Ar nātrija tiosulfātu papildināts UW šķīdums aizsargā nieru transplantātus pret ilgstošu aukstuma išēmijas reperfūzijas traumu singēnās nieru transplantācijas peļu modelī

Kontaktpersona: ali.ma@wecistanche.com

Max Y. Zhang et al

Cistanche tubulosa novēršnieresslimība, noklikšķiniet šeit, lai iegūtuprodukti un Cistanche Nz

KOPSAVILKUMS

Ievads:Aukstā išēmijas-reperfūzijas trauma (IRI) ir neizbēgams notikums, kas palielina pēctransplantācijas komplikācijas. Mēs jau iepriekš esam pierādījuši, ka Viskonsinas Universitātes (UW) šķīduma papildināšana ar FDA neapstiprinātām sērūdeņraža (H2S) donoru molekulām samazina auksto IRI un uzlabo nieru transplantāta darbību pēc transplantācijas. Šajā pētījumā tiek pētīts, vai FDA apstiprinātai H2S donora molekulai, nātrija tiosulfātam (STS), būs tāda pati vai labāka iedarbība klīniski nozīmīgā singēnu ortotopiskā žurku modelī.nierestransplantācija.

Metode:Trīsdesmit Lūisa žurkām tika veikta divpusēja nefrektomija, kam sekoja kreisās puses singēnā ortotopiskā transplantācijanierespēc 24-stundu uzglabāšanas UW vai UW plus STS šķīdumā 4 ◦C temperatūrā. Žurkas tika novērotas līdz 14. dienai pēc transplantācijas un tika nogalinātas, lai novērtētu nieru darbību (urīna izdalīšanos, kreatinīna līmeni serumā un urīnvielas slāpekli).Nieressekcijas tika iekrāsotas ar H&E, TUNEL, CD68 un mieloperoksidāzi (MPO), lai noteiktu akūtu tubulāro nekrozi (ATN), apoptozi, makrofāgu infiltrāciju un neitrofilu infiltrāciju.

Rezultāts:UW plus STS transplantāti uzrādīja ievērojami uzlabotu transplantāta funkciju tūlīt pēc transplantācijas, uzlabojot saņēmēju dzīvildzi, salīdzinot ar UW transplantātiem (p < {0}},05).="" histopatoloģiskā="" izmeklēšana="" atklāja="" ievērojami="" samazinātu="" atn,="" apoptozes,="" makrofāgu="" un="" neitrofilu="" infiltrāciju="" un="" pro-iekaisuma="" un="" proapoptotisko="" gēnu="" pazemināšanos="" uw="" plus="" sts="" transplantātos,="" salīdzinot="" ar="" uw="" transplantātiem="" (p=""><>

Secinājums:Mēs pirmo reizi parādām, ka nieru transplantātu saglabāšana ar STS papildinātā UW šķīdumā aizsargā pret ilgstošu aukstu IRI, nomācot apoptotiskos un iekaisuma ceļus un tādējādi uzlabojot transplantāta darbību un pagarinot saņēmēja izdzīvošanu. Tas varētu būt jauna klīniski piemērojama terapeitiskā stratēģija, lai samazinātu ilgstošas ​​aukstās IRI kaitīgo klīnisko iznākumu.nierestransplantācija.

Atslēgvārdi:Nātrija tiosulfāts (STS) Išēmijas-reperfūzijas bojājums (IRI) Statiskā saldētava (SCS)Nierestransplantācija Transplantāta un recipienta izdzīvošana

1. Ievads

Nierestransplantācija ir optimālā ārstēšana beigu stadijānieresnieruslimība (ESRD). Salīdzinot ar dialīzi,nierestransplantācija ir pārāka, jo tā nodrošina labāku dzīves kvalitāti un ievērojamu izdzīvošanas priekšrocību, kā arī tās rentabilitāti [1–3]. Tomēr donora nieru iegūšana pēc būtības ir saistīta ar išēmijas-reperfūzijas traumu (IRI), kas ir neizbēgamas sekas asins plūsmas pārtraukšanai un turpmākai atjaunošanai transplantācijas laikā [4]. Pašreizējā stratēģija transplantācijas izraisītas IRI mazināšanai ir nieru transplantātu statiskā aukstā uzglabāšana (SCS) standarta konservēšanas šķīdumos, piemēram, Viskonsinas Universitātes (UW) šķīdumā uz ledus 4 ◦C periodā pirms transplantācijas [5]. Tomēr ir pierādīts, ka ilgstoša SCS ir saistīta ar palielinātu šūnu nāvi, iekaisumu un citiem kaitīgiem šūnu un molekulāriem notikumiem, kas galu galā palielina aizkavētas transplantāta funkcijas (DGF), akūtas tubulārās nekrozes (ATN) un samazinātu transplantāta sastopamību. izdzīvošana [6–10]. Turklāt, lai neatpaliktu no pasaulē pieaugošā ESRD sastopamības biežuma un arvien pieaugošā pacientu skaita transplantācijas gaidīšanas sarakstos, daudzi transplantācijas centri pieņem nieru transplantātus ar ilgstošiem aukstiem išēmiskiem periodiem, kas vēl vairāk veicina kopējo audu bojājumu. Pēc SCS notiek reperfūzija, kad aukstā išēmiskā transplantātā tiek atjaunotas siltas ar skābekli bagātinātas asinis. Reperfūziju, kas ir išēmiska bojājuma efektora fāze, raksturo palielināts audu bojājums [11–13].

Iespējama terapeitiskā stratēģija aukstā IRI ierobežošanai laikānierestransplantācija ietver standarta konservēšanas šķīduma papildināšanu ar sērūdeņradi (H2S), endogēni ražotu gāzu raidītāju, kam ir nozīmīga fizioloģiska loma vazodilatācijā un šūnu signalizācijā [14–16]. Mēs jau iepriekš esam parādījuši, ka ilgstoša SCS ar H2S papildinātā UW šķīdumā samazina transplantācijas izraisītu aukstu IRI un uzlabo transplantāta izdzīvošanu singēnu un alogēnu nieru transplantācijas peļu modeļos [17–19, 41, 42]. Tomēr šajos pētījumos izmantotās H2S donoru molekulas nav klīniski dzīvotspējīgas. Tā rezultātā tika apsvērta iespēja izmantot nātrija tiosulfātu (STS), H2S donoru, ko ir apstiprinājusi Pārtikas un zāļu pārvalde (FDA), lai ārstētu kalcifilaksi pacientiem ar ESRD, cisplatīna izraisītu toksicitāti vēža terapijā un kā pretlīdzekli pret to. saindēšanās ar cianīdu [20–23]. Jaunākie pētījumi liecina, ka STS piemīt aizsargājoša iedarbība IRI dzīvnieku modeļos [24–26]. Tomēr tā ietekme uz transplantācijas izraisītu aukstu nieru IRI nav zināma. Tāpēc šajā pētījumā tiek pētīta STS renoprotektīvā iedarbība nieru IRI in vitro modelī un singēnas ortotopiskās nieru transplantācijas žurku modelī.

2. Materiāli un metodes

2.1. Eksperimentālais in vitro protokols

Lai novērtētu STS aizsargājošo iedarbību nieru IRI laikā, tika izmantots aukstās hipoksijas un siltās reoksigenācijas traumas in vitro modelis, kas atdarina šūnu apstākļus in vivo aukstā IRI laikā. Eksperimentos in vitro tika izmantotas žurku nieres epitēlija šūnas (NRK{{0}}E šūnu līnija; ATCC, ASV), jo šīs šūnas ir uzņēmīgas pret išēmisku bojājumu [27] un to lietošana atbilst žurku lietojumam. transplantācijas modelis, kas izmantots šī pētījuma otrajam mērķim. Šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM), kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma (FBS), kas inaktivēts ar karstumu 60 ◦C 20 minūtes un 1 procentu penicilīna/streptomicīna (P/S). Šūnas tika inkubētas normālos augšanas apstākļos 37 ◦C, 21% O2 un 5% CO2. Kontroles šūnas bija apstākļos, kas bija identiski tiem, kas bija pirmseksperimenta šūnām. Eksperimentālās šūnas tika apstrādātas vai nu ar serumu nesaturošu barotni (SF), SF plus 200 nM AP39, vai SF ar dažādu koncentrāciju (50 µM, 150 µM, 500 µM, 1 mM) nātrija tiosulfāta pentahidrātu (STS), kas iegūti no 250 mg/ml injicējams STS šķīdums (Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Kanāda]). Tika izmantota 200 nM AP39 koncentrācija, jo mēs iepriekš parādījām, ka AP39 šajā koncentrācijā ir citoprotektīvs pret to pašu šūnu līniju līdzīgā aukstā IRI modelī [20]. Pēc tam šūnas 24 stundas inkubēja 10 ◦C temperatūrā hipoksiskos apstākļos (5 procenti CO2, 0,5 procenti O2, 95 procenti N2) HypOxystation H85 hipoksijas kamerā (HYPO2YGEN, ASV), lai izraisītu aukstu išēmisku traumu. Tika izmantota hipotermiskā temperatūra 10 ◦C, jo tā bija zemākā temperatūra, ko varēja tehnoloģiski sasniegt, saglabājot 0,5 procentu O2 līmeni hipoksijā. Pēc hipoksijas barotne, kas satur eksperimentālās šūnas, tika aizstāta ar kontroles barotni, un šūnas tika atkārtoti oksigenētas, inkubējot normālos augšanas apstākļos (37 ◦C, 21 procents O2 un 5 procenti CO2) 24 stundas, lai modelētu reperfūziju un ar to saistītos bojājumus. Pēc 24 stundu reoksigenācijas šūnu dzīvotspēja tika novērtēta, krāsojot šūnas ar FITC konjugētu anneksīnu-V (FITC-Aneksīns-V; BioLegend, ASV) un 7-aminoaktinomicīnu D (7-AAD; BioLegend, ASV). ), kas mēra attiecīgi šūnu apoptozi un nekrozi. Šūnas tika analizētas, izmantojot plūsmas citometriju, izmantojot CytoFLEX S (Beckman Coulter, ASV). FlowJo 11. versija (FlowJo LLC, ASV) tika izmantota, lai atbilstoši iegūtu datus statistikas analīzei.

2.2. Eksperimentālie dzīvnieki

Trīsdesmit Lūisa žurku tēviņi, kas sver 275–300 g un iegādāti no Čārlza Rivera (St. Constant, QC, Kanāda), standarta apstākļos tika izmitināti Dzīvnieku aprūpes un veterināro pakalpojumu iestādē Rietumu universitātē (Londona, ON). Pētījumus ar dzīvniekiem apstiprināja Rietumu universitātes Dzīvnieku kopšanas un dzīvnieku izmantošanas padome ar protokola ID 2018–155.

2.3. Nieru transplantācijas modelis

Syngeneic kidney transplantation in Lewis rats was performed to eliminate any confounding effects of immunosuppression. Rats were randomized into treatment groups of UW solution alone (UW) or UW+STS, anesthetized with ketamine (30 mg/kg) via intraperitoneal administration, and maintained under anesthesia with isoflurane during surgery. The left donor kidneys were procured under aseptic condition and flushed with 10 mL of either cold (4 ◦C) UW solution (UW group, n = 8) in a 28-G Angiocath Becton-Dickinson, or cold UW solution supplemented with sodium thiosulfate pentahydrate (150 µM Seacalphyx® [Seaford Pharmaceuticals Inc, Mississauga, ON, Canada]; UW+STS group, n = 6) until venous effluent was clear. Grafts were then subjected to SCS in UW solution at 4◦C with or without STS for 24 h to mimic prolonged cold ischemic time as previously described [13]. Following 24 h of SCS and bilateral nephrectomy in recipients, renal grafts were transplanted orthotopically into the left renal fossa of syngeneic recipient rats using 11–0 Prolene sutures as we previously described [22]. Sham-operated rats (mid-line incision only; n = 5), were used to establish a baseline for survival, histological analysis, BUN, and serum creatinine. Additionally, another subset of rats in the UW+STS group had grafts removed pre-emptively on a postoperative day (POD) 3 (n = 5) for histological comparison with UW grafts of recipients that were sacrificed at this time point. All surgeries were performed by the same microsurgeon with the length of surgery for the recipient being approximately 2–3 h for both UW and UW+STS groups. Graft failure was presumed in animals that required premature sacrifice (severe visible distress and/or >20 procentu svara zudums) vai nāve. Humāni galapunkti tika pārbaudīti divas reizes dienā, un visas žurkas tika nonāvētas ar CO2 iedarbību kamerā ar plūsmas ātrumu 40%. Eitanāzijas laikā nebija nekādu ķirurģisku komplikāciju, kas varētu izraisīt rezultātu atšķirības.

2.4. Nieru darbības analīze

Pēc nieres transplantācijas žurkas 14 dienas tika uzraudzītas vielmaiņas būros un pēc tam nonāvētas. Asins un urīna paraugi tika savākti ar POD 3, 5, 7, 10 un 14, lai noteiktu nieru darbības parametrus (seruma kreatinīnu, urīnvielas slāpekli [BUN], urīna osmolalitāti un urīna izdalīšanos). BUN un seruma kreatinīna līmenis tika iegūts no nieru transplantācijas saņēmējiem, un viltus operētām žurkām tika mērīts, izmantojot IDEXX Catalyst One Chemistry Analyzer iekārtu (Markham, ON). Urīna osmolalitātes līmeņi tika noteikti ar sasalšanas punkta osmometriju, izmantojot 3320 Osmometer iekārtu (Advanced Instruments, Norwood, MA), un salīdzināja ar uzņēmuma nodrošinātajiem standartiem.

2.5. Histopatoloģiskā un morfometriskā analīze

Parafīnā iestrādātie nieru audi tika sagriezti 4 µm biezās daļās un uzstādīti uz mikroskopiskiem priekšmetstikliņiem histoloģijai. Sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu un eozīnu (H&E), termināla dezoksinukleotidiltransferāzes dUTP nick end marķēšanu (TUNEL), lai noteiktu attiecīgi ATN un apoptozes pakāpi. Akls nieru patologs H&E sekcijām piešķīra ATN punktu skaitu saskaņā ar šādu shēmu: 1 =<11%, 2="11–24%," 3="25–45%," 4="46–75%," 5="">75 procenti transplantāta ATN. Nieru sekcijas tika iekrāsotas arī ar šādām primārajām antivielām: nieru bojājuma marķieri (KIM-1), makrofāgu virsmas marķieri CD68 un neitrofiliem specifisku enzīmu mieloperoksidāzi (MPO; Abcam®, Toronto, Kanāda) un vizualizēja ar sekundārajām antivielām un DAB substrāta hromogēns, izmantojot Dako Envision System (Dako, Glostrup, Dānija) saskaņā ar ražotāja protokolu, pēc tam analizēts ar Eclipse 90i digitālo gaismas mikroskopu (Nikon® Instruments, Ņujorka) ar 10x palielinājumu un kvantitatīvs ar ImageJ programmatūru v. 1.8 (National Veselības institūti, Bethesda, MD).

2.6. Kvantitatīvā PCR analīze

Kopējā RNS tika izolēta no nieru transplantāta audiem, kas iegūti POD 3, izmantojot RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Toronto, Kanāda), un reversā transkribēta cDNS, izmantojot OneScript® Plus cDNS sintēzes komplektu (ABM, Kanāda) kopā ar oligo(dT)12–. 18 grunti saskaņā ar ražotāja protokolu. Izolētā RNS un cDNS pirms lietošanas tika analizētas, izmantojot nanodrop (DeNovix DS-11 spektrofotometrs, Kanāda), ar A260/280 vērtējumiem attiecīgi > 1,95 un > 1,8. Katra qPCR parauga reakcijas maisījuma tilpums bija 20 µL, un tas tika izgatavots saskaņā ar Blastaq® Green 2X qPCR Master Mix (ABM, Kanāda) protokolu un tika analizēts, izmantojot CFX Connect reāllaika PCR noteikšanas sistēmas iekārtu (Bio-Rad, Kanāda). . Primeru sekvences tika izstrādātas, izmantojot Primer-BLAST programmatūru (NCBI) pret beta-aktīnu, poli (ADP-ribozes) polimerāzi (PARP), gamma interferonu (IFN-), audzēja nekrozes faktoru-alfa (TNF-), interleikīnu 6 (IL). -6), B-šūnu limfoma 2 (Bcl-2), Bcl-2- saistītais X proteīns (BAX), kaspāze 3, BH3 mijiedarbības domēna nāves agonists (BID), c-Jun N-terminālā kināze 1/2 (JNK1/2), Pparg koaktivators 1 alfa (PGC-1 ), mitohondriju komplekss I (NDUFB8), mitohondriju komplekss II (SDHB), mitogēnu aktivētā proteīnkināze 1/2 (ERK1) /2), neitrofilo želatināzes lipokalīna (NGAL) un nieru bojājuma molekulas-1 (KIM-1) gēni. Visi interesējošie gēni tika normalizēti pret beta-aktīnu. Gēnu ekspresijas izmaiņas tika salīdzinātas ar viltus operētām žurkām un tika aprēķinātas, izmantojot ΔΔCt metodi.

2.7. Statistiskā analīze

Visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot GraphPad (La Jolla, CA) Prism statistikas programmatūras pakotni, 9. versiju.{1}}. Izdzīvošanas dati tika analizēti, izmantojot Kaplan-Meier izdzīvošanas analīzi un log rank testu, savukārt qPCR gēnu ekspresijas dati tika analizēti, izmantojot nepāra vienvirziena t-testu. Visi pārējie dati tika analizēti, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey post-hoc tests, lai noteiktu statistiskās atšķirības starp grupām. Statistiskā nozīme tika pieņemta p<0.05. values="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" standard="" error="" of="" mean="">

3. Rezultāti

3.1. Ar STS papildināta seruma nesaturoša barotne uzlabo nieru kanāliņu epitēlija šūnu izdzīvošanu aukstās hipoksijas/reoksigenācijas laikā

Plūsmas citometrijas analīze pēc iekrāsošanas apoptozes un nekrozes noteikšanai parādīja, ka NRK{{0}}E šūnām, kas apstrādātas ar SF in vitro aukstā IRI laikā, bija ievērojami samazināta šūnu dzīvotspēja, salīdzinot ar kontroles (normoksiskām) šūnām (1.A attēls; p < 0.05).="" lai="" gan="" visi="" eksperimentālie="" paraugi="" uzrādīja="" ievērojami="" zemāku="" nieru="" kanāliņu="" epitēlija="" šūnu="" dzīvotspēju="" nekā="" šūnas,="" kas="" audzētas="" normoksiskos="" apstākļos="" (p="">< 0,05),="" šūnas,="" kas="" apstrādātas="" ar="" sf,="" kas="" papildinātas="" ar="" 150="" µm="" un="" 500="" µm="" sts,="" uzrādīja="" ievērojami="" augstāku="" dzīvotspēju="" nekā="" apstrādātās="" šūnas.="" tikai="" ar="" sf="" barotni="" (1.a="" att.;="" p="">< 0,05),="" kas="" atbilda="" ievērojami="" samazinātai="" apoptozei,="" salīdzinot="" ar="" šūnām,="" kas="" apstrādātas="" tikai="" ar="" sf="" barotni="" (1.b="" att.;="" p="">< 0,05).="" turklāt="" šķiet,="" ka="" šūnu="" dzīvotspējas="" palielināšanās="" un="" apoptozes="" samazināšanās="" sasniedz="" optimālos="" līmeņus="" ar="" 150="" µm="" un="" 500="" µm="" sts,="" jo="" lielāka="" deva="" mainīja="" šīs="" tendences="" (1.a="" un="" b="">

3.2. UW šķīduma papildināšana ar STS uzlabo agrīnu nieru transplantāta izdzīvošanu un darbību

Nieru transplantātu saglabāšana ar STS papildinātā UW šķīdumā ievērojami uzlaboja saņēmēju dzīvildzi ar 83 procentu dzīvildzi līdz POD 14 (nogalināšanas diena), salīdzinot ar kontroles grupu bez STS papildinājuma, kas uzrādīja 12,5 procentu dzīvildzi, īpaši pirmajās 3 dienās (att. 2A; p < 0.05).="" turklāt="" sts="" papildināšana="" ievērojami="" uzlaboja="" transplantāta="" darbību="" agrīnā="" pēctransplantācijas="" periodā,="" salīdzinot="" ar="" ārstēšanu="" tikai="" ar="" uw.="" seruma="" kreatinīna="" un="" bun="" līmenis="" bija="" ievērojami="" paaugstināts="" gan="" uw,="" gan="" uw="" plus="" sts="" grupās="" ar="" pod="" 3,="" kas="" korelēja="" ar="" samazinātu="" urīna="" osmolalitāti,="" salīdzinot="" ar="" fiktīvu="" (2.b,="" c="" un="" 3a="" attēls;="" p="">< 0).{25="" }}5).="" tomēr="" seruma="" kreatinīna="" un="" bun="" līmenis="" uw="" plus="" sts="" grupā="" ievērojami="" pazeminājās="" uz="" pod="" 3,="" attiecīgi="" palielinoties="" urīna="" osmolalitātei,="" salīdzinot="" ar="" uw="" grupu="" (2.b,="" c="" un="" 3a="" att.;="" p="">< 0,05).="" interesanti,="" ka="" seruma="" kreatinīna="" un="" bun="" līmenis="" uw="" plus="" sts="" grupā="" nepārtraukti="" samazinājās="" no="" pod="" 3="" līdz="" pod="" 14,="" palielinoties="" urīna="" osmolalitātei="" un="" bija="" salīdzināms="" ar="" sham="" līmeni="" (2.b,="" c="" un="" 3a="" attēls).="" arī="" urīna="" izdalīšanās="" uw="" plus="" sts="" grupā="" bija="" ievērojami="" augstāka="" pirmajās="" četrās="" pēcoperācijas="" dienās,="" salīdzinot="" ar="" uw="" un="" sham="" grupām="" (3.b="" att.;="" p="">< 0,05).="" tomēr="" tas="" nepārtraukti="" samazinājās,="" tuvojoties="" sākotnējās="" vērtības="" (fiktīvajai)="" vērtībai,="" un="" bija="" salīdzināms="" ar="" fiktīvu="" pod="" 14,="" kamēr="" urīna="" izdalīšanās="" izdzīvojušajām="" žurkām="" uw="" grupā="" saglabājās="" augstāka="" nekā="" sākotnējā="" vērtība="" pod="" 14="" (3.b="">

3.3. STS pievienošana UW šķīdumam mazina transplantācijas izraisītu šūnu nāvi pēc nieru transplantācijas

Nieru sekcijas, kas iegūtas uz POD 3 un 14, tika iekrāsotas ar TUNEL, lai noteiktu apoptotisko šūnu nāvi, un to novērtēja akls nieru patologs (4.A attēls). Nieru transplantāti no UW grupas uzrādīja ievērojami augstāku apoptotisko šūnu nāvi uz POD 3, par ko liecina augstāks TUNNEL rādītājs, salīdzinot ar nierēm no UW plus STS un Sham grupām (5.A un b att.; p < 0.{11}="" }5).="" transplantāti="" no="" uw="" plus="" sts="" grupas="" būtiski="" neatšķīrās="" no="" sham="" tiem="" tajā="" pašā="" laika="" punktā="" un="" pie="" pod="" 14="" (4.b="" att.).="" turklāt,="" lai="" gan="" transplantāti="" gan="" no="" uw,="" gan="" uw="" plus="" sts="" grupām="" uzrādīja="" ievērojami="" palielinātus="" atn="" rādītājus="" pod="" 3="" salīdzinājumā="" ar="" fiktīvu="" grupu="" (5.="" att.;="" p="">< 0.05),="" uw="" plus="" sts="" transplantāti.="" uzrādīja="" samazinātus="" atn="" rādītājus="" uz="" pod="" 3,="" salīdzinot="" ar="" uw="" (5.="" att.;="" p="">< 0,05).="" turklāt,="" lai="" gan="" uw="" transplantātu="" saņēmēji="" neizdzīvoja="" līdz="" pod="" 14,="" un="" tāpēc="" viņu="" atn="" rādītājus="" nevarēja="" noteikt="" pēc="" pod="" 14,="" uw="" un="" sts="" transplantātu="" saņēmēji="" izdzīvoja="" līdz="" pod="" 14,="" bet="" uzrādīja="" ievērojami="" paaugstinātus="" atn="" rādītājus,="" salīdzinot="" ar="" fiktīvo="" grupu="" (att.="" 5;="" p=""><>

3.4. Nieru transplantātiem, kas saglabāti ar STS papildinātā UW šķīdumā, pēc nieres transplantācijas bija samazināti traumu marķieri un iekaisuma infiltrāts

Nieru sekcijas, kas iegūtas uz POD 3 un 14, tika iekrāsotas ar KIM-1, lai noteiktu proksimālo kanāliņu bojājumu, kā arī CD68 (makrofāgu marķieris) un MPO (neitrofilu marķieris), un to novērtēja akls nieru patologs (6.A, 7.A att., un C). KIM-1, CD68 un MPO nieru audu ekspresija bija ievērojami augstāka UW grupā ar POD 3, salīdzinot ar UW plus STS un Sham grupām (6.B, 7.B un D attēls; p < {{11}="" }.05),="" lai="" gan="" šo="" marķieru="" ekspresija="" uw="" plus="" sts="" transplantātos="" būtiski="" neatšķīrās="" salīdzinājumā="" ar="" sham="" uz="" pod="" 14="" (6.b,="" 7.b="" un="" d="" att.;="" p=""> 0,05).

3.5. STS papildinājums UW šķīdumam nomāca pro-iekaisuma, proapoptotisko un mitohondriju gēnu ekspresiju nierēs

Pro-iekaisuma, proapoptotisko, mitohondriju un nieru bojājumu marķieru gēnu ekspresija tika noteikta, izmantojot qRT-PCR transplantētās nierēs, kas iegūtas ar POD 3. Pro-iekaisuma gēnu ekspresija IFN-, TNF- un IL{8 }} bija ievērojami palielināti UW transplantātos salīdzinājumā ar UW plus STS transplantātiem uz POD 3 (8.A attēls; p < 0.05)="" un="" sekoja="" tam="" pašam="" modelim="" ar="" proapoptotiskiem="" gēniem="" parp,="" bax="" ,="" kaspāzes-3,="" bid,="" jnk1="" un="" jnk2="" (8.a="" att.;="" p="">< 0.05),="" savukārt="" anti-apoptotiskā="" bcl-2="" ekspresija="" uw="" bija="" nedaudz="" palielināta.="" plus="" sts="" grupa="" salīdzinājumā="" ar="" uw="" grupu,="" lai="" gan="" šis="" pieaugums="" nesasniedza="" statistisku="" nozīmīgumu="" (8.a="" att.).="" turklāt="" mitohondriju="" gēnu="" pgc-1,="" ndufb8="" (komplekss="" i)="" un="" sdhb="" (komplekss="" ii)="" ekspresija="" uw="" transplantātos="" bija="" ievērojami="" samazināta,="" salīdzinot="" ar="" uw="" plus="" sts="" transplantātiem="" (8.b="" att.;="" p="">< 0="" .05),="" savukārt="" pretējais="" tika="" novērots="" ar="" erk1="" un="" erk2="" izteiksmēm="" (8.b="" att.;="" p="">< 0,05).="" turklāt="" kim-1="" gēna="" ekspresija="" uw="" transplantātos="" bija="" ievērojami="" palielināta,="" salīdzinot="" ar="" uw="" plus="" sts="" transplantātiem="" (8.c="" att.;="" p="">< 0,05),="" savukārt="" samazināta="" ngal="" ekspresija="" uw="" plus="" sts="" transplantātos="" nesasniedza="" statistisku="" nozīmīgumu="" salīdzinājumā="" ar="" transplantātu="" uw="" potzari="" (8.c="" att.;="" p=""> 0,05).

4. Diskusija

Šis pētījums nosaka standarta konservēšanas šķīduma papildināšanu ar STS, klīniski dzīvotspējīgu FDA apstiprinātu H2S donoru, lai mazinātu transplantācijas izraisītu aukstu nieru IRI, uzlabotu transplantāta kvalitāti un pagarinātu saņēmēja dzīvildzi. Izmantojot in vitro nieru IRI modeli un singēnās ortotopiskās nieres transplantācijas žurku modeli, mēs pirmo reizi parādām, ka UW šķīduma papildināšana ar STS ilgstošas ​​​​SCS laikā aizsargā gan orgānus, gan orgānus.

Galvenais atklājums mūsu in vitro modelī ir tāds, ka STS papildināšana ar serumu nesaturošu barotni aizsargā nieru epitēlija šūnas no aukstās hipoksijas un siltas reoksigenācijas izraisītas apoptozes un palielina dzīvotspēju, kas atbilst mūsu iepriekšējam pētījumam, kurā mēs parādījām mitohondriju aizsargājošo iedarbību. - H2S donora zāles AP39 mērķa saaukstēšanās nieru IRI in vitro modelī [20]. Interesanti, ka augstāka STS koncentrācija 1 mM apvērsa labvēlīgo ietekmi, kas nozīmē, ka STS ir divfāzu devas-atbildes parādība, ko dēvē par hormēzi, kurā zemāka koncentrācija ir citoprotektīva, bet augstāka koncentrācija ir citotoksiska. Mitohondriju bojājumi ir galvenās nieru IRI sekas, jo mitohondriju caurlaidība var kavēt adenozīna trifosfāta (ATP) veidošanos un palielināt reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanos, kas ir destruktīvs audu bojājumu mediators [13]. Nesen tika ierosināts, ka mitohondriji ir galvenā STS aktivitātes vieta. Ir zināms, ka STS ne tikai ģenerē H2S mitohondrijās, izmantojot no glutationa atkarīgu reducēšanu un otrādi, izmantojot sulfīdu oksidācijas ceļu, bet arī saglabā mitohondriju ATP sintēzi, samazina ROS veidošanos un uzlabo sarežģītās enzīmu aktivitātes elektronu transporta ķēdē (ETC) [24]. ,28–30]. Turklāt nesenie pētījumi parādīja, ka STS ievērojami palielināja PGC-1 ekspresiju, kas ir pozitīvs mitohondriju bioģenēzes un ATP ražošanas regulators [26], kas atbilst mūsu novērojumiem in vivo. Šie molekulārie mehānismi varētu izskaidrot ievērojami palielinātu mitohondriju ETC kompleksu I un II (attiecīgi NDUFB8 un SDHB) ekspresiju mūsu nieru transplantācijas modelī ar palielinātu dzīvildzi un darbību, kā novērots nieru transplantātos, kas saglabāti ar STS papildinātā UW šķīdumā.

Pamatojoties uz mūsu in vitro rezultātiem, mēs nolēmām izpētīt, vai STS aizsargājošā iedarbība ir piemērojama in vivo, izmantojot transplantācijas modeli, kurā aukstā IRI ir galvenais transplantāta disfunkcijas un palielinātu pēctransplantācijas komplikāciju veicinātājs. Mūsu atklājumi liecina, ka ilgstoša (24 h) nieru transplantātu SCS ar STS papildinātā UW šķīdumā ievērojami uzlabo transplantāta kvalitāti un funkciju, kam raksturīgs pazemināts kreatinīna un BUN līmenis serumā, lielāka urīna izdalīšanās un ilgāka saņēmēja dzīvildze, salīdzinot ar transplantātiem, kas saglabāti tikai UW šķīdumā. . Ir svarīgi atzīmēt, ka urīna izdalīšanās tūlītēja pat pēc klīniskas nieres transplantācijas ir kritisks iznākums, kas nosaka, vai ir nepieciešama dialīze, lai novērstu aizkavētu transplantāta funkciju (DGF). Tāpēc mūsu novērojums, ka STS palielina urīna izdalīšanos tūlīt pēc transplantācijas un ir salīdzināms ar Sham grupu ar POD 14, ir daudzsološs atklājums. Novērotais nieru darbības uzlabojums pēc STS papildinātā UW šķīdumā saglabāto transplantātu transplantācijas arī sniedza ievērojamu izdzīvošanas priekšrocību. Kvantitatīvi STS papildināšana pagarināja transplantāta mūžu tā, ka 83 procenti (5/6) žurkām, kuras saņēma UW plus STS transplantātus, izdzīvoja līdz POD 14 (nogalināšanas diena), salīdzinot ar tikai 12,5 procentiem (1/8) recipientu žurkām. potzari, kas konservēti UW šķīdumā bez STS papildinājuma. Šis šī pētījuma atklājums atbilst arī mūsu iepriekšējam pētījumam, kurā tikai 14 procenti (1 no 7) potzaru recipientu žurkām tika saglabāti UW šķīdumā 24 stundas bez H2S (GYY4137) piedevas, izdzīvoja līdz POD 14 [20]. .

Papildus tam, ka tika uzlaboti nieru darbības parametri, STS papildināšana arī inhibēja nieru transplantāta apoptozi un iekaisumu, samazinot proapoptotisko un pro-iekaisuma gēnu ekspresiju audos, vienlaikus palielinot anti-apoptotiskos gēnu regulēšanu un samazinot CD68-pozitīvo makrofāgu un MPO pozitīvi neitrofīli, kas kopumā samazināja KIM{5}} ekspresiju un ATN un galu galā saglabāja nieru morfoloģiju. Ir zināms, ka šie iekaisuma citokīni ir šūnu nāves mediatori aukstā IRI laikā [31], un to UW plus STS transplantātu samazināšanās, iespējams, ir saistīta ar labi zināmajām STS īpašībām, kas samazina endotēlija caurlaidību asinsvadu endotēlija monoslānī, mazina citokīnu veidošanos. , un izraisa pretiekaisuma citokīnu veidošanos [32]. Turklāt mūsu konstatējums, ka STS papildināšana UW šķīdumam samazina pro-iekaisuma gēnu ekspresiju, sakrīt ar iepriekšējo pētījumu par STS pretiekaisuma aktivitāti, samazinot TNF- un IL{13}} līmeni neiroloģiskās slimībās [33]. ,34]. Mehāniski STS inaktivē kaspāzi-3, piesaistoties tās aktīvajai vietai, izmantojot spēcīgas ūdeņraža saites, un tādējādi novērš dabiskā substrāta piekļuvi aktīvajai vietai, galu galā apturot apoptozi [35]. STS arī bloķē JNK aktivāciju, proteīnu, kam ir izšķiroša loma apoptotiskajā signalizācijā [35], kas apstiprina mūsu secinājumus par STS pazeminošo ietekmi uz kaspazi3 un JNK. Tomēr mēs nevaram noteikt, vai šajā pētījumā šādi mehānismi darbojas, jo mēs neveicām papildu eksperimentus, lai izpētītu šos molekulāros mehānismus.

Galvenais mūsu in vitro eksperimenta ierobežojums ir mūsu tehniskais izaicinājums izmantot pašreizējo standarta saglabāšanas temperatūru 4 ◦ C [36], jo 10 ◦ C, ko mēs izmantojām, bija zemākā temperatūra, ko var tehnoloģiski sasniegt, neapdraudot hipoksisko vidi. Tā ir patiesa atšķirība attiecībā uz šūnu fizioloģiskajiem procesiem un arī saglabāšanas paņēmieniem. Iespējamais risinājums ir izmantot ķīmiski izraisītu hipoksiju plastmasas maisiņā un ievietot to 4 ◦C ledusskapī, lai atspoguļotu SCS klīniskos apstākļus. Tomēr šie anaerobās atmosfēras ģenerēšanas maisi bija paredzēti lietošanai siltā temperatūrā (21–37 ◦C), jo ķīmiskie savienojumi, kas izraisa hipoksisku vidi, darbojas šādos apstākļos. Turpmākajos pētījumos jācenšas optimizēt temperatūru hipoksijas kamerā, lai atdarinātu klīniskos SCS iestatījumus. Konsekventas 4 ◦C temperatūras sasniegšana, neapdraudot hipoksisku vidi, ļaus mums noteikt, vai eksperimentālajā in vitro aukstā IRI modelī novērotie fenotipi ir konsekventi izteikti. Neatkarīgi no in vitro eksperimenta, mūsu žurku transplantācijas modelim nav arī trūkumu. Mēs veicām singēnu nieru transplantāciju (ģenētiski identiski donori un recipienti ar imunoloģisku savietojamību), kas ir attiecināma tikai uz identiskiem dvīņiem klīniskajā nieru transplantācijā, savukārt lielākā daļa klīnisko nieru transplantāciju ir alogēnas (ģenētiski atšķirīgi donori un recipienti). Alogēnā transplantācija liek transplantāta saņēmējiem pirms transplantācijas iziet imunoloģiskos testus, lai identificētu donora cilvēka leikocītu antigēnus (HLA; molekulas, kas izraisa un regulē imūnreakciju), noteiktu imunoloģisko saderību starp donoriem un recipientiem un izvairītos no orgānu atgrūšanas [37, 38]. Turpmākajos pētījumos, izmantojot STS, jāapsver alogēna transplantācija. Vēl viens ierobežojošs nieres transplantācijas modelis ir fakts, ka mēs koncentrējāmies uz dzīviem donoriem, suboptimāli transplantāti no ziedošanas pēc sirds nāves (DCD) donoriem kļūst arvien izplatītāki kā donora nieru avots daudzos transplantācijas centros visā pasaulē [39]. DCD pakļauj donora orgānus dažādiem siltas išēmijas periodiem papildus aukstiem išēmiskiem laikiem SCS laikā, un tas ir saistīts ar paaugstinātu DGF līmeni un samazinātu transplantāta izdzīvošanu, salīdzinot ar dzīviem donoriem [40]. Tāpēc turpmākajos pētījumos jāņem vērā DCD nieru transplantācijas modelis, lai novērtētu STS ietekmi pret IRI šajā modelī.

Noslēgumā jāsaka, ka mūsu pētījums parāda, ka standarta konservēšanas šķīduma papildināšana ar klīniski dzīvotspējīgu H2S donoru medikamentu ilgstošas ​​nieru transplantātu SCS laikā aizsargā pret transplantācijas izraisītu aukstu nieru IRI, uzlabo transplantāta vispārējo kvalitāti un transplantāta funkciju, kā arī pagarina transplantāta saņēmēja dzīvildzi. Ņemot vērā, ka DGF risks palielinās līdz ar ilgstošu aukstu išēmisku laiku klīniskās nieres transplantācijas gadījumā, kas rada lielas klīniskas bažas, novērojums, ka STS aizsargā nieru transplantātus ilgstošas ​​SCS laikā un novērš DGF pēc transplantācijas, sniedz lielu klīnisku solījumu, kas varētu samazināt vai novērst DGF sastopamība klīniskajā nieru transplantācijā tuvākajā nākotnē. Tādējādi nākotnes ieguvums no STS pievienošanas saglabāšanas risinājumiem var būt potenciāls šīs aktuālās problēmas risinājums. Kopumā šis pētījums papildina pieaugošo literatūras klāstu, kas atbalsta STS un citu H2S donoru citoprotektīvo iedarbību pret orgānu IRI, īpaši uzlabojot transplantācijas rezultātus transplantācijas izraisītā aukstā nieru IRI gadījumā. Šīs stratēģijas varētu atvieglot tādu transplantātu izmantošanu, kas pakļauti ilgstošam aukstajam išēmiskajam laikam, kas varētu palielināt transplantējamo orgānu kopumu.

CRediT autorības ieguldījuma paziņojums

Visi autori ir piekrituši šī manuskripta iesniegšanai. Nav interešu konflikta.

Atsauces

[1] RA Wolfe, VB Ashby, EL Milford, et al., Mirstības salīdzinājums visiem pacientiem, kuriem tiek veikta dialīze, pacientiem, kuriem tiek veikta dialīze, kas gaida transplantāciju, un pirmās līķa transplantācijas saņēmējiem, New Engl. J. Med. 341 (23) (1999) 1725–1730.

[2] M. Tonelli, N. Wiebe, G. Knoll, et al., Sistemātisks pārskats: nieru transplantācija salīdzinājumā ar dialīzi klīniski nozīmīgos iznākumos, Am. J. Transpl. 11 (10) (2011) 2093–2109.

[3] MC Cavallo, V. Sepe, F. Conte, et al., Rentabilitāte nieru transplantācijai no DCD Itālijā, Transplant. Proc. 46 (10) (2014) 3289–3296.

[4] B. Dorweiler, D. Pruefer, TB Andrasi, SM Maksan, W. Schmiedt, A. Neufang, CF Vahl, Ischemia-reperfusion trauma, Eur. J. Trauma izcelties. Surg. 33 (6) (2007) 600–612.

[5] EE Guibert, AY Petrenko, CL Balaban, AY Somov, JV Rodriguez, BJ Fuller, Orgānu saglabāšana: pašreizējās koncepcijas un jaunas stratēģijas nākamajai desmitgadei, Transfus. Med. Hemomāte. 38 (2) (2011) 125–142.

[6] AK Salahudeen, N. Haider, W. May, Cold išēmija un mirušo nieru alotransplantātu samazināta ilgtermiņa izdzīvošana, Kidney Int. 65 (2) (2004) 713–718.

[7] I. Quiroga, P. McShane, DD Koo, et al., Galvenās aizkavētas transplantāta funkcijas un aukstās išēmijas laika ietekmes uz nieru allotransplantāta izdzīvošanu, Nephrol. Zvanīt. Transplantācija. 21 (6) (2006) 1689–1696.

[8] LK Kayler, J. Magliocca, I. Zendejas, TR Srinivas, JD Schold, Aukstās išēmijas laika ietekme uz transplantāta izdzīvošanu ECD transplantāta saņēmēju vidū: pāra nieru analīze, Am. J. Transplantācija. 11 (12) (2011) 2647–2656.

[9] MD Doshi, N. Garg, PP Reese, CR Parikh, recipienta riska faktori, kas saistīti ar transplantāta aizkavēšanos: pāra nieru analīze, Transplantation 91 (6) (2011) 666–671.

[10] A. Debout, Y. Foucher, K. Tr´ebern-Launay, et al., Katra papildu aukstuma išēmijas stunda ievērojami palielina transplantāta mazspējas un mirstības risku pēc nieres transplantācijas, Kidney Int. 87 (2) (2015) 343–349.

[11] A. Kezic, I. Spasojevic, V. Lezaic, M. Bajcetic, Mitochondria-targeted antioksidanti: nākotnes perspektīvas nieru išēmijas-reperfūzijas traumā, Oxid. Med. Šūna Longev. 2016 (2016) 2950503.

[12] TI ​​Peng, MJ Jou, Oksidatīvais stress, ko izraisa mitohondriju kalcija pārslodze, Ann. NY Akad. Sci. 1201 (2010) 183–188.

[13] W. Jassem, SV Fuggle, M. Rela, DD Koo, ND Heaton, Mitohondriju loma išēmijas/reperfūzijas ievainojumos, Transplantation 73 (4) (2002) 493–499.

[14] PM Snijder, E. van den Berg, M. Whiteman, SJ Bakker, HG Leuvenink, H. van Goor, Emerging role of gasotransmitters in renal transplantation, Am. J. Transplantācija. 13 (12) (2013) 3067–3075.

[15] JT Henkoks, M. Vaitmens, Sērūdeņradis un šūnu signalizācija: komandas spēlētājs vai tiesnesis? Augu fiziol. Biochem. 78 (2014) 37.–42.

[16] W. Zhao, J. Zhang, Y. Lu, R. Wang, H(2)S kā jauna endogēna gāzveida K(ATP) kanālu atvērēja vazorelaksējoša iedarbība, EMBO J. 20 (21) (2001) 6008–6016.

[17] I. Lobs, M. Deisons, D. Kārters u. c., Ārstēšana ar sērūdeņradi mazina nieru allotransplantāta išēmijas-reperfūzijas bojājumus aukstuma uzglabāšanas laikā un uzlabo agrīnu transplantāta nieru darbību un izdzīvošanu pēc alogēnas nieres transplantācijas, J. Urol. 194 (6) (2015) 1806–1815.

[18] I. Lobs, A. Moks, Z. Lans, V. Liu, B. Garsija, A. Seners, Papildu sērūdeņradis aizsargā transplantāta nieru darbību un pagarina saņēmēja dzīvildzi pēc ilgstoša aukstā išēmijas-reperfūzijas bojājuma, mazinot nieru transplantāta apoptozi. un iekaisums, BJU Int. 110 (11 Pt C) (2012) E1187–E1195.

[19] I. Lobs, J. Dzjans, D. Lians u.c., Ūdeņraža sulfīds aizsargā nieru transplantātus pret ilgstošu aukstuma išēmijas un reperfūzijas bojājumu, izmantojot specifiskas mitohondriju darbības, Am. J. Transplantācija. 17 (2) (2017) 341–352.

[20] C. Renard, SW Borron, C. Renoeau, FJ Baud, Nātrija tiosulfāts akūtai saindēšanai ar cianīdu: pētījums ar žurku modeli, Ann. Pharm. Fr. 63 (2) (2005) 154.–161. [21] N. Laplass, V. Kepenekians, A. Frigeri u.c., Nātrija tiosulfāts pasargā no nieru darbības traucējumiem pēc hipertermiskas intraperitoneālās ķīmijterapijas (HIPEC) ar cisplatīnu, Int. J. Hiperta. 37 (1) (2020) 897–902.