Iepriekšējas sagatavošanas aktivētais AKT kontrolē neironu toleranci pret išēmiju, izmantojot MDM2–p53 ceļuⅡ

3. Diskusija

Mūsu rezultāti atklāj, ka IPC izraisīta PI3K / AKT signalizācijas ceļa aktivizēšana izraisa neironu IT, kontrolējot MDM2 – p53 kompleksu primārajos garozas neironos. Vispirms mēs apstiprinājām sagatavošanas efektivitāti neiroaizsardzības ziņā [33, 39–41], izmantojot apstiprinātu IPC eksperimentālo modeli.

Noklikšķiniet uz cistanche tubulosa blakusparādības Neuron

Mēs noskaidrojām, ka eksperimentālā IPC, ko izraisīja īsa (20 min) skābekļa un glikozes atņemšana (OGD), kam sekoja 2 h reoksigenācija, izraisīja neiroprotekciju, par ko liecina gan neironu apoptozes, gan ilgstošas ​​inducētās kaspāzes -3 aktivācijas novēršana. OGD (90 min), kam seko 4 h reoksigenācija (OGD/R). Mēs parādām, ka IPC samazina kaspāzes -3 aktivāciju garozas neironos, kas korelē ar mazāku apoptozi pēc sekojoša un smagāka išēmiska apvainojuma.

Līdzsvars starp pro- un antiapoptotiskiem signāliem ir būtisks, lai nodrošinātu neironu izdzīvošanu pēc išēmijas [3,33,38,42–44]. Lai gan šādu notikumu nozīme ir pierādīta gan hemorāģiskā, gan išēmiskā in vivo insulta modeļos [43,45], mehānismi, kas regulē šos signalizācijas ceļus, vēl nav pilnībā izprotami išēmiskās tolerances kontekstā. Antiapoptotiskā AKT loma un ar to saistītie ceļi ir plaši pētīti vēža šūnās [46,47] un smadzeņu audos [38,48]; tomēr līdz šim AKT / MDM2–p53 signalizācijas ceļa loma IPC mediētā neironu tolerancē pret išēmisku traumu joprojām ir nenotverama.

Šeit mēs noskaidrojām, ka IPC izraisītā PI3K/AKT signalizācijas ceļa aktivizēšana veicina MDM2 fosforilēšanos pie Ser166, kas izraisa tā kodola translokāciju un proteīna stabilizāciju, novēršot p53-inducētu apoptozi, izmantojot kaspāzes-3 aktivāciju. pēc išēmijas. AKT aktivizēšana ar fosforilēšanas palīdzību veicina neironu izdzīvošanu [24, 49] un var veicināt IT indukciju [25, 50]. Mūsu rezultāti liecina, ka AKT proteīna relatīvais daudzums nemainās išēmisku vai sagatavošanas stimulu ietekmē. Interesanti, ka mēs noskaidrojām, ka agrīna PI3K mediētā AKT fosforilēšana pie Ser473 novērš išēmijas izraisītu p53 stabilizāciju iepriekš sagatavotajos neironos.

Ietekme nebija saistīta ar p53 mRNS līmeņa izmaiņām [33, 34, 44], bet gan ar samazinātu p53 proteīna līmeni, ko izraisīja IPC pirms OGD/R. Tā kā MDM2 ir galvenais p53 stabilizācijas regulators un arī tiešs AKT mērķis, mūsu rezultāti norāda uz AKT / MDM2 – p53 signalizācijas ceļa lomu neironu tolerancē pret išēmiju. MDM2 mRNS strauji palielinās pēc OGD [34], bet MDM2 aktivitāti galvenokārt kontrolē pēctranslācijas modifikācijas, īpaši fosforilēšana [51]. Labi vienojoties ar to, mēs atklājām, ka pēc IPC aktivizēšanas ar fosforilēšanu AKT savukārt fosforilē MDM2 atlikumā Ser166, kas atrodas netālu no kodola lokalizācijas signāla [52], un šis efekts saglabājas pēc OGD/R traumas.

Mūsu rezultāti liecina, ka MDM2 fosforilēšana pie Ser166 ir pietiekama, lai ar p53 destabilizācijas palīdzību radītu IPC mediētu neiroprotektīvo efektu. Tādējādi šeit mēs identificējām no laika atkarīgu AKT / MDM2 – p53 ceļa aktivizēšanu pēc išēmiskas traumas un patiešām parādām, ka IPC aktivēta AKT izraisīja ārpusdzemdes MDM2 kodola translokāciju, kā arī endogēno proteīnu stabilizāciju.

Turklāt AKT paliek aktīvs kodolā, kur PI3K varētu arī migrēt, reaģējot uz oksidatīvo stresu, un pēc tam ņemt vērā AKT fosforilēšanos [53]. PI3K-mediētās AKT vai AKT knockdown fosforilācijas inhibīcija veicina MDM2 proteīna aizturi citoplazmā un novērš MDM2 Ser166 fosforilāciju, kā arī IPC mediētu neiroprotekciju pret išēmijas izraisītu neironu apoptozi. Gluži pretēji, mēs parādījām, ka aktīvā AKT saistās ar kodola MDM2 proteīnu.

Tā rezultātā aktīvā AKT veicina gan MDM2 fosforilāciju, gan tā kodola stabilizāciju, kas veicina IPC mediētu neiroprotekciju. Mūsu rezultāti atklāj, ka IPC veicinātā neiroaizsardzība bija atkarīga no PI3K mediētas AKT aktivācijas, kas fosforilēja MDM2 pie Ser166, veicinot MDM2 kodola uzkrāšanos pēc išēmiska apvainojuma.

Attiecīgi PI3K / AKT inhibīcija ar wortmannīna vai AKT samazināšanās ar siRNS palīdzību atcēla IPC veicināto neiroprotekciju, izraisot p53 stabilizāciju un sekojošu neironu apoptozi pēc išēmijas. Tādējādi mūsu rezultāti palīdz noskaidrot no IPC atkarīgās AKT – MDM2 ceļa aktivācijas būtisko lomu neironu izdzīvošanā pret išēmiskiem bojājumiem.

P53 proteīns ir iesaistīts neironu nāves/izdzīvošanas kontrolē, kas nosaka prognozi insulta pacientiem [34, 42, 54], kā arī TIA pacientiem [3]. P53 stabilizācija apdraud iepriekšējas kondicionēšanas izraisītu neiroprotekciju līdz išēmijas/reperfūzijas bojājumiem [33]. Tāpēc MDM2–p53 mijiedarbība šajā kontekstā būs kritiska neironu izdzīvošanai [34] un IPC mediētai tolerancei pret išēmisku traumu [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G MDM2 promotorā nosaka MDM2 ekspresiju un, savukārt, modulē pacientu, kas cieš no insulta, atveseļošanos [34].

Turklāt mēs novērojām, ka Tp53 gēns SNP (rs1042522) modulē mitohondriju p53 stabilizāciju un neironu toleranci pret išēmiju, vienlaikus prognozējot funkcionālo atveseļošanos pacientiem, kuri cieš no TIA pirms insulta [3]. Tāpēc p53 apoptotisko ceļu kontrole būs būtiska, lai nodrošinātu IPC neiroprotektīvo efektu.

Šie rezultāti nodrošina translācijas pieeju pētījumam, ko nākotnē varētu īstenot pacientu labā, un tie rada PI3K / AKT – MDM2 – p53 signalizācijas ceļu kā būtisku mērķi iepriekšējas sagatavošanas veicinātajām IT stratēģijām išēmiskā insulta gadījumā. Rezumējot, mēs parādām, ka IPC uzlabotais PI3K / AKT signalizācijas ceļš veicina MDM2 fosforilēšanos pie Ser166, izraisot MDM2 kodola translokāciju un tās stabilizāciju, kas izraisa neironu IT, veicinot p53 destabilizāciju un sekojošu apoptotiskās nāves inaktivāciju, kas izraisīta pēc išēmiska apvainojuma.

Mūsu rezultāti izceļ AKT agrīnas aktivizēšanas iespējamos ieguvumus IPC mediētā neironu tolerancē, kas regulē MDM2 – p53 apoptotisko ceļu išēmiska bojājuma gadījumā. Šie atklājumi izceļ iespēju izprast mehānismus, kas regulē neironu AKT – MDM2 – p53 signalizācijas ceļu, lai izstrādātu jaunas neiroprotektīvas stratēģijas ar IT saistītiem traucējumiem.

4. Materiāli un metodes

4.1. Kortikālo neironu primārās kultūras

Neironu kultūras tika sagatavotas no C57Bl/6J vai p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) peles embrija (14.5E) garozas. Neironus iesēja ar ātrumu 1,8 × 105 šūnas/cm2 Neurobasal barotnē, kas papildināta ar 2% B27 un 2 mM glutamīnu (Invitrogen, Madride, Spānija) un inkubēja 37 ◦C mitrinātā, 5% CO2- saturošā atmosfērā [ 55].

4.2. Skābekļa glikozes atņemšanas un sagatavošanas modeļi

Pēc 9–1{{10}} dienām in vitro (DIV) neironi tika pakļauti skābekļa un glikozes atņemšanai (OGD), inkubējot šūnas 37 ◦C temperatūrā 90 minūtes inkubatorā. aprīkots ar gaisa slūžu un nepārtraukti gāzēts ar 95 procentiem N2/5 procentiem CO2. Inkubācijas barotne (buferēts Henksa šķīdums bez glikozes: 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 un pH 9 iepriekš tika gāzēts ar 9 % HEPES, 20 % 7 HEPES. /5 procenti CO2 30 min. Šādos apstākļos skābekļa koncentrācija inkubācijas vidē bija 6,7 ​​± 0,5 µM, mērot ar Clark tipa skābekļa elektrodu [56,57].

Ja norādīts, neironi tika pakļauti išēmiskai sagatavošanai (IPC; īss OGD 20 minūtes, kam sekoja 2 h reoksigenācija) pirms sekojošas ilgstošas ​​išēmijas (OGD, 90 min) un 4 h reoksigenācijas (IPC plus OGD/R) (S1B attēls). ). Paralēli neironi tika inkubēti normoksijā (Nx) 37 ◦C mitrinātā atmosfērā ar 95 procentiem gaisa/5 procentiem CO2 vai išēmiskā sagatavošanās (IPC). Ja norādīts, neironi tika inkubēti 30 minūtes pirms IPC buferētā Henksa šķīdumā (pH 7, 4), bez wortmannīna (100 nmol/L) vai tā klātbūtnē, kā aprakstīts iepriekš [19].

4.3. Šūnu transfekcijas

Neironi (8 DIV) vai HEK-293T šūnas tika transficētas ar plazmīdas vektoru, kas ekspresē ar YFP marķētu Mdm2 no cilvēka MDM2 promotora. MDM2p/Mdm2-YFP bija dāvana no Uri Alon & Galit Lahav (Addgene plazmīda Nr. 53962, Votertauna, MA, ASV) [58]. Ja nepieciešams, tādos pašos apstākļos kā kontrole tika izmantots tukšs vektors (pYFP). Plazmīdu transfekcija tika veikta, izmantojot Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, ASV), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Šūnas tika transficētas ar 1, 5 µg / µL plazmīdu vektoru un izmantotas pēc 24 stundām.

AKT notriekšana 6 DIV neironos tika panākta, transfekējot ar maziem traucējošiem divpavedienu ribonukleotīdiem (siRNS). Mērķa sekvences bija šādas: 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisense: 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (pele, s62216, kas atbilst nukleotīdiem 1006–1025, GenBank pievienošanās numurs NM) [{{9]}. Kā negatīvo kontroli mēs izmantojām Silencer™ Select Negative Control Nr. 1 siRNA (siControl). Visas siRNS tika iegādātas no Ambion®, Invitrogen® un Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Vācija). Saskaņā ar proteīnu notriekšanas pakāpi tika lēsts, ka siRNS transfekcijas efektivitāte ir 70–80 procenti 3 dienas pēc transfekcijas. Klusināšanas eksperimentiem neironi tika transficēti ar siRNS (10 nM), izmantojot Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), ievērojot ražotāja norādījumus. Pirms lietošanas neironus tālāk inkubēja Neurobasal vidē 72 stundas.

4.4. Apoptotisko šūnu nāves plūsmas citometriskā noteikšana

Neironi tika rūpīgi atdalīti no plāksnēm, izmantojot 1 mM EDTA tetranātrija sāli PBS (pH 7,4), un tika iekrāsoti ar aneksīnu V/APC un 7-AAD, veicot tieši tā, kā aprakstīts iepriekš [55].

4.5. Kaspāzes-3 aktivitātes tests

Kaspāzes-3 aktivitāte tika novērtēta šūnu lizātos [33] un saskaņā ar ražotāja norādījumiem, izmantojot SIGMA fluorimetriskās analīzes komplektu CASP3F, un nolasīja emisijas laikā pie viļņa garuma 405 nm. Metode ir balstīta uz fluorescējošās 7-amino4-metilkumarīna (AMC) daļas izdalīšanos. AMC koncentrāciju aprēķina, izmantojot AMC standartu.

4.6. Imūnbloti un līdzimūnprecipitācijas tests

Neironi tika lizēti buferšķīdumā, kas satur 1 procentu SDS, 2 mM EDTA, 150 mM NaCl, 12,5 mM Na2HPO4 un 1 procentu Triton X-100 (NP40: 1 procents NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{13). }} mM, NaCl 135 mM un 10 procenti glicerīna), kas papildināts ar fosfatāzes inhibitoriem (1 mM Na3VO4 un 50 mM NaF) un proteāzes inhibitoriem (100 mM fenilmetilsulfonilfluorīds, 50 µg/mL anti-papaīns, 50 µg/mL peµg/m 5 pstatīns µg/mL amastatīna, 50 µg/mL leupeptīna, 50 µg/mL bestatīna un 50 µg/mL sojas pupu tripsīna inhibitoru), uzglabā uz ledus 30 minūtes un vāra 5 minūtes. Lizētu ekstraktu alikvotas tika pakļautas SDS poliakrilamīda gēlam (MiniProtean®, Bio-Rad) un blotētas ar antivielām nakti 4 ◦C temperatūrā. Izmantotās antivielas bija anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-šķeltās kaspāzes -3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, ASV), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290; nosaka arī YFP) (Abcam, Cambridge, UK), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberga, Vācija) un antiGAPDH (Ambion, Kembridža, Apvienotā Karaliste) nakti 4 ◦C. Pēc inkubācijas ar mārrutku peroksidāzi konjugētu kazu anti-trušu IgG (Pierce, Thermo Scientific) vai kazas anti-peles IgG (Bio-Rad) membrānas nekavējoties inkubēja ar pastiprinātu ķīmisko luminiscences SuperSignal West Dura (Pierce) 5 minūtes pirms iedarbības ar Kodak. XAR-5 filma 1 līdz 5 minūtes, un tika skenētas autoradiogrammas. Joslu intensitātes tika noteiktas, izmantojot ImageJ 1.48v programmatūru, kā aprakstīts iepriekš [60].

Lai veiktu koimunoprecipitācijas testu, neironi tika lizēti ledusaukstā buferšķīdumā, kas satur 50 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 procentu NP-40), kas papildināts ar iepriekš aprakstītajiem fosfatāzes inhibitoriem. Pēc gružu attīrīšanas ar centrifugēšanu neironu lizātus (100 mg) inkubēja ar 1 mg antivielas 24 stundas 4 °C temperatūrā, pēc tam pievienoja 10 ml proteīna A-agarozes (GE Healthcare Life Sciences) 2 stundas 4 °C temperatūrā. ◦C. Imunoprecipitāti tika plaši mazgāti ar līzes buferi un izšķīdināti ar SDS-PAGE un imūnblotēti ar norādītajām antivielām [61]. Relatīvais olbaltumvielu daudzums ir parādīts S1 attēlā. Pilni bloti un gēla skenēšana ir iekļauta S3 attēlā.

4.7. Imūncitoķīmija un attēlu analīze

Neironi tika audzēti uz stikla segstikliņiem un fiksēti ar 4% (w/v, PBS) paraformaldehīdu 30 minūtes un imūnkrāsoti ar trušu anti-fosfoAKT (Ser473; 9271; Cell Signaling, MA, ASV), peles anti-MDM2 (2A10, ab-16895), peles anti-MAP2 (1:500; M#1406, Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV) [55], peles anti-p53 (1:200; 554157, BD Pharmingen , Sandjego, Kalifornija, ASV) un anti-GFP (1:1000; ab290; apstiprināts arī YFP noteikšanai). Imunomarķēšana tika noteikta, izmantojot sekundārās antivielas pret trušu IgG–Cy3 vai anti-peles IgG–Cy2 (1:500; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, UK).

Kodoli tika iekrāsoti ar 40,6-diamidino-2 fenilindolu (DAPI; D9542, Sigma-Aldrich). Pārsegstikliņi tika mazgāti, uzstādīti SlowFade gaismas pretizbalēšanas reaģentā (Invitrogen) uz stikla priekšmetstikliņiem un pārbaudīti, izmantojot mikroskopu (Nikon Inverted microscope Eclipse Ti-E, (NY, ASV), kas aprīkots ar 40x objektīvu, iepriekš centrētu Nikon Intensilight šķiedru apgaismotāju. C-HGFI un melnbalta ar lādiņu savienota ierīce digitālā kamera Hamamatsu ORCAER vai skenējošais lāzera konfokālais mikroskops ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokija, Japāna) ar trim lāzeriem 405, 491 un 561 nm, aprīkots ar 40×, 63× un 100× PL Apo eļļas imersijas objektīvu augstas izšķirtspējas attēlveidošanai un ierīces digitālajai kamerai Evolve Photometrics.

Visi mikroskopa iestatījumi tika iestatīti tā, lai savāktu fluorescējošos attēlus zem piesātinājuma, un tie tika saglabāti nemainīgi visiem eksperimentā uzņemtajiem attēliem. Attēli tika analizēti ar ImageJ 1.48v programmatūru (Nacionālie veselības institūti). P (Ser473) AKT plus un p53 plus neironu procentuālais daudzums un p (Ser473) AKT un p53 maksimālās proteīna fluorescences intensitātes kvantitatīvais novērtējums ir parādīts S2A attēlā. Ar MDM2-GFP transfektētiem neironiem MDM2-GFP nukleocitoplazmatiskais sadalījums tika aprēķināts kā kodola vidējās fluorescences attiecība pret endogēnā MDM2 citoplazmas vidējo fluorescenci, ko mēra 24 neironos (seši neironi uz katru stāvoklis četrās dažādās neironu kultūrās) (S2B attēls) [62].

Lai kvantitatīvi noteiktu endogēnās MDM2 krāsošanas un pSer473AKT maksimālo kodolfluorescences intensitāti, tika izmērīti 40 neironi (10 neironi katrā stāvoklī četrās dažādās kultūrās) (S2C attēls), kā aprakstīts iepriekš [44]. Reprezentatīvajos šķērsgriezuma intensitātes profilos, kas parādīti 5.B attēlā, p(Ser473)AKT un MDM2 procentuālā daļa, kas norādīta zem katra stāvokļa, tika kvantificēta kā kodola vidējā fluorescence. Visos gadījumos kodoli tika identificēti ar DAPI krāsošanu. Maksimālā kodola MDM2 fluorescences intensitāte neironos, kas apstrādāti ar wortmannin vai siAkt, ir parādīta S2D attēlā.

4.8. Statistiskā analīze

Eksperimenta rezultāti tika novērtēti ar vienvirziena dispersijas analīzi, kam sekoja Bonferroni post hoc tests, ko izmantoja, lai salīdzinātu vērtības starp vairākām grupām. Rezultāti ir izteikti kā vidējie ± SEM. Divu vērtību grupu salīdzināšanai tika izmantots Stjudenta t-tests. Visos gadījumos p < 0.05 tika uzskatīts par nozīmīgu (* p < 0,05 pret Nx; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Kā Cistanche aizsargā neironus?

Ir daži pierādījumi, kas liecina, ka Cistanche var aizsargāt neironus, samazinot apoptozi (ieprogrammētu šūnu nāvi) un veicinot neironu izdzīvošanu. Apoptoze ir dabisks process, kas notiek organismā, lai noņemtu bojātas vai nevēlamas šūnas, bet tas var būt kaitīgs, ja tas notiek pārmērīgi vai neatbilstoši. Laboratorijas pētījumos ir konstatēts, ka Cistanche inhibē apoptozi, un šī iedarbība var palīdzēt aizsargāt neironus no bojājumiem.

Turklāt Cistanche satur vairākus bioaktīvus savienojumus, kuriem ir pierādīta neiroprotektīva iedarbība. Piemēram, tas satur ehinakozīdu, kas, kā pierādīts, aizsargā neironus no oksidatīvā stresa un iekaisuma. Tas satur arī akteozīdu, kuram ir konstatētas pretiekaisuma un antioksidanta īpašības.

Atsauces

1. Embersons, Dž. Lees, KR; Laidens, P.; Blekvels, L.; Albers, G.; Bluhmki, E.; Brotts, T.; Koens, G.; Deiviss, S.; Donnans, G.; un citi. Ārstēšanas kavēšanās, vecuma un insulta smaguma ietekme uz intravenozas trombolīzes ietekmi ar alteplāzi akūta išēmiska insulta gadījumā: atsevišķu pacientu datu metaanalīze no randomizētiem pētījumiem. Lancet 2014, 384, 1929–1935. [CrossRef]

2. Wang, W.-W.; Čens, D.-Z.; Džao, M.; Yang, X.-F.; Gongs, D.-R. Iepriekšējiem pārejošiem išēmiskiem lēkmēm var būt neiroprotektīva iedarbība pacientiem ar išēmisku insultu. Arch. Med. Sci. 2017, 5, 1057–1061. [CrossRef] [PubMed]

3. Ramos-Araque, ME; Rodrigess, C.; Vecīno, R.; Garsija, EK; Alfonso, MDL; Barba, MS; Colàs-Campàs, L.; Purroy, F.; Arenillas, Dž.F.; Almeida, A.; un citi. Neironu išēmisko toleranci nosaka Tp53 Arg72Pro polimorfisms. Tulk. Stroke Res. 2019, 10, 204–215. [CrossRef] [PubMed]

4. Jadekola, C.; Anrather, J. Stroke pētījumi krustcelēs: jautājiet smadzenēm norādījumus. Nat. Neirosci. 2011, 14, 1363–1368. [CrossRef] [PubMed]

5. Džao, C.; Dzjans, M.; Džans, L.; Hu, Y.; Hu, Z.; Džans, M.; Qi, J.; Su, A.; Lū, N.; Sjaņ, X.; un citi. Peroksisomu proliferatora aktivētais gamma receptors piedalās smadzeņu išēmiskās tolerances iegūšanā, ko izraisa išēmiska sagatavošana, izmantojot glia glutamāta transporteri 1 in vivo un in vitro. J. Neurochem. 2019, 151, 608–625. [CrossRef]

6. Rodrigess, C.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M. Smadzeņu pārorientēšana: jaunas pieejas neiroaizsardzībā pret išēmisku traumu. Neurochem. Res. 2021, 46, 51–63. [CrossRef] [PubMed] 7. Stenzels-Pūrs, MP; Stīvensa, SL; Sjons, Z.; Lesovs, NS; Haringtona, AC; Mori, M.; Mellers, R.; Rozencveiga, HL; Tobar, E.; Šovs, ET; un citi. Išēmiskās sagatavošanas ietekme uz genoma reakciju uz smadzeņu išēmiju: līdzība ar neiroprotektīvajām stratēģijām hibernācijas un hipoksiju tolerantos stāvokļos. Lancet 2003, 362, 1028–1037. [CrossRef]

8. Gidday, JM Smadzeņu priekškondicionēšana un išēmiskā tolerance. Nat. Rev. Neurosci. 2006, 7, 437–448. [CrossRef] [PubMed]

9. Stetler, RA; Noplūde, R.; Gan, Y.; Li, P.; Džans, F.; Hu, X; Jings, Z.; Čens, Dž.; Zigmonds, MJ; Gao, Y. Iepriekšēja sagatavošana nodrošina neiroprotekciju CNS slimību modeļos: paradigmas un klīniskā nozīme. Prog. Neirobiol. 2014, 114., 58.–83. [CrossRef] [PubMed]

10. Kohs, S.; Della Morte, D.; Deivs, KR; Sacco, RL; Peress-Pinzons, AM Biomarķieri išēmiskai sagatavošanai: atbildes reakcijas atrašana. Br. J. Pharmacol. 2014, 34, 933–941. [CrossRef]

11. La Russa, D.; Frisina, M.; Secondo, A.; Bageta, G.; Amantea, D. Smadzeņu veikalā darbināmā kalcija ievadīšanas regulējošā faktora (SARAF) un perifēro orai1 modulācija pēc fokālās cerebrālās išēmijas un iepriekšējas sagatavošanas pelēm. Neirozinātne 2020, 441, 8.–21. [CrossRef]

12. Sisalli, MJ; Annunziato, L.; Scorziello, A. Novel Cellular Mechanisms for Neuroprotection in Ischemic Preconditioning: A View from Inside Organellus. Priekšpuse. Neirol. 2015, 6, 115. [CrossRef]

13. Durukāns, A.; Tatlisumak, T. Pirmskondicionēšanas izraisīta išēmiska tolerance: logs endogēnā gearing cerebroprotection. Exp. Tulk. Stroke Med. 2010, 2., 2. [CrossRef]

14. Broughton, BR; Reutens, D.; Sobey, CG; Sims, K.; Politei, J.; Banikazemi, M.; Lee, P. Apoptotiskie mehānismi pēc smadzeņu išēmijas. Stroke 2009, 40, 788–794. [CrossRef]

15. Džao, H.; Sapoļskis, RM; Steinberg, GK Phosphoinositide{1}}Kināzes/Akt izdzīvošanas signālu ceļi ir saistīti ar neironu izdzīvošanu pēc insulta. Mol. Neirobiol. 2006, 34, 249–270. [CrossRef]

16. Uzdensky, AB Apoptozes regulēšana penumbrā pēc išēmiska insulta: pro- un antiapoptotisku proteīnu ekspresija. Apoptoze 2019, 24, 687–702. [CrossRef] [PubMed]

17. Fukunaga, K.; Kawano, T. Akt ir molekulārais mērķis signālu transdukcijas terapijai smadzeņu išēmiskā apvainojumā. J. Pharmacol. Sci. 2003, 92, 317–327. [CrossRef] [PubMed]

18. Zhao, EY; Efendizade, A.; Cai, L.; Ding, Y. Akt (proteīnkināzes B) un proteīnkināzes C loma išēmijas-reperfūzijas bojājumos. Neirol. Res. 2016, 38., 301.–308. [CrossRef] [PubMed]

19. Delgado-Estebans, M.; Martīns-Zanka, D.; Andress-Martins, L.; Almeida, A.; Bolanos, JP PTEN inhibēšana ar peroksinitrītu aktivizē fosfoinositīda-3-kināzes/Akt neiroprotektīvo signālu ceļu. J. Neurochem. 2007, 102., 194.–205. [CrossRef]

20. Menings, BD; Toker, A. AKT/PKB Signalizācija: Navigācija tīklā. Šūna 2017, 169, 381–405. [CrossRef] [PubMed]

21. Diezs, H.; Garido, Dž. Wandosell, F. Specific Roles of Akt iso Forms in Apoptosis and Axon Growth Regulation in Neirons. PLoS ONE 2012, 7, e32715. [CrossRef]

22. Santi, SA; Lee, H. Akt izoformas atrodas atsevišķās subcelulārās vietās. Am. J. Physiol. Fiziol. 2010, 298, C580–C591. [CrossRef]

23. Yang, C.; Talukder, MH; Varadharadžs, S.; Velauthems, M.; Zweier, JL Agrīnai išēmiskai sagatavošanai nepieciešama Akt un PKA mediēta eNOS aktivācija, izmantojot serīna1176 fosforilāciju. Sirds un asinsvadu sistēmas. Res. 2012, 97, 33.–43. [CrossRef] [PubMed]

24. Ouyang, Y.-B.; Tan, Y.; Ķemme, M.; Liu, C.-L.; Martone, ME; Siesjö, BK; Hu, B.-R. Izdzīvošanu un nāvi veicinoši notikumi pēc pārejošas cerebrālās išēmijas: Akt fosforilācija, citohroma C izdalīšanās un kaspazei līdzīgu proteāžu aktivizēšana. Br. J. Pharmacol. 1999, 19, 1126–1135. [CrossRef] [PubMed]

25. Li, S.; Hafēzs, A.; Noorulla, F.; Gengs, X.; Šao, G.; Ren, C.; Lu, G.; Džao, H.; Dings, Y.; Ji, X. Neiroprotekcijas sagatavošana: no hipoksijas līdz išēmijai. Prog. Neirobiol. 2017, 157., 79.–91. [CrossRef] [PubMed]

26. Mayo, LD; Donner, DB Fosfatidilinozīta 3-kināzes/Akt ceļš veicina Mdm2 pārvietošanos no citoplazmas uz kodolu. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 2001, 98, 11598–11603. [CrossRef]

27. Eškrofts, M.; Ludvigs, RL; Vudss, DB; Koplenda, TD; Vēbers, HO; Makrejs, EJ; Vousden, KH HDM2 fosforilēšana ar Akt. Onkogēns 2002, 21, 1955–1962. [CrossRef]

28. Džou, BP; Liao, Dž.; Xia, W. HER-2/neu inducē p53 ubikvitināciju, izmantojot Akt mediētu MDM2 fosforilāciju. Nat. Cell Biol. 2001, 3, 973–982. [CrossRef]

29. Grosmans, SR; Peress, M.; Kung, AL; Jāzeps, M.; Mansurs, C.; Sjao, Z.-X.; Kumar, S.; Haulijs, P.; Livingston, DM p300/MDM2 kompleksi piedalās MDM2-mediētā p53 degradācijā. Mol. Cell 1998, 2, 405–415. [CrossRef]

30. Tots, A.; Niksons, P.; Qin, LL; Erhardt, P. Diferenciālā kardiomiocītu izdzīvošanas un hipertrofijas regulēšana ar MDM2, E3 ubikvitīna ligāzi. J. Biol. Chem. 2006, 281, 3679–3689. [CrossRef]

31. Hauzenlojs, dīdžejs; Tsangs, A.; Mocānu, MM; Yellon, DM Išēmiskā sagatavošana aizsargā, aktivizējot prosurvival kināzes reperfūzijas laikā. Am. J. Physiol. Circ. Fiziol. 2005, 288, H971–H976. [CrossRef] [PubMed]

32. Mocānu, MM; Yellon, DM p53 pazemināta regulēšana: jauns molekulārs mehānisms, kas iesaistīts išēmiskā sagatavošanā. FEBS Lett. 2003., 555., 302.–306. [CrossRef]

33. Vecīno, R.; Burguete, MC; Jover-Mengual, T.; Agulla, J.; Bobo-Džimeness, V.; Saloms, JB; Almeida, A.; Delgado-Esteban, M. MDM2-p53 ceļš ir saistīts ar iepriekšējas kondicionēšanas izraisītu neironu toleranci pret išēmiju. Sci. Rep. 2018, 8, 1610. [CrossRef] [PubMed]

34. Rodriguez, C.; Ramos-Araque, M.E.; Domínguez-Martínez, M.; Sobrino, T.; Sánchez-Morán, I.; Agulla, J.; Delgado-Esteban, M.; Gómez-Sánchez, J.C.; Bolaños, J.P.; Castillo, J.; et al. Single-Nucleotide Polymorphism 309T>G MDM2 veicinātājā nosaka funkcionālo rezultātu pēc insulta. Stroke 2018, 49, 2437–2444. [CrossRef]

35. Fens, Dž. Parks, J.; Krons, P.; Hess, D.; Hemmings, BA PKB/Akt hidrofobā motīva Ser-473 kināzes kā no DNS atkarīgas proteīna kināzes identificēšana. J. Biol. Chem. 2004, 279, 41189–41196. [CrossRef]

36. Lai, TW; Džans, S.; Wang, YT Eksitotoksicitāte un insults: jaunu neiroaizsardzības mērķu identificēšana. Prog. Neirobiol. 2014, 115., 157.–188. [CrossRef] [PubMed]

37. Konstantīno, LC; Binder, LB; Vandresens-Filju, S.; Viola, GG; Ludka, FK; Lopes, MW; Leal, RB; Tasca, CI. Fosfatidilinozīta-3 kināzes ceļa loma NMDA sagatavošanā: dažādi mehānismi krampjiem un hinolīnskābes izraisītai hipokampu neironu deģenerācijai. Neirotox. Res. 2018, 34, 452–462. [CrossRef]

38. Sje, R.; Čens, M.; Li, M.; Xiong, X.; Daadi, M.; Sapoļskis, RM; Zhao, H. Akt izoformas atšķirīgi aizsargā pret insulta izraisītiem neironu bojājumiem, regulējot mTOR aktivitātes. Br. J. Pharmacol. 2013, 33, 1875–1885. [CrossRef]

39. Soriano, FX; Papadija, S.; Hofmanis, F.; Hardingema, NR; Badings, H.; Hardingham, GE Iepriekšējas sagatavošanas NMDA devas veicina neiroprotekciju, uzlabojot neironu uzbudināmību. J. Neurosci. 2006, 26, 4509–4518. [CrossRef]

40. Grabb, MC; Choi, DW išēmiskā tolerance peles kortikālo šūnu kultūrā: NMDA receptoru kritiskā loma. J. Neurosci. 1999, 19, 1657–1662. [CrossRef]

41. Čens, M.; Lu, T.-J.; Čens, X.-J.; Džou, Y.; Čens, K.; Feng, X.-Y.; Sju, L.; Duans, V.-H.; Xiong, Z.-Q. NMDA receptoru apakštipu atšķirīgās lomas išēmiskā neironu šūnu nāvē un išēmiskā tolerance. Stroke 2008, 39, 3042–3048. [CrossRef]

42. Gomess-Sančess, JC; Estebans, MD; Rodrigess-Ernandess, I.; Sobrino, T.; De La Ossa, NP; Reverte, S.; Bolaños, JP; Gonsaless Sarmiento, R.; Castillo, J.; Almeida, A. Cilvēka Tp53 Arg72Pro polimorfisms izskaidro dažādas funkcionālās prognozes insulta gadījumā. J. Exp. Med. 2011, 208, 429–437. [CrossRef]

43. Sju, V.; Gao, L.; Li, T.; Džens, Dž.; Šao, A.; Zhang, J. Mesencephalic Astrocyte Derived Neurotrophic Factor (MANF) aizsargā pret neironu apoptozi, aktivizējot Akt/MDM2/p53 signalizācijas ceļu intracerebrālās asiņošanas žurkas modelī. Priekšpuse. Mol. Neirosci. 2018, 11, 176. [CrossRef] [PubMed]

44. Sančess-Morāns, I.; Rodrigess, C.; Lapreša, R.; Agulla, J.; Sobrino, T.; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. Nuclear WRAP53 veicina neironu izdzīvošanu un funkcionālo atjaunošanos pēc insulta. Sci. Adv. 2020, 6, eabc5702. [CrossRef]

45. Burmistrova, O.; Oliass-Arjona, A.; Lapreša, R.; Himeness-Blasko, D.; Eremejeva, T.; Šišovs, D.; Romanovs, S.; Zakurdajeva, K.; Almeida, A.; Fedičevs, PO; un citi. Mērķauditorijas atlase PFKFB3 atvieglo smadzeņu išēmijas un reperfūzijas bojājumus pelēm. Sci. Rep. 2019, 9, 1.–13. [CrossRef]

46. ​​Tu, Y.; Kims, E.; Gao, Y.; Rankins, GO; Li, B.; Chen, YC Theaflavin-3, 30 -gallate inducē apoptozi un G2 šūnu cikla apstāšanos caur Akt/MDM2/p53 ceļu cisplatīna rezistentā olnīcu vēža A2780/CP70 šūnās. Int. J. Oncol. 2016, 48, 2657–2665. [CrossRef] [PubMed]

47. Vans, V.; Hou, Y.; Van, K.; Čens, Y.; Pu, X.; Jā, X. LXR-623-inducētā garā nekodējošā RNS LINC01125 nomāc krūts vēža šūnu proliferāciju, izmantojot PTEN/AKT/p53 signalizācijas ceļu. Šūnu nāve Dis. 2019, 10, 248. [CrossRef] [PubMed]

48. Tao, J.; Cui, Y.; Duans, Y.; Džans, N.; Vangs, C.; Džans, F. Puerarins mazina kustību un kognitīvo deficītu, kā arī hipokampu neironu bojājumus, izmantojot PI3K/Akt1/GSK-3 signālu ceļu smadzeņu išēmijas in vivo modelī. Oncotarget 2017, 8, 106283–106295. [CrossRef] [PubMed]

49. Janelidze, S.; Hu, B.-R.; Siesjö, P.; Siesjö, BK Akt1 (PKB) un p70S6K izmaiņas pārejošā fokālās išēmijas gadījumā. Neirobiol. Dis. 2001, 8, 147–154. [CrossRef] [PubMed]

50. Pignataro, G.; Boscia, F.; Espozito, E.; Sirabella, R.; Kuomo, O.; Vinčigerra, A.; Di Renco, G.; Annunziato, L. NCX1 un NCX3: divi jauni smadzeņu išēmijas aizkavētas priekškondicionēšanas efektori. Neirobiol. Dis. 2012, 45, 616–623. [CrossRef]

51. Li, J.; Kurokawa, M. MDM2 stabilitātes regulēšana pēc DNS bojājumiem. J. Cell. Fiziol. 2015., 230., 2318.–2327. [CrossRef]

52. Olsons, DC; Marešals, V.; Momands, J.; Čens, Dž.; Romockis, C.; Levine, AJ Vairāku mdm-2 proteīnu un mdm-2-p53 proteīnu kompleksu identificēšana un raksturojums. Oncogene 1993, 8, 2353–2360. [PubMed]

53. Uranga, RM; Katz, S.; Salvador, GA Uzlabotai fosfatidilinozīta 3-kināzei (PI3K)/Akt signalizācijai ir pleiotropiski mērķi hipokampu neironos, kas pakļauti dzelzs izraisītam oksidatīvajam stresam. J. Biol. Chem. 2013, 288, 19773–19784. [CrossRef] [PubMed]

54. Almeida, A.; Sančess-Morāns, I.; Rodríguez, C. Mitohondriju un kodolenerģijas p53 tirdzniecība kontrolē neironu jutību insulta gadījumā. IUBMB Life 2021, 73, 582–591. [CrossRef] [PubMed]

55. Delgado-Estebans, M.; Garsija-Higēra, I.; Maestre, C.; Moreno, S.; Almeida, A. APC/C-Cdh1 attīstības laikā koordinē neiroģenēzi un kortikālo izmēru. Nat. Commun. 2013, 4, 2879. [CrossRef] [PubMed]

56. Constantino, LC NMDA receptoru loma smadzeņu rezistences attīstībā, izmantojot pirms- un pēckondicionēšanu. Novecošanās Dis. 2014, 5, 430–441. [CrossRef]

57. Almeida, A.; Estebans, MD; Bolaños, JP; Medina, JM Skābekļa un glikozes trūkums izraisa mitohondriju disfunkciju un oksidatīvo stresu neironos, bet ne astrocītos primārajā kultūrā. J. Neurochem. 2002, 81, 207–217. [CrossRef]

58. Ļavāvs, G.; Rozenfelds, N.; Sigal, A.; Geva-Zatorskis, N.; Levine, AJ; Elovics, MB; Alons, U. P53-Mdm2 atgriezeniskās saites cilpas dinamika atsevišķās šūnās. Nat. Genet. 2004, 36, 147–150. [CrossRef]

59. Li, J.; Karaplis, AC; Huanga, DC; Zīgels, PM; Kamirands, A.; Yang, XF; Mullers, WJ; Krēmers, R. PTHrP veicina krūts audzēja ierosināšanu, progresēšanu un metastāzes pelēm un ir potenciāls terapeitiskais mērķis. Dž.Klins. Izpētīt. 2011, 121, 4655–4669. [CrossRef]

60. Maestre, C.; Estebans, MD; Gomess-Sančess, JC; Bolaños, JP; Almeida, A. Cdk5 fosforilē Cdh1 un modulē ciklīna B1 stabilitāti eksitotoksicitātē. EMBO J. 2008, 27, 2736–2745. [CrossRef]

61. De Tudela, MV-P.; Estebans, MD; Maestre, C.; Bobo-Džimeness, V.; Džimeness-Blasko, D.; Vecīno, R.; Bolaños, JP; Almeida, A. Mitohondriju ciklīna B1-ciklīna atkarīgās kināzes-1 Bcl-xL-ATP sintāzes mijiedarbības regulēšana nosaka neironu izdzīvošanu. J. Neurosci. 2015, 35, 9287–9301. [CrossRef] [PubMed]

62. Bobo-Džimeness, V.; Estebans, MD; Angibaud, J.; Sančess-Morāns, I.; de la Fuente, A.; Jadžeja, Dž.; Nāgerls, UV; Castillo, J.; Bolaños, JP; Almeida, A. APC/CCdh1-Rock2 ceļš kontrolē dendritisko integritāti un atmiņu. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 2017, 114, 4513–4518. [CrossRef] [PubMed]