Gaismas jutīgie pro-zāļu nanokomplekti, kas satur ķīmijterapijas miega funkciju, pastiprina vēža imūnterapiju

Abstrakts

Imunoterapija apvienojumā ar efektīvām terapijām, piemēram, ķīmijterapiju un fotodinamisko terapiju, ir veiksmīga stratēģija, lai aktivizētu pretvēža imūnās atbildes, lai uzlabotu pretvēža ārstēšanu. Tomēr daudzfunkcionālu bioloģiski noārdāmu, bioloģiski saderīgu, zemu toksisku, bet ļoti efektīvu un klīniski pieejamu pārveidotu nanoimūnstimulatoru izstrāde joprojām ir izaicinājums un ir ļoti pieprasīts. Šeit mēs ziņojam un izstrādājam jaunus nesējus nesaturošus fotoķīmijterapijas nanopreparātus COS-BA/Ce6 NP, apvienojot trīs daudzfunkcionālus komponentus, pašsamontētu dabisko mazu molekulu betulīnskābi (BA), ūdenī šķīstošu hitozāna oligosaharīdu (COS), un zemu toksisku fotosensibilizatoru hloru e6 (Ce6), lai palielinātu imūnadjuvanta anti-PD-L1-mediētās vēža imūnterapijas pretvēža efektivitāti. Mēs parādām, ka izstrādātajām nanozālēm bija gudra un atšķirīga "miega" īpašība ķīmijterapijas efektā ar vēlamo zemāku citotoksicitāti un vairākas labvēlīgas terapeitiskās īpašības, tostarp uzlabota 1 O2 paaudze, ko izraisīja samazinātā Ce6 enerģijas atšķirība, pH reakcija, laba bioloģiskā noārdīšanās un biosaderība, nodrošinot ļoti efektīvu, sinerģisku fotoķīmijterapiju. Turklāt, ja to apvieno ar anti-PD-L1 terapiju, gan uz nanomontāžas balstīta ķīmijterapija, gan ķīmijterapija/fotodinamiskā terapija (PDT) varētu efektīvi aktivizēt pretvēža imunitāti, ārstējot primāros vai attālos audzējus, paverot potenciāli pievilcīgas iespējas klīniskai imūnterapijai.

Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības

ATSLĒGVĀRDI

Vēža imūnterapija; nanoimūnstimulatori; Ķīmijterapijas miera stāvoklis; Pro-narkotiku; Pašmontāža; Dabiska maza molekula; Betulīnskābe; Fotodinamiskā terapija

1. Ievads

Vēža imūnterapija, piemēram, imūnās kontrolpunkta blokādes stratēģija, izmantojot PD-L1 vai CTLA-4, lai apkarotu vēzi, aktivizējot saimniekorganisma imūnsistēmu, neapšaubāmi ir mainījusi vēža ārstēšanu1,2. Diemžēl vājā imūnā atbilde un neefektīvā terapeitiskā iedarbība ievērojami ierobežoja tās klīniskās izredzes 3, 4. Nesen pašreizējie pētījumi atklāja, ka imūnterapijas kombinācija ar citām metodēm, piemēram, ķīmijterapiju5, fotodinamisko terapiju (PDT)6, fototermisko terapiju (PTT)7 un staru terapiju8, var efektīvi izraisīt pretvēža imunogenitāti, izraisot vēža šūnu imunogēnu šūnu nāvi. ICD)9, kas liecina par imūnmodulācijas potenciālu, lai aktivizētu pretvēža imūnās atbildes. Daudzi novatoriski nanomateriālu modeļi, kuru pamatā ir šīs imūnterapijas stratēģiju sinerģiskas kombinācijas, ir panākuši ievērojami uzlabotu pretvēža aktivitāti, tostarp neorganiskās10, polimēru11 un biomimētiskās12 nanodaļiņas (NP). Tomēr daudzfunkcionālu bioloģiski noārdāmu, bioloģiski saderīgu, zemas toksicitātes, bet ļoti efektīvu un klīniski pieejamu pārveidotu nanoimūnstimulatoru izstrāde joprojām ir liels izaicinājums un milzīgs pieprasījums. Dabiski bioloģiskie materiāli, piemēram, nukleīnskābes13, olbaltumvielas12, peptīdi14,15 un mazmolekulārie dabiskie produkti16,17 to raksturīgo priekšrocību (piemēram, biosaderības, netoksicitātes) dēļ, ir izraisījuši ievērojamu pētniecisko interesi medicīnā. Īpaši pēdējos gados ir secīgi atklātas pretvēža bioaktīvās terpenoīdu dabiskās mazās molekulas (NSM), kurām ir pašsavienošanās funkcija 18, 19. Piemēram, betulīnskābe (BA), ergosterols (ET) un abietīnskābe (AA) var pašas savākties mikronu vai nanostrukturētās daļiņās. Šie NSM ir pievilcīgi celtniecības bloki, ko izmantot, lai izstrādātu pretvēža līdzekļus sinerģiskai ķīmijterapijai un PDT. Ir pierādīts, ka tiem piemīt ievērojamas priekšrocības, ko sniedz viegla nano izgatavošana, labāka bioloģiskā saderība un bioloģiskās noārdīšanās, zemāka toksicitāte ar samazinātu aknu bojājumu un augsta sinerģija pretvēža terapijā20e23. Tas nodrošina daudzsološas alternatīvas klīniski pieejamu translējamu nanoimūnstimulatoru izstrādei sinerģiskai imūnterapijai. Tomēr šo NSM kopumā spēcīgākā lipofilitāte izraisīja neefektīvu šūnu endocitozi, kas vājināja to pretvēža aktivitāti un ierobežoja to klīnisko vērtību vēža ārstēšanā24. Līdzīgi kā parasti ziņotie nanokompozītmateriāli, atbilstošās NSM nanoformulas veicināja šūnu uzņemšanu, lai uzlabotu ķīmijterapijas efektus, bet arī netīši palielināja nespecifiskas citotoksicitātes risku normālām šūnām22. Tāpēc par to, kā maksimāli palielināt terpenoīdu NSM nanoaģentu pretvēža efektivitāti, vienlaikus samazinot tā toksicitāti normāliem audiem, ir vērts padomāt par būtisku jautājumu sinerģiskās imūnterapijas procesā.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

Pro-zāļu stratēģijas ir plaši izmantotas, lai uzlabotu lipofīlo mazo molekulu uzņemšanu šūnās, palielinot hidrofilitāti25. Parasti amfifilajām zālēm ir īpaši augstāka šūnu uzņemšanas efektivitāte nekā hidrofilajām vai lipofīlajām zālēm26. Jo augstāka ir šūnu fagocitoze, jo labāka ir terapeitiskā efektivitāte24. Tādējādi amfifilo terpenoīdu NSM pro-zāļu molekulu izstrāde var būt potenciāla metode to terapeitiskās iedarbības palielināšanai. Turklāt uz stimuliem reaģējošas nanozāles pret specifisko audzēja mikrovidi (piemēram, skābes, redoksreakcijas spējas) ir lielas cerības kontrolēt zāļu izdalīšanos, kas ir izdevīga ķīmijterapijas zāļu citotoksicitātes nomākšanai 27, 28. Tikmēr supramolekulārā apvienošana (piemēram, atkārtotas nogulsnēšanas pieeja) bija efektīva stratēģija, lai sagatavotu ūdenī ļoti šķīstošus nesējus nesaturošus nanozāles 22, 29, kas varētu nedaudz samazināt amfifilo NSM fagocitozes efektivitāti zināmā mērā, tādējādi mazinot to pre- izstrādāta citotoksicitāte. Mēs izvirzām hipotēzi, ka uz stimuliem reaģējošas un pilnībā hidrofīlas nanozāles tika tālāk izveidotas, pamatojoties uz amfifīlo NSM priekšzāļu un var efektīvi nomākt tā nespecifisko citotoksicitāti normālām šūnām, vienlaikus stimulējot ļoti toksisku amfifīlo NSM izdalīšanos audzēja šūnās, atvieglojot to miera stāvokli normālos audos un aktivācija audzēja vietā. Ir svarīgi izvēlēties piemērotu ūdenī šķīstošu un uz stimuliem reaģējošu prekursoru, lai modificētu terpenoīdu NSM, lai sagatavotu amfifilās priekšzāļu molekulas. Jau gadiem ilgi hitozāna oligosaharīdiem (COS), kā hitozāna noārdītajiem produktiem, ir ne tikai laba šķīdība ūdenī un bagātīgas eOH oreNH2 grupas, kas nodrošina labu pH reakciju, bet arī labvēlīga pretvēža iedarbība, uzlabojot saimnieka imūno funkciju, regulējot aktivitāti. imūnās šūnas, piemēram, monocītu makrofāgi un limfocīti30,31. Tie garantē milzīgu iespēju izveidot uz stimuliem reaģējošus mērķa nano imūnstimulatorus sinerģiskai imūnterapijai.

Šeit, pamatojoties uz iepriekš minētajiem apsvērumiem, mūsu eksperimentālajā projektā betulīnskābes (BA) pentacikliskais triterpēna NSM tiek izmantots kā spēcīgs pretvēža līdzeklis32, COS tika ieviests, lai sintezētu amfifilu COS-BA molekulu, lai uzlabotu ķīmijterapijas efektu. Hlors e6 (Ce6), plaši izmantots fotosensibilizators ar ļoti zemu/bez tumšu toksicitāti33, tika izmantots, lai izveidotu pilnībā ūdenī šķīstošu nesēju nesaturošu gaismjutīgu priekšzāļu COS-BA/Ce6 NP, izmantojot tiešu kopsalikšanas stratēģiju. COS-BA/Ce6 NP apvienoja divas terapeitiskās metodes, ķīmijterapiju un fotodinamisko terapiju (PDT), kas var efektīvi palielināt no audzēja atvasinātu antigēnu parādīšanos T šūnās, radot spēcīgas imunoloģiskas atbildes ar imūnadjuvanta anti-PD-L1 palīdzību. izraisīt ļoti efektīvu un sinerģisku pretaudzēju ķīmijterapiju/PDT/imūnterapiju (1. shēma). Inženierijas COS-BA/Ce6 NP uzrādīja gudru miera funkciju ar mānīgu ķīmijterapijas efektu, ti, neapstaroti kopā samontēti NP uzrādīja ievērojami inhibētu citotoksicitāti in vitro salīdzinājumā ar amfifīlo COS-BA gan pret vēzi, gan pret normālām šūnām. Attiecinot uz atšķirīgo pH reaģējošo uzvedību, tas veic zemu toksicitāti un bioloģisko drošību normāliem audiem in vivo, bet ir ļoti toksisks audzēja audiem, jo ​​vāji skābā audzēja mikrovidē tiek stimulēta hiperaktīvā COS-BA izdalīšanās34. Cik mums zināms, pašlaik joprojām reti tiek ziņots par izstrādātajām nanozālēm, kurām ir šī ķīmijterapijas miega funkcija. Tikmēr nanozālēm ir vairākas labvēlīgas terapeitiskās īpašības, piemēram, uzlabota 1 O2 ģenerēšana, samazinot Ce6 enerģijas plaisu (DEST), ātra bioloģiskā vielmaiņa un pastiprināta audzēja uzkrāšanās, kas noveda pie efektīvas un drošas pretvēža ķīmijterapijas un PDT ārstēšanas kombinācijas. Vēl svarīgāk ir tas, ka gan uz NP balstīta ķīmijterapija, gan ķīmijterapijas / PDT sistēmas varētu efektīvi aktivizēt pretvēža imunitāti, veicinot TNF-a un IFN-g ražojošo CD8þ T šūnu proliferāciju primārajos vai attālos audzējos. Mūsu ierosinātā bioloģiski noārdāmā, bioloģiski saderīgā, unikāli neaktīva, bioloģiski droša un ļoti efektīva fotoķīmijterapijas nanozāle nodrošina nozīmīgas sistēmiskas imūnās terapeitiskās atbildes, paverot pievilcīgas iespējas klīniskai izmantošanai attālas vai metastātiskas vēža terapijas ārstēšanā.

1. shēma PDT un kopīgi samontētu COS-BA/Ce6 NP ķīmijterapija pastiprināja anti-PD-L1, lai izraisītu sistēmisku pretvēža imūnterapiju. Ūdenī šķīstoša COS ieviešana var efektīvi uzlabot BA (attēlota kā puszobens) ķīmijterapijas aktivitāti, kā rezultātā veidojas hiperaktīvs COS-BA amfifils priekšzāles (garais zobens). Samontējot kopā ar fotosensibilizatoru Ce6 (mašīnes), čaulas strukturētajiem un pH jutīgajiem nano mezgliem bija gudra un atšķirīga "miega" funkcija ar inhibētu ķīmijterapijas toksicitāti normāliem audiem. Bet, tiklīdz tas nonāks un to stimulēs skābā (Hþ) audzēja mikrovide, augsti aktīvais amfifilais priekšzāles COS-BA tiks atbrīvots, kā rezultātā tiks veikta nozīmīga ķīmijterapija. Turklāt konstruētajiem kopkomplektiem bija lieliska PDT aktivitāte ar pastiprinātu singleta skābekļa (1 O2) veidošanos, ko izraisīja samazinātā enerģijas atstarpe starp Ce6 singleta un tripleta ierosinātajiem stāvokļiem (DEST). Apvienojumā ar anti-PD-L1 kontrolpunkta blokādi ar audzēju saistītu antigēnu izdalīšanās pēc ķīmijterapijas/PDT terapijas var efektīvi aktivizēt sistēmisku pretvēža imūnreakciju attālā vēža imūnterapijai.

2. Materiāli un metodes

2.1. COS-BA sintēze

Betulīnskābe (40 mg, 0,1 mmol), EDC (38 mg, 0,2 mmol) un NHS (17 mg, 0,15 mmol) ) tika izšķīdināti 3 ml N,N-dimetilformamīda (DMF). Pēc maisīšanas istabas temperatūrā 3 0 min, maisījumam viegli pa pilienam pievienoja 96 mg COS ūdens šķīduma (1 ml) un maisīja 24 stundas. Pēc tam reakcijas maisījumu atšķaida ar CH2Cl2 un vairākkārt ekstrahēja. CH2Cl2 slānis tika iztvaicēts un attīrīts uz silikagela kolonnas. Nereaģējušais BA sākotnēji tika noņemts, izmantojot petrolēteri: acetonu (5:1, tilpums/tilpums) kā eluentu, un pēc tam mainīts uz 3:1, lai iegūtu baltu COS-BA (raža: 42%), kur COS tika identificēts kā dimērs ( n Z 2). 1H KMR (40{{70} MHz, CDCl3) d: 8,98 (1H, s, BA-28O]CeNH), 4,73 (1H, s, H -29a), 4,60 (1H, s, H-29b), 3,18 (1H, dd, JZ 4,8, 10,8 Hz, H-3), 2,95e3,93 (8H, m, COS), 2,64 (3H, s, CH3eCOS), 0,76 (3H, s, H-24), 0,83 (3H, s, H{65}}), 0,90 (3H, s, H{ {69}}), 0,97 (3H, s, H-26), 0,98 (3H, s, H-27), 1,70 (3H, s, H{81}}). 13C KMR (100 MHz, CDCl3) d: 179,18 (CO, COS), 156,43 (C{89}}), 150,97 (C{92}}), 109,03 (C{95}}), 78,74, 77,04 . 04., 36.39, 35.31, 34.21, 31.81, 31.54, 31.17, 30.28 , 29.09, 27.80, 27.22, 25.74, 25.53, 20.91, 19.48, 18.12, 16.02, 15.87, 15.17, 14.65, 14.62. ESIeMS m/z: 814,5871 [M‒6H] (C44H72N2O12).

2.2. COS-BA/Ce6 NP sagatavošana

Kopīgi samontētie COS-BA / Ce6 NP tika sagatavoti ar viena posma atkārtotas nogulsnēšanas metodi. Parasti vispirms sajauca 5 ml Ce6 (33 mmol/L) un 40 ml COS-BA (33 mmol/L) DMSO šķīdumu. Pēc tam maisījumu ātri injicēja 1 ml ūdens, kas satur 10 ml NaOH (50 mmol/L), veicot ultraskaņu (KQ-250E, ShuMei, Kunshan, Ķīna). Pēc 10 minūšu ilgas apstrādes ar ultraskaņu COS-BA/Ce6 NP tika iegūti, 25 minūtes centrifugējot pie 13,000 apgr./min (TGL-16G, Xiangyi, Changsha, China). Citi preparāti ar dažādām COS-BA un Ce6 attiecībām tika sagatavoti ar to pašu procedūru ar nemainīgu NaOH un Ce6 molāro attiecību 3:1.

2.3. Šūnu līnijas

Cilvēka MCF-7, HepG2, LO2 un peles 4T1, L929 šūnu līnijas nodrošina Bioķīmijas un šūnu bioloģijas institūts, SIBS, CAS (Ķīna). MCF-7, HepG2 un LO2 kultivēja DMEM barotnē ar 10% liellopu augļa serumu (FBS, Gibco) un 1% penicilīna-streptomicīna antibiotiku (Life Technology, ASV) 37 C temperatūrā. 4T1 un L929 tika kultivēti RMPI-1640 vide ar tādu pašu attiecību kā iepriekš.

2.4. Šūnu uzņemšanas un endocītu ceļu pētījumi

Lai pētītu šūnu uzņemšanu, 4T1 vai LO2 šūnas tika inkubētas ar brīviem Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP (ekvivalentā Ce6 koncentrācija: 1,7 mg/mL, COS-BA: 19,5 mg/mL, BA: 10 .8 mg/mL) dažādiem laikiem. Pēc mazgāšanas, fiksēšanas un DIPA (#D9542, Sigma) krāsošanas šūnas tika attēlotas fluorescējošā apgrieztā mikroskopā (FIM) (DSY-2000X, UP Optotech, Čančuņa, Ķīna). Fluorescences intensitāte tika noteikta, izmantojot plūsmas citometriju, izmantojot Guava EasyCyte mini sistēmu (Merck Millipore, Vācija). Lai kvantitatīvi noteiktu uzņemšanas efektivitāti, BA un COS-BA uzkrāšanās šūnās tika mērīta, izmantojot HPLC (Agilent 1200, ASV). Parasti 4T1 šūnas tika apstrādātas ar brīvu COS-BA vai BA (ekvivalents BA: 25 mg / ml) 0, 5 un 3 stundas. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnu granulas tika novāktas un tika pakļautas ultraskaņas homogenizācijai (JY92-IIN, Scientz Biotechnology, Ningbo, Ķīna), lai veiktu šūnu līzi. Pēc tam COS-BA vai BA tika ekstrahēts ar hloroformu HPLC analīzei pēc paraugu liofilizēšanas. Kustīgā fāze bija ūdens (0,2% fosforskābe) un acetonitrils ar plūsmas ātrumu 1,0 ml/min, un atbilstošās tilpuma attiecības bija attiecīgi 60:40 un 15:85 (v/v) COS-BA un BA analīzei. . Noteikšanas viļņa garums bija 213 nm. Lai pētītu COS-BA/Ce6 NP endocītu ceļus, 4T1 šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs un inkubētas 24 stundas, pēc tam 30 minūtes iepriekš apstrādātas ar dažādiem endocitozes inhibitoriem, ieskaitot mikropinocitozes inhibitoru [50 mmol/L , etilizopropilamilorīds (EIPA) (#N132356, Aladdin)], klatrīna mediētais endocitozes inhibitors [20 mmol/L, hlorpromazīns (#C7010, Solarbio)], kaveola mediētais endocitozes inhibitors [25 mmol/L, nistatīns ( #IN0260, Solarbio)], un lizosomu paskābināšanas inhibitors [50 mmol/L, hlorokvīna fosfāts (#C9720, Solarbio)]35. Pēc tam šūnas 2 stundas tālāk kultivēja ar 2 ml COS-BA / Ce6 NP (Ce6: 1,7 mg / ml, COS-BA: 19,5 mg / ml) un attēloja ar FIM (UP Optotech). Šūnas, kas inkubētas bez endocītiskā inhibitora 37 ° C temperatūrā, tika iestatītas kā kontrole un zemas temperatūras inkubācija (4 ° C), lai novērtētu no enerģijas atkarīgo endocitozi. Tikmēr šūnu vidējā fluorescences intensitāte tika noteikta arī ar plūsmas citometriju.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2.5. Citotoksicitātes tests

4T1 šūnas tika iesētas 96-iedobes plāksnē. Pēc tam šūnas 24 stundas apstrādāja ar dažādām COS-BA NP koncentrācijām. Pēc tam iedobei pievienoja 10 ml MTT (#M158055, Aladdin) krāsas (5 mg/ml) un inkubēja vēl 4 stundas, un pēc tam pievienoja 150 ml DMSO, lai izšķīdinātu formazāna kristālus. . Katras iedobes absorbcija pie 492 nm tika reģistrēta ar mikroplašu lasītāju. Apstarošanas grupai šūnas 4 stundas apstrādāja ar zālēm, pēc tam 10 minūtes apstaroja ar 675  10 nm gaismu un inkubēja vēl 20 stundas. COS-BA/Ce6 NP citotoksicitāte (1 mg/ml Ce6 atbilst 11,5 mg/ml COS-BA un 6,4 mg/mL BA) pret citām šūnām (MCF-7, HepG2, LO2 un L929) tika noteikti arī ar to pašu MTT testu tikai ar citu barotni. Tikmēr kombinācijas indeksu aprēķināja programmatūra CompuSyn 2.0, izmantojot Chou Talalay teorēmas aprēķinu36.

2.6. Dzīvnieku modeļi

Visas eksperimentālās procedūras tika veiktas saskaņā ar Harbinas Medicīnas universitātes Dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas apstiprinātajiem protokoliem. 4T1 šūnas tika suspendētas RMPI-1640 barotnē un subkutāni injicētas katras BALB/c peles (18 e22 g, 6 e7 nedēļas) mugurā.

2.7. In/ex vivo fluorescences attēlveidošana

Pelēm ar audzēju caur astes vēnu tika ievadīts 200 ml COS-BA/Ce6 NPs 5% glikozes šķīduma (ekvivalents Ce6: 0,35 mg/ml, COS-BA: 4,02 mg/ml). Pēc tam audzēju vietu fluorescences attēlveidošana iepriekš noteiktā laikā tika veikta, izmantojot AniView 100/600 vairāku modeļu in vivo dzīvnieku attēlveidošanas sistēmu (Guangzhou Biolight Biotechnology Co., Ltd., Ķīna) ar ierosmi pie 630 nm. Pēc 24 stundām pēc injekcijas galvenie orgāni (sirds, aknas, liesa, plaušas un nieres) un audzējs tika savākti ex vivo fluorescences attēlveidošanai. Turklāt tika novērtēti arī audzēju un galveno orgānu ex vivo fluorescences attēli dažādos laikos pēc Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP iv injekcijas.

2.8. In vivo ķīmijterapija/PDT

4T1-nesošās peles (75e100 mm3 ) nejauši iedala sešās grupās (n Z 5): 1) 5% glikozes šķīdums; 2) Ce6; 3) Ce6 ar apstarošanu; 4) COS-BA (40,2 mg/kg, kur BA: 22,3 mg/kg); 5) COS-BA/Ce6 NP; 6) COS-BA/Ce6 NP ar apstarošanu. Katrai grupai pelēm caur astes vēnu 0., 2. un 4. dienā injicē 200 ml COS-BA/Ce6 NP (ekvivalents Ce6: 3,5 mg/kg ķermeņa). Apstarošanas grupām 4 h. pēc injekcijas pēc katras ievadīšanas visas peles tika anestēzētas ar izoflurānu, un audzēja vietas 15 minūtes apstaroja ar 675  10 nm (150 mW/cm2) gaismu. Audzēju apjomu un peļu ķermeņa svaru reģistrē arī katru otro dienu. Audzēju tilpumus aprēķina pēc formulas: VZ platums2 garums/2. Pēc 14 ārstēšanas dienām audzēji tika izgriezti un nosvērti, lai aprēķinātu audzēja inhibīcijas koeficientu (TIR) ​​pēc parasti izmantotā vienādojuma: TIRZ (1 paraugs/kontrole) 100%. Kur paraugs un kontrole bija attiecīgi katras apstrādātās grupas un 5% glikozes ūdens šķīduma grupas vidējais audzēja svars.

2.9. In vivo ķīmijterapija/PDT/imūnterapija

Lai parādītu COS-BA / Ce6 NP potenciālu kombinācijā ar imūnterapiju, divpusējais audzēja modelis tika izstrādāts, subkutānu 4T1 šūnu injekciju ceļā kreisajā un labajā pusē. Kad audzēji tuvojās 75e100 mm3, peles tika sadalītas piecās grupās. (1) kontrole; (2) COS-BA/Ce6 NP (COS-BA Z 40,2 mg/kg, kur BA Z 22,3 mg/kg); (3) COS-BA/Ce6 NPs þ gaisma; (4) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PDL1; (5) COS-BA/Ce6 NPs þ anti-PD-L1 þ gaisma. 0. dienā pelēm iv injicēja 200 ml 5% glikozes šķīduma (1. grupa) vai COS-BA/Ce6 NP (Ce6 Z 3,5 mg/kg) (2., 3., 4., 5. grupa). Pēc 4 stundām pēc injekcijas 3. un 4. grupas labie audzēji tika apstaroti 15 minūtes. Peles tika anestēzētas ar izoflurānu un velmētas vienā pusē, lai izvairītos no kreiso audzēju atsegšanas. Pēc tam anti-PD-L1 antiviela (BioXcell, produkta numurs: BE0101, klona numurs: 10F.9G2) tika iv injicēta 4. un 5. grupas pelēm 2., 4. un 6. dienā (15 mg vienai pelei vienā injekcijā). Katra audzēja garums un platums tika uzraudzīti katru otro dienu. Pēc 14 dienu ilgas ārstēšanas tika savākts peļu asins serums, lai novērtētu gamma interferonu (IFN-g) (#KMC4021) un audzēja nekrozes faktoru (TNF-a) (#BMS607-3), izmantojot ELISA testu (eBioscience). ). Audzēji tika savākti, atdalīti, apstrādāti ar sarkano asins šūnu līzes buferi un mazgāti ar PBS, centrifugējot. Pēc tam šūnu suspensija tika iekrāsota ar anti-CD3-FITC (#MA1-10187, klons 145-2C11, eBioscience) un anti-CD8a-PE (#12-0081-85, klons 53-6.7, eBioscience). Pēc tam citotoksiskā T limfocītu (CTL) infiltrācija labajā un kreisajā audzējā pēc dažādām ārstēšanas metodēm tika novērtēta ar plūsmas citometriju.

3. Rezultāti un diskusijas

3.1. COS-BA/Ce6 NP sintēze, izgatavošana un raksturojums

Šajā pētījumā mēs izstrādājam jaunu priekšzāļu mazo molekulu COS-BA, kuras pamatā ir ūdenī šķīstošs hitozāna oligosaharīds (COS), kas var paaugstināt pentacikliskās triterpēna betulīnskābes (BA) ķīmijterapijas aktivitāti, uzlabojot šūnu uzņemšanu, palielinot hidrofilitāti. Šeit izmantotā COS (polimerizācijas pakāpe, DP: 2e6) tika sagatavota ar mūsu iepriekš aprakstīto metodi30. Pēc tam COS-BA tika sintezēts, izmantojot dehidratācijas kondensācijas reakciju. Apvienojumā ar COS galveno komponentu analīzi tika uzskatīts, ka COS-BA ķīmiskā struktūra ir ar disaharīdu (DP:2) modificētu BA (atbalsta informācija S1 att.), ko apstiprināja 1H KMR, 13C KMR un ESIeMS. (Papildinformācija S2eS4 att.). Reprezentatīvā 1H KMR analīze parādīja atšķirīgo COS protonu signālu aptuveni 2,64–3,93 ppm un C]CH2 pīķus (4,60, 4,73 ppm) BA, parādot veiksmīgu COS-BA sintēzi (1. att.). Lai sagatavotu apvienoto sinerģisko pretvēža reaģentu COS-BA/Ce6 NP, tika izmantota daudzpusīga atkārtotas nogulsnēšanas pieeja, sadarbojoties ar ļoti efektīvu fotosensibilizatoru Ce6. Mainot sākotnējās molārās attiecības, abas COS-BA/Ce6 kopas montāžas preparāti var veidot sfēriskas nanostruktūras ar modulētiem izmēriem (1.B att. un papildinformācija S5. att.). Dažādās COS-BA/Ce6 ievades attiecībās COS-BA/Ce6 NP hidrofilie diametri bija tuvu 200e300 nm ar negatīvu z potenciālu. Ņemot vērā, ka NP, kas sagatavoti ar formulu 8:1, uzrādīja zemāku polidispersitātes indeksu (PDI, 0, 143) ar salīdzinoši mazāku izmēru (249 nm), kombinatoriskajai ārstēšanai bija nepieciešams arī pietiekams daudzums ķīmijterapijas līdzekļa COS-BA. Tāpēc šim pētījumam mēs izvēlējāmies COS-BA/Ce6 (8:1) formulējumus. Saskaņā ar šo optimizāciju COS-BA/Ce6 NP uzrādīja šauru izmēru sadalījumu (1. att. C) un labu šķīdību ūdenī, kas norāda uz tā koloidālo raksturu (1. att. D). Lai izpētītu šīs veiksmīgās kopsalikšanas iemeslus, tika pētīta brīvā COS-BA primārā pašsavienošanās izturēšanās, izmantojot skenējošo elektronu mikroskopiju (SEM) (1E att.), kas liecināja, ka COS-BA var veidot ļoti viendabīgu nano- sfēra w168 nm, kas nozīmē, ka COS ķīmiskā modifikācija nemaina pašas BA pašsavienošanās spēju (atbalsta informācija S6. attēls). Tieši šī īpašība galu galā veicina veiksmīgu kopkomplektu uzbūvi. Proti, izņemot cieto nanostruktūru, kas apstiprināta ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM), COS-BA/Ce6 NP uzrādīja atšķirīgus COS-BA NP bez apvalka struktūras, un vidējais apvalka biezums bija aptuveni 2, 35 nm. Cits fizikāli ķīmiskais raksturojums ir apkopots 1.F attēlā. Turklāt COS-BA/Ce6 NP uzrādīja negatīvu z-potenciālu 5, 38 mV un hidrodinamisko izmēru w249 nm, kas ir augstāks nekā iegūtais no SEM (w182 nm). Vienlaikus Ce6 iekraušanas un iekapsulēšanas efektivitāte bija attiecīgi 8,1 un 96%, kā noteikts ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC). Arī FT-IR dati (1.G att.) vēl vairāk apstiprināja šo kopagregātu, jo COS-BA/Ce6 NP uzrādīja raksturīgās Ce6 C]N, CeN un C]CH virsotnes, kas parādījās pie 1633, 1078 un 633 cm 1 , attiecīgi.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

3.2. Kopā salikts mehānisms un čaulas struktūras veidošana

Pēc tam, lai labāk izprastu kopas montāžas mehānismu, mēs vispirms izpētījām NP primāro veidošanās procesu. Mēs noskaidrojām, ka COS-BA kopa montāža ar Ce6 var būt spontāna, jo šīs divas sugas var veidot arī sfērisku nanostruktūru pat bez ultraskaņas (atbalsta informācija S7 att.), kas var būt saistīts ar negatīvām Gibsa brīvās enerģijas izmaiņām (DG). ) kopsapulcēs37. Šī spontānā montāža arī liecināja par spēcīgāku starpmolekulāro mijiedarbību starp COS-BA un Ce6. Parasti starpmolekulārās mijiedarbības supramolekulāros paš (vai ko) mezglos ir nekovalenta p‒p sakraušana, ūdeņraža saite un van der Vālsa spēki 38, 39. Lai veiktu šo analīzi, mēs pētījām COS-BA/Ce6 NP UV absorbciju (1H un F att.), kas liecināja par Soreta (410 nm) un Qy (667 nm) joslām ar sarkanu nobīdi, salīdzinot ar brīvs Ce6 (attiecīgi 405 un 665 nm). Tikmēr var atrast arī ievērojamo sarkano nobīdi raksturīgo COS-BA absorbciju, kas norāda uz iespējamu starpmolekulāru pp sakraušanos starp COS-BA un Ce640. Turklāt pēc inkubācijas ar virsmaktīvo vielu nātrija dodecilsulfātu (SDS, 0,2 % w/v) (papildinformācija S8. attēls), COS-BA/Ce6 NP uzrādīja tikko zili nobīdītu Qy joslu pie 641 nm un dramatiski atjaunoja fluorescenci, parādot. ka hidrofobās mijiedarbības arī veicināja kopīgu montāžu28. Tā kā šīs asociatīvās nekovalentās mijiedarbības, kopasamblejas uzrādīja ievērojamu fluorescences slāpēšanu (98,2%) ūdenī (1. att. I). Kopumā ir pamatoti uzskatīt, ka p‒p sakraušana un hidrofobās mijiedarbības var būt galvenie kopasagregātu veidošanas virzītājspēki. Pēc tam, lai vēl intuitīvāk vizualizētu montāžas procesu un atklātu galvenos iemeslus, kāpēc var veidoties čaulas strukturēti NP, mēs veicām vienkāršotu molekulārās dinamikas (MD) simulācijas modeli, kas satur 16 optimizētas COS-BA molekulas un vēl divus Ce6 ūdens kastē. . Sākotnēji mēs novērtējām iespējamo COS-BA pašsavienojumu mijiedarbību/saistīšanu 5 ns laikā pēc simulācijas laika (2.A att. un papildinformācija S9. att.). Mēs atklājām, ka, izņemot daudzas intramolekulāras ūdeņraža saites COS frakcijā, var novērot arī vairākus starpmolekulāro H saišu pārus starp COS-BA (2.B att. un papildu informācija S10. att.), kas norādīja, ka ūdeņraža saite var būt viena. no galvenajiem virzītājspēkiem COS-BA NP veidošanā. Īpaši interesanti ir tas, ka COS-BA pašsavienojumos visas COS-BA molekulas veido šķietami simetrisku struktūru (2. att. C). Šī aizraujošā parādība motivēja mūs izpētīt iespējamās attiecības starp šo īpašumu un čaulas strukturētu COSBA NP veidošanos. Pēc tam mēs mēģinājām paplašināt kastes vienības. Pārsteidzoši, savienotās kastes, kas sastāv no COS-BA molekulām, tika sakārtotas regulāri, kā rezultātā izveidojās "ortogonālas" dobas tīkla struktūras (atbalsta informācija S11. attēls). Vēl svarīgāk ir tas, ka mēs nejauši aprēķinājām apvalka molekulu biezumu un atklājām, ka tie atbilst TEM (w2,35 nm) (2. D attēls). Šī tendence veidot dobas tīkla struktūras var būt atbildīga par čaulas strukturētu NP veidošanos. Lai pārbaudītu šo ideju, tika simulēta COS-BA/Ce6 kopkomplektu MD struktūra (2.E att. un atbalsta informācija S12. att.). Līdzīgi kā COS-BA pašsavienojumos, liels skaits intramolekulāru un starpmolekulāru H-saišu tika atrasts arī koagregātos (2. att. F un papildu informācija S13. att.). Turklāt iespējamā pp sakraušana starp C] C COS-BA un Ce6 aromātisko gredzenu tika novērota kopkomplektos (2. G att.), kas atbilst datiem no iepriekšējiem UV pētījumiem. Pēc kastīšu skaita palielināšanas līdzīgas dobas tīkla struktūras joprojām var atrast, tikai ar samazinātu regularitāti un ortogonalitāti (atbalsta informācija S14. att.). Tas var būt iespējamais iemesls COS-BA / Ce6 NP nevienmērīgajai morfoloģijai salīdzinājumā ar COSBA NP. Turklāt molekulārā apvalka slāņa attālums ir tuvu arī NP apvalka biezumam (w2,35 nm), kā redzams, izmantojot TEM (2. H att.). Kopumā mēs spekulējām, ka čaulas strukturētu COS-BA/Ce6 NP vai COS-BA NP veidošanās lielā mērā varētu būt saistīta ar šo molekulu tendenci apvienoties dobās apvalka tīkla struktūrās.

1. attēls Ar hitozāna oligosaharīdiem modificētas betulīnskābes (COS-BA) prozāļu mediētu nano mezglu COS-BA/Ce6 NP izgatavošana un raksturojums. (A) COS-BA 1H NMR pastiprinātās atslēgas pozīcijas. (B) Kopā samontētu COS-BA/Ce6 NP sagatavošana ar dažādām COS-BA/Ce6 attiecībām. (C) COS-BA/Ce6 NP izmēru sadalījums, izmantojot COS-BA un Ce6 (molārā attiecība, 8:1) kā celtniecības blokus. (D) Kopasagregātu šķīdība ūdenī un Tyndall efekts norāda uz koloidālu raksturu. (E) SEM un TEM attēli no bezmaksas COS-BA pašmontāžas un kopīgi samontētiem COS-BA/Ce6 NP. (F) COS-BA/Ce6 NP fizikāli ķīmisko īpašību kopsavilkums. (G) FT-IR spektri, (H) UV Vis spektri un (I) fluorescences emisijas spektri brīvajiem Ce6, COS-BA un kopā saliktajiem COS-BA/Ce6 NP ūdenī.

2. attēls (A) COS-BA pašsavienojumu un (E) kopā samontētu COS-BA/Ce6 NP struktūras pēc molekulārās dinamikas (MD) simulācijas 5 ns ar strukturālās vienības molāro attiecību 8:1 (COS-BA) /Ce6, aprēķināts, pamatojoties uz Ce6 iekraušanas efektivitāti). Līnijas modelis tika izmantots H2O, un nūju modeļi attēlo COS-BA vai Ce6 molekulas, kur Ce6 C atomi ir marķēti ar purpursarkanu. Informācija par ūdeņraža saiti starp COS-BA molekulām (B) tās paškomplektācijās un (F) COS-BA/Ce6 NP kopagregātos. (C) Acīmredzami simetriskā COS-BA molekulārā izkārtojuma struktūra pēc MD simulācijas. (G) Iespējamā molekulārā mijiedarbība starp COS-BA un Ce6 parāda iespējamo pp sakraušanu. Norādītais apvalka molekulu biezums "ortogonālā" dobā tīkla struktūrā pēc atbilstošo (D) brīvo COSBA pašmontāžas un (H) COS-BA / Ce6 NP kopagregātu MD kārbu paplašināšanas.

3.3. Uzlabotas 1 O2 paaudzes enerģijas mehānisms

Pēc tam mēs tālāk pētījām singleta skābekļa (1 O2) veidošanos, kas ir viena no kritiskajām reaktīvajām skābekļa sugām (ROS) PDT veiktspējai, izmantojot DPBF (1,3-difenilizobenzofurānu) kā zondi. Pēc ilgstošas ​​COS-BA/Ce6 NP maisījumu šķīdumu apstarošanas ar DPBF DPBF UV absorbcijas intensitāte samazinājās, liecinot par 1 O2 veidošanos (3.A att.). Pēc salīdzināšanas ar metilēnzilo (MB) atsauci COS-BA/Ce6 NP F (1 O2) tika aprēķināts kā 0,26, kas ir nedaudz augstāks par brīvo Ce6 (FZ0.19). (3.B att.). Parasti fotosensibilizatoru absorbētā enerģija tiks pakļauta trīs relaksācijas ceļiem, kas ietver fluorescenci, sildīšanas efektu, izmantojot vibrācijas relaksāciju, un ROS ģenerēšanu, izmantojot starpsistēmu šķērsošanu (ISC)41. Atbilstoši ievērojami samazinātajai fluorescences emisijai COS-BA/Ce6 NP arī neveicināja nekādu sildīšanas efektu ūdenī (papildinformācija S15 att.), kas nozīmēja uzlabotu ISC procesu pēc Ce6 kopas montāžas ar COS-BA, tādējādi izraisot uzlabotajai 1 O2 paaudzei. Lai vēl vairāk noskaidrotu šāda efekta molekulāro mehānismu, mēs mēģinājām optimizēt un aprēķināt iespējamo COS-BA/Ce6 vienas molekulas modeli, kas sastāv no potenciālās pp sakraušanas, kas iegūta no MD simulācijas pēc blīvuma funkcionālās teorijas (DFT) (3. att. C). . Pārsteidzoši, COS-BA/Ce6 uzrādīja novērojamu sarkano nobīdes UV absorbciju 581,24 nm nekā brīvā Ce6 (579,30 nm), norādot uz pp sakraušanos (3. D attēls). Lai gan COS-BA/Ce6 minimālā enerģijas ģeometrija uzrādīja nelielas strukturālas atšķirības ar ievadīto MD konfigurāciju, COS-BA C]C vai C]O saišu atšķirības ar Ce6 porfīna gredzenu joprojām bija novērojamas, vēl vairāk apstiprinot, ka virs p‒p ir iespējama sakraušana. Tikmēr nesen tika pierādīts, ka palielināta elektronu ziedošanas efektivitāte ar p‒p sakraušanu varētu atvieglot ISC procesu42, savukārt ISC ātrums (KISC) ir proporcionāls (1/DEST) 2,43. Tas nozīmē, ka fotosensibilizatora zemākā enerģijas starpība (DEST) uzlabos ISC procesu, veicinot efektīvu ROS ģenerēšanu. Pēc tam mēs aprēķinām attiecīgi Ce6 un COS-BA/Ce6 (3.E att.) zemāko ierosināto singleta stāvokli (S1) un tripleta stāvokli (T1). Rezultāti liecināja, ka COS-BA/Ce6 uzrādīja samazinātu DEST vērtību par 1,1892 eV, salīdzinot ar brīvo Ce6 (1,2001 eV), apstiprinot uzlaboto ISC procesu. DEST samazināšana ir noderīga 1 O2 ražošanai, kas ir pārbaudīta arī citos nanofotosensibilizatoros44. Kopumā šķiet, ka p-stacking samazina Ce6 DEST pēc montāžas kopā ar COS-BA, tādējādi uzlabojot 1 O2 paaudzi.

3. attēls Enerģijas mehānisms uzlabotai 1 O2 ražošanai, ko izraisa COS-BA/Ce6 NP. (A) 1,3-difenilizobenzofurāna (DPBF) fotosadalīšanās UV Vis spektri pēc ilgstošas ​​COS-BA/Ce6 NP apstarošanas. (B) DPBF UV absorbcijas izmaiņu (DOD) pirmās kārtas diagrammās 1 O2 iznākums tika novērtēts, kā atsauces savienojumu izmantojot metilēnzilu (MB) (FZ 0.52) DMSO. (C) Iespējamā vienas molekulas COS-BA / Ce6 modeļa enerģijas minimizētas struktūras, skatoties no sāniem un priekšpuses, kas tika iegūta saskaņā ar sākotnējo molekulāro konfigurāciju starp Ce6 ar COS-BA pēc MD simulācijas un pēc DFT aprēķiniem. (D) Brīvā Ce6 un optimizēta COS-BA/Ce6 modeļa paredzamās UV Vis absorbcijas spektru pārejas (vertikālās joslas). (E) Aprēķinātie enerģijas līmeņi to zemākajam ierosinātajam singleta stāvoklim (S1) un zemākajam tripleta stāvoklim (T1), attiecīgi [Gausa 09/B3LYP/6-31G (d, p)]. Kur DEST tika aprēķināts kā ES1 ET1.

3.4. Ķīmijterapijas miera pazīmes

Pēc tam, lai apstiprinātu šī pētījuma dizaina koncepciju, ka amfifilās COS-BA molekulas izstrāde varētu efektīvi palielināt BA terapeitisko efektu, uzlabojot šūnu uzņemšanu, palielinot hidrofilitāti, un tikmēr turpinot konstruēt uz stimuliem reaģējošu un pilnībā hidrofilu COS-BA/Ce6. NP veicināja tā miera stāvokli normālos audos un aktivāciju audzēja vietās. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs vispirms pētījām COS-BA/Ce6 NP zāļu izdalīšanās uzvedību dažādos buferšķīdumos (4.A att.). Rezultāti liecināja, ka COS-BA/Ce6 NP uzrādīja pH reaģējošu uzvedību ar kumulatīvo Ce6 izdalīšanos attiecīgi 88% pie pH 5,6 un 57% pie pH 7,4 pēc 24 stundām. Šī īpašība, iespējams, radās no daudzu ūdeņraža saišu iznīcināšanas, kas pastāvēja COS-BA/Ce6 NP pēc skābā Hþ45 ieviešanas, tādējādi palielinot Ce6 izdalīšanos (4.B att.). To vēl vairāk apstiprināja COS-BA/Ce6 NP izjaukšana pēc tiešas inkubācijas skābā vidē (4. C att.). Šī uz pH reaģējošā funkcija var būt noderīga efektīvai pretvēža terapijai vāji skābās audzēja mikrovides dēļ34. Tikmēr COS-BA/Ce6 NP bija labāka stabilitāte, jo pēc 10 dienu inkubācijas PBS un 1640-RMPI šūnu barotnē nevarēja novērot būtiskas izmēra vai PDI izmaiņas (atbalsta informācija S16. att.), kas būtu svarīgi. par to iespējamo izmantošanu turpmākiem biomedicīnas lietojumiem. Pēc tam tika veikti turpmāki pētījumi, novērtējot brīvā lipofīlā BA (kontakta leņķis q: 133,3 ) un amfifilā COS-BA (q: 52 ) (4D att.) citotoksicitāti ar standarta metiltiazolil-difeniltetrazolija bromīda (MTT) assays. Kā prognozēts, vai nu 4T1 vēža šūnām, vai normāliem LO2 hepatocītiem, atsevišķai COS būtībā nav pretvēža aktivitātes salīdzinoši mazās devās. Tas varētu būt saistīts ar COS antiproliferācijas iedarbību, kas tiek aktivizēta, inducējot NF-kB signalizācijas ceļu tikai augstās koncentrācijās (aptuveni miligramu līmenī)30. Tā kā COS-BA nodrošina ievērojami uzlabotu citotoksicitāti ar ārkārtīgi zemām IC50 vērtībām (6,03 mg/ml 4T1 un 9,92 mg/mL LO2), salīdzinot ar BA (17,63 mg/mL 4T1 un 20,53 mg/mL LO2). vienādās masas koncentrācijās (4.E un J att.). Iegūtie rezultāti liecināja, ka ūdenī šķīstošās COS modifikācija ievērojami uzlabo lipofīlā BA šūnu uzņemšanas efektivitāti, tādējādi izraisot spēcīgu COS-BA pretvēža aktivitāti. Lai kvantitatīvi noteiktu uzņemšanas efektivitāti, BA vai COS-BA uzkrāšanās 4T1 šūnās tika tieši noteikta ar HPLC (atbalsta informācija S17. att.). Rezultāti nepārprotami apstiprināja, ka amfifīlā COS-BA uzrāda ievērojami augstāku uzņemšanu nekā brīvā BA (apmēram 3{70}} reizes pēc 3 h inkubācijas), kas liecina par COS-BA pastiprināto ķīmijterapijas aktivitāti. Iepriekš minēto secinājumu vēl vairāk apstiprināja ievērojami uzlabotā amfifilā COSBA citotoksicitāte pret HepG2 un MCF-7 vēža šūnām (atbalsta informācija S18. att.), kas labi atbilst dizaina koncepcijai. Pēc kopīgās montāžas ar Ce6 mēs noskaidrojām, ka COS-BA/Ce6 NP bez apstarošanas uzrāda ievērojami inhibētu citotoksicitāti pret 4T1 vēža šūnām, salīdzinot ar līdzvērtīgu COS-BA, īpaši pie 11,5 mg/ml, bet pamata PDT aktivitāte netika ietekmēta ( 4F). Lai pilnīgāk apstiprinātu šo parādību, mēs tālāk pētījām COS-BA/Ce6 NP in vitro citotoksicitāti pret citām vēža šūnām, tostarp MCF{88}} un HepG2. Interesanti, ka amfifilais COS-BA uzrādīja ļoti spēcīgāku citotoksicitāti pret MCF-7 šūnām (4.G att.), bet ķīmijterapijas aktivitāte ievērojami samazinājās pēc salikšanas ar Ce6, ti, neapstarotiem COS-BA/Ce6 NP. Līdzīgi rezultāti tika novēroti arī HepG2 šūnās tikai ar nelielu samazināšanos (4H attēls). Lai vēl vairāk atbalstītu iepriekš minētos secinājumus, mēs arī novērtējām nano-sastāvdaļu un COS-BA ķīmijterapijas iedarbību pret normālām peles fibroblastu L929 šūnām un cilvēka LO2 hepatocītiem (4. att. I). Rezultāti liecināja, ka samontētie COS-BA / Ce6 NP ievērojami samazināja oriģinālo ļoti toksisko amfifilo medikamentu COS-BA, parādot izcilu bioloģisko saderību. Analizējot citotoksicitāti, amfifilā COS-BA IC50 vērtības bija ievērojami zemākas nekā kopā samontētajiem COS-BA/Ce6 NP neatkarīgi no vēža vai normālām šūnām (4.J att.). Tas nozīmē, ka pilnīgi hidrofilu un uz stimuliem reaģējošu nano kopu konstruēšana var jau iepriekš efektīvi nomākt amfifilo zāļu COS-BA augsto citotoksicitāti. Ņemot vērā atšķirīgo pH-reaģējošo iezīmi, šķiet, ka COS-BA/Ce6 NP būs neaktīvi normālos audos ar vēlamo zemu ķīmijterapijas toksicitāti, bet aktīvi audzēja audos, jo tie stimulē ļoti toksisko COS-BA izdalīšanos vāji skābā audzējā. mikrovide. Kopumā atšķirībā no plaši ziņotās ķīmijterapijas reaģentu neofunkcionalizācijas, kam ir pastiprināta pretvēža aktivitāte22, 23, amfifīlajiem COS-BA mediētajiem nano mezgliem ir ne tikai gudra "miega" īpašība ar mānīgiem ķīmijterapijas efektiem, bet arī saglabā specializētu PDT aktivitāti, parādot milzīgu potenciālu. gudrai pretvēža terapijai.

4. attēls (A) In vitro Ce6 izdalīšanās profili no COS-BA/Ce6 NP PBS (pH 7,4, 6,5 vai 5,6), kas satur Tween 80 (0,5%, v/v) plkst. 37 C. (B) Iespējamais uz pH reaģējošs mehānisms, kas H aktivizē NP izjaukšanu. (C) COS-BA/Ce6 NP izjaukšana pēc tiešas inkubācijas aptuveni pH 4.{45}} ūdenī. (D) attiecīgi brīvo BA, Ce6, COS-BA un COS-BA/Ce6 NP kontakta leņķis. (E) Brīvā BA, COS un amfifilā COS-BA šūnu citotoksicitāte pret reprezentatīvām vēža 4T1 un normālām LO2 šūnām. (F) 4T1, (G) MCF-7, (H) HepG2 vēža šūnu dzīvotspēja pēc inkubācijas ar brīviem COS-BA, COS-BA/Ce6 NP ar/bez apstarošanas ar norādīto ekvivalento COS-BA koncentrāciju uz 24h. (I) Brīvo COS-BA, neapstaroto COS-BA/Ce6 NP šūnu citotoksicitāte pret normālām LO2 un L929 šūnām. (J) COS-BA IC50 analīze pret vēzi un normālām šūnām. Dati ir izteikti kā vidējie SD (n Z 6). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 un ***P ˂ 0,001 parāda būtiskās atšķirības.

Lai izpētītu iespējamos šīs ķīmijterapijas miera rakstura iemeslus, COS-BA / Ce6 NP no laika atkarīgā šūnu uzņemšanas uzvedība tika secīgi novērtēta, inkubējot ar 4T1 vēža šūnām. Rezultāti liecināja, ka, lai gan COS-BA/Ce6 NP uzrādīja ievērojamu fluorescences slāpēšanu, tie joprojām uzrādīja uzlabotu fagocītu efektivitāti, salīdzinot ar brīvo Ce6, pateicoties spēcīgākai citoplazmas sarkanajai fluorescencei, kā noteikts plūsmas citometrijas kvantitatīvā analīzē (5.A att.). Šo uzlaboto NP šūnu internalizāciju var saistīt ar endocitozi21. Kopumā mēs spekulējām, ka, lai gan ūdenī ļoti šķīstošiem COS-BA/Ce6 NP (kontakta leņķis q: 36,7 ) bija labāka šūnu endocitoze nekā lipofīlajam Ce6 (q: 132,6, tuvu BA), samazināta fagocitozes efektivitāte. NP var parādīties salīdzinājumā ar amfifilo COS-BA molekulu, tādējādi šķiet, ka tie nomāca COS-BA / Ce6 NP ķīmijterapijas citotoksicitāti. Tas nozīmē, ka šūnu uzņemšanas efektivitāte no augstas līdz zemai kā šāda secība: amfifīlā COS-BA, hidrofilā COS-BA/Ce6 NP, lipofīlā BA vai Ce6. Vēl svarīgāk ir tas, ka nepietiekama šūnu NP izjaukšana var būt vēl viens svarīgs iemesls vājinātajai ķīmijterapijas iedarbībai, un tas viss var būt saistīts ar COS-BA / Ce6 NP viedo ķīmijterapijas miegainību. Turklāt, tā kā NP demontāža tika īpaši veikta audzēja šūnu skābā vidē, lai parādītu pH reaģējošo īpašību, mēs tālāk mēģinājām salīdzināt COS-BA/Ce6 NP uzņemšanas efektus normālās LO2 šūnās (5.B attēls). . Tomēr COS-BA / Ce6 NP neuzrādīja būtiski inhibētu Ce6 sarkano fluorescenci LO2 šūnās. Turpretim LO2 uzņemšanas uzvedība bija līdzīga 4T1 vēža šūnu uzvedībai, kas liecina, ka COS-BA / Ce6 NP var arī izjaukt pat normālās šūnās, ko var izraisīt iekšēji esošie vāji skābie pH intracelulārie nodalījumi (endosomas / lizosomas). gan vēzis, gan normālas šūnas46. Tā kā NP uzņemšana šūnās ir atkarīga no endocitozes procesa, tiešā zāļu inkubācija var neizcelt COS-BA / Ce6 NP reakciju uz pH līmeni šūnu līmenī. Tomēr audzēja mikrovide (TME) ir ļoti skāba salīdzinājumā ar normāliem audiem47. Neatkarīgi no vēža intracelulārā vai TME, COS-BA/Ce6 NP var būt pH reaģējoši un izjaukti, lai izraisītu ļoti toksiska COS-BA izdalīšanos. Tā kā normālos audos COS-BA / Ce6 NP varēja izjaukt tikai pēc nokļūšanas normālā šūnu vidē, samazinot COSBA izdalīšanās iespējamību. Tāpēc mēs secinām, ka COS-BA / Ce6 NP raksturīgā ķīmijterapijas miegainība audzēja mikrovidei ir derīga un uzticama, un šī pētījuma dizaina ideja ir iespējama.

3.5. COS-BA/Ce6 NP in vitro ķīmijterapijas/PDT pretvēža efektivitāte

Turklāt pirms detalizētas COS-BA/Ce6 NP in vitro ķīmijterapijas/PDT pretvēža efektivitātes un, lai vēl vairāk atklātu endocitozes mehānismu, mēs pētām četrus galvenos endocitozes ceļus, pievienojot atbilstošus endocītu inhibitorus, tostarp hlorpromazīnu (ar klatrīnu mediētu), hlorokvīna fosfātu ( lizosomu paskābināšanas inhibitors), nistatīns (caveolae mediēts) un makropinocitozes inhibitors EIPA (etilizopropilamilorīds) (5.C un D attēls). Mēs novērojam, ka nistatīna un hlorpromazīna ievadīšana var efektīvāk inhibēt fagocītu efektivitāti nekā EIPA un hlorokvīna fosfāts, uzrādot ievērojami samazinātu šūnu fluorescenci, salīdzinot ar normālu 37 C. Šie rezultāti liecināja, ka COS-BA/Ce6 NP tika internalizēti ar vairākiem mehānismiem, galvenokārt caur klatrīna un caveolae mediētie endocitozes ceļi. Tā kā starpmolekulāro mijiedarbību rezultātā palielinās 1 O2 veidošanās, COS-BA/Ce6 NP uzrāda ievērojami lielāku starpšūnu ROS iznākumu nekā Ce6, par ko liecina spēcīgāka DCFH zondes zaļā fluorescence (5E att.), kas nozīmē augstāku fotodinamisko efektivitāti. MTT testi parāda, ka COS-BA/Ce6 NP, kas tiek apstaroti, ievērojami uzlabo 4T1 šūnu inhibīcijas efektu nekā līdzvērtīgs Ce6, bet ar salīdzinoši mērenu citotoksicitāti bez apstarošanas (5. att. F). Zīmīgi, ka Ce6 (0,53 mg/ml) IC50 COS-BA/Ce6 NP bija daudz zemāks nekā brīvā Ce6 (1,39 mg/ml) (5G attēls), kas liecina par ievērojami uzlabotu PDT efektivitāti, kas To lieliski pierāda arī COSBA/Ce6 NP citotoksicitāte pret cilvēka MCF-7 un HepG2 vēža šūnām (atbalsta informācija S19. att.). Tāpat, salīdzinot ar brīvo Ce6, salīdzinoši zemākas IC25, IC50 un IC75 vērtības tika novērotas arī kopkomplektos (5. G att.). Tikmēr, salīdzinot ar Ce6 PDT vienu pašu un atsevišķu NP ķīmijterapiju tumsā, COS-BA/Ce6 NP apstaroti panāca efektīvāku kombinēto ķīmijterapiju/PDT pret trim iepriekšminētajām vēža šūnām, uzrādot sinerģismu (kombinācijas indekss: CI ˂ 1) ( 5I att.). Turklāt dzīvu / mirušu šūnu fluorescences dubultā krāsošana, izmantojot kalceīna-acetoksimetilesteri (kalceīns-AM) un propīdija jodīdu (PI), vēl vairāk apstiprināja, ka COS-BA / Ce6 NP var efektīvi izraisīt šūnu apoptozi un nekrozi, jo apstrādātās šūnas bija gandrīz iekrāsotas. ar sarkanu PI fluorescences signālu, kultivējot vēl 10 h pēc apstarošanas (5H att.). Tikmēr neapstarotiem COS-BA/Ce6 NP (lielākas Ce6 devas: 3,2 mg/ml) bija arī noteikta ķīmijterapijas aktivitāte, ko vienlaikus redzēja AM un PI signāli. Šī ievērojami uzlabotā COS-BA/Ce6 NP PDT aktivitāte tika apstiprināta ar AM/PI krāsošanu pēc papildu 20 stundu ilgas apstrādes (atbalsta informācija S20. attēls). Turklāt, pievienojot ar COS-BA/Ce6 NPs-PDT apstrādātajām 4T1 šūnām nātrija azīdu (SA) un D-mannītu (DM), atsevišķi īpašu 1 O2 un $ OH48 dzēsēju, acīmredzami palielinātā šūnu dzīvotspēja nozīmēja, ka I tipa ($OH) un II tipa (1 O2) fotoreakcijas notika vienlaikus COSBA/Ce6 NPs mediētā PDT procesā (5J att.). Turklāt COS-BA/Ce6 NP ir īpaši labāka saderība ar asinīm, par ko liecina niecīgā sarkano asins šūnu hemolīze (5K att.), kas liecina par biomedicīnas pielietojuma iespējām, izmantojot intravenozu ievadīšanu.

3.6. COS-BA/Ce6 NP bioloģiskā izplatība in vivo

Pēc tam, pirms in vivo izplatīšanas izmeklēšanas, mēs pēc tam novērtējām COS-BA/Ce6 NP farmakokinētiku, pārraugot Ce6 koncentrāciju asinīs pēc intravenozas injekcijas ar līdzvērtīgiem Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP. Ce6 koncentrācijas un laika profili asinīs (6.A att.) un salīdzinošie farmakokinētiskie parametri (papildinformācijas tabula S1) nepārprotami apstiprina, ka COS-BA/Ce6 NP ir ilgstoša cirkulācija asinsritē, kas var nodrošināt lielāku uzkrāšanos pie audzēja. vietnes. Jo īpaši COS-BA / Ce6 NP uzrādīja ātru asiņu elimināciju 2 stundu laikā, kas nozīmē labvēlīgu bioloģisko noārdīšanos. Attiecīgi mēs pētījām COS-BA/Ce6 NP in vivo bioloģisko sadalījumu un audzēju uzkrāšanās spēju (6.B un C att.). Līdzīgi kā vispārēji ziņotie Ce6 nanokompozītmateriāli33, COS-BA / Ce6 NP var ātri izplatīties visā ķermenī. Īpaši pirmajās 4 stundās audzēja vietās bija acīmredzami spēcīgāka fluorescences emisija nekā brīvajam Ce6, kas liecina par COS-BA/Ce6 NP labāku aizturi un uz audzēju mērķētu akumulācijas spēju, kas, iespējams, ir saistīta ar pasīvās uzlabotās caurlaidības saglabāšanas (EPR) efektu. ko nodrošina nanodaļiņas14. Pēc 6 stundām pēc injekcijas fluorescences intensitāte audzēja vietās pakāpeniski strauji samazinājās. Proti, atšķirībā no parasti ziņotajiem nanokompozītmateriāliem ar ievērojami pastiprinātu audzēja uzkrāšanos, salīdzinot ar brīvām pozitīvām zālēm29, COS-BA/Ce6 NP neuzrādīja īpaši izteiktu uzkrāšanos audzēja vietā 24 stundas pēc injekcijas nekā brīvais Ce6 (6. C attēls), kas bija ko papildina izgrieztā audzēja attēlveidošana (6.D un E att.). Lieliskā NP bioloģiskā noārdīšanās spēja var būt atbildīga par dabisko mazu organisko molekulu ieviešanu. Tas tika novērots arī ar citiem terpenoīdu mazo molekulu mediētiem nano mezgliem49. Turklāt COS-BA/Ce6 NP arī uzrādīja līdzīgu audu sadalījumu kā brīvajam Ce6 (6. att. E), un ex vivo vidējā fluorescences intensitāte parasti bija zemāka nekā in vivo, kas vēl vairāk norāda uz labu bioloģisko noārdīšanos. Turklāt, ņemot vērā ciešo fluorescences līmeņa atšķirību starp 2 un 4 stundām pēc NP un Ce6 injekcijas, kā arī eksperimentālo darbību, kas pieļauj pietiekamus intervālus apstarošanai, 4 stundas pēc ievadīšanas tika izvēlēta kā gaismas laika punkts turpmākajai PDT terapijai.

Ņemot vērā ne pārāk ievērojamo audzēja uzkrāšanos 24 stundās nekā brīvais Ce6, lai vēl vairāk apstiprinātu palielināto EPR efektu, kas piemīt COS-BA / Ce6 NP, mēs nekavējoties novērojām audzēju ex vivo fluorescences attēlus dažādos laikos pēc intravenozas injekcijas ar nanozālēm ( 6F un G att.). Jāatzīmē, ka vai nu 20 minūtes, vai 12 stundas pēc injekcijas, COS-BA / Ce6 NP patiešām uzrādīja spēcīgāku fluorescences emisiju audzēja vietās nekā brīvais Ce6, parādot izcilu un uzlabotu audzēja uzkrāšanās spēju. Tikmēr, laikam ejot, audzēja audos saglabātā fluorescences intensitāte pakāpeniski vājinājās (6.G att.), kas pilnībā atbilst in vivo dzīvnieku fluorescences attēlveidošanas rezultātiem. Skaidrs, ka šis ātrais bioloģiskais metabolisms un pastiprinātā audzēja uzkrāšanās izvairījās no iespējamās ilgstošas ​​uzkrāšanās toksicitātes, garantējot ļoti efektīvu pretvēža terapiju ar labāku bioloģisko drošību.

5. attēls COS-BA/Ce6 NP pretvēža efektivitāte in vitro. (A) 4T1 vēža šūnu un (B) LO2 normālu šūnu internalizācija, kas inkubētas brīvos Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP 0,5 un 3 stundas, un atbilstoša fluorescences intensitātes plūsmas citometriskā analīze. (C) specifisku endocītu ceļu pētījumu uzņemšanas kavēšana un (D) atbilstošā šūnu fluorescences intensitāte, ko mēra ar plūsmas citometriju pēc inkubācijas ar COSBA/Ce6 NP ar/bez endocītu inhibitoriem, tostarp hlorpromazīnu, hlorokvīnu, nistatīnu un etilizopropilamilorīdu (EIPA). Mēroga joslas Z 20 mm. (E) Šūnu ROS veidošanās, ko izraisa brīvie Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP (ekvivalents Ce6: 1,6 mg/ml). Mēroga joslas Z 20 mm. (F) 4T1 šūnu dzīvotspēja pēc dažādām 24 stundu apstrādēm. (G) Brīvo Ce6 un COS-BA/Ce6 NP IC25, IC50, IC75 analīze pret attiecīgi 4T1, MCF-7 un HepG2 šūnām. (H) COS-BA/Ce6 NP (Ce6: 1,6 mg/mL) apstrādātu 4T1 šūnu dzīvā/nedzīvā krāsošana ar kalceīnu-AM/propidija jodīdu (PI) pēc inkubācijas papildu 10 stundas, kā arī neapstarotās COS- BA/Ce6 NP (Ce6: 3,2 mg/ml). Mēroga stieņi Z 50 mm. (I) COS-BA/Ce6 NP kombinācijas indekss (CI) uz 4T1, MCF-7 un HepG2 šūnām, kā noteikts ar Chou Talalay teorēmas aprēķinu. (J) PDT mehānismi (I un II tips), ko izraisa COS-BA/Ce6 NP apstarošana un novērtēti ar attiecīgi specifisku 1 O2 un $OH slāpētāju nātrija azīdu (SA) un D-mannītu (DM). (K) Sarkano asins šūnu hemolīze procentos pēc inkubācijas ar COS-BA / Ce6 NP 4 stundas. Dati ir izteikti kā vidējie SD (n Z 3). *P ˂ 0,05, **P ˂ 0,01 un ***P ˂ 0,001 parāda būtiskās atšķirības.

6. attēls In vivo asinsrite un COS-BA/Ce6 NP bioloģiskā sadale. (A) Ce6 koncentrācijas un laika profili asinīs pēc līdzvērtīga Ce6 vai kopā samontētu COS-BA/Ce6 NP (n Z 3) iv. (B) Visa ķermeņa fluorescences attēli 4T1 audzēju saturošām pelēm pēc norādīto zāļu iv injekcijas dažādos laika punktos. (C) vidējā fluorescences intensitāte, kas iegūta no audzēja vietām (B). (D) Ex vivo fluorescences attēli audzējiem un galvenajiem orgāniem, kas izgriezti no iepriekšminētajām pelēm pēc 24 stundām, un atbilstošs (E) fluorescences intensitātes kvantitatīvs rezultāts (n Z 3). (F) Ex vivo audzēju un galveno orgānu fluorescences attēli dažādos laikos pēc Ce6 vai COS-BA/Ce6 NP iv injekcijas un (G) atbilstoša audzēju fluorescences intensitātes analīze. Dati ir izteikti kā vidējie SD (n Z 3).

3.7. In vivo ķīmijterapija/PDT kombinatoriskā pretvēža ārstēšana 

Motivējot unikālo miera raksturlielumu, labu bioloģisko noārdīšanos un PDT aktivitāti, tika pētīta in vivo ķīmijterapijas/PDT kombinētā pretvēža terapija. 4T1 audzēju nesošās peles tika nejauši sadalītas 6 grupās un intravenozi injicētas ar ekvivalentu Ce6 (3,5 mg/kg ķermeņa) ik pēc 2 dienām, kopā trīs devas. 4 stundas pēc injekcijas peļu audzēja vietas gaišajās grupās tika apstarotas 15 minūtes (7.A att.). Tikmēr attiecīgie audzēja tilpumi vai ķermeņa svars tika reģistrēti katru otro dienu. Pēc 14 ārstēšanas dienām (7.B att.) brīvais Ce6 ar apstarošanu un brīvais COS-BA bija neefektīvs audzēja nomākšanā, iespējams, ierobežotās zāļu uzkrāšanās dēļ audzēja audos. Turpretī pēc COS-BA / Ce6 NP apstarošanas tika novērota visnozīmīgākā audzēja inhibīcija, apstiprinot lielisko ķīmijterapijas / PDT kombinācijas efektivitāti. Vidējais audzēju svars (7. att. D) un atbilstošās izdalīto audzēju fotogrāfijas (7. att. E) uzrādīja vislabāko COS-BA/Ce6 NP pretvēža efektivitāti apstarošanas laikā, jo ārstētajām pelēm bija mazākie audzēju izmēri nekā citām grupām. Vidējais audzēja inhibīcijas koeficients ar PDT ārstētiem COS-BA/Ce6 NP sasniedza 80,3%, augstāks nekā brīvā Ce6 PDT (42,4%) un brīvā COS-BA (38,5%). Jāatzīmē, ka, lai gan iepriekšējie in vitro pētījumi ir parādījuši, ka COS-BA/Ce6 NP bez gaismas uzrādīja neaktīvu ķīmijterapijas aktivitāti, tiem joprojām ir uzlabota pretaudzēju efektivitāte (49,5%), salīdzinot ar brīvo COS-BA (7. att.). Mēs spekulējām, ka šo rezultātu veicina divi iespējamie iemesli, viens ir lielāka COS-BA / Ce6 NP audzēja uzkrāšanās plaši ziņotā EPR efekta dēļ. Vēl viens faktors ir vāji skābā audzēja mikrovide, kas stimulēja ļoti toksiskas COS-BA izdalīšanos. Tā kā COS-BA ir augstāka kritiskā micellu koncentrācija (CMC, 187 mg/ml) (papildinformācija S21. att.), tā var pastāvēt monomēra stāvoklī audzēja vidē, tādējādi veicinot neapstarotās COS-ķīmijterapijas uzlabošanos. BA/Ce6 NP. Turklāt, lai vēl vairāk pārbaudītu COS-BA/Ce6 NP augstāko pretvēža efektivitāti, tika veikta audzēju iekrāsošana ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E) (7.G att.).

7. attēls Efektivitātes pētījums ar subkutānu 4T1 ksenotransplantāta modeli. (A) In vivo PDT ārstēšanas shematisks ilustrācija. (B) Audzēja augšanas profili, (C) ķermeņa masas izmaiņas un (D) izgrieztā audzēja svars, kas satur audzēja inhibīcijas koeficientus pelēm, kurām ir 4T1- pēc dažādām procedūrām norādītajās grupās (n Z 5 katrai grupai). (E) Izgrieztu audzēju attēli no reprezentatīvām pelēm pēc ārstēšanas. (F) Seruma bioķīmijas analīze pēc ārstēšanas ar COS-BA / Ce6 NP 14 dienas. (G) Izgriezto audzēju sekciju reprezentatīva H&E krāsošana pēc dažādām procedūrām. Mēroga joslas Z 50 mm. (H) brīvo Ce6 un COS-BA/Ce6 NP PDT apstrādāto audzēju sekciju TUNEL krāsošana. Mēroga joslas Z 20 mm **P < 0,01 norāda uz būtiskām atšķirībām.

Rezultāti liecināja, ka ar COS-BA/Ce6 NPs-PDT apstrādātām audzēju sekcijām bija nopietna audu pasliktināšanās un kodolu deficīts, savukārt pārējās grupās tika novērota mērena audu nekroze. Vienlaikus, salīdzinot ar brīvo Ce6 gaismu, apstaroti COS-BA/Ce6 NP ievērojami palielināja TUNEL pozitīvo šūnu skaitu, kas uzrāda spēcīgāku brūno kodoliekrāsojumu (7.H att.), vēl vairāk apstiprinot lielisko ķīmijterapijas/PDT kombinēto terapiju. Turklāt visās grupās netika novērotas acīmredzamas ķermeņa svara atšķirības (7.C att.). Pat ja COSBA / Ce6 NP vai Ce6 vieglajām grupām ievadīšanas laikā bija neliels ķermeņa svara zudums, ķermeņa svars pēc dažām dienām atgriezās normālā stāvoklī. Nevarēja atrast acīmredzamus bojājumus vai iekaisuma bojājumus galvenajos orgānos, kas iegūti ārstēšanas beigās (papildinformācija S22. att.), kas norāda uz zemu/nav sistēmisku toksicitāti un labu bioloģisko drošību COS-BA/Ce6 NP. Turklāt, lai gan COS-BA/Ce6 NP galvenokārt uzkrājas aknu audos, atbilstošie aknu funkciju marķieri (ALT, ASAT un ALP) neuzrādīja būtiskas izmaiņas salīdzinājumā ar normālām veselām pelēm (7.F att.), kas liecina par labāku bioloģisko saderību. Turklāt nieru funkcijas marķieri (BUN, CRE un UA) un bioķīmiskie parametri (ALB un TBIL) arī izrādījās līdzīgi parastajām pelēm, kas vēl vairāk nozīmē labāku bioloģisko drošību. Skaidrs, ka šīm prozāļu organiskajām mazajām molekulām COS-BA/Ce6 NP ir vairākas labvēlīgas terapeitiskās īpašības, kas paver pievilcīgas iespējas izmantošanai klīniskajā medicīnā.

3.8. Kombinētās ķīmijterapijas/PDT un anti-PD-L1 blokādes pretvēža imunitāte

Nesen daudzi inovatīvi pētījumi ir parādījuši, ka vēža imūnterapijas kombinācija ar citām ārstēšanas metodēm var efektīvi izraisīt audzējam specifiskas imūnās atbildes reakcijas uz primāro vai attālo audzēju likvidēšanu1. COS-BA/Ce6 NP unikālās ķīmijterapijas miega funkcijas un lieliskās ķīmijterapijas/PDT pretvēža efektivitātes mudināti, mēs domājam, vai tas varētu izraisīt arī imunoloģiskas reakcijas ar imūnadjuvanta anti-PD-L1 palīdzību, lai izraisītu ļoti efektīvu pretvēža terapiju. . Vai tas varētu ārstēt attālus audzējus, kurus nevar tieši ārstēt, izmantojot PDT ārstēšanu, tādējādi nodrošinot alternatīvu stratēģiju klīniskiem pretvēža lietojumiem? Lai pārbaudītu šo hipotēzi, šajā pētījumā tika izveidots "divu audzēju" modelis un detalizētas eksperimenta procedūras ir parādītas 8.A attēlā. Parasti katras peles kreisajā un labajā pusē tika inokulēti divi 4T1 audzēji. Ņemot vērā, ka tikai anti-PD-L1 nav izteikta imūnterapijas efekta50, eksperimenti tika sadalīti 5 grupās, ieskaitot neapstrādātu grupu, COS-BA/Ce6 NP, COS-BA/Ce6 NP ar anti-PD-L1, COS- BA/Ce6 NP ar gaismu, COS-BA/Ce6 NP ar gaismu un anti-PD-L1. Pēc vienas iv injekcijas NP (Ce6: 3,5 mg/kg) labie audzēji (primārais audzējs) gaišajās grupās tika apstaroti 15 minūtes, lai novērtētu PDT/ķīmijterapijas imunoloģisko ietekmi, savukārt kreisie audzēji (tāli audzēji) visās grupās bez jebkādas ārstēšanas tika atlasītas individuālai ķīmijterapijai. Pēc tam 2., 4. un 6. dienā imūno grupu pelēm iv injicēja anti-PD-L1 antivielu (15 mg uz vienu peli vienā injekcijā) kopumā trīs devās. Zīmīgi, ka neatkarīgi no PDT ārstēšanas vai nē, COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 var efektīvi kavēt primārā audzēja progresēšanu (8.B att.). Un attiecīgie vidējie audzēja inhibīcijas rādītāji atsevišķi sasniedza 86,7% (apstarošana) un 76,5% (bez apstarošanas), kas ir daudz augstāka nekā individuāla ķīmijterapija (5,7%) vai ķīmijterapija/PDT (27,4%) (8. C attēls). . Fotogrāfijas ar izdalītiem audzējiem (8.D att.) un 4T1-nesošajām pelēm (papildinformācija S23. att.) pēc 14 dienu ārstēšanas arī vizuāli apstiprināja iepriekš minēto secinājumu. Šie rezultāti liecināja, ka gan uz NP balstīta ķīmijterapija, gan ķīmijterapija / PDT varētu efektīvi aktivizēt pretvēža imunitāti. Tikmēr pārsteidzošākais ir tas, ka anti-PD-L1 blokāde plus NP piedāvāja arī ievērojamu audzēju inhibējošo efektu neapstarotiem attāliem (kreisajiem) audzējiem (8.E un F att.), parasti spēcīgāku nekā tikai COS-BA/Ce6 NP, kas bija to apstiprina arī atbilstošie sadalītie audzēji un peļu attēli pēc apstrādes (8. D un S23. att.), kas vēl vairāk parāda COS-BA/Ce6 NP izraisīto efektīvu pretvēža imūnreakciju.

Lai pilnībā izpētītu šo efektīvo pretvēža imūnreakciju, CD8 þ citotoksiskie T limfocīti (CTL), kas ir kritisks imūnocīts vēža imūnterapijai4, tika tālāk novērtēti, analizējot imūnās šūnas labajā vai kreisajā audzējā pēc 14 ārstēšanas dienām. Tika konstatēts, ka COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 ar vai bez PDT terapijas izraisīja spēcīgu CD8þ CTL infiltrāciju primārajos audzējos (8.H un J att.). CD8þ CTL infiltrācija bija līdz 11,3% pēc COS-BA/Ce6 NP balstītas ķīmijterapijas/PDT plus anti-PD-L1 terapijas, nedaudz augstāka nekā COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 (9,63%), un daudz augstāks nekā citās grupās bez anti-PD-L1, ieskaitot ārstēšanu ar COS-BA/Ce6 NP balstītu ķīmijterapiju (5,12%) vai tikai ķīmijterapiju/PDT (4,07%). Līdzīgi, salīdzinot ar grupām, kas nav imūnas, ievērojami palielināta CTL infiltrācija tika novērota arī peles kreisajā (tālajā) audzējos pēc COS-BA/Ce6 NP plus antiPD-L1 ar vai bez PDT terapijas (8.I un K attēls). kas nozīmē ļoti efektīvas imūnās atbildes reakcijas, ko izraisa ķīmijterapija vai ķīmijterapijas/PDT kombinētā terapija. Tikmēr pēc anti-PD-L1 ieviešanas gan uz COS-BA/Ce6- balstīta ķīmijterapija, gan ķīmijterapija/PDT izraisīja spēcīgu vairāku citokīnu veidošanos, kam ir galvenā loma CTL8 citotoksisko funkciju regulēšanā, tostarp audzēja. nekrozes faktors-alfa (TNF-a) (8. att.) un interferons-gamma (IFN-g) (att. 8M) peļu seruma paraugos pēc 14 dienu ārstēšanas, vēl vairāk apstiprinot, ka pastāv efektīvas pretvēža imūnās atbildes. Turklāt dažādās ārstēšanas grupās netika novērotas acīmredzamas ķermeņa svara izmaiņas (8. N attēls), kas norāda uz šīs kombinētās ķīmijterapijas/PDT/imūnterapijas labvēlīgo bioloģisko drošību. Kopumā mēs atklājām, ka, lai gan anti-PD-L1 plus COSBA/Ce6 NP ar gaismu uzrādīja nedaudz augstāku audzēja inhibīcijas koeficientu (86,7%) nekā neapstarotajā grupā (76,5%) pret pareizajiem audzējiem. PDT ietekmes dēļ (8.B-D att.) PDT klātbūtnē (77,8%) vai bez tās (78,4%) netika novērotas būtiskas terapeitiskās iedarbības atšķirības uz kreisās puses audzējiem (8.E-G att.). Mēs domājam, ka šādi iespējamie iemesli noved pie šīs parādības. Pirmkārt, attiecībā uz ķīmijterapijas vai PDT mehānismu, kas uzlabo anti-PD-L1 kontrolpunkta blokādes imunoloģisko iedarbību, uzkrājošie pētījumi ir parādījuši, ka šīs ārstēšanas metodes var izraisīt akūtu iekaisumu audzēja zonā, tādējādi palielinot ar audzēju saistītu antigēnu parādīšanos T. šūnām, tādējādi liekot vēža šūnām pakļaut ICD8,9. Audzēja šūnas, kurām tiek veikta ICD, pastiprināti regulētu "apēstu mani" signālus, pakļaujot kalretikulīnu (CRT) uz imunogēniski mirstošu audzēja šūnu virsmām, un "bīstamības" signālus, atbrīvojot augstas mobilitātes grupas 1. lodziņu (HMGB1), veicinot dendrītu šūnu aktivāciju. lai aktivizētu CTL, kuru aktivitāti varētu pastiprināt anti-PD-L1, tādējādi ievērojami uzlabojot pretvēža imūnterapiju51.

8. attēls Uz COS-BA/Ce6 NP balstītas ķīmijterapijas/PDT plus kontrolpunkta blokādes anti-PD-L1 imūnterapijas pretvēža iedarbība. (A) Uz CNP balstītas ķīmijterapijas/PDT shematisks ilustrācija ar anti-PD-L1 terapiju. (BeD) (B) Audzēja augšanas profili, (C) vidējais audzēja svars un (D) izgrieztu audzēju attēli no reprezentatīvām pelēm primārajiem (labajiem) audzējiem pēc dažādām 14 dienu ilgas ārstēšanas, kā norādīts. (EeG) (E) Audzēja augšanas līknes, (F) vidējais audzēja svars un (G) izgrieztu audzēju attēli neapstarotiem attāliem (kreisajiem) audzējiem pēc dažādām ārstēšanas metodēm, kā norādīts. (H) CD8þ T šūnu populācijas labajā audzējos un (J) CTL infiltrācijas procentuālais daudzums tika kvantitatīvi noteikts ar plūsmas citometriju pēc 14 ārstēšanas dienām. (I, K) CD8þ T šūnu populācijas kreisās puses audzējos 14. dienā tika kvantitatīvi noteiktas ar plūsmas citometriju (n Z 3). Citokīnu sekrēcija serumos pēc 14 dienu ārstēšanas, ieskaitot (L) IFN-g un (M) TNF-a, ko mēra ar ELISA testu (n Z 3). (N) Peļu ķermeņa svara izmaiņas dažādu ārstēšanu laikā. *P < 0.05, **P < 0,01 un ***P < 0,001 parāda būtiskās atšķirības.

Otrkārt, šajā darbā COS-BA / Ce6 NP var vienlaikus izplatīties kreisajā un labajā audzējā, gan kreisajai ķīmijterapijai, gan labai ķīmijterapijai / PDT ir milzīgs potenciāls izraisīt audzēja šūnas, kurām tiek veikta ICD. Tikmēr COS-BA/Ce6 NP tiek ievadīti tikai vienā devā, imūnterapija galvenokārt ir atkarīga no trim anti-PD-L1 devām, neatkarīgi no tā, vai tā ir ķīmijterapija vai ķīmijterapija/PDT, tie ir tikai primeri. Terapeitiskās atšķirības audzēja šūnu ICD ierosināšanā starp individuālo ķīmijterapiju un kombinēto ķīmijterapijas/PDT ārstēšanu var nebūt ļoti pamanāmas. CD8þ CTL procentuālais daudzums kreisajā pusē (8. att. un K. att.) un labajā pusē (8. H. un J. att.) arī apstiprināja iepriekš minēto pieņēmumu. PDT klātbūtnē vai bez tās netika novērotas būtiskas atšķirības CD8þ CTL. Tāpēc COS-BA/Ce6 NP plus anti-PD-L1 ar vai bez apstarošanas sasniedza līdzīgu pretvēža efektivitāti pret kreisajiem audzējiem. Turklāt, tā kā 4T1 šūnas ekspresē zemu PD-L152 līmeni, ir plaši pierādīts, ka tikai anti-PD-L1 ir kāda izteikta imūnterapijas ietekme uz 4T1 krūts vēzi53, 54. Neskatoties uz COS-BA/Ce6 NP izraisītajiem ICD efektiem, ir nepieciešama turpmāka izmeklēšana, iesniegtie rezultāti ir parādījuši, ka COS-BA/Ce6 NP ar anti-PD-L1 palīdzību sasniedz ievērojami uzlabotu imūnās atbildes reakciju. Kopumā šķiet, ka COS-BA / Ce6 NP patiešām pastiprināja anti-PD-L1 vēža imūnterapiju, nevis tikai kombinēto terapiju. Lai gan anti-PD-L1 plus COS-BA/Ce6 NP ar vai bez PDT terapijas neuzrādīja būtiskas terapeitiskās iedarbības atšķirības, abiem bija acīmredzami uzlabota pretvēža efektivitāte, salīdzinot ar vienu COS-BA/Ce6 NP devu. Tas nozīmē, ka pat bez vieglas apstrādes pēc imūnadjuvanta antiPD-L1 ieviešanas var palielināt audzēja atlieku imunogenitāti pēc COS-BA/Ce6 NPs ķīmijterapijas, izraisot ievērojamas sistēmiskas pretvēža imūnās atbildes reakcijas, tādējādi radot efektīvu nomākšanu. primārie vai attālie audzēji. Tādējādi klīniskās pretvēža imūnterapijas laikā ar atkārtotu ārstēšanu ar NP vajadzētu būt iespējai novērst primāros un metastātiskus audzējus. Skaidrs, ka šie rezultāti kopā sniedz pierādījumus par ļoti efektīvām un sinerģiskām pretvēža imūnreakcijām, ko izraisa COS-BA/Ce6 NP kombinācijā ar anti-PD-L1 blokādi, vai nu ar ķīmijterapiju atsevišķi, vai kombinācijā ar ķīmijterapiju/PDT.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

4. Secinājumi

Rezumējot, mēs mērķtiecīgi izstrādājām, sintezējām un izstrādājām bioloģiski saderīgu, bioloģiski noārdāmu, zemu toksisku, bet ļoti efektīvu un klīniski pieejamu pārveidotu fotoķīmijterapijas nanopreparātu COS-BA/Ce6 NP, apvienojot trīs daudzfunkcionālus komponentus pašmontētu dabīgo mazmolekulu betulīnskābi. (BA), ūdenī šķīstošs COS un zems toksisks fotosensibilizators Ce6 kombinētai ķīmijterapijai/PDT. Pēc tam tas izraisa ļoti efektīvas un sinerģiskas pretaudzēju imūnās atbildes reakcijas kombinācijā ar anti-PD-L1 blokādi, vai nu ar ķīmijterapiju atsevišķi, vai kombinācijā ar ķīmijterapiju/PDT. Konkrēti, mēs parādām, ka doba tīkla molekulārais izkārtojums var veicināt čaumalas strukturētu nanodaļiņu veidošanos. Ūdenī šķīstošās COS modifikācijas varētu ievērojami uzlabot lipofīlo dabisko mazo molekulu pretvēža aktivitāti, izveidojot amfifilu priekšzāļu. Mēs arī parādām, ka iegūtajām nanozālēm bija vairākas labvēlīgas terapeitiskās īpašības, īpaši gudra "miega" funkcija ar mānīgu ķīmijterapijas efektu. Apvienojumā ar īpatnējo pH jutīgumu, šie kopējie mezgli nodrošina zemu toksicitāti un bioloģisko drošību ar normāliem audiem, bet ir ļoti toksiski audzēja audiem. Kopā ar uzlabotu 1 O2 paaudzi, labu bioloģisko noārdīšanos un bioloģisko saderību, kas viss veicināja ļoti efektīvu, sinerģisku un drošu pretvēža ķīmijterapiju/PDT/imūnterapiju. Jo īpaši individuāla ķīmijterapija bez PDT terapijas var aktivizēt sistēmiskas pretvēža imūnās atbildes, paverot pievilcīgas iespējas klīniski sinerģiskai pretvēža ķīmijterapijas imūnterapijai. Kopumā šis darbs sniedz daudzsološu ieskatu dabisku daudzfunkcionālu, ļoti bioaktīvu un zemu toksisku nanoimūnstimulantu izstrādē klīniskai imūnterapijai.

Atsauces

1. Sang W, Zhang Z, Dai YL, Chen XY. Jaunākie sasniegumi uz nanomateriāliem balstītā sinerģiskā kombinētā vēža imūnterapijā. Chem Soc Rev 2019;48:3771e810.

2. Li XY, Guo XM, Ling JB, Tang Z, Huang GN, He LZ u.c. Uz nanomedicīnu balstītas vēža imūnterapijas, kas izstrādātas, pārprogrammējot ar audzēju saistītus makrofāgus. Nanomērogs 2021;13:4705e27.

3. Chao Y, Xu LG, Liang C, Feng LZ, Xu J, Dong ZL u.c. Kombinētā lokālā imūnstimulējošā radioizotopu terapija un sistēmiskā imūnās kontrolpunkta blokāde rada spēcīgas pretvēža reakcijas. Nat Biomed Eng 2018;2:611e21.

4. Wen YY, Chen X, Zhu XF, Gong YC, Yuan GL, Qin XY u.c. Fototermiskās ķīmijterapijas integrētās nanodaļiņas ar audzēja mikrovides reakciju uzlaboja imunogēno šūnu nāves indukciju kolorektālā vēža efektīvai ārstēšanai. ACS Appl Mater Interfaces 2019;11:43393e408.

5. Peng JR, Xiao Y, Yang Q, Liu QY, Chen Y, Shi K u.c. Peptīdu pārprogrammētu mazo molekulu nanomezglu intracelulāra agregācija uzlabo vēža ķīmijterapiju un kombinatorisko imūnterapiju. Acta Pharm Sin B 2021;11:1069e82.

6. Song W, Kuang J, Li CX, Zhang MK, Zheng DW, Zeng X u.c. Uzlabota imūnterapija, kuras pamatā ir fotodinamiskā terapija gan primārā, gan plaušu metastāžu audzēja izskaušanai. ACS Nano 2018;12: 1978e89.

7. Wang C, Xu LG, Liang C, Xiang J, Peng R, Liu Z. Imunoloģiskās atbildes reakcijas, ko izraisa fototermiskā terapija ar oglekļa nanocaurulēm kombinācijā ar anti-CTLA-4 terapiju, lai kavētu vēža metastāzes. Adv Mater 2014;26:8154e62.

8. He CB, Duan XP, Guo NN, Chan C, Poon C, Weichselbaum RR u.c. Kodola apvalka nanomēroga koordinācijas polimēri apvieno ķīmijterapiju un fotodinamisko terapiju, lai pastiprinātu kontrolpunkta blokādes vēža imūnterapiju. Nat Commun 2016; 7:12499.

9. Galluzzi L, Buque A, Kepp O, Zitvogel L, Kroemer G. Immunogēno šūnu nāve vēža un infekcijas slimību gadījumā. Nat Rev Immunol 2017;17: 97e111.

10. Chiang CS, Lin YJ, Lee R, Lai YH, Cheng HW, Hsieh CH u.c. Fukoidāna magnētisko nanodaļiņu un imūnmodulatoru kombinācija uzlabo audzēja lokalizētu imūnterapiju. Nat Nanotechnol 2018;13:746e54.

11. Zheng XL, Ge JC, Wu JS, Liu WM, Guo L, Jia QY u.c. Bioloģiski noārdāma hipokretīna atvasinājuma nanovezikula kā gandrīz infrasarkanās gaismas vadīta teranostika dubultai fotoaktīvai vēža attēlveidošanai un terapijai. Biomateriāli 2018;185:133e41.

12. Spicer CD, Jumeaux C, Gupta B, Stevens MM. Peptīdu un olbaltumvielu nanodaļiņas konjugē daudzpusīgas platformas biomedicīnas lietojumiem. Chem Soc Rev 2018;47:3574e620.

13. Mei YL, Wang RB, Jiang W, Bo Y, Zhang TF, Yu JL u.c. Nesenie panākumi nanomateriālos nukleīnskābju piegādei vēža imūnterapijā. Biomater Sci 2019; 7:2640e51.

14. Zheng YL, Ye JX, Li ZY, Chen HJ, Gao Y. Nesenie sasniegumi sonofotodinamiskajā vēža terapijā: no izstrādātiem jauniem sensibilizatoriem līdz uz nanotehnoloģiju balstītām efektivitātes uzlabošanas stratēģijām. Acta Pharm Sin B 2021;11:2197e219.

15. Li SK, Zou QL, Li YX, Yuan CQ, Xing RR, Yan XH. Gudras uz peptīdu bāzes veidotas supramolekulāras fotodinamiskas metalo-nano zāles, kas izstrādātas ar daudzkomponentu koordinācijas pašsavienojumu. J Am Chem Soc 2018; 140:10794e802.

16. Zhi KK, Wang JC, Zhao HT, Yang X. Pašsamontēts mazu molekulu dabīgo produktu gēls zāļu piegādei: izrāviens jaunā mazmolekulāro dabisko produktu pielietojumā. Acta Pharm Sin B 2020;10: 913e27.

17. Yang X, Ma C, Chen ZM, Liu J, Liu FY, Xie RB u.c. Atsevišķas mazas molekulas saliktas nanodaļiņas nodrošina efektīvu perorālo zāļu piegādi. Nano Res 2019;12:2468e76.

18. Zhi KK, Zhao HT, Yang X, Zhang H, Wang JC, Wang J u.c. Dabīgo produktu želatori un vispārīga metode to iegūšanai no organismiem. Nanomērogs 2018;10:3639e43.

19. Cheng JJ, Fu SY, Qin Z, Han Y, Yang X. Pašsamontētas dabiskas mazas molekulas diterpēna skābes ar labvēlīgu pretvēža aktivitāti un bioloģisko drošību sinerģiski uzlabotai pretvēža ķīmijterapijai. J Mater Chem B 2021;9:2674e87.

20. Wang JC, Zhao HT, Zhi KK, Yang X. Dabiskā aktīvā mazo molekulu zāļu iekraušanas procesa un ļoti efektīvas sinerģiskas pretaudzēju efektivitātes izpēte. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:6827e39.

21. Cheng JJ, Zhao HT, Yao L, Li Y, Qi BK, Wang J u.c. Vienkārši un daudzfunkcionāli dabiski pašizveidoti sterīni ar pretvēža aktivitātes izraisītiem supramolekulāriem fotosensibilizatoriem uzlabotai pretvēža fotodinamiskai terapijai. ACS Appl Mater saskarnes 2019;11: 29498e511.

22. Cheng JJ, Zhao HT, Wang JC, Han Y, Yang X. Bioaktīva dabiskā mazo molekulu noregulēta gaismjutīgu zāļu kopa ļoti efektīvai sinerģiskai un uzlabotai I tipa fotoķīmijterapijai. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:43488e500.

23. Wang JC, Zhao HT, Qiao WS, Cheng JJ, Han Y, Yang X. Nanomedicine-cum-carrier, kopā montējot dabiskus mazus produktus, lai uzlabotu sinerģisku pretaudzēju ar audu aizsargājošu darbību. ACS Appl Mater Interfaces 2020;12:42537e50.

24. Xi JC, Liu HP. Nesenie sasniegumi pašpiegādes amfifilo zāļu un vakcīnu izstrādē. Adv Ther 2019;3:1900107.

25. Zhang RS, Qin XF, Kong FD, Chen PW, Pan GJ. Uzlabot terapeitisko vienību uzņemšanu šūnās, mijiedarbojoties ar šūnu membrānas sastāvdaļām. Drug Deliv 2019;26:328e42.

26. Pujals S, Giralt E. Ar prolīnu bagāti, amfipātiski šūnās iekļūstoši peptīdi. Adv Drug Deliv Rev 2008;60:473e84.

27. Karimi M, Ghasemi A, Sahandi Zangabad P, Rahighi R, Moosavi Basri SM, Mirshekari H u.c. Gudras mikro/nanodaļiņas uz stimuliem reaģējošās zāļu/gēnu piegādes sistēmās. Chem Soc Rev 2016;45: 1457e501.

28. Cheng JJ, Li XY, Wang S, Han Y, Zhao HT, Yang X. Nesēju nesaturoši triterpēna priekšzāles ar glutationa reakciju un bioloģisko drošību sinerģiski uzlabotai fotoķīmijterapijai. ACS Appl Mater Interfaces 2021;13:245e56.

29. Li XS, Lee SY, Yoon J. Supramolekulārie fotosensibilizatori atjauno fotodinamisko terapiju. Chem Soc Rev 2018;47:1174e88.

30. Zou P, Yuan SJ, Yang X, Guo YZ, Li LN, Xu CW u.c. Hitozāna oligosaharīdu strukturālais raksturojums un pretvēža iedarbība pret ortotopisku aknu audzēju, izmantojot NF-KB signalizācijas ceļu. J Funct Foods 2019;57:157e65.

31. Zhai XC, Yuan SJ, Yang X, Zou P, Li NL, Li GY u.c. Hitozāna oligosaharīdi izraisa apoptozi cilvēka nieru karcinomā, izmantojot no reaktīvā skābekļa sugas atkarīgo endoplazmatiskā tīkla stresu. J Agric Food Chem 2019;67:1691e701.

32. Deng G, Ma C, Zhao HT, Zhang SQ, Liu J, Liu FY u.c. Prettūskas un antioksidantu kombinētā terapija išēmiskam insultam, izmantojot gliburīdu saturošas betulīnskābes nanodaļiņas. Theranostics 2019;9: 6991e7002.

33. Liu K, Xing RR, Zou QL, Ma GH, Mo¨hwald H, Yan XH. Vienkārša peptīdu noregulēta fotosensibilizatoru pašmontāža pretvēža fotodinamiskai terapijai. Angew Chem Int Ed Engl 2016;55:3036e9.

34. Li Y, Lin JY, Wang PY, Luo Q, Lin HR, Zhang Y u.c. Uz audzēja mikrovides reaģējošas formas maiņas pašmērķīga vīrusa iedvesmotas nanozāles attēlveidošanas vadītai tuvu infrasarkano staru II fototermiskai ķīmijterapijai. ACS Nano 2019;13:12912e28.

35. Sawada SI, Sato YT, Kawasaki R, Yasuoka JI, Mizuta R, Sasaki Y u.c. Nanogel hibrīda montāža eksosomu intracelulārai piegādei: ietekme uz endocitozi un saplūšanu, izmantojot eksosomu virsmas polimēru inženieriju. Biomater Sci 2020;8:619e30.

36. Chou TC. Teorētiskā bāze, eksperimentālais dizains un datorizēta sinerģisma un antagonisma simulācija zāļu kombināciju pētījumos. Pharmacol Rev 2006;58:621e81.

37. Zhao YP, Zhao YN, Ma QS, Sun B, Wang QP, Ding Z u.c. Bez nesēja, divfunkcionāli nanostieņi, izmantojot tīru zāļu molekulu pašsavienojumu sinerģiskai ķīmijfotodinamiskai terapijai. Int J Nanomed 2019;14:8665e83.

38. Ma X, Zhao YL. Supramolekulāro sistēmu biomedicīnas pielietojumi, kuru pamatā ir saimnieka un viesa mijiedarbība. Chem Rev 2015;115:7794e839.

39. Qin XH, Zhang MZ, Hu X, Du Q, Zhao ZP, Jiang Y u.c. Jaunizveidota hlora e6 atvasinājuma nanoinženierijas izstrāde pastiprinātai fotodinamiskai terapijai, regulējot laktāta metabolismu. Nanomērogs 2021;13:11953e62.

40. Du Q, Qin XH, Zhang MZ, Zhao ZP, Li Q, Ren XM u.c. Mitohondriju vielmaiņas regulējama nanozāle, kas nesatur nesēju, lai palielinātu fototermālās terapijas jutīgumu. Chem Commun (Camb) 2021;57:8993e6.

41. Li XS, Yu S, Lee D, Kim G, Lee B, Cho Y u.c. Vienkārša supramolekulāra pieeja ar nukleīnskābēm saistītai aktivizējamai nanoteranostikai, kas novērš fotodinamiskās terapijas trūkumus. ACS Nano 2018; 12:681e8.

2. Gilson RC, Black KC, Lane DD, Achilefu S. Hibrīda TiO2-rutēnija nanofotosensibilizators sinerģiski rada reaktīvas skābekļa sugas gan hipoksiskos, gan normoksiskos apstākļos. Angew Chem Int Ed Engl 2017;56:10717e20.

43. Xu SD, Yuan YY, Cai XL, Zhang CJ, Hu F, Liang J u.c. Singleta-tripleta enerģijas starpības regulēšana: unikāla pieeja efektīviem fotosensibilizatoriem ar agregācijas izraisītas emisijas (AIE) īpašībām. Chem Sci 2015; 6:5824e30.

44. Wu WB, Mao D, Xu SD, Kenry, Hu F, Li XQ u.c. Polimerizācija, pastiprināta fotosensibilizācija. Chem 2018; 4:1937e51.

45. Kundu PK, Samanta D, Leizrowice R, Margulis B, Zhao H, Bo¨rner M u.c. Ar gaismu kontrolēta fotoreaģējošu nanodaļiņu pašmontāža. Nat Chem 2015; 7:646e52.

46. ​​Miyazaki M, Yuba E, Hayashi H, Harada A, Kono K. Hialuronskābes bāzes pH jutīgas polimēru modificētas liposomas šūnu specifiskām intracelulārām zāļu piegādes sistēmām. Bioconjug Chem 2018;29:44e55.

47. Zhang JY, Liu ZN, Lian P, Qian J, Li XW, Wang L u.c. Selektīva attēlveidošana un vēža šūnu nāve, izmantojot pH pārslēdzamu gandrīz infrasarkano fluorescenci un fototermiskos efektus. Chem Sci 2016; 7:5995e6005.

48. Cheng JJ, Tan GH, Li WT, Zhang HY, Wu XD, Wang ZQ u.c. Vienkārša sintēze ar hitozāna palīdzību daudzfunkcionālu magnētisko Fe3O4@SiO2@CS@pyropheophorbide-a fluorescējošu nanodaļiņu fotodinamiskai terapijai. Jauns J Chem 2016;40:8522e34.

49. Cheng JJ, Wang S, Zhao HT, Liu Y, Yang X. Izpētīt pašsavienošanās mehānismu un efektīvu sinerģisku pretaudzēju ķīmijfototerapiju bioloģiski noārdāmam un glutationam reaģējošam ursolskābes priekšzāļu mediētam gaismjutīgam nanozāles līdzeklim. Biomater Sci 2021; 9: 3762e75.

50. Yang Y, Xu J, Sun Y, Mo LT, Liu B, Pan XS u.c. Uz aptameru balstīta loģiskās skaitļošanas reakcija uz dzīvām šūnām, lai nodrošinātu ne-antivielu imūnās kontrolpunkta blokādes terapiju. J Am Chem Soc 2021;143: 8391e401.

51. Kuai R, Yuan WM, Son SJ, Nam J, Xu Y, Fan YC u.c. Konstatētu audzēju likvidēšana ar kombinētu ķīmijimunterapiju, kuras pamatā ir nanodiski. Sci Adv 2018;4:eaao1736.

52. Lesniak WG, Chatterjee S, Gabrielson M, Lisok A, Wharram B, Pomper MG u.c. PD-L1 noteikšana audzējos, izmantojot [(64)Cu]atezolizumabu ar PET. Bioconjug Chem 2016;27:2103e10.

53. Sagiv-Barfi I, Kohrt HEK, Czerwinski DK, Ng PP, Chang BY, Levy R. Terapeitisko pretaudzēju imunitāti ar kontrolpunkta blokādi pastiprina ibrutinibs, gan BTK, gan ITK inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 2015;112:E966e72.

54. Liang C, Chao Y, Yi X, Xu J, Feng LZ, Zhao Q u.c. Nanodaļiņu mediēta iekšējo radioizotopu terapija, lai lokāli palielinātu audzēja asinsvadu caurlaidību sinerģiski uzlabotai vēža terapijai. Biomateriāli 2019;197:368e79.