesanti, ka šis p62 un LC3II pieaugums ar floretīnu tika novērsts, ārstējot BMDM ar AMPK inhibitoru BML-275 (4. E-F att.). Kopumā mūsu dati liecina, ka floretīns stimulē autofagiju no AMPK atkarīgā veidā.

Floretīns aktivizē Nrf2 ceļu caur autofagijas izraisītu Keap1 degradāciju

Mūsu dati liecina, ka floretīns aktivizē Nrf2 un stimulē autofagiju makrofāgos. Interesanti, ka autofagijas receptors p62 var konkurēt ar Nrf2 par saistīšanos ar Keapl, adapteri, kas normālos apstākļos veicina Nrf2 ubikvitināciju un degradāciju. Šī p62-mediētā Keap1/Nrf2 disociācija tādējādi novērsīs Nrf2 degradāciju un galu galā novedīs pie Nrf2 aktivācijas [35]. Šī iemesla dēļ mēs noteicām, vai floretīns veicina p62 / Keapl mijiedarbību, tādējādi aktivizējot Nrf2 ceļu. Šeit mēs parādām, ka floretīns aktivizē Nrf2 ceļu caur p62-mediētu Keapl degradāciju makrofāgos. Izmantojot augstas izšķirtspējas Airyscan kon-fokālo mikroskopiju apvienojumā ar kolokalizācijas analīzi, mēs parādām, ka floretīns stimulē p62 un Keapl mijiedarbību, par ko liecina palielināta kolokalizācijas parametra vērtība (Pīrsona koeficients) ar floretīnu apstrādātos BMDM (5.A att.). , B). Turklāt mūsu atklājumi liecina, ka ar floretīnu apstrādātajos BMDM ir zemāks Keapl proteīna līmenis, kas apstiprina Keapl degradāciju (5.C att.). Lai apstiprinātu, ka degradācija ir atkarīga no autofagijas, mēs pievienojām autofagijas inhibitoru bafilomicīnu A1 ar floretīnu apstrādātajam. BMDM. Interesanti, ka šo Keapl samazināšanos apvērsa ārstēšana ar bafilomicīnu Al (5. C att.). Šie rezultāti tika apstiprināti ar Western blot, parādot Keapl proteīna līmeņa samazināšanos ar floretīnu apstrādātos BMDM, ko novērsa bafilomicīns A1 (5D, E att.).

Phloretin reduces neuroinflammation in the EAE model To validate our findings in vivo, we investigated the impact of phloretin on the EAE model, the most commonly used animal model of MS, that is characterized by a pronounced macrophage-mediated inflammatory response in the CNS 5]. EAE animals treated with phloretin before disease onset showed reduced clinical scores compared to vehicle-treated animals (Fig. 6A). Importantly, even in a therapeutic setup, in which phloretin treatment was started after disease onset (clinical score>1), floretīns samazināja slimības smagumu (6.B attēls). Samazināta slimības smaguma pakāpe ar floretīnu ārstētiem dzīvniekiem bija paralēla iekaisuma gēnu MHCI samazinātai ekspresijai,

CD86,Nos2,TNFa,IL-6,CCL4, CCL5 un CXCL2 muguras smadzenēs (6. C attēls). Turklāt ar floretīnu ārstēto dzīvnieku muguras smadzenēs tika konstatēts samazināts F4/80tšūnu daudzums (6. E, F att.). Tā kā gan F4/80*mikroglija, gan F4/80* makrofāgi veicina neiroiekaisumu, padziļināta analīze parādīja, ka floretīns ievērojami samazināja F480 plus TMEMl daudzumu.{17}}

makrofāgi EAE pelēm (papildu 2. att. DF), kamēr tika novērota nenozīmīga tendence uz F480 plus TMEMl19 plus mikroglia samazināšanos. Saskaņā ar šo konstatējumu floretīns nomāca iekaisuma mediatoru veidošanos mikroglijā, bet šī nomākšana bija mazāk izteikta salīdzinājumā ar makrofāgiem (papildu 2. att. AC). Šie atklājumi liecina, ka EAE uzlabošanos ar floretīnu galvenokārt nosaka makrofāgi. Papildus iekaisuma gēnu ekspresijas samazināšanai floretīns palielināja pretiekaisuma un neirotrofisko faktoru, ti, IL-4, CNTF un IGF-1, ekspresiju EAE dzīvnieku muguras smadzenēs (6. D attēls). ). Šie atklājumi stingri norāda, ka floretīns samazina EAE slimības smagumu, virzot makrofāgus uz slimību atrisinošu fenotipu. Saskaņā ar mūsu iepriekšējiem in vitro atklājumiem mēs arī atklājām paaugstinātu Nrf2 signālu pārnešanu ar floretīnu ārstētu EAE dzīvnieku CNS, par ko liecina palielināta Nrf2 mRNS ekspresija un tā pakārtotie mērķi NQO1 un GPX1 (6. G att.). Kopumā šie dati liecina, ka floretīns nomāc neiroinflammāciju gan profilaktiskā, gan terapeitiskā vidē. Turklāt mūsu atklājumi liecina, ka floretīns var samazināt neiroiekaisumu, nomācot makrofāgu iekaisuma pazīmes, aktivizējot Nrf2.

Diskusija

Šajā pētījumā mēs parādām, ka floretīns no Nrf{1}}atkarīgā veidā virza makrofāgus uz mazāk iekaisuma fenotipu. Tika konstatēts, ka no AMPK atkarīga autofagijas aktivācija un sekojošā Keapl degradācija ir pamatā Nrf2 aktivācijai ar floretīnu. Turklāt mēs apstiprinām floretīna pretiekaisuma iedarbību EAE modelī, kur tas samazina slimības smagumu un atvieglo no makrofāgiem atkarīgo.neiroiekaisums.

Mēs parādām, ka floretīns nomāc makrofāgu iekaisuma fenotipu. Tas atbilst Wei-Tien Chang et al. kurš pierādīja, ka floretīnam piemīt pretiekaisuma īpašības makrofāgu šūnu līnijā [36]. Mēs parādām, ka šīs fenotipa maiņas indukcija ir atkarīga no Nrf2. Nrf2 ir galvenais antioksidatīvo reakciju regulators, un ir zināms, ka tā aktivizēšana virza makrofāgus pretī pretiekaisuma fenotipam [1l, 12, 37]. Turklāt vairākos pētījumos tika noteikts, ka Nrf2 aktivācija mazina neiroiekaisumus un neirodeģenerāciju CNS traucējumu gadījumā [{{10] }}]. Tomēr, lai gan mūsu atklājumi liecina, ka Nrf2 ir pamatā ar floretīnu apstrādātu makrofāgu fenotipa maiņai, RNS sekvencēšanas dati parādīja, ka starp Nrf2 aktivāciju citi ceļi tika regulēti. Jo īpaši interesants ir PPAR ceļa regulējums, pateicoties tā pretiekaisuma īpašībām un savstarpējai sarunai ar Nrf2 [41-45]. Turklāt, tā kā floretīns ir precīzi definēts GLUT inhibitors un pāreja uz glikolīzi ir būtisks metabolisma notikums makrofāgu aktivācijai, fenotipu izmaiņas daļēji var izraisīt arī floretīna tiešā metaboliskā ietekme uz šiem glikozes transportētājiem [46, 47]. Ir nepieciešami vairāk pētījumu, lai noteiktu PPAR nozīmi floretīna izraisītā Nrf2 aktivācijā un cik lielā mērā floretīna izraisīto imūnmodulāciju ietekmē tiešas vielmaiņas izmaiņas. Kopumā mūsu atklājumi skaidri parāda, ka Nrf2 aktivācijai ir būtiska loma floretīna mediētā fenotipa pārslēgšanā.

Mūsu atklājumi liecina, ka Nrf2 aktivācija ar floretīnu ir saistīta ar AMPK aktivāciju. AMPK ir izšķiroša loma šūnu enerģijas homeostāzes atjaunošanā spriedzes gadījumā, kas noārda ATP, kā rezultātā palielinās ADP: ATP attiecība, tādējādi ieslēdzot alternatīvus kataboliskos ceļus, kas ģenerē ATP, vienlaikus izslēdzot anaboliskos ceļus, kas patērē ATP [48]. Attiecīgi floretīns ir vispāratzīts GLUT inhibitors un pazemina glikozes līmeni šūnās [49-51]. Vairāki pētījumi parādīja, ka AMPK aktivācija makrofāgos izraisa imūnsupresīvu fenotipu, kas apstiprina mūsu rezultātus, kas liecina, ka AMPK aktivācija ir būtiska floretīnam, lai samazinātu iekaisumu [52, 53]. Mūsu dati atbilst arī iepriekšējiem pētījumiem, kuros ir pierādīts, ka floretīns aktivizē AMPK citos šūnu veidos, tostarp adipocītos un endotēlija šūnās [50, 54-56]. Floretīns var aktivizēt AMPK netieši, palielinot AMP un pazeminot ATP līmeni, jo AMP un ATP allostēriski stimulē vai kavē AMPK aktivāciju attiecīgi [48, 57]. Neskatoties uz to, CaMKK, kas ir kināze pirms AMPK, var veicināt AMPK aktivāciju, reaģējot uz paaugstinātu šūnu Ca2 plus līmeni, nemainot AMP/ATP līmeni [58]. Turklāt, ņemot vērā plašo mijiedarbības tīklu starp AMPK un augšup un lejup ceļiem, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu floretīna izraisītās AMPK aktivācijas pamatā esošo mehānismu.

Mūsu dati liecina, ka floretīna mediētā AMPK aktivācija stimulē autofagiju makrofāgos. Kā minēts iepriekš, AMPK aktivizēšana ir pašaizsardzības process, kura mērķis ir atjaunot šūnas enerģijas līdzsvaru [48]. Lai gan neviens pētījums nekad nav pierādījis, ka floretīns varētu stimulēt makrofāgu fenotipu, veicinot autofagiju, daži pētījumi tomēr ir pierādījuši floretīna ietekmi uz autofagijas ceļiem vēža šūnās un hepatocītos [59-61]. Turklāt dažādi pētījumi liecina, ka AMPK aktivācijas pakārtotie kataboliskie procesi var aktivizēt autofagiju [60, 62, 63]. Interesanti, ka, reaģējot uz glikozes badu, AMPK mediētā autofagija tiek ierosināta, fosforilējot svarīgu autofagijas iniciatoru unc{9}}, piemēram, autofagiju aktivizējošo kināzi [64,65]. Saistībā ar to mēs domājam, ka AMPK stimulē autofagiju, lai atjaunotu ATP no šūnu komponentiem, reaģējot uz floretīna izraisītu glikozes samazināšanos. Tomēr glikozes bads var arī aktivizēt autofagiju neatkarīgi no AMPK [66-68]. Tāpēc ir nepieciešams vairāk pētījumu, lai noteiktu, vai autofagijas aktivācija ar floretīnu notiek arī daļēji neatkarīgi no AMPK.

Nesenie pētījumi parādīja autofagijas nozīmi funkcionālā makrofāgu fenotipa vadīšanā. Šajā kontekstā autofagijas disregulācija makrofāgos ir īpaši saistīta ar aterosklerozes un neiroloģisko slimību rašanos [69-72]. Šeit mēs sniedzam saikni starp ārstēšanu ar floretīnu, autofagijas indukciju un Nrf2 aktivāciju, parādot, ka floretīns veicina Nrf2 aktivāciju, izmantojot p62-mediētu Keap1 degradāciju. Vēl nesen p62 puncta palielināšanās tika uzskatīta par samazinātas autofagijas pazīmi, jo pēc autofagijas aktivizēšanas p62 tiek noārdīts autofagosomās [34]. Saistībā ar to p62 uzkrāšanās ir saistīta ar autofagijas disfunkciju aterosklerozes bojājumos [73]. Tomēr pēdējos gados šis jēdziens ir apstrīdēts, un tagad tiek uzskatīts, ka p62 ir nepieciešams autofagosomu veidošanai un ka p62 līmeņa paaugstināšanās paralēli LC3Il puncta palielināšanai var būt autofagijas indukcijas pazīme [74]. Tāpēc kopā ar floretīna spēju aktivizēt AMPK un tā zināmo lomu autofagijas aktivācijā, mūsu rezultāti liecina, ka P62 un LC3 uzkrāšanās, ārstējot ar bafilomicīnu A1 floretīna stimulētos makrofāgos, ir saistīta ar palielinātu autofagisko plūsmu, nevis traucējumiem. autofagija. Interesanti, ka Lee Y et al. nesen parādīja, ka papildus Nrf2 aktivizēšanai p62 saistīšanās ar Keapl ir iesaistīta arī autofagosomu veidošanā, kas liecina, ka floretīna mediētā autofagijas aktivācija ir tieši saistīta ar palielinātu p62 aktivitāti, no vienas puses, bet arī ar lielāku Keapl-p62 mijiedarbību, no otras puses. 75]. Keapl ir Cullin-3-bāzētas ubikvitīna ligāzes adapteris, kas homeostatiskos apstākļos veido homodimēru ar Nrf2, tādējādi veicinot Nrf2 ubikvitināciju un proteasomu degradāciju [76]. Keapl-Nrf2 kompleksa pārtraukšana noved pie Nrf2 stabilizācijas un pārvietošanas uz kodolu [77, 78]. Ir labi dokumentēts, ka šī kompleksa izjaukšana notiek, vai nu pārveidojot Keapl cisteīna atlikumus ar elektrofīlām molekulām, mazām molekulām tiešā veidā mijiedarbojoties ar Keapl, vai arī ar p62-mediētu Keapl degradāciju [35]. Ying Y et al., pamatojoties uz in silico eksperimentiem, ierosina tiešu floretīna un Keapl mijiedarbību, kas pēc tam noved pie Nrf2 ceļa aktivizēšanas kardiomiocītu šūnu līnijā [79]. Šeit mēs izveidojām papildu ar autofagiju saistītu mehānismu, ar kuru floretīns aktivizē Nrf2.

Izmantojot EAE modeli, mēs noskaidrojām, ka floretīns mazina neiroiekaisumu in vivo. Mūsu dati liecina, ka floretīns uzlabo EAE, nomācot makrofāgu izraisīto iekaisuma reakciju un aktivizējot Nrf2 ceļu. Tika ziņots, ka citos slimību modeļos floretīnam ir arī neiroprotektīvas un imūnmodulējošas īpašības. Jo īpaši tika konstatēts, ka floretīns aktivizē Nrf2 ceļu smadzenēs smadzeņu išēmijas gadījumā un samazina beta amiloīda uzkrāšanos žurku Alcheimera slimības modelī [80-84]. Floretīns var ietekmēt arī citas imūnās šūnas in vivo, jo ir konstatēts, ka šis savienojums inhibē T šūnu un dendritisko šūnu aktivāciju in vitro [85, 86]. Ņemot vērā, ka EAE modelī neiroinflammācija nav tikai makrofāgu atkarīga, būtu interesanti noteikt, cik lielā mērā neiroiekaisuma samazināšanos veicina citas imūnās šūnas. Saistībā ar to, lai gan mūsu dati liecina, ka EAE uzlabošanos galvenokārt virza makrofāgi un tā ir mazāk atkarīga no mikroglia modulācijas, ir nepieciešami turpmāki eksperimenti, lai noskaidrotu, cik lielā mērā floretīns ietekmē mikrogliju neiroiekaisuma slimībās. Kopumā mūsu atklājumi liecina, ka floretīns samazina neiroiekaisumu, ietekmējot makrofāgu fenotipu, parādot floretīna terapeitisko potenciālu neiroinflammatorisku traucējumu gadījumā.

Secinājumi

Mūsu pētījums parāda, ka floretīns ir spēcīgs imūnmodulējošs līdzeklis, kas modulē makrofāgu iekaisuma īpašības neiroiekaisuma traucējumos. Lai vadītu šo fenotipa maiņu, tika izveidota Nrf2 ceļa aktivizēšana, ko izraisīja no AMPK atkarīga autofagijas aktivizēšana un sekojoša Keapl degradācija. Tādējādi floretīns ir daudzsološs dabiski sastopams līdzeklis, ko var izmantot, lai samazinātu neiroiekaisuma slimību, piemēram, MS, iekaisuma slogu.

Atsauces

1. Zeng Y, Peng Y, Tang K, Wang YQ, Zhao ZY, Wei XY u.c. Dihidromiricetīns uzlabo putu šūnu veidošanos, izmantojot LXRalpha-ABCA1/ABCG1-atkarīgo holesterīna izplūdi makrofāgos. Biomed Pharmacother. 2018; 101:543–52. https://doi.org/10.1016/j.biopha.2018.02.124.

2. Xia M, Hou M, Zhu H, Ma J, Tang Z, Wang Q u.c. Antocianīni izraisa holesterīna izplūdi no peles peritoneālās makrofāgiem: peroksisomu proliferatora aktivētā receptora {gamma}-aknu X receptora {alfa}-ABCA1 ceļa loma. J Biol Chem. 2005;280(44):36792–801. https://doi.org/10.{11}}/jbc.M505047200.

3. Chang YC, Lee TS, Chiang AN. Kvercetīns uzlabo ABCA1 ekspresiju un holesterīna izplūdi, izmantojot ap38-atkarīgo ceļu makrofāgos. J Lipid Res. 2012;53(9):1840–50. https://doi.org/10.1194/jlr.M024471.

4. Grajchen E, Hendriks JJA, Bogie JFJ. Putojošo fagocītu fizioloģija multiplās sklerozes gadījumā. Acta Neuropathol Commun. 2018; 6(1):124. https://doi. org/10.1186/s40478-018-0628-8.

5. Bogie JF, Stinissen P, Hendriks JJ. Makrofāgu apakšgrupas un mikroglia multiplās sklerozes gadījumā. Acta Neuropathol. 2014;128(2):191–213. https://doi.org/1 0.1007/s00401-014-1310-2.

6. Baecher-Allan C, Kaskow BJ, Weiner HL. Multiplā skleroze: mehānismi un imūnterapija. Neirons. 2018;97(4):742–68. https://doi.org/10.1016/j. neirons.2018.01.021.

7. Bogie JFJ, Grajchen E, Wouters E, Corrales AG, Dierckx T, Vanherle S u.c. Stearoil-CoA desaturāze-1 pasliktina makrofāgu un mikrogliju reparatīvās īpašības smadzenēs. J Exp Med. 2020;217(5).

8. Bogie JF, Stinissen P, Hellings N, Hendriks JJ. Mielīna fagocitozējošie makrofāgi modulē autoreaktīvo T šūnu proliferāciju. J Neiroiekaisums. 2011;8(1):85. https://doi.org/10.1186/1742-2094-8-85.

9. Bogie JF, Timmermans S, Huynh-Thu VA, Irrthum A, Smeets HJ, Gustafsson JA u.c. No mielīna iegūtie lipīdi modulē makrofāgu aktivitāti, aktivizējot aknu X receptorus. PLoS One. 2012;7(9):e44998. https://doi.org/10.1371/ journal.pone.0044998.

10. Bogie JF, Jorissen W, Mailleux J, Nijland PG, Zelcer N, Vanmierlo T u.c. Mielīns maina makrofāgu iekaisuma fenotipu, aktivizējot PPAR. Acta Neuropathol Commun. 2013;1(1):43. https://doi.org/10.1186/2 051-5960-1-43.