MiR{0}}b2/c dzēšana izraisa paātrinātu novecošanos un neiroprotezēšanu pelēm ar MPTP izraisītu Parkinsona slimību

Abstrakts

Pētījumi atklāj saikni starp miR{0}} novecošanā un Parkinsona slimību (PD). Šeit mēs parādām, ka miR-29 līmenis serumā 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridīna (MPTP) izraisītā PD pelēm bija dinamiskas izmaiņas. MiR-29b2/c nozīme novecošanā un PD tika pētīta, izmantojot miR-29b2/c gēna nokautas peles (miR-29b2/c KO). miR-29b2/c KO pelēm bija raksturīgs ievērojami mazāks svars, kifoze, muskuļu vājums un patoloģiska gaita, salīdzinot ar savvaļas tipa (WT) pelēm. WT arī attīstīja acīmredzamu dermas sabiezēšanu un taukaudu samazināšanos. Tomēr miR-29b2/c deficīts mazināja MPTP izraisītos dopamīnerģiskās sistēmas bojājumus un glia aktivāciju nigrostriatālajā ceļā un tādējādi uzlaboja ar MPTP ārstēto KO peļu motorisko funkciju. MiR-29b2/c izslēgšana inhibēja iekaisuma faktoru ekspresiju 1-metil-4-fenilpiridīnija (MPP plus ) apstrādātās primārās jauktu glia, primāro astrocītu vai ar LPS apstrādātās kultūrās. primārā mikroglija. Turklāt miR-29b2/c deficīts pastiprināja AMPK aktivitāti, bet nomāca NF-κB p65 signālu pārraidi glia šūnās. Mūsu rezultāti liecina, ka miR-29b2/c KO pelēm ir progērijai līdzīgs fenotips. Mazāk aktivētas glia šūnas un apspiests neiroiekaisums miR- 29b2/c KO pelēm var izraisīt dopamīnerģisku neiroprotekciju. Visbeidzot, miR-29b2/c ir iesaistīts novecošanas regulēšanā un tam ir kaitīga loma Parkinsona slimības gadījumā.

Atslēgvārdi

MiR-29b2/c; neiroaizsardzība; MPTP izraisīta Parkinsona slimība;Cistanche priekšrocības.

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtukāda ir Cistanche ietekme

Ievads

Parkinsona slimība (PD) ir otrā biežākā neirodeģeneratīvā slimība, ko raksturo progresējoša dopamīnerģisko neironu zudums vidussmadzeņu nigra par compacta (SNpc), kā arī pastiprināta glia aktivācija un neiroiekaisumi [1–3]. MikroRNS ir īsas nekodējošas RNS molekulas, kas regulē gēnu ekspresiju pēctranskripcijas līmenī [4, 5]. MikroRNS ir iesaistītas nervu sistēmas attīstības, neironu plastiskuma un neirodeģeneratīvo slimību regulēšanā. MikroRNS29 saimi (miR- 29) veido divas gēnu kopas: miR-29a/b1 un miR-29b2/c, kas atrodas attiecīgi 6. un 1. hromosomā. peles genoms. miR-29a un miR-29c ir tikai viena nukleotīda atšķirība, turpretim miR-29b1 un miR-29b2 secībā ir identiski [6]. miR{20}} ir iesaistīti vairākos bioloģiskos procesos. Daudzi miR-29 mērķa gēni ir eksperimentāli pārbaudīti, tostarp Procell izdzīvošanas gēni Bcl-2, Mcl-1, Cdc42 un p85-; proapoptotiskie gēni Puma, Bim, Bak un Bmf; un proinflammatoriskie citokīni IFN- un IL-12. Perifērās sistēmas pētījumi ir parādījuši, ka miR-29 ir iesaistīti audu fibrozē [7–9], vielmaiņā un imūnās regulēšanā [10–13].

miR{0}} plaši izpaužas centrālajā nervu sistēmā, un to transkripti pastāv gan neironos, gan glia šūnās [14, 15]. Arvien vairāk tiek parādīta saistība starp miR-29 un neiroloģiskām slimībām. miR-29 ir iesaistīti amiloīda ražošanas regulēšanā, un tie tiek pazemināti AD pacientu smadzenēs [16, 17]; miR-29 līmenis pazeminās arī Hantingtona slimības (HD) pacientiem un HD modeļa pelēm [18, 19], bet paaugstinās pacientiem ar amiotrofisko laterālo sklerozi (ALS) un ALS peļu modeļiem [16, 20]. Gan pelēm ar miR-29a/b-1-deficītu, gan miR-29 nepietiekami regulētām pelēm ir ataksijai līdzīgs fenotips [6, 21]. Attiecībā uz miR-29 ekspresijas ietekmi uz neiroprotekciju un neironu nāves veicināšanu išēmisku grauzēju modeļos tika ziņots par pretējiem rezultātiem [22, 23]. Iepriekšējos pētījumos mēs novērojām, ka miR{24}s līmenis PD pacientu serumā bija ievērojami pazemināts ar samazināšanās tendenci saistībā ar smagāku parkinsonismu [24]. Turklāt miR{26}s līmenis korelē ar atmiņas veiktspēju pacientiem ar PD [25]. Mēs secinājām, ka miR-29b2/c ir cieši saistīts ar PD, taču tā fizioloģiskās funkcijas un patoloģiskie mehānismi, kas saistīti ar PD, lielākoties nav zināmi.

Šajā pētījumā miR{0}} līmenis peles serumā, reaģējot uz MPTP ievadīšanu, tika mērīts līdz 120 dienām pēc injekcijas. MiR-29b2/c deficīta ietekme uz perifērajiem audiem tika pētīta, izmantojot miR-29b2/c KO peles. Dopamīnerģiskais neirotoksīns MPTP tika tālāk izmantots, lai izraisītu PD peles modeli. Pēc tam tika pētīti nigrostriatālās dopamīnerģiskās sistēmas ievainojumi, uzvedības rādītāji un iespējamie mehānismi. Mēs novērojām, ka miR-29 līmenis peles serumā uzrādīja dinamiskas izmaiņas pēc MPTP ievadīšanas. miR- 29b2/c KO pelēm bija paātrināta novecošanās, par ko liecina mazāks ķermeņa svars, taukaudu samazināšanās, kifoze, ādas sabiezēšana, muskuļu vājums un gaitas novirzes. Tomēr miR-29b2/c deficīts mazināja dopamīnerģiskos bojājumus un glia aktivāciju, un līdz ar to uzlaboja uzvedības rādītājus PD līdzīgā dzīvnieku modelī.

Cistanche tabletes

Rezultāts

1. Progerijai līdzīgais fenotips miR-29b2/c KO pelēm

miR-29b2/c nokautas peles (miR-29b2/c KO) tika ģenerētas, izmantojot CRISPR-Cas9 tehniku. Gēnu mērķauditorijas atlases un mutantu peļu genotipēšanas stratēģija tika parādīta 1. papildu attēlā. Četrus un 16- mēnešus vecām miR-29b2/c KO pelēm bija samazināts ķermeņa svars (1.A attēls). Trīs mēnešu vecumā miR-29b2/c KO peļu īpašības palika nemainīgas, kā to pierādīja rentgena mikrodatortomogrāfijas (mikro-CT) skenēšana (papildu attēls 2A). Kaulu minerālā blīvuma (KMB), trabekulu vidējā KMB, trabekulārās atdalīšanas, trabekulārā biezuma un strukturālā modeļa indeksa (SMI) atšķirības starp miR-29b2/c KO pelēm un to WT līdziniekiem 13 mēnešu vecumā ( Papildu attēls 2B). Krāsojot ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E), mēs atklājām, ka 13-mēnešus vecām miR-29b2/c KO pelēm bija sabiezināta derma ar palielinātām un padziļinātām grumbām (1.B, 1.C attēls). Un kifoze bija redzama 16-mēnesi vecām miR-29b2/c KO pelēm (1. C attēls). miR-29b2/c KO pelēm jaunā vecumā (3 mēnešus vecām) bija normāli taukaudi (papildu attēls 2C, 2D). Tomēr vēdera taukaudi (zemādas tauki un viscerālie tauki kopā) un brūnie taukaudi bija dramatiski samazinājušies miR-29b2/c KO pelēm, salīdzinot ar WT pelēm 16 mēnešu vecumā (1. D attēls). Turklāt tika analizēti novecošanās marķieru p21 un p53 transkripcijas līmeņi smadzenēs. Tie ievērojami palielinājās hipokampā, bet ne garozā miR-29b2/c KO pelēm sešu mēnešu vecumā. p53 un p16 proteīna līmenis miR-29b2/c deficīta hipokampā neatšķīrās no WT kontroles. Turklāt -galaktozidāzes aktivitāte, kas ir zināma šūnu novecošanās īpašība, neatšķīrās trīs mēnešus vecu WT un miR-29b2/c KO peļu smadzenēs.

Muskuļu vājums un gaitas anomālijas miR{0}}b2/c KO pelēm

Tika novērtēta miR-29b2/c deficīta peļu uzvedība. Muskuļu spēks tika mērīts ar stieples pakarināšanas un režģa piekāršanas testiem. Vadu pakarināšanas testā miR-29b2/c KO peles ieguva zemākus punktus nekā kontroles pelēm (2.A attēls). Un kritiena latentums bija ievērojami īsāks miR-29b2/c KO pelēm, salīdzinot ar savvaļas tipa līdziniekiem režģa pakarināšanas testā (2.B attēls), taču Rotarod testa veiktspēja WT un miR{10} }b2/c KO peles būtiski neatšķīrās (2.C attēls). Dzīvnieka gaitu noteica Catwalk XT analīzes sistēma. Pārsteidzoši, ka miR-29b2/c KO peles ātrums un soļa garums bija lielāki nekā to kolēģēm, turpretim soļu cikls, stāvēšanas un šūpošanās laiks bija īsāks un darba cikls samazināts miR{ {15}} peles ar b2/c deficītu (2.D attēls).

MiR{0}} izmaiņas MPTP izraisītā PD peles serumā

miR{0}} līmenis pazeminājās pacientu ar PD serumā, salīdzinot ar veselām kontrolēm [24]. Šajā pētījumā miR-29 līmenis PD peļu serumā tika noteikts 3, 30 un 120 dienas pēc subakūtas MPTP shēmas ievadīšanas. miR-29a un miR-29b līmenis samazinājās 3 dienas pēc injekcijas un atjaunojās līdz sākotnējām vērtībām 30 dienās, un atkal samazinājās pēc 120 dienām. Tomēr miR-29c līmenis būtiski nemainījās (5. papildu attēls).

Cistanche piedevas

miR-29b2/c deficīts mazina MPTP izraisītos nigrostriatālos ievainojumus un motorisko deficītu pelēm

miR-29b2/c nokautajām pelēm un WT metiena biedriem tika injicēts MPTP, lai ierosinātu PD modeli. P21, p53 un Pai1 ekspresijas līmeņi gan miR-29b2/c KO peles, gan WT kontroles striatumā pēc MPTP ievadīšanas nemainījās. MPTP iedarbība izraisīja ievērojamu TH pozitīvo dopamīnerģisko neironu skaita samazināšanos SNpc [F(1, 20)=5.441, P=0.0302] un TH pozitīvajos nervu terminālos, TH proteīnos. [F(1, 20)=10.5, P=0.0041] un dopamīna, DOPAC un HVA līmeni striatumā (3A–3D attēls). Tomēr nigrostriatālās traumas ar MPTP ārstētām miR-29b2/c KO pelēm tika ievērojami atvieglotas, salīdzinot ar MPTP apstrādātām WT kontrolēm, ņemot vērā dopamīnerģisko neironu skaitu, dopamīnerģisko nervu galu blīvumu un striatālā TH proteīna līmeni un dopamīna koncentrācija bija ievērojami augstāka; Turklāt izmaiņas attiecībā uz DOPAC pret DA un HVA attiecībām pret DA [F(1, 19)=12.64, P=0.0021] tika ievērojami mazinātas (3.A–3D attēls). Parastām miR-29b2/c KO pelēm, kas injicētas ar fizioloģisko šķīdumu, 5-HT un tā metabolīta 5-HIAA striatālā koncentrācija palielinājās, salīdzinot ar to WT līdziniekiem, un NE koncentrācija bija tuvu starp savvaļas tipa un miR-29b2/c KO peles (3.D attēls). Audzēšanas un pole testi tika izmantoti, lai novērtētu spontānu vertikālo aktivitāti [26, 27] un peļu lokomotoro aktivitāti [28]. Divas dienas pēc pēdējās MPTP injekcijas WT pelēm audzēšanas biežums pēdējo 2 minūšu laikā samazinājās, salīdzinot ar parasto ar fizioloģisko šķīdumu apstrādātām WT kontrolēm. Līdzīgi eksperimenti neatklāja miR- 29b2/c deficīta ietekmi uz MPTP izraisītajām pārmaiņām audzēšanas biežumā (3. E attēls). Līdzīgi kopējais laiks, kas pavadīts, lai pagrieztos un kāptu lejā, palielinājās WT pelēm pēc MPTP ievadīšanas Pole testā, turpretim kopējais laiks bija tuvu starp parastajām fizioloģiskā šķīduma un MPTP apstrādātām miR-29b2/c KO pelēm (3.F attēls). .

miR-29b2/c deficīts mazina MPTP izraisīto glia aktivāciju pelēm

PD patoloģijā ir iesaistīta glia šūnu aktivācija un glia šūnu izraisīts neiroiekaisums [29]. Astrocītu skaits WT peļu nigrostriatālajā ceļā ievērojami palielinājās, turpretim GFAP plus astrocīti palielinājās striatumā, bet ne SNpc [F(1, 8)=5.412, P=0.0484] no miR. -29b2/c KO peles trīs dienas pēc MPTP injekcijas. Konkrēti, astrocītu blīvums neatšķīrās divos WT un miR{10}}b2/c KO peļu reģionos, kas tika ārstēti ar MPTP (4.A un 4.B attēls). Iba 1 plus mikroglija palielinājās WT peļu melnās krāsas pamatnē un striatumā [F(1, 8)=12.74, P=0.0073] gan WT, gan miR{21} }b2/c KO peles pēc MPTP ievadīšanas. Turklāt miR-29b2/c KO pelēm MPTP injekcija ievērojami samazināja mikroglia blīvumu (4.C, 4D attēls).

2. MiR-29b2/c deficīta ietekme primāri kultivētos astrocītos

Tika izmantots skrāpējuma tests, lai pārbaudītu, vai miR-29b2/c deficīts ietekmēja astrocītu proliferāciju un migrāciju. Primārie miR-29b2/c KO astrocīti neuzrādīja atšķirību proliferācijas un migrācijas spējās. Sākotnējā līmenī primāro WT un miR-29b2/c KO astrocītu šūnu dzīvotspēja neatšķīrās. Pēc MPP plus intoksikācijas WT astrocītu šūnu dzīvotspēja bija augstāka nekā kontroles grupām, turpretim mutantu astrocītu dzīvotspēja nemainījās [F(1, 18)=5.727, P=0.0278 ]. Pastiprināta ROS produkta un glikozes uzņemšana tika novērota ar MPP plus apstrādātajiem WT un miR-29b2/c KO astrocītiem.

Cistanche tubulosa

Tika izmērīti neirotrofisko faktoru, ar iekaisumu saistīto molekulu, astrocītu A1 tipa un A2 tipa marķieru gēnu ekspresijas līmeņi MPP plus apstrādātajos astrocītos. 12 stundas pēc izaicinājuma BDNF ekspresija bija paaugstināta WT un miR-29b2/c KO astrocītos (5.A attēls). TGF- 1 ekspresijas līmenis tika ievērojami paaugstināts WT astrocītos pēc MPP plus iedarbības, savukārt miR- 29b2/c KO astrocītos tas bija pazemināts, salīdzinot ar savvaļas tipa astrocītiem gan sākumā, gan pēc. intoksikācija (5.B attēls). TNF transkripta bāzes līmenis bija zemāks miR-29b2/c KO astrocītos, salīdzinot ar WT astrocītiem. Pēc 12 stundu ilgas ārstēšanas IL-1, IL-6 un COX-2 ekspresijas līmeņi ievērojami palielinājās WT un miR-29b2/c astrocītos, bet TNF transkriptā. bija paaugstināts tikai WT astrocītos, un IL-1, TNF un COX-2 transkripti samazinājās miR-29b2/c KO astrocītiskajās šūnās, salīdzinot ar savvaļas tipa līdziniekiem (5.C attēls). . A1 marķieris H2-T23 un A2 marķieris CD14 bija ievērojami zemāks ar PBS apstrādātajos miR- 29b2/c KO astrocītos, salīdzinot ar WT kontrolēm. Pēc 12 stundu ilgas ārstēšanas A1 marķieri H2-D1, Ggta1 un C3 un A2 marķieri Clcf1 un S100 10 tika regulēti gan WT, gan miR-29b2/c KO astrocītos; H2-T23 palielinājās tikai WT astrocītos; Gbp2 un CD14 nemainījās divos astrocītu genotipos. Turklāt H2-T23, H2-D1 un CD14 transkripti miR-29b2/c KO astrocītos tika pazemināti, salīdzinot ar WT kontrolēm (5D, 5E attēls). 12 stundas un 24 stundas pēc apstrādes AMPK proteīnu un fosforilēto-AMPK proteīnu līmenis WT astrocītos nemainījās, savukārt 24 stundas pēc MPP plus iedarbības AMPK proteīna līmenis samazinājās miR-29b2/ c KO astrocīti, un p-AMPK attiecība pret AMPK mutantu astrocītos palielinājās, salīdzinot ar WT astrocītiem un arī ar PBS apstrādātiem mutantiem astrocītiem (5F attēls). Turklāt kondicionētā barotne no BV2 šūnām, kas apstrādātas ar PBS vai LPS (īsi saukta par CM un LCM), tika izmantota, lai stimulētu WT un miR-29b2/c KO peļu primāros astrocītus. Lai gan p-AMPK proteīna ekspresija pēc 12 stundu ilgas LCM ārstēšanas nemainījās, tā bija ievērojami augstāka miR-29b2/c KO astrocītos, salīdzinot ar WT astrocītiem. Mēs novērojām, ka pAMPK proteīni palielinājās abos astrocītu genotipos pēc 24 LCM ārstēšanas. LCM stimulācija ievērojami palielināja COX- 2 proteīnu ekspresiju [F(2, 18)=10.29, P=0.0010], tomēr COX-2 proteīna līmenis miR-29b2/c KO astrocītu skaits samazinājās, salīdzinot ar WT astrocītiem (5.G attēls). Nitrītu koncentrācija ar LCM apstrādātos miR-29b2/c KO astrocītos arī bija ievērojami zemāka, salīdzinot ar LCM apstrādātajiem WT astrocītiem [F(2, 30)=17, P<0.0001] (Figure 5H). Further, the expression of senescence marker genes was evaluated. 12 h-treatment of MPP+ increased p53 transcript levels in both WT and miR- 29b2/c KO astrocytes. p19 and Pai1 transcripts were elevated only in WT astrocytes, and Pai1 expression levels in miR-29b2/c KO astrocytes were decreased compared to WT astrocytes after the treatment. Moreover, Bcl-2, Bax protein levels, and the ratio of Bcl-2 to Bax did not change in WT and miR-29b2/c KO astrocytes.

3. MiR-29b2/c deficīta ietekme primāri kultivētās mikroglijās

Lai izmērītu miR-29b2/c deficīta mikroglia reakciju uz iekaisuma stimuliem, tika izmantota LPS. Sākotnēji BDNF ekspresijas līmenis bija zemāks miR-29b2/c KO mikroglijā. Četras un astoņas stundas pēc ārstēšanas ar LPS IL-1, IL-6, TNF un COX-2 transkriptu daudzums tika paaugstināts, savukārt IGF-1 ekspresija WT tika samazināta. un miR-29b2/c KO mikroglia šūnās, BDNF ekspresija samazinājās tikai WT mikroglijā [F(2, 27)=41.5, P<0.0001]. IL-10 transcript increased in WT and miR-29b2/c KO microglia [F(2, 27) = 3.753, P=0.0365], and TGF-β1 transcript decreased in WT microglia at eight hours after the LPS challenge. BDNF and TGF-β1 transcripts were not changed in miR-29b2/c KO microglia. In addition, IL-6 transcripts were significantly reduced in miR-29b2/c KO microglia after the challenge compared to WT controls, IGF-1 and IL-10 transcripts were markedly higher in miR-29b2/c KO microglia after four and eight hours of intoxication, respectively (Figure 6A–6C). At baseline, the p-AMPK protein level and pAMPK to AMPK ratio were dramatically elevated in miR-29b2/c KO microglia when compared with WT microglia. 24 h after the treatment of LPS, p-AMPK level [F(1, 17) = 5.066, P=0.0379] and the ratio [F(1, 17) = 5.537, P=0.0309] were elevated only in WT microglia (Figure 6D). At one hour after the treatment, the phosphorylated-NF-κB p65 (p-p65) proteins and pp65 to p65 ratio, but not p65 proteins, increased in wildtype and miR-29b2/c KO microglial cells, yet the ratio decreased modestly in miR-29b2/c KO microglial cells when compared with WT microglia (p=0.071) (Figure 6E). The expression of COX-2 was enhanced in the two genotypes of microglial cells; whereas, the level of COX-2 in mutant microglia decreased when compared with WT controls after 24 h-treatment of LPS [F(1, 17) = 5.33, P=0.0338] (Figure 6D). Nitrite product was induced by the treatment of LPS in both genotypes of microglia, however, it was dramatically lower in miR- 29b2/c KO microglia at baseline and after the treatment of LPS [F(1, 20) = 14.03, P=0.0013] (Figure 6F).

Diskusija

MiR-29 ģimenes locekļu ekspresija tiek regulēta vairākos audos, kad indivīdi kļūst vecāki [30–32]. Mūsu un citu laboratoriju darbi liecina par saistību starp miR{3}} un Parkinsona slimību [33]. Šajā pētījumā tika pētīta miR- 29b2/c nozīme novecošanā un Parkinsona slimībā. miR-29 iedarbojas uz novecošanos un novērš novecošanos atkarībā no audiem, sugām un attīstības stadijām. Mēs noskaidrojām, ka 3-mēnesi vecām miR-29b2/c KO pelēm ir normāls skelets un taukaudi, bet 4-mēnesi vecām miR- 29b2/c KO pelēm uzrādīja vieglāku ķermeņa svaru, salīdzinot ar viņu WT kolēģi, kas atbilst citiem pētījumiem [11, 34]. Muskuļu vājums un nestabila gaita tika konstatēta 3-mēnesi vecām miR- 29b2/c KO pelēm. Trīspadsmit mēnešus vecām miR-29b2/c KO pelēm bija dermas sabiezējums. Tomēr tiem bija normāla augšstilba kaula smalkā struktūra. Ķermeņa masas samazināšanās novēroja 16-mēnešus vecām miR-29b2/c KO pelēm. Šajā vecumā miR-29b2/c KO pelēm bija mazāk vēdera tauku un brūno tauku, un tām bija acīmredzama kifoze. miR-29 ir iesaistīti p53-mediētā šūnu cikla apstādināšanā [35, 36] un p16/Rb vadītā šūnu novecošanā [37]. Tomēr miR-29b2/c KO peles smadzenēs šūnu novecošanās nebija redzama. Tāpēc, lai gan miR-29b2/c veicina novecošanas regulēšanu, tā loma perifērajos audos un smadzenēs var atšķirties.

MiR{0}} līmenis serumā bija pazemināts pacientiem ar PD, salīdzinot ar veseliem kontroles pacientiem [24]. Šeit mēs atklājām, ka miR-29 ekspresija PD peles serumā svārstījās no 3 līdz 120 dienām pēc MPTP ievadīšanas. miR-29 smadzenēs ir daudz [6, 30]. Izmantojot GEO profilu, tiek konstatēts, ka miR-29c ekspresija ir pārregulēta PD pacientu melnajā substantijā (p=0.0059, pēc Manna-Vitnija testa), turklāt miR{{12 }}c ekspresija augšējā frontālajā girusā neatšķīrās (p=0.47, pēc Studenta-T testa), salīdzinot ar kontroles subjektiem (10. papildu attēls). Šeit miR-29b2/c KO pelēm tika ievadīts MPTP, lai izraisītu PD līdzīgus ievainojumus. Mutantajām pelēm bija mazāk smagi nigrostriatālās dopamīnerģiskās sistēmas ievainojumi un maigāka glia aktivācija un pēc tam zināmā mērā uzvedības rezistence. Tādējādi miR-29b2/c ir kaitīga loma PD patoloģijā. Mēs novērojām, ka MPTP izraisītajā peles PD modelī p21, p53 un Pai1 transkriptu striatālais līmenis nemainījās, kas liecina, ka šūnu novecošanās varētu nenotikt. Novecošana tiek uzskatīta par augsta riska faktoru PD attīstībai [38], tomēr ar novecošanos saistītas izmaiņas smadzenēs, īpaši dopamīnerģiskajā sistēmā, varētu būt svarīgāks faktors.

Primārā glia no WT un miR{0}}b2/c KO pelēm tika kultivēta, lai izpētītu pamatā esošos mehānismus. Ārstēšana ar MPP plus palielināja GDNF ekspresiju un samazināja IL-1 ekspresiju miR-29b2/c deficīta jauktā glijā. MPP plus arī palielināja proinflammatorisko gēnu ekspresiju WT astrocītos, bet ne miR- 29b2/c deficīta astrocītos. Tāpat mutanti astrocīti ražoja mazāk NO salīdzinājumā ar WT astrocītiem pēc tam, kad tie tika pakļauti kondicionētai BV2 šūnu barotnei, kas apstrādāta ar LPS. Primārajā mikrogliju kultūrā, salīdzinot ar LPS apstrādātajām WT kontrolēm, pretiekaisuma citokīna IL-10 un neirotrofiskā faktora IGF-1 transkripti bija ievērojami augstāki un pro-iekaisuma citokīna IL{ transkripti. {15}} samazinājās ar LPS apstrādātu miR-29b2/c KO mikrogliju. NO līmenis bija pazemināts miR-29b2/c KO mikroglijā sākotnējā līmenī un pēc LPS intoksikācijas. Pētījumi liecina, ka miR{20}s un daudzi prognozētie mērķa gēni ir iesaistīti vielmaiņas procesos [34, 39–41]. Ir pierādīts, ka AMPK kā būtisks regulators ir aizsargājošs PD, kad tas ir aktivizēts [42]. AMPK aktivizēšana stimulē Sirtuin 1 un netieši inhibē NF-κB aktivāciju un pakārtotos iekaisuma mērķa gēnus [43]. Mēs novērojām, ka fosforilētā-AMPK proteīna līmenis un p-AMPK attiecība pret AMPK tika pārregulēta attiecīgi ar LCM un MPP plus apstrādātajos miR- 29b2/c KO astrocītos. COX-2 proteīna līmenis bija pazemināts ar LCM apstrādātos mutantu astrocītos, salīdzinot ar WT astrocītiem. Sākotnēji AMPK aktivitāte bija paaugstināta miR-29b2/c KO mikroglijā. COX-2 proteīna daudzums bija ievērojami samazināts miR-29b2/c KO mikroglijā, salīdzinot ar WT kontroli pēc LPS ārstēšanas. Ārstēšanas laikā ar LPS p-p65 un p65 attiecība bija nedaudz pazemināta mutantu mikroglijā, kas nozīmē mazinātu NF-κB signālu ceļu. Mūsu rezultāti liecina, ka pastiprināta AMPK aktivitāte un samazināta glia iekaisuma reakcija aizsargā nigrostriatālo ceļu miR-29b2/c KO pelēm (6.G attēls). Visbeidzot, miR-29b2/c ir svarīga loma novecošanā un nigrostriatālās dopamīnerģiskās sistēmas bojājumos.

Atsauces

1. Braak H, Del Tredici K. Ielūgtais raksts: Nervu sistēmas patoloģija sporādiskas Parkinsona slimības gadījumā. Neiroloģija. 2008. gads; 70:1916–25.

2. Wang Q, Liu Y, Zhou J. Neiroinflammation in Parkinson's slimība un tās potenciāls kā terapeitisks mērķis. Transl Neurodegener. 2015. gads; 4:19.

3. Wang Z, Dong H, Wang J, Huang Y, Zhang X, Tang Y, Li Q, Liu Z, Ma Y, Tong J, Huang L, Fei J, Yu M u.c. NF-κB c-Rel izdzīvošana un pretiekaisuma loma Parkinsona slimības modeļos. Redox Biol. 2020. gads; 30:101427.

4. Zhu S, Wu H, Wu F, Nie D, Sheng S, Mo YY. MikroRNS- 21 ir vērsta pret audzēju nomācošiem gēniem invāzijā un metastāzēs. Cell Res. 2008. gads; 18:350–59.

5. Qiu L, Zhang W, Tan EK, Zeng L. MikroRNS funkcijas un regulēšanas atšifrēšana Alcheimera slimībā un Parkinsona slimībā. ACS Chem Neurosci. 2014. gads; 5:884–94.

6. Papadopoulou AS, Serneels L, Achsel T, Mandemakers W, Callaerts-Vegh Z, Dooley J, Lau P, Ayoubi T, Radaelli E, Spinazzi M, Neumann M, Hébert SS, Silahtaroglu A u.c. MiR-29a/b-1 klastera trūkums izraisa ataksiskas pazīmes un smadzeņu izmaiņas pelēm. Neirobiol Dis. 2015. gads; 73:275–88.

7. Hyun J, Choi SS, Diehl AM, Jung Y. Potenciālā loma Hedgehog signālu un mikroRNS-29 aknu fibrozē peles ar IKK deficītu. J Mol Histol. 2014. gads; 45:103–12.

8. Qin W, Chung AC, Huang XR, Meng XM, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. TGF-/Smad3 signalizācija veicina nieru fibrozi, inhibējot miR-29. J Am Soc Nephrol. 2011. gads; 22:1462–74.

9. Xiao J, Meng XM, Huang XR, Chung AC, Feng YL, Hui DS, Yu CM, Sung JJ, Lan HY. miR-29 inhibē bleomicīna izraisītu plaušu fibrozi pelēm. Mol Ther. 2012. gads; 20:1251–60.

10. Steiner DF, Thomas MF, Hu JK, Yang Z, Babiarz JE, Allen CD, Matloubian M, Blelloch R, Ansel KM. MikroRNS-29 regulē T-kastes transkripcijas faktorus un interferona veidošanos palīgu T šūnās. Imunitāte. 2011. gads; 35: 169–81.

11. Dooley J, Garcia-Perez JE, Sreenivasan J, Schlenner SM, Vangoitsenhoven R, Papadopoulou AS, Tian L, Schonefeldt S, Serneels L, Deroose C, Staats KA, Van der Schueren B, De Strooper B u.c. MikroRNS-29 ģimene nosaka līdzsvaru starp homeostatisku un patoloģisku glikozes apstrādi diabēta un aptaukošanās gadījumā. Diabēts. 2016. gads; 65:53–61.

12. Adoro S, Cubillos-Ruiz JR, Chen X, Deruaz M, Vrbanac VD, Song M, Park S, Murooka TT, Dudek TE, Luster AD, Tager AM, Streeck H, Bowman B u.c. IL-21 inducē pretvīrusu mikroRNS-29 CD4 T šūnās, lai ierobežotu HIV-1 infekciju. Nat Commun. 2015. gads; 6:7562.

13. Ma F, Xu S, Liu X, Zhang Q, Xu X, Liu M, Hua M, Li N, Yao H, Cao X. MikroRNS miR-29 kontrolē iedzimtas un adaptīvas imūnās atbildes reakcijas uz intracelulāru bakteriālu infekciju. mērķējot uz interferonu-. Nat Immunol. 2011. gads; 12:861–69.

14. Jovičić A, Roshan R, Moisoi N, Pradervand S, Moser R, Pillai B, Luthi-Carter R. Visaptverošas neironu šūnu tipam specifisku miRNS ekspresijas analīzes identificē jaunus neironu fenotipu specifikācijas un uzturēšanas faktorus. J Neirosci. 2013. gads; 33:5127–37.

15. Ouyang YB, Xu L, Lu Y, Sun X, Yue S, Xiong XX, Giffard RG. Ar astrocītiem bagātinātā miR-29a ir vērsta uz PUMA un samazina neironu neaizsargātību pret priekšējo smadzeņu išēmiju. Glia. 2013. gads; 61:1784–94.

16. Shioya M, Obayashi S, Tabunoki H, Arima K, Saito Y, Ishida T, Satoh J. Neirodeģeneratīvo slimību smadzenēs novirzīta mikroRNS ekspresija: miR-29a samazinājies Alcheimera slimības smadzenēs ir vērsts uz neironu navigatoru 3. Neuropathol Appl Neurobiol. 2010. gads; 36:320–30.

17. Hébert SS, Horré K, Nicolaï L, Papadopoulou AS, Mandemakers W, Silahtaroglu AN, Kauppinen S, Delacourte A, De Strooper B. MikroRNS klastera miR-29a/b-1 zudums sporādiski. Alcheimera slimība korelē ar palielinātu BACE1 / beta-sekretāzes ekspresiju. Proc Natl Acad Sci USA. 2008. gads; 105:6415–20.

18. Johnson R, Zuccato C, Belyaev ND, Viesdīdžejs, Cattaneo E, Buckley NJ. Uz mikroRNS balstīts gēnu disregulācijas ceļš Hantingtona slimībā. Neirobiol Dis. 2008. gads; 29:438–45.

19. Packer AN, Xing Y, Harper SQ, Jones L, Davidson BL. Bifunkcionālā mikroRNS miR-9/miR-9* regulē REST un COREST, un Hantingtona slimības gadījumā tā tiek samazināta. J Neirosci. 2008. gads; 28:14341–46.

20. Nolan K, Mitchem MR, Jimenez-Mateos EM, Henshall DC, Concannon CG, Prehn JH. Paaugstināta mikroRNS-29a ekspresija ALS pelēm: tās inhibīcijas funkcionālā analīze. J Mol Neurosci. 2014. gads; 53:231–41.

21. Roshan R, Shridhar S, Sarangdhar MA, Banik A, Chawla M, Garg M, Singh VP, Pillai B. Smadzenēm specifiska miR-29 notriekšana izraisa neironu šūnu nāvi un ataksiju pelēm. RNS. 2014. gads; 20:1287–97.

22. Khanna S, Rink C, Ghoorkhanian R, Gnyawali S, Heigel M, Wijesinghe DS, Chalfant CE, Chan YC, Banerjee J, Huang Y, Roy S, Sen CK. MiR-29b zudums pēc akūta išēmiska insulta veicina nervu šūnu nāvi un infarkta lielumu. J Cereb Blood Flow Metab. 2013. gads; 33:1197–206.

23. Shi G, Liu Y, Liu T, Yan W, Liu X, Wang Y, Shi J, Jia L. Pārregulēts miR-29b veicina neironu šūnu nāvi, inhibējot Bcl2L2 pēc išēmiskas smadzeņu traumas. Exp Brain Res. 2012. gads; 216:225–30.

24. Bai X, Tang Y, Yu M, Wu L, Liu F, Ni J, Wang Z, Wang J, Fei J, Wang W, Huang F, Wang J. Asins seruma mikroRNS 29 ģimenes pazemināšanās pacientiem ar Parkinsona slimību . Zinātnes Republika 2017; 7:5411.

25. Han L, Tang Y, Bai X, Liang X, Fan Y, Shen Y, Huang F, Wang J. Seruma mikroRNS-29 saimes saistība ar kognitīviem traucējumiem Parkinsona slimībā. Novecošana (Albani, NY). 2020. gads; 12:13518–28.

26. Chinta SJ, Woods G, Demaria M, Rane A, Zou Y, McQuade A, Rajagopalan S, Limbad C, Madden DT, Campisi J, Andersen JK. Šūnu novecošanos izraisa vides neirotoksīns parakvāts, un tas veicina neiropatoloģiju, kas saistīta ar Parkinsona slimību. Šūnas Rep. 2018; 22:930–40.

27. Willard AM, Bouchard RS, Gittis AH. Motora deficīta diferenciāla degradācija pelēm, pakāpeniski samazinot dopamīnu ar 6-hidroksidopamīnu. Neirozinātne. 2015. gads; 301:254–67.

28. Kam TI, Mao X, Park H, Chou SC, Karuppagounder SS, Umanah GE, Yun SP, Brahmachari S, Panicker N, Chen R, Andrabi SA, Qi C, Poirier GG u.c. Poli (ADP-riboze) veicina patoloģisku -sinukleīna neirodeģenerāciju Parkinsona slimības gadījumā. Zinātne. 2018. gads; 362:eaat8407.

29. Huang D, Xu J, Wang J, Tong J, Bai X, Li H, Wang Z, Huang Y, Wu Y, Yu M, Huang F. Dynamic Changes in the Nigrostriat Pathway in the MPTP Mouse Model of Parkinson's Disease. Parkinsona slimība. 2017. gads; 2017: 9349487.

30. Ugalde AP, Ramsay AJ, de la Rosa J, Varela I, Mariño G, Cadiñanos J, Lu J, Freije JM, López-Otín C. Novecošanās un hroniska DNS bojājumu reakcija aktivizē regulēšanas ceļu, kurā iesaistīts miR{{2} } un 53. lpp. EMBO J. 2011; 30:2219–32.

31. Hu Z, Kleins JD, Mičs WE, Džans L, Martiness I, Vans XH. MikroRNS-29 inducē šūnu novecošanos novecojošajos muskuļos, izmantojot vairākus signalizācijas ceļus. Novecošana (Albani, NY). 2014. gads; 6:160–75.

32. Fenn AM, Smith KM, Lovett-Racke AE, Guerau-deArellano M, Whitacre CC, Godbout JP. Palielināts mikroRNS 29b vecajās smadzenēs korelē ar insulīnam līdzīgā augšanas faktora-1 un fraktalkīna liganda samazināšanos. Neirobiols novecošana. 2013. gads; 34:2748–58.

33. Wang R, Yang Y, Wang H, He Y, Li C. MiR-29c aizsargā pret iekaisumu un apoptozi Parkinsona slimības modelī in vivo un in vitro, mērķējot uz SP1. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2020. gads; 47:372–82.

34. Caravia XM, Fanjul V, Oliver E, Roiz-Valle D, Morán- Álvarez A, Desdín-Micó G, Mittelbrunn M, Cabo R, Vega JA, Rodríguez F, Fueyo A, Gómez M, LoboGonzález M u.c. MikroRNS-29/PGC1 regulējošā ass ir būtiska sirds funkcijas vielmaiņas kontrolei. PLoS Biol. 2018. gads; 16:e2006247.

35. Varela I, Cadiñanos J, Pendás AM, Gutiérrez-Fernández A, Folgueras AR, Sánchez LM, Zhou Z, Rodríguez FJ, Stewart CL, Vega JA, Tryggvason K, Freije JM, LópezOtín C. Accelerated de2ficient in Zmpste2ficient proteāze ir saistīta ar p53 signālu aktivāciju. Daba. 2005. gads; 437:564–68.

36. Park SY, Lee JH, Ha M, Nam JW, Kim VN. miR-29 miRNS aktivizē p53, mērķējot uz p85 alfa un CDC42. Nat Struct Mol Biol. 2009. gads; 16:23–29.

37. Martinez I, Cazalla D, Almstead LL, Steitz JA, DiMaio D. miR-29 un miR-30 regulē B-Myb ekspresiju šūnu novecošanās laikā. Proc Natl Acad Sci USA. 2011. gads; 108:522–27.

38. Collier TJ, Kanaan NM, Kordower JH. Novecošana un Parkinsona slimība: vienas monētas dažādas puses? Mov traucējumi. 2017. gads; 32:983–90.

39. Massart J, Sjögren RJ, Lundell LS, Mudry JM, Franck N, O'Gorman DJ, Egan B, Zierath JR, Krook A. Mainīts miR- 29 Izteiksme 2. tipa diabēta gadījumā ietekmē glikozes un lipīdu metabolismu skeletā Muskuļi. Diabēts. 2017. gads; 66:1807–18.

40. Dooley J, Lagou V, Garcia-Perez JE, Himmelreich U, Liston A. miR-29a-deficīts nemaina peles aizkuņģa dziedzera acināra karcinomas gaitu. Oncotarget. 2017. gads; 8:26911–17.

41. Kwon JJ, Factora TD, Dey S, Kota J. Sistemātisks pārskats par miR-29 vēža ārstēšanā. Mol Ther Oncolytics. 2018. gads; 12:173–94.

42. Lu M, Su C, Qiao C, Bian Y, Ding J, Hu G. Metformīns novērš dopamīnerģisko neironu nāvi MPTP / PIN izraisītā Parkinsona slimības peles modelī, izmantojot autofagiju un mitohondriju ROS klīrensu. Int J Neuropsychopharmacol. 2016. gads; 19:pyw047.

43. Salminen A, Hyttinen JM, Kaarniranta K. AMP aktivētā proteīnkināze inhibē NF-κB signālu pārraidi un iekaisumu: ietekme uz veselības ilgumu un mūža ilgumu. J Mol Med (Berle). 2011. gads; 89:667–76.

Xiaochen Bai 1,2, Xiaoshuang Zhang 1, Rong Fang 1, Jinghui Wang 1, Yuanyuan Ma 1, Zhaolin Liu 1, Hongtian Dong 1, Qing Li 1, Jingyu Ge 1, Mei Yu 1, Jian Fei 3,4, Ruilin Sun 4, Fang Huang 1

1. Translācijas neiroloģijas nodaļa, Šanhajas Jing'an District Center Hospital, State Key Laboratory of Medical Neirobiology un MOE Frontiers Center for Brain Science, Institutes of Brain Science, Fudan University, Shanghai, 200032, China

2. Rehabilitācijas medicīnas nodaļa, Šanhajas Dzjao Tongas universitātes saistītā Sestā tautas slimnīca, Šanhaja 200233, Ķīna

3. Dzīvības zinātnes un tehnoloģiju skola, Tongji Universitāte, Šanhaja, 200092, Ķīna

4. Šanhajas paraugorganismu inženierzinātņu pētniecības centrs, Šanhajas modeļu organismu centrs, INC, Šanhaja 201203, Ķīna