Kvantitatīvs proteomisks pētījums atklāj fibrinogēna ceļu policistisko aknu slimību gadījumā Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Rezultāti
3.1. Nieres un aknas neievēro vienus un tos pašus cistiskos mehānismus
Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka agrīna Pkd1 gēna inaktivācija (pirms p12) izraisa policistiskas slimības strauju attīstību (cistiskais logs), savukārt inaktivācija pēc p14 izraisa vēlu cistu veidošanos pēc 4–5 mēnešiem ar vieglu fenotipu (necistiskais logs). [19]. Izmantojot to pašu ortoloģisko ADPKD modeli (Pkd1cond/cond; Tam-Cre) [18,19], mēs pētījām, vai šis nieru attīstības logs laikā atbilst līdzīgam aknu attīstības logam. Lai veiktu tiešu salīdzinājumu ar mūsu iepriekšējiem pētījumiem [37], pelēm tika inducēts ar tamoksifēnu, lai inaktivētu Pkd1 gēnu pēcdzemdību 14. (p14) un 12 (p12) dienā, un tās tika nogalinātas 30 dienu vecumā (p30). Interesanti, ka mēs novērojām cistisko fenotipu abos laika punktos ar atšķirīgu slimības pakāpi (vieglu un smagu), kas liecina, ka nierēm un aknām ir neatkarīgi cistiskās attīstības logi (1.a attēls) un / vai iespējami atšķirīgi slimības laiki un progresēšana. . Atšķirības starp tēviņiem un mātītēm šajā kaušanas vecumā starp abiem inaktivācijas logiem netika atrastas (katrai mutantu grupai tika izmantots n=6). P14 mutantu dzīvniekiem bija maigāks fenotips nekā p12 mutantu grupai ar zemākām cistiskā indeksa vērtībām, cistu skaitu un aknu funkciju atbilstoši ALP seruma vērtībai (1b – d attēls). Šis ir pirmais pētījums, kas parāda dažādus Pkd1 aknu un nieru deficīta attīstības logus/mehānismus. Šīs molekulārās atšķirības būs jānosaka turpmākajos pētījumos.
1. attēls. Cistiskās aknu fenotipa raksturojums 3. dienā 0 formā p12 un p14 stadijās. Pkd1 dzēšana pie p12 izraisa smagāku cistoģenēzi. (a) Reprezentatīvi makroskopiski un mikroskopiski hematoksilīna-eozīna attēli, kas iekrāsoti no Pkd1cond/cond; Tam-Cre peles savvaļas tipa (WT, Pkd1cond/cond; Tam-Cre−) un Mutant (KO, Pkd1cond/cond; Tam-Cre+) aknām. ) ar Pkd1 gēna dzēšanu, ko izraisīja tamoksifēns 14. pēcdzemdību dienā (p14 grupa) un 12 (p12 grupa). Visas peles tika nogalinātas p30. Mēroga josla, 2 mm (augšējais panelis) 100 µm (apakšējais panelis). n apzīmē paraugu skaitu katrā grupā, un Bd nozīmē žults ceļu. (b, c) aknu cistiskais indekss un dažādu fenotipu cistu skaits. (d, e) ALP un ALT vērtības asins serumā. Joslas visos gadījumos apzīmē vidējos ± SEM. p < 0,05 pēc Stjudenta t-testa (divu astes) tika uzskatīts par nozīmīgu rezultātu. ns nav nozīmes. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Noklikšķiniet, lai cistanche herba nieru slimībām
3.2. Bise un SWATH-MS proteomiskā analīze PLD
Kā norādīts 2. attēlā, mēs veicām diferenciālu proteomu analīzi abās mutantu (KO) cistiskās stadijās (p12 — smaga cistiskā slimība un p14 — viegla cistiskā slimība), salīdzinot ar savvaļas tipa (WT) dzīvniekiem, lai identificētu un raksturo attiecīgos molekulāros mehānismus, kuros notiek aknu cistoģenēze un slimības progresēšana.
2. attēls. Ilustrēta darbplūsmas shēma. Mēs izmantojām ADPKD peles modeli (Pkd1cond/cond; Tam‐Cre peles), kurā Pkd1 ģenētisko inaktivāciju izraisīja tamoksifēna ievadīšana pēcdzemdību 10. dienā (p10) un p11 (ātra slimības progresēšana) vai p15 un p16 (aizkavēta slimības progresēšana). ) saskaņā ar nieru cistoģenēzes attīstības pāreju, definējot divas pētījuma grupas, kas attiecīgi nosauktas p12 un p14 [19]. Abām grupām mēs izmantojām n vienādu vai lielāku par sešiem savvaļas tipa (WT) un mutantu (KO) indivīdiem katrā stāvoklī, un visi dzīvnieki tika nogalināti pie p30. Mēs pētījām WT un KO aknu diferenciālo proteomu abās aknu cistiskās slimības smaguma pakāpēs (1. attēls), izmantojot gan kvantitatīvo proteomisko SWATH–MS, gan no bises datiem atkarīgo iegūšanas DDA-MS analīzi. No olbaltumvielām ar būtiskām pārpilnības izmaiņām mēs izmantojām bioinformātiku. 2. attēls. Ilustrētā darbplūsmas shēma. Mēs izmantojām ADPKD peles modeli (Pkd1cond/cond; Tam-Cre peles), kurā Pkd1 ģenētisko inaktivāciju izraisīja tamoksifēna ievadīšana pēcdzemdību 10. dienā (p10) un p11 (ātra slimības progresēšana) vai p15 un p16 (aizkavēta slimības progresēšana). ) saskaņā ar nieru cistoģenēzes attīstības pāreju, definējot divas pētījuma grupas, kas attiecīgi nosauktas p12 un p14 [19]. Abām grupām katrā stāvoklī izmantojām n, kas vienāds vai lielāks par sešiem savvaļas tipa (WT) un mutantu (KO) indivīdiem, un visi dzīvnieki tika nogalināti pie p30. Mēs pētījām WT un KO aknu diferenciālo proteomu abās aknu cistiskās slimības smaguma pakāpēs (1. attēls), izmantojot gan kvantitatīvo proteomisko SWATH–MS, gan no bises datiem atkarīgo iegūšanas DDA-MS analīzi. No olbaltumvielām ar ievērojamām pārpilnības izmaiņām mēs izmantojām bioinformātikas rīkus, lai noteiktu jaunus terapeitiskos mērķus un ceļus, kas saistīti ar slimību. Visbeidzot, mēs apstiprinājām šos mērķus, izmantojot vispirms in silico (DDA vs SWATH analīze) un visbeidzot in vivo stratēģijas, kā arī RT-qPCR, Western blotēšanu un imūnhistoķīmiju. p nozīmē pēcdzemdību dienu
Olbaltumvielu ekspresijas modelis aknu cistoģenēzē Pirmkārt, mēs veicām proteomiskās masas spektrometrijas analīzi, izmantojot no bises datiem atkarīgu ieguvi DDA-MS vai DDA. Šī analīze ļauj raksturot proteomu no pilnīgiem un atsevišķiem paraugiem, nodrošinot proteīnu klātbūtni / neesamību ar augstu jutību, bet nenodrošinot to kvantitatīvo noteikšanu. Mēs izskatījām tikai visus proteīnus, kas atšķirīgi izteikti vairāk nekā piecos neatkarīgos paraugos no kopumā sešiem paraugiem, attiecīgi savvaļas tipa un mutantu indivīdu p14 un p12 stadijām (S1 attēls). Pie p14 tika identificēts 1 WT ekskluzīvs (vai slimībai pazemināts) un 7 MUT ekskluzīvs (augšupregulēts) proteīns, savukārt p12 tika novēroti astoņi WT ekskluzīvi un seši MUT ekskluzīvi proteīni (attēls S1).
Tālāk mēs izmantojām metodi, kas ļāva mums kvantitatīvi noteikt diferencēti izteiktus proteīnus. Mēs veicām SWATH-MS kvantitatīvo proteomisko analīzi tiem pašiem paraugiem, kurus izmantojām DDA, iegūstot ~ 1500 proteīnu katrā paraugā un vairāk nekā 2000 proteīnu katrā pētījuma grupā. Pirmkārt, mēs veicām kopējās platības summas (TAS) normalizāciju, lai novērtētu, vai mūsu paraugi atbilst normālam sadalījuma modelim, kā parādīts S2 un S3 attēlā. Tālāk mēs pētījām proteīnu ar būtiskām atšķirībām starp savvaļas tipa un mutantu grupām. 1. tabulā parādītas olbaltumvielas ar būtiskām pārpilnības izmaiņām ar divkāršu pieaugumu (augšupregulēts) vai samazinājumu (uz leju regulēts) un nozīmīgu koriģētu p-vērtību (saskaņā ar parametrisko Stjudenta t-testu) WT vs. MUT paraugi p14 un p12. Kopumā seši proteīni uzrādīja būtiskas atšķirības olbaltumvielu pārpilnībā starp WT p14 un MUT-p14 grupām (pieci paaugstināti regulēti proteīni un viens pazemināti regulēts proteīns). Starp WT-p12 un MUT-p12 26 olbaltumvielas (20 proteīni tika regulēti augstāk un 6 proteīni tika regulēti zemāk) uzrādīja būtiskas atšķirības (3.a attēls un 1. tabula). Grafiski šīs variācijas var novērot, izmantojot vulkānu diagrammas, kas tika izveidotas, attēlojot log (2) reizes izmaiņas visiem identificētajiem proteīniem pret to -log (10) p-vērtību (3.b attēls). Būtiskas atšķirības starp olbaltumvielu pārpilnības līmeņiem var vizualizēt siltuma kartē ar individualizētām vērtībām atbilstoši spektrālās bibliotēkas apgabaliem un tās klasterizācijas līmeni klasteru siltuma kartes analīzē (3.c un S4. attēls). Šīs SWATH–MS analīzē atklātās kopas palīdz mums identificēt tos kvalitatīvi atdalītos paraugus, kas jāņem vērā kvantitatīvā analīzē (S5. attēls). Neuzraudzīta daudzfaktoru statistiskā analīze tika veikta, izmantojot galveno komponentu analīzi (PCA), lai salīdzinātu datus starp paraugiem (S6. attēls). Siltuma kartes un PCA dati parādīja parauga trīs eksemplāru reproducējamību, jo abās analīzēs trīs atkārtojumi bija cieši apvienoti. Mēs varam novērot gan PCA, gan siltuma kartes klasteru analīzē (S5 un S6 attēls), kā daži paraugi nav pareizi grupēti, pārklājoties starp abiem klasteriem. Neskatoties uz to, mēs varam redzēt tendenci atdalīt datus savvaļas tipa un mutantu kopās. Mazāku olbaltumvielu skaitu ar būtiskām atšķirībām p14 un p12 var attaisnot ar atšķirīgo smaguma pakāpi (2. attēls), kas liecina, ka olbaltumvielu un ceļu skaits palielinās, pamatojoties uz cistiskā fenotipa smagumu un slimības statusu.
3.3. Gēnu ekspresijas klasterizācija, ceļa bagātināšana un proteīnu-olbaltumvielu mijiedarbības analīze PLD
Lai noteiktu funkciju, kas saistīta ar SWATH-MS analīzē identificētajiem atšķirīgi ekspresētajiem proteīniem, mēs izmantojām vairākus bioinformātiskos rīkus un analīžu formas. Gēnu ontoloģijas (GO) terminu un ceļu analīzes tika veiktas, izmantojot FunRich [39, 40], String [41] un Reactome [42]. Olbaltumvielas tika sakārtotas FunRich gēnu bagātināšanas analīzē. Runājot par bioloģisko procesu, visvairāk bagātinātā olbaltumvielu grupa p14 grupai (viegla cistiskā) bija saistīta ar taukskābju transportu un prostaglandīnu biosintēzi, bet p12 (smaga cistiskā) grupai ar fibrinogēna/fibrīna aktivitāti, šūnu-šūnu/matricas adhēziju un vielmaiņu. process (4.a attēls, augšējais panelis). ANXA2 un fibrinogēna komplekss bija divi visvairāk bagātinātie šūnu komponenti attiecīgi p14 un p12 grupās. Turklāt ārpusšūnu telpa bija šūnu komponents ar vislielāko olbaltumvielu procentuālo daudzumu abās grupās (4.a attēls, apakšējais panelis). Līdzīgi tika noteikta tāda pati analīze ar stīgu analīzi, identificējot dažādus vielmaiņas procesus kā galveno bioloģisko procesu un ekstracelulāro telpu kā visvairāk bagātināto šūnu komponentu; atbilst GO rezultātiem (S7a attēls). Visbeidzot, mēs atkārtojām analīzi ar Reactome platformu, konstatējot, ka vielmaiņa un imūnsistēma bija visvairāk bagātinātie ceļi (S7b attēls).
Tika veikta arī proteīna-olbaltumvielu vai klasteru analīze, kas balstīta uz virkņu analīzi, lai izpētītu iespējamo olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbību (mijiedarbība ar eksperimentāliem pierādījumiem). Dažādās grupās tika identificētas daudzas proteīnu mijiedarbības (attēls S8), bet viens klasteris pie p14 un cits pie p12 bija visatbilstošākais, pamatojoties uz mijiedarbību skaitu starp proteīniem un ekspresijas līmeni (4.b attēls). P14- klasteris satur aneksīna A2 proteīnu (ANXA2_P07356), kas saistīts ar vairākām šūnu funkcijām, piemēram, fibrinolīzi, šūnu kustīgumu (epitēlija šūnās), proteīnu, kas saistīts ar aktīnu. citoskeleta un šūnu-matricas mijiedarbība [43], mijiedarbojoties ar diviem citiem proteīniem, kas iesaistīti intracelulārajā lipīdu transportēšanā (FABP1_P12710 un FABP5_Q05816). Interesanti, ka p12-klasterī tika identificēta vēl viena atbilstoša proteīnu grupa ar ļoti spēcīgu proteīna-olbaltumvielu mijiedarbību starp vairākiem fibrinogēniem (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22). }}E9PV24 un FIBGG_Q8VCM7). Fibrinogēni ir iesaistīti hepatocītu augšanā un veicina trombocītu izplatīšanos asinīs, intersticiālu kolagēnu un fibrotiskos bojājumus [44]. Turklāt tika konstatēts, ka papildu proteīni mijiedarbojas ar fibrinogēniem (S8. attēls), piemēram, seruma amiloīda p-komponents (SAMP_P12246), hemopeksīns (HEMO_Q91X72) vai hidroksiskābes oksidāze 2 (HAOX{). {37}}Q9NYQ2). Atbilstoši virkņu rezultātiem ANXA2 un fibrinogēna kompleksi bija arī visvairāk bagātinātie šūnu komponenti, kas identificēti FunRich analīzē (4.a attēls). Interesanti, ka, salīdzinot ar DDA un SWATH analīzi iegūtos datus, mēs apstiprinājām, ka ar DDA analīzi tika identificēti arī vairāki SWATH identificētie proteīni, tostarp vairāki, kas saistīti ar fibrinogēna kompleksa proteīniem (SAMP / Apcs un S10A9 / S100a9; S3 tabula).
3.4. SWATH-MS analīzes apstiprināšana atklāj fibrinogēna kompleksu kā jaunu molekulāro mehānismu, kas saistīts ar PLD
Pamatojoties uz šiem datiem, mēs no SWATH-MS analīzes (S9. attēls) izvēlējāmies ar fibrinogēna kompleksu saistītās izmainītās olbaltumvielas p12 un p14 stadijās in vivo validācijai ar RT-qPCR, Western blotēšanu un imūnhistoķīmiju, lai pēc iespējas apstiprinātu tos. slimības mērķi. Astoņi no 10 no šiem atlasītajiem proteīniem tika apstiprināti mRNS līmenī ar RT-qPCR (5. attēls); viens augstāk regulēts 14-posmā (ANXA2_P07356) un p12-grupā (SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 un FIBG_Q8VCM7) un viens uz leju regulē p12 grupa (HAOX2_Q9NYQ2). Interesanti, ka abu proteīnu gēnu ekspresija ar lielāku attālumu vai mazāku mijiedarbību ar fibrinogēna grupu (ILK un S10A9) bija vienīgās, kas netika apstiprinātas (5.c attēls).
Fibrinogēna kompleksa (ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG un HAOX2 proteīnu) regulēšanu vēl vairāk apstiprināja Western blotēšanas (WB) analīze (6. attēls). Kopumā gēnu ekspresija un WB ļoti atbilda SWATH-MS proteomikas datiem. Visbeidzot, mēs arī veicām fibrinogēna kompleksa imūnhistoķīmisko validāciju mutantu un policistisko aknu paraugos (7. attēls). Fibrinogēna iekrāsošanās tika stingri regulēta cistu izklātajās epitēlija šūnās un žultsvadu dilatācijās (7.a attēls). Šie rezultāti pirmo reizi atklāj fibrinogēna kompleksu kā iespējamu ceļu, kas saistīts ar aknu cistoģenēzi, un kā iespējamo turpmāko PLD terapeitisko mērķi.
5. attēls. Iespējamo PLD mērķu apstiprināšana ar RT-qPCR. Gēnu ekspresija no 8 līdz 10 atlasītajiem mērķiem korelēja ar SWATH-MS datiem. Augsti regulētā atlasītā p14 mērķa aneksīna A2 (Anxa2) RT-qPCR (a); Augšupregulētais p12 ir vērsts uz amiloīda p komponentu, serumu (Apcs, SAMP gēns), fibrinogēnam līdzīgo 1 (Fgl1), fibrinogēna beta ķēdi (Fgb), hemopeksīnu (Hpx), fibrinogēna alfa ķēdi (Fga), fibrinogēna gamma ķēdi (Fgg) (b), ar integrīnu saistītā kināze (Ilk) un S10{{30}} kalciju saistošais proteīns A9 (S100a9) (c); un pazemināta p12 mērķa hidroksiskābes oksidāze 2 (Hao2) (d). n=6 tika izmantots katrai olbaltumvielu grupai. Gapdh tika izmantots kā mājturības gēns. Joslas apzīmē vidējos ± SEM. Tika izmantots Stjudenta t-tests ar divu asti, un vērtība p < 0,05 tika uzskatīta par nozīmīgu. ns: nav nozīmīgs (p lielāks vai vienāds ar 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
7. attēls. Fibrinogēna komplekss tiek regulēts cistiskajā epitēlijā. ( a, b ) Reprezentatīvi fibrinogēna imūnhistoķīmijas attēli žults ceļā (augšējais panelis) un aknu parenhīmā (apakšējais panelis) (a) un tā kvantitatīvā noteikšana (b). n=6 tika izmantots katrai grupai. Imūnhistoķīmiskā analīze parādīja fibrinogēna regulēšanu caur cistisko epitēliju. Paraugi atbilda p12 grupai. Mēroga joslas apzīmē 100 µm. Bd nozīmē žultsvadu. Joslas apzīmē vidējos ± SEM. Tika izmantots Stjudenta t-tests ar divu asti, un vērtība p < 0,05 tika uzskatīta par nozīmīgu. *** p < 0,001.
Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:
E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/Tel.:+86 15292862950
Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:
Skatīt šeit: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop
