Vogonīna aizsargājošā iedarbība uz lipopolisaharīdu izraisītu iekaisumu un plaušu epitēlija šūnu apoptozi un tā iespējamiem mehānismiem

Sazinātiestina.xiang@wecistanche.com

Abstrakts

Fons: Vogonīns (5,7-dihidroksi-8-metoksiflavons) ir dabisks dihidroksilflavonoīds, kas iegūts no Scutellaria baicalensis Georgi saknes. Šis raksts bija paredzēts, lai izpētītu vogonīna darbības mehānismu atvieglošanaiiekaisumsunapoptozeakūtu plaušu bojājumu (ALI) gadījumā.

materiāli un metodes: Lipopolisaharīds (LPS) tika izmantots, lai izveidotu ALL in vitro modeli. Pēc apstrādes ar vogonīnu LPS inducēto A549 šūnu dzīvotspēja un apoptoze tika mērīta attiecīgi ar CCK-8, TUNELassays un akridīna apelsīna/etīdija bromīda dubultkrāsošanu, savukārt iekaisuma citokīnu saturs unoksidatīvais stressmarķieri tika novērtēti ar RT-qPCR, ELISA testu, Western blot analīzi un komerciāliem komplektiem. Tika veikts arī Western blot, lai novērtētu iesaistīto olbaltumvielu ekspresiju. Pēc tam tika pētīta vogonīna ietekme uz sirtuīna 1 (SIRT1) mediēto augstas mobilitātes grupas 1. kastes proteīna (HMGB1) deacetilēšanu. SIRT1 inhibitors EX527 tika izmantots, lai novērtētu vogonīna regulējošo ietekmi uz SIRT1-mediētu HMGB1 deacetilāciju A549 šūnās LPS stimulācijas laikā.

Rezultāti: LPS izraisīja iekaisumu, oksidatīvo stresu un A549 šūnu apoptozi, ko atcēla vogonīns. Tika arī konstatēts, ka vogonīns veicināja HMGB1 dezacetilāciju, ko papildināja paaugstināta SIRT1 ekspresija. Tomēr SIRT1 inhibitors EX527 daļēji mainīja vogonīna aizsargājošo iedarbību uz LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu un apoptozi.

SecinājumsWogonin mazināja iekaisumu un apoptozi LPS inducētās A549 šūnās ar SIRT1-mediētu HMGB1 deacetilāciju, kas varētu būt jauna mehānisma identificēšana, ar kuru vogonīns iedarbojas uz ALI, un sniedz idejas vogonīna lietošanai Visa ārstēšana.

Atslēgvārdi: akūts plaušu bojājums, vogonīns, iekaisums, SIRT1, HMGB1 deacetilēšana

Noklikšķiniet šeit, lai iegūtu vairāk informācijas

Fons

Akūts plaušu bojājums (AL) ir klīniski dokumentēts kā patoloģisku stāvokļu, tostarp sepses, pneimonijas, traumas un akūta pankreatīta, rezultāts [1]. To bieži novēro pacientiem, kuri ievietoti intensīvās terapijas nodaļās un kuriem ir augsts mirstības līmenis [2]. Tie, kas izdzīvo no ALI, parasti saskaras ar zemāku dzīves kvalitāti [3]. Lai gan ir gūti sasniegumi AL patofizioloģijas izpratnē, pašreizējo terapiju ārstēšanas efektivitāte joprojām ir ierobežota, kas nevar apmierināt pacientu un viņu ģimeņu cerības [4]. Tāpēc ir ļoti steidzami jānosaka jaunas terapijas vai mērķi ALL ārstēšanai. Vogonīns(5,7-dihidroksi-8-metoksiflavons), kura struktūra parādīta 1.A attēlā, ir dabisks dihidroksilflavonoīds, kas iegūts no Scutellaria baicalensis Georgi saknes [5]. Tās nozīmīgas pretiekaisuma īpašības un pielietojums iekaisuma slimību ārstēšanā ir plaši ziņots daudzos pētījumos. Piemēram, vogonīns potenciāli uzlaboja peles plaušu tūsku un pasargāja tās no lipopolisaharīdu (LPS) izraisītas ALI, bloķējot p38 mitogēnu aktivētu proteīna kināzi (MAPK) un c-Jun NH(2)-terminālo kināzi (INK fosforilācija [6]). ]. Vogonīns arī samazināja LPS izraisīto neitrofilu infiltrāciju, proinflammatorisku citokīnu veidošanos, adhēzijas molekulu ekspresiju un nomāca LPS izraisīto AL pelēm [7]. Pašreizējie pierādījumi liecina, ka LPS izraisīto iekaisuma reakciju un ALI var vājināt kā vogonīna ārstēšanas rezultāts ar peroksisomu proliferatora aktivētu receptoru gamma (PPARy) mediētu NF-KB ceļu [8]. Jaunais pētījums parādīja, ka vogonīns samazināja cecal ligāciju un punkciju (CLP) izraisītu augstas mobilitātes grupas 1. proteīnu (HMGB1) ražošanu un HMGB{29}}atkarīgu iekaisumu, kā arī samazināja ar sepsi saistīto saslimstību un plaušu traumu risku [9]. LPS inducētā in vitro un in vivo ALI modelī citā ziņojumā tika parādīts, ka HMGB1 un citi iekaisuma mediatori, izmantojot ulinastatīnu, acīmredzami mazināja ALI izpausmes [10]. Iepriekšējie pētījumi apstiprināja, ka LPS inducētas cilvēka plaušu epitēlija šūnas (A549) ir plaši izmantotas kā ALI in vitro modelis [11-13]. Ir ierosināts, ka Sirtuīnam 1 (SIRT1), adenozīna monofosfāta aktivētās proteīna kināzes (AMPK) pakārtotajam efektoram, ir nozīmīga loma adiponektīna izdalīšanās regulēšanā [14]. Wogonin papildināšana ievērojami palielināja AMPK fosforilāciju un SIRT1 ekspresiju, savukārt AMPK vai SIRT1 inhibīcija samazināja vogonīna ietekmi uz adiponektīna ražošanu vai izdalīšanos [14]. Iepriekš tika ziņots, ka SIRT1-modulētā HMGB1 deacetilācija kavē akūtu nieru bojājumu, ko izraisīja sepse [15].

Šajā pētījumā mūsu mērķis bija izpētīt vogonīna darbības mehānismu, lai atvieglotuiekaisumsunapoptozeLPS izraisītu cilvēka plaušu epitēlija šūnu, kas varētu sniegt visaptverošāku ieskatu ALI ārstēšanā ar vogonīnu.

Rezultāti

Vogonīna ietekme uz LPS izraisīto A549 šūnu dzīvotspēju un apoptozi

Lai novērotu vogonīna ietekmi uz ALI, mēs vispirms spekulējām, vai vogonīns var sabojāt normālu A549 šūnu dzīvotspēju. Kā parādīts 1.B attēlā, vogonīns nekaitēja A549 šūnām, nesaņemot nekādu ārstēšanu, kas liecina par vogonīna apstrādes drošību A549 šūnās O, 5, 10 un 20 μM koncentrācijās. Pēc 24 stundu ilgas LPS stimulācijas A549 šūnu dzīvotspēja tika ievērojami bojāta, ko no koncentrācijas atkarīgā veidā neitralizēja vogonīns (1. att. C). Turklāt LDH testa rezultāti parādīja, ka ievērojams LDH aktivitātes pieaugums ar LPS apstrādātajās A549 šūnās tika samazināts pēc pieaugošu vogonīna devu ievadīšanas (1. att.). Pēc tam mēs pārbaudījām vogonīna ietekmi uz LPS izraisīto A549 šūnu apoptozi. Kā parādīts 2.A attēlā, TUNEL krāsošana parādīja, ka LPS iedarbība ievērojami uzlaboja A549 šūnu apoptozi, salīdzinot ar kontroles grupu, ko samazināja vogonīns atkarībā no devas. Turklāt LPS pakļautajā grupā tika novērota acīmredzama Bcl-2 ekspresijas pazemināšanās un Bax, Cyto-C un šķeltās kaspāzes 3 ekspresiju paaugstināšanās, salīdzinot ar kontroles grupu, kas tika atjaunota ar vogonīna ārstēšanu (att. 2B). Konsekventi AO/EB dubultās fluorescences testu rezultāti, kas parādīti 3. attēlā, liecina, ka LPS izraisīja paaugstinātu šūnu apoptozes ātrumu, salīdzinot ar kontroles grupu, savukārt EB pozitīvās šūnas pēc vogonīna pievienošanas bija ievērojami samazinātas, salīdzinot ar LPS. grupai. Tādējādi vogonīns atjauno dzīvotspēju un samazina LPS izraisīto A549 šūnu apoptozi.

Vogonīna ietekme uz LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu un oksidatīvo stresu

Lai izpētītu vogonīna pretiekaisuma un antioksidanta spējas ALI,iekaisumsunoksidatīvais stresstika atklātas attiecīgi ar vogonīnu apstrādātas LPS inducētas A549 šūnas. Kā redzams 4.A-C attēlā, iekaisuma citokīnu (TNF-, IL-6 un IL-1) mRNS līmenis, kas noteikts ar RT-qPCR, pēc LPS stimulācijas palielinājās līdz ievērojami augstam līmenim, turpretim vogonīna līmenis ārstēšana izraisīja to izpausmes samazināšanos. Konsekventi ELISA rezultāti liecināja, ka LPS indukcija izraisīja ievērojamu TNF-, IL-6 un IL-1 satura palielināšanos, salīdzinot ar neārstēto grupu, kas pēc ārstēšanas ar vogonīnu samazinājās atkarībā no devas (att. 4D-F). Svarīgi ir tas, ka ciklooksigenāze-2(Cox-2) un fosfo-nukleārais faktors (NF)-KB p65 (p-NF-KB p65), kas ir ar iekaisumu saistīti marķieri, tika pazemināti LPS regulējumā. Turklāt LPS izraisīja SOD un GSH-Px aktivitātes samazināšanos un MDA un ROS satura palielināšanos, ko mainīja vogonīns (4H-K att.). Kopumā vogonīns mazina LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu un oksidatīvo stresu.

Vogonīna regulēšana SIRT{0}}mediētā HMGB1 dezacetilācijā

Lai apstiprinātu mūsu pieņēmumus, ka vogonīnam ir aizsargājoša iedarbība uz LPS izraisītu A549 šūnu bojājumu ar SIRT1-mediētu HMGB1 deacetilēšanu, mēs veicām Western blot, lai noteiktu iesaistīto faktoru proteīna līmeni. Acīmredzot LPS nomāca SIRT1 ekspresiju un veicināja HMGB1 pārvietošanos no kodola uz citoplazmu, kā arī HMGB1 acetilēšanu. Tomēr šo tendenci mainīja vogonīna iedarbība uz LPS inducētām A549 šūnām (5. att.). Tādējādi ārstēšana ar vogonīnu regulē SIRT{10}}mediētu HMGB1 dezacetilāciju LPS inducētās A549 šūnās.

SIRT1 inhibitora EX527 regulēšana uz LPS inducētu A549 šūnu, kas apstrādātas ar vogonīnu, šūnu uzvedību

Lai pārbaudītu SIRT1 lomu pamatā esošajā mehānismā, ar kuru vogonīns ietekmēja LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu un apoptozi, mēs izmantojām EX527, SIRT1 inhibitoru, lai ārstētu LPS inducētas A549 šūnas 24 stundas. Kā parādīts 6.A attēlā, EX527 pievienošana samazināja SIRT1 ekspresiju, kavēja HMGB1 nukleocitoplazmas transportu un stimulēja HMGB1 dezacetilāciju, salīdzinot ar LPS plus Wogonin grupu. Turpmākie CCK-8 un LDH testi parādīja, ka EX527 sabojāja vogonīna atjaunojošo iedarbību uz LPS inducēto A549 šūnu dzīvotspēju (6.B attēls). Turklāt EX527 LPS inducētās A549 šūnās daļēji mazināja vogonīna ietekmi uz Bcl-2, Bax, Cyto-C un šķeltās kaspāzes 3 ekspresiju (6.C att.). Visbeidzot, iekaisuma faktoru (TNF-, IL-6 un IL-1), ar iekaisumu saistīto proteīnu (Cox-2 un p-NF-kB p65) variāciju tendences un oksidatīvā stresa marķieri (SOD, GSH-Px un MDA) LPS inducētās A549 šūnās, kas apstrādātas kopā ar vogonīnu un EX527, parādīja, ka EX527 sabojāja vogonīna inhibējošo iedarbību uz iekaisumu un oksidatīvo stresu LPS inducētās A549 šūnās (att. 7A-K). Tāpēc SIRT1 inhibitors EX527 maina vogonīna aizsargājošo iedarbību uz LPS inducēto A549 šūnu ļaundabīgajiem fenotipiem.

Diskusija

Pašlaik daudzi eksperti ir atzinuši vogonīnu par spēcīgu līdzekli iekaisuma slimību ārstēšanai. Tiek ziņots, ka tā efektivitāte iekaisuma reakciju mazināšanā tika saistīta ar NF-kB nomākšanu un ar kodolfaktora eritroīdo 2-saistīto 2. faktora (Nrf2) signalizācijas ceļu aktivizēšanu[16]. Interesanti, ka iepriekšējie ziņojumi saistīja pretiekaisuma iedarbību ar iNOS un Cox-2 ekspresijas starpniecību vai reaktīvo skābekļa sugu (ROS)/ERK/Nrf2 signālu ceļu aktivizēšanu [5,17]. Saskaņā ar iepriekšējiem atklājumiem, kas neuzrāda vogonīna ietekmi uz hondrocītu dzīvotspēju, mēs praktiski neatradām nozīmīgu vogonīna citotoksisku ietekmi uz normālām A549 šūnām, atbalstot mūsu turpmāko izpēti par pamatā esošo mehānismu, ar kuru vogonīns ietekmēja in vitro ALI šūnu modeli [17]. Oksidatīvais stress un iekaisums ir divas galvenās pazīmes AL patoģenēzē, un tādējādi mēs atklājām izmaiņas oksidatīvā stresa indikatoros un iekaisuma citokīnās, ārstējot ar vogonīnu [18]. Interesanti, ka gan iekaisumu, gan oksidatīvo stresu mazināja vogonīna iedarbība ar LPS apstrādātā A549 šūnu modelī, par ko liecina pro-iekaisuma faktoru izdalīšanās bloķēšana un pastiprināta SOD un GSH-Px ražošana, kā arī samazināta MDA ražošana pēc tam. wogonīna ārstēšana HMGB1 parādās kā ļoti konservēts proteīns, kas pirmo reizi tika identificēts, lai modulētu sepsi peles modelī[19]. Mērķēšana uz HMGB1 tika uzskatīta par potenciālu terapeitisku iespēju sepses ārstēšanai, jo pacientiem, kuri izpaudās kā ilgstošas ​​iekaisuma reakcijas, bieži bija augsts HMGB1 līmenis [10]. Jaunākie ziņojumi un pārskati ir pievērsuši lielu uzmanību HMGB1 terapeitiskajai iedarbībai uz iekaisuma slimībām, ne tikai sepsi. Piemēram, iepriekš tika pierādīts, ka HMGB1 inhibīcija ar ulinastatīnu uzlaboja LPS izraisīto ALI bojājumu pelēm [10, 20]. Pēc atbrīvošanās no aktivizētiem monocītiem/makrofāgiem HMGB1 kalpoja kā proinflammatorisks faktors, izmantojot dažādus stimulatorus [20]. Iekaisuma signāli, piemēram, LPS, varētu veicināt ar acetilēšanu saistītu HMGB1 pārvietošanos no kodola uz citoplazmu [21]. Šeit konstatējums, ka HMGB1 pārvietošana no kodola uz citoplazmu pēc LPS stimulācijas tika neitralizēta ar wogonīna ārstēšanu, netieši atklāja, ka LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu spēcīgi kavēja vogonīns.

Ir ierosināts, ka SIRT1 spēlē nozīmīgu lomu dažādos bioloģiskos procesos [22]. Atkarībā no tā dezacetilēšanas mērķiem, SIRT1 aktivitātes izmaiņas bija sagaidāmas saistībā ar oksidatīvo stresu un iekaisumu [23]. HMGB1 nesen tika atzīts par SIRT1 deacetilācijas mērķi [20]. Būtiski pierādījumi liecina, ka SIRT1-modulētā HMGB1 deacetilācija mazināja iekaisumu, atjaunoja nieru darbību un pagarināja izdzīvošanas laiku pelēm ar sepsi saistītu akūtu nieru bojājumu [15]. Eksperimentālā traumatiskas smadzeņu traumas pētījumā Omega-3 polinepiesātinātās taukskābes mazināja iekaisumu, modulējot mikroglia polarizāciju, izmantojot SIRT1-modulētu HMGB1/NF-KB ceļa deacetilāciju [24]. Turklāt oleanolskābe novērsa žurku modeli no subarachnoidālās asiņošanas, izmantojot SIRT1-modulētu HMGB1 dezacetilāciju [25]. NLRP3/NF-kB inhibīcija, ko veica Aloins, aktivizējot SIRT1, pelēm vājināja LPS izraisīto ALI [26]. Regulējot SIRT1/HMGB1/NF-KB signālu pārraidi, kaempferols uzlaboja išēmijas-reperfūzijas izraisītos plaušu bojājumus, izmantojot pretiekaisuma un antioksidatīvo stresu 27I. Kā svarīga molekula lejpus HMGB1, NF-kB ir galvenais signalizācijas ceļš, kas iesaistīts iekaisuma mediatoru regulēšanā, aktivizējot proinflammatorisko faktoru gēnus un atbrīvojot lielu skaitu iekaisuma faktoru, tostarp TNF-, IL-6 un TNF. -a[28,29]. Turklāt NF-KB var piedalīties arī oksidatīvā stresa procesā, regulējot ROS veidošanos un ietekmējot SOD, MDA un GSH-Px līmeni [30]. Šajā pētījumā samazināta p-NF-kB p65 ekspresija tika novērota pēc vogonīna pievienošanas, ko atjaunoja SIRT1 inhibitors EX527. Turklāt mēs noskaidrojām, ka vogonīna deacetilētais HMGB1 tika papildināts ar aktivizētu SIRT1 ekspresiju, kas noveda pie mūsu pieņēmumiem, ka vogonīnam var būt aizsargājoša iedarbība uz LPS izraisītu A549 šūnu iekaisumu ar SIRT 1-mediētu HMGB1 dezacetilēšanu. EX527 izmantošana turpmākajos eksperimentos arī parādīja, ka SIRTl inhibīcija mainīja wogonīna aizsargājošo iedarbību uz LPS izraisīto A549 šūnu iekaisumu.

Secinājums

Noslēgumā mēs parādījām, ka vogonīns mazināja LPS izraisīto ALI šūnu modeļa iekaisumu, oksidatīvo stresu un apoptozi. Šķiet, ka šis darbības mehānisms ir saistīts ar SIRT1-mediētās HMGB1 deacetilācijas regulēšanu, ko izraisa vogonīns. Šie atklājumi varētu identificēt jaunu mehānismu, ar kura palīdzību vogonīns iedarbojas uz ALI, un nodrošina eksperimentālu pamatu vogonīna lietošanai ALI klīniskajā ārstēšanā.

materiāli un metodes

Šūnu kultūra un zāles

Human lung epithelial cells(A549) were purchased from the Cell Bank of Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology at the Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China) and cultured in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM; Gibco, Paisley, UK) containing 10% heat-inactivated fetal bovine serum(Gibco, Paisley, UK), 100 U/ml penicillin, and 100 g/ml streptomycin at 37 ℃ with 5% CO. The cells were collected after 10 μg/mL LPS（Sigma Chemical Co., St Louis, MO）stimulation for 24 h. Wogonin (purity>99 procenti), kas izolēti no Scutellaria baicalensis Georgi, tika nopirkti no Biotic Chemical (Taipeja, Taivāna). Tas tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (DMSO), uzglabāts -20 ° C temperatūrā un atšķaidīts ar DMEM. SIRT1 inhibitors EX527 (10 μM); MedChemExpress, Šanhaja, Ķīna) tika izmantots šūnu apstrādei 24 stundas pirms ievadīšanas saskaņā ar iepriekšējo pētījumu [31].

Šūnu skaitīšanas komplekta-8 (CCK-8) tests

Pēc LPS stimulēšanas 24 stundas un dažādu vogonīna koncentrāciju iedarbības vēl 4 stundas, šūnas tika iesētas 96-iedobes plāksnē, un tika veikts šūnu dzīvotspējas tests, pievienojot 10 μL CCK-8 reaģenta (Dojindo). , Kumamoto, Japāna) katrā iedobē 37 grādu temperatūrā 4 stundas. Absorbcija pie 450 nm tika uzraudzīta, izmantojot mikroplašu lasītāju (Bio-Rad Laboratories, Inc.).

Laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanās tests

Šūnu supernatants, kas apstrādāts ar vogonīnu, tika iesēts 96-iedobju kultivēšanas plāksnēs un inkubēts 24 stundas 37 grādu temperatūrā ar 5% CO, pirms katrai pievienoja 100 μL citotoksicitātes noteikšanas komplekta LDH šķīduma (Roche Diagnostics, Francija). 15 minūtes vēlāk šūnu supernatants tika atšķaidīts ar optiskā blīvuma vērtību uzraudzīta pie 450 nm.

Ar termināla dezoksinukleotidiltransferāzes mediētu nick end marķēšanas (TUNEL) iekrāsošanas TUNEL testu tika veikts, lai novērtētu LPS izraisītu A549 šūnu apoptozi ar vai bez vogonīna apstrādes ar Colorimetric TUNEL Apoptosis Assay Kit (Beyotime, Šanhaja, Ķīna), pamatojoties uz operāciju. vadlīnijas. Pēc fosfāta bufera fizioloģiskā šķīduma (PBS) divreiz mazgāšanas un fiksācijas ar 4% paraformaldehīdu 0,5 h, 0,3% ūdeņraža peroksīda PBS tika izmantots, lai šūnas inkubētu vēl 20 minūtes istabas temperatūrā. Pēc tam šūnas 10 minūtes apstrādāja ar diaminobenzolu (DAB) un 30 sekundes krāsoja ar hematoksilīnu (Solarbio, Pekina, Ķīna). Apoptotiski pozitīvās šūnas tika novērotas ar fluorescences mikroskopu (Olympus Corporation), un apoptotiskais ātrums tika kvalificēts ar Image-J programmatūru (NIH, Bethesda, MD, ASV).

Akridīna apelsīna/etīdija bromīda dubultā krāsošana

Lai novērtētu šūnu apoptozes izmaiņas, tika veikti akridīna apelsīna / etīdija bromīda (AO / EB) dubultās fluorescences testi. Īsāk sakot, A549 šūnas tika audzētas uz stikla segstikliņiem 24-iedobju plāksnēs. Šūnas tika iepriekš inkubētas 24 stundas ar serumu nesaturošu barotni un pēc tam inkubētas ar LPS un dažādām vogonīna koncentrācijām 37 ° C temperatūrā. Šūnas tika mazgātas ar PBS un piegādātas ar 5 μL AO / EB jauktu šķīdumu (100 ug / ml AO un 100 ug / ml EB, kas sajaukti PBS, Aladdin, Ķīna) 3 minūšu laikā. Šūnas tika novērotas un fotografētas ar ierosmes viļņa garumu 510 nm fluorescences mikroskopā (Olympus Corporation).

Western blot analīze

Olbaltumvielas tika ekstrahētas no A549 šūnām, izmantojot RIPA līzes buferi (Beyotime, Šanhaja, Ķīna), un proteīnu koncentrācijas tika mērītas ar bicinhonīnskābes (BCA) proteīna testa komplektu (Thermo Fisher Scientific, ASV). Pēc tam tika veikta 10% nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzes (SDS-PAGE) elektroforēze, lai atdalītu 40 ug proteīnu, un pēc tam olbaltumvielas tika pārnestas uz polivinilidēna difluorīda (PVDF) membrānām. Pēc tam šīs membrānas tika bloķētas ar beztauku pienu un pēc tam inkubētas 4 ° C temperatūrā nakti ar primārajām antivielām. Pēc tam HRP konjugētā sekundārā antiviela tika izmantota, lai inkubētu membrānas 1, 5 stundas istabas temperatūrā. Visbeidzot, joslas tika vizualizētas ar uzlabotu ķīmijluminiscences (ECL) komplektu (Amersham Biosciences, Bekingemšīra, Apvienotā Karaliste), savukārt joslu intensitāte tika uzraudzīta, izmantojot Image-J programmatūru (NIH, Bethesda, MD, ASV). GAPDH tika uzskatīts par iekšēju atsauci.

Reversās transkripcijas kvantitatīvā PCR (RT-gPCR)

A549 šūnas tika lizētas 1 ml TRIzol reaģenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ASV), lai iegūtu kopējo RNS. Pēc kopējās RNS savākšanas tika veikta reversā transkripcija komplementārai DNS (cDNS) sintēzei, izmantojot PrimeScript RT reaģentu komplektu (Takara Bio, Inc.). Nosacījumi bija šādi: 50 grādi C 15 minūtes, 85 grādi C 5 sekundes, un saglabāšana 4 grādu temperatūrā. SYBR Premix Ex Taq TM (TaKaRa, Japāna) tika izmantots, lai iestatītu PCR reakcijas apstākļus un reakcijas sistēmu, pamatojoties uz ražotāja ieteikumiem. qPCR tika izmantots ABI 7500 instruments (AB-4351107; Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Tika izmantoti šādi termociklēšanas apstākļi: sākotnējā denaturācija 95 grādu temperatūrā 10 minūtes; kam seko 40 denaturēšanas cikli 95°C 15 sekundes un atkvēlināšana 60°C 1 minūti; un pēdējais pagarinājums par 10 minūtēm 72 °C temperatūrā. GAPDH tika pieņemts kā relatīvās gēnu ekspresijas normalizācijas kontrole. Relatīvās gēnu ekspresijas aprēķins tika veikts ar 2-AAct metodi.

Ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests (ELISA)

Interleikīna-6(IL-6), IL-1 un audzēja nekrozes faktora (TNF-) līmenis šūnās šūnu supernatantā tika noteikts, izmantojot IL-6 ELISA komplektu. , IL-1 ELISA komplekts un TNF-ELISA komplekts, pamatojoties uz ražotāja ieteikumiem (Shanghai Xi Tang Biotechnology, Šanhaja, Ķīna).

Oksidatīvā stresa noteikšana

Lai noteiktu oksidatīvo stresu, oksidatīvā stresa marķieru, tostarp malondialdehīda (MDA), reaktīvo skābekļa sugu (ROS), glutationa peroksidāzes (GSH-Px) un superoksīda dismutāzes (SOD) aktivitātes tika noteiktas, ievērojot ražotāja norādījumus (Nanjing Jiancheng Biotechnology). institūts, Ķīna).

Statistiskā analīze

Visi dati tika parādīti kā vidējā ± standarta novirze (SD) vismaz trīs neatkarīgiem eksperimentiem. Vairāku grupu salīdzināšanai tika veikta vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA) ar Tukey post hoc testu, savukārt divu grupu analīze tika veikta ar Stjudenta t-testu. P<0.05 was="" deemed="" as="" statistically="">

Saīsinājumi

AL: akūts plaušu bojājums; LPS: lipopolisaharīds; HMGB1: augstas mobilitātes grupas kastes 1 proteīns; PPARy. Peroksisomu proliferatora aktivētais receptors-gamma; MAPK: mitogēna aktivētā proteīna kināze; JNK: C-Jun NH(2)-termināla kināze; CLP: cecal nosiešana un punkcija; DMEM: Dulbecco modificētā Eagle barotne; DMSO: dimetilsulfoksīds; CCK-8: Šūnu skaitīšanas komplekts-8; LDH: laktātdehidrogenāze; TUNEL: termināla-dezoksinukleotidiltransferāzes mediēta nick-end marķēšana; PBS: fosfāta buferšķīdums; DAB: diaminobenzols; AO/EB: akridīna apelsīns/etīdija bromīds; BCA: bicinhonīnskābe; SDS-PAGE: Nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēze; PVDF: polivinilidēna difluorīds; ECL: uzlabota ķīmiskā luminiscence; cDNS: komplementārā DNS; ELSA: ar enzīmu saistīts imūnsorbcijas tests; IL: Interleikīns; TNF-a: audzēja nekrozes faktors-a; MDA: Malondialdehīds; GSH-Px glutationa peroksidāze; SOD: superoksīda dismutāze; SD: standarta novirze; ANOVA: dispersijas analīze; Cox-2:Ciklooksigenāze-2; Nrf2: ar kodolfaktoru eritroīdo 2-saistītais 2. faktors; ROS: reaktīvās skābekļa sugas.

Atsauces

1. Mokra D, Kosutova P. Biomarķieri akūtu plaušu bojājumu gadījumā. Respir Physiol Neurobiol. 2015;209:52–8.

2. Hayes M, Curley G, Ansari B, Laffey JG. Klīniskais pārskats: cilmes šūnu terapija akūtu plaušu bojājumu/akūta respiratorā distresa sindroma gadījumā — cerība vai ažiotāža? Kritu aprūpe. 2012;16(2):205.

3. Angus DC, Clermont G, Linde-Zwirble WT, Musthafa AA, Dremsizov TT, Lidicker J u.c. Veselības aprūpes izmaksas un ilgtermiņa rezultāti pēc akūta respiratorā distresa sindroma: III fāzes inhalējamā slāpekļa oksīda izmēģinājums. Crit Care Med. 2006;34(12):2883–90.

4. Hu JT, Lai J, Zhou W, Chen XF, Zhang C, Pan YP u.c. Hipotermija mazināja LPS izraisītu akūtu plaušu bojājumu žurku modeļos, izmantojot TLR2 / MyD88 ceļu. Exp Lung Res. 2018;44(8–9):397–404.

5. Chi YS, Lim H, Park H, Kim HP. Vogonīna, augu flavona no Scutellaria radix, ietekme uz ādas iekaisumu: ar iekaisumu saistītās gēnu ekspresijas regulēšana in vivo. Biochem Pharmacol. 2003;66(7):1271–8.

6. Wei CY, Sun HL, Yang ML, Yang CP, Chen LY, Li YC u.c. Vogonīna aizsargājošā iedarbība uz endotoksīnu izraisītu akūtu plaušu bojājumu, samazinot p38 MAPK un JNK fosforilāciju. Vides toksīns. 2017;32(2):397–403.

7. Yeh YC, Yang CP, Lee SS, Horng CT, Chen HY, Cho TH u.c. Akūtu plaušu bojājumu, ko izraisa lipopolisaharīds, pelēm inhibē vogonīns, samazinot Akt fosforilāciju un RhoA aktivāciju. J Pharm Pharmacol.2016;68(2):257–63.