Stx2 izraisa diferenciālu gēnu ekspresiju un traucē diennakts ritma gēnus proksimālajā kanāliņā Ⅱ

3. Diskusija

3.1. Proksimālā cauruļveida patoloģija STEC pacientiem un dzīvnieku modeļos

Oligūrija ir zīmeakūta tubulārā nekroze(ATN). ATN dēļ noslīpētās epitēlija šūnas aizsprosto kanāliņu lūmenu, lai samazinātu šķidruma plūsmu, kas parādās kā oligūrija. STEC pacientiem oligūrija un anūrija bieži ir konstatējumi, kas liecina par ATN. Proksimālo kanāliņu funkcijas samazināšanās STEC infekcijas slimības agrākajos posmos ir pierādīta kā 2MG un NAG palielināšanās urīnā [3,33]. B2MG ir 12 kDa mazs proteīns, kas tiek brīvi filtrēts caur glomeruliem un veselīgā stāvoklī pilnībā absorbēts proksimālajās kanāliņos. Tomēr, tiklīdz ir bojāti proksimālie kanāliņi, 2MG daudzums urīnā palielinās, tādējādi kalpojot kā biomarķieris proksimālās kanāliņu funkcijai. NAG ir liels lizosomu enzīms ar 130 kDa un galvenā glikozidāze proksimālajā kanāliņā. Lielā izmēra dēļ glomeruls nevar filtrēt NAG, savukārt bojātie proksimālie kanāliņi izdala NAG urīnā. Tādējādi NAG palielināšanās urīnā ir vēl viens proksimālo cauruļveida bojājumu biomarķieris. Glomerulārā histopatoloģija, piemēram, fibrīna nosprostoti kapilāri, ir bieža STEC pacientu konstatācija; tomēr iepriekš minētie urīna dati liecina par proksimālu kanāliņu bojājumu agrākās slimības gadījumā. Arī STEC pacientu urīnā ir casts, kas sastāv no cauruļveida epitēlija, kas ir bojāto proksimālo cauruļveida šūnu izspiešanas rezultāts [1]. Dzīvnieku modeļos proksimālo cauruļveida šūnu noslīdēšana bieži tiek konstatēta gan STEC infekcijas, gan Stx injekcijas modeļos [25–27,34]. Pašreizējā pētījumā mēs atklājām Stx2-injicētās peles nierēs proksimālo kanāliņu šūnu izsīkumu, kas liecina par Stx2-inducētām proksimālajām kanāliņu izmaiņām (1. attēls). Mēs arī atklājām Stx2 receptoru Gb3 gan pelē, gancilvēka nieru proksimālie kanāliņiar luminālo sānu izteiksmi, kas liecina par Stx2 tiešu mijiedarbību ar proksimālajām kanāliņiem (2. un 3. attēls). PDK4 fosforilē piruvāta dehidrogenāzi, lai kavētu tās aktivitāti, kā rezultātā samazinās glikozes izmantošana un palielinās tauku metabolisms, reaģējot uz ilgstošu badošanos un badu. Tas aizsargā atdalītās epitēlija šūnas pret atslāņošanās izraisītu šūnu nāvi (anoikis) [35]. Sākotnēji PDK4 maksimums bija 4 stundās, pēc tam vēl viens maksimums 8 stundās (5.A attēls). Tas tika samazināts pēc 12 stundām, bet pēc tam tas pakāpeniski palielinājās līdz 72 stundām ar log2-reižu maiņu un beidzās ar 3 (12-kārtīgas izmaiņas) (5.A attēls). Epitēlija šūnu atdalīšanās notika Stx{16}}injicētajās peles proksimālajās cauruļveida šūnās (sloughing) ar relatīvi neskartu morfoloģiju (1. attēls), tas var atspoguļot PDK4 augšupregulāciju.

CISTANCHE TUBULOSA EKSTRAKTA PULVERIS NIERĒM

Tā kā NHERF1 (SLC9A3R1) veicina normālu šūnu pielipšanu ārpusšūnu matricai [36], aktīna citoskeleta organizāciju un saglabā šūnu morfoloģiju, šī gēna pazemināta ekspresija var izraisīt tādas sekas kā šūnu noslīdēšana (5K attēls).

Stx2 ietekme uz proksimālajiem kanāliņiem šķiet tik svarīgs STEC infekcijas slimības faktors; tomēr izmaiņas gēnu ekspresijā, koncentrējoties uz in vivo proksimālajām cauruļveida šūnām, iepriekš nebija pieejamas. Keepers et al. [37] parādīja atšķirīgi ekspresētus gēnus (DEG) Stx2+LPS injicēto peļu nierēs tā, ka lielākā daļa agrāko un lielā mērā izmainīto gēnu bija no LPS ietekmes, un gēni, kas tika mainīti ļoti vēlu, ir no Stx2 efekta. . Viņu dati parādīja vērtīgu ieskatu nieru diferenciālajās gēnu ekspresijās, bet neatdalīja šūnu veidus, kas bija atbildīgi par šīm izmaiņām. Pašreizējā pētījumā mēs mēģinājām meklēt DEG, kas ir saistītas ar proksimālajām cauruļveida šūnām, salīdzinot peles mikromasīva datus.nieru un cilvēka primārais proksimālais kanāliņušūnas, kas tika apstrādātas ar Stx2.

3.2. Proksimālie cauruļveida faktori, kas saistīti ar Stx2-izraisītu patoloģiju saistībā ar zināmajām Stx2 aktivitātēm Gb3 ekspresējošās šūnās

3.2.1. Aktivitāte (I), signāla pārraide, ko izraisa Stxs saistīšanās ar Gb3

Stxs B apakšvienības inducē nereceptoru src tirozīna kināzes Jā fosforilāciju [4]. Fosforilēts Yes aktivizē pakārtotās signalizācijas molekulas ar tās kināzes aktivitāti un noved pie citoskeleta pārveidošanas [5]. Ir zināms, ka ar Jā saistītā proteīna (YAP) fosforilēšana Y357, izmantojot Yes, izraisa YAP kodola translokāciju, kur tā darbojas kā transkripcijas koaktivators, lai inducētu mērķa gēnus, piemēram, CTGF [38]. Matriccelulārie proteīni CYR61 (CCN1) un CTGF (CCN2) tiek izdalīti ekstracelulārajā matricā (ECM) un palīdz uzturēt šūnu-ECM adhēziju, saistot receptoru integrīnus un šūnu virsmai piesaistītos heparāna sulfāta proteoglikānus (HSPG) [39, 40]. CCN1 un 2 transkripcijas galvenā molekula ir YAP, un tā tiek turēta neaktīva (fosforilēta pie serīna atlikuma 127) normālā stāvoklī zem Hippo signalizācijas ceļa. Kad tiek konstatēta zema šūnu un šūnu adhēzija, YAP (S127) vairs netiek fosforilēts, ļaujot tam iekļūt kodolā, un palielinās CCN1 un 2 transkripcija [41–43]. CCN1 un 2 darbojas kā brūču dzīšanas molekulas, lai atjaunotu šūnu zaudētos audus [38, 44]. Mūsu datu kopā CCN1 un 2 bija nelieli maksimumi agrākā laika punktā (6 h). Tas var atspoguļot Stx2 saistīšanās izraisītu Yes aktivizāciju. Vēlākās stundās slaucīšana, iespējams, ir izraisījusi turpmāku YAP aktivāciju, izslēdzot Hippo signalizācijas ceļu, lai izraisītu lielāku CCN1 un 2 ekspresiju pēc 12 stundām vai vēlāk (5. C attēls).

3.2.2. Aktivitāte (II), ER-stress/UPR izraisīšana

Stxs sasniedz ER, kur šķeltie A1 fragmenti un B apakšvienības atdarina nesalocītus proteīnus [9, 10, 45, 46]. Glikozes regulētais proteīns 78 kDa (Grp78, saistošais imūnglobulīna proteīns (Bip)) noenkuro trīs UPR galvenos proteīnus, kas prasa inozitolu enzīmu -1 (Ire-1), proteīnkināzi R līdzīgo endoplazmatiskā tīkla kināzi (PERK) ) un aktivizējot transkripcijas faktoru 6 (ATF6) ER membrānā normālā stāvoklī. Tomēr, pateicoties lielākai Grp78 afinitātei pret nesalocītiem proteīniem, tas atbrīvo šos noenkurotos proteīnus. ATF6 tiek aktivizēts pēc atbrīvošanās un palielina CHOP (DDIT3) un X-box saistošā proteīna 1 (XBP-1) mR NA, savukārt Ire-1 savieno XBP-1 mRNS, veidojot XBP{{ 22}} proteīnu, kas veicina CHOP (DDIT3) transkripciju. PERK aktivācija noved pie ATF4 aktivācijas, kas arī palielina CHOP (DDIT3) mRNS. Tāpēc CHOP (DDIT3) mRNS palielināšanās ir UPR pazīme [47,48]. Tiek ziņots, ka Stxs izraisa UPR, un mūsu datu kopā CHOP (DDIT3) tiek regulēts (attēls 5D – G).

GDF15 pieder transformējošā augšanas faktora beta (TGF) saimei. Nesen tika pierādīts, ka GDF15 ir starpnieks diabēta zāļu metformīna izraisītam svara zudumam [49]. Pelēm, kuras lietoja perorāli metformīnu, palielinājās zarnu un nieru GDF15 mRNS, kā rezultātā paaugstinājās GDF15 līmenis serumā. Cirkulējošais GDF15 darbojas caur smadzeņu stumbra ierobežotu receptoru, lai nomāktu pārtikas uzņemšanu un samazinātu ķermeņa svaru [50]. Pelēm, kurām ievadīts metformīns, palielināts nieru GDF15 līmenis vismaz daļēji ir pakļauts CHOP (DDIT3) regulējumam. Mūsu datu kopā par Stx2-injicētām peļu nierēm CHOP (DDIT3) sākotnēji palielinājās pēc 4 stundām ar ļoti nelielu maksimumu, bet pēc tam sāka pieaugt līdz 48 stundām, kur tas saglabāja loga līmeni{16. }}reizes izmaiņas ap 1,3 (5. E attēls). Saskaņā ar STRING klasteru analīzi GDF15 saņem aktīvu ievadi no transkripcijas faktoriem CHOP (DDIT3) un ATF3 (attēls 5E) [51,52]. Stx2-injicētās peles svars sāka samazināties vai novirzīties no fizioloģiskā šķīduma kontroles pēc 24 stundām (S3B attēls). GDF15 mRNS palielināšanās nierēs pēc 12 stundām, iespējams, ietekmēja smadzeņu stumbru, lai samazinātu pārtikas uzņemšanu, kas savukārt parādījās kā svara zudums (attēls 5E un S3B). Tā kā GDF15 ekspresijas līmenis turpināja būt augsts pēc 24 stundām, peles turpināja zaudēt svaru (5E un S3B attēls).

Pēc ER stresa PERK tiek atbrīvots no Grp78 (Bip) un oligomerizējas, lai fosforilētos un inhibētu eIF2, izraisot globālas translācijas represijas, izņemot dažus UPR reaģējošus proteīnus, piemēram, ATF4, CHOP un Grp78. GADD34 (proteīna fosfatāzes 1 regulējošā apakšvienība 15A (PPP1R15A)) ir viens no palielinātajiem proteīniem, kas tiek pakļauti fosforilētā eIF2 (eIF2 (P)) izraisītajai inhibīcijai un tiek regulēti mūsu datu kopā (5D, G attēls). GADD34 ir proteīna fosfatāze-1, kas defosforilē eIF2 (P), lai negatīvi regulētu UPR izraisītu proteīnu sintēzes inhibīciju [53]. GADD34 (PPP1R15A) izteiksme kļūst par log2-reizes izmaiņu, kas ir lielāka par 1 pēc 12 h Stx2 mūsu datu kopā un turpina palielināties līdz 24 stundām, kad tā tiek sasniegta platumā (log2-reizes maiņa ir vienāda ar 2,1) un saglabā šo vērtību. līmenī līdz beigām (5.D,G attēls). Tas liecina, ka Stx2-izraisītā UPR bija negatīva atgriezeniskā saite pēc 12 stundām. Paaugstināta CHOP (DDIT3, GADD153) transkripcija un translācija ir ER stresa pazīme, un diferenciālais izteiksmes modelis atgādina GADD34, izņemot log2, kas lielāks par 1, notiek pēc 24 stundām un pēc tam pakāpeniski palielinās (log2 ir 1, 3) (5D, G attēls). Arī CEBPB, dominējošais CHOP dimerizējošs partneris, mūsu datu kopā ir pārregulēts (5D, G attēls). Šie rezultāti liecina, ka, lai gan Stx2-inducētais ER stress sākas ļoti agrīnā laika posmā, tas palielina efektu līdz 24 stundām un saglabā šo ER stresa līmeni līdz beigām, savukārt negatīvās atgriezeniskās saites grupa vienlaikus līdzsvaro sevi.

3.2.3. Aktivitāte (III), Ribosomu inaktivējošā proteīna (RIP) aktivitāte

Atdalot adenīnu no rRNS, Stxs inhibē de novo proteīnu sintēzi. Attīrīta rRNS ietekmē ribosomu morfoloģijas izmaiņas, kas aktivizē signāla transdukciju [11], kas pazīstama kā ribotoksiskā stresa reakcija (RSR), izraisot raksturīgu gēnu aktivāciju (skatīt nākamo punktu).

3.2.4. Aktivitāte (IV), Ribotoksiskā stresa reakcija (RSR) aktivitāte

ZAK (MAPKKK) ir zināmā kināze RSR un aktivizē JUN N termināla kināzes (JNK) un p38 MAPK ceļus [12,15]. Stx1 inducē JUN un FOS mRNS ekspresiju cilvēka zarnu epitēlija šūnās, un šim notikumam bija nepieciešams RIP aktivitātes pozitīvs Stx1, kas, domājams, atrodas RSR kontrolē [15]. Ir zināms, ka cita RSR pakārtotā molekula, p38 MAPK, inducē agrīnas reakcijas gēnus, piemēram, JUN, FOS, EGR1, MAFF, DDIT3 un ATF3 [54], kas visi mūsu datu kopā tika izteikti atšķirīgi. Ir zināms, ka JNK un p38 MAPK ceļi tiek aktivizēti arī Ire-1 pakārtotajos notikumos saskaņā ar UPR (4.B,D un 5B,E,F attēls) [47]. Sakarā ar to Stxs var aktivizēt šos divus ceļus, izmantojot RSR un/vai UPR. Ir pierādīts, ka ārpusšūnu signālu regulētās kināzes (ERK) 1/2 ceļš atrodas lejpus RSR [55], un ir zināms, ka DUSP1 (MKP1) gēnu inducē ERK1/2 ceļš [56]. Stx1 un anizomicīns (vēl viens proteīnu sintēzes inhibitors) spēj izraisīt DUSP1 ekspresiju Caco-2 šūnās [57]. Mūsu datu kopā tika ierosināta DUSP1 ekspresija, un tas var norādīt uz ERK1 / 2 aktivāciju (4.B, D attēls).

3.2.5. Aktivitāte (V), īpaša gēnu transkripcija, kas noved pie citokīna

Secretion IL-8 secretion in Stxs-treated cells, human intestinal cells in particular, has been reported extensively as a downstream factor of RSR [12,58]. Cytokines and chemokines in animal models revealed CXCL1 and CXCL10 expression within Stx2-treated mouse kidneys [37,59]. IL-8 (CXCL8) and CXCL1 are both neutrophil chemoattractants that utilize CXCR2 as their receptor. IL-8 is expressed in humans but not in mice. In our dataset, human RPTEC showed an increase in IL-8 expression by log2 equals 4.6-fold maximum (log2 values were 4.6, 3.52 and 4.48 at 6, 13, and 19 h after Stx2, respectively). As we extracted common DEGs from mouse kidney and human proximal tubular cells IL-8 was not included in the final dataset. Instead, the molecule with similar function as IL-8, CXCL1 showed a significant increase as a common DEG (Figure 5L). A downstream pathway of UPR is the NF-κB signaling pathway. NFKBIA (IκBα) is an inhibitory factor of the classical (canonical) NF-κB pathway that binds with NF-κB subunits RelA (p65) and p50. Upon phosphorylation by an upstream kinase, NF-kappa B kinase (IKK), NFKBIA (IκBα) is degraded, thus NF-κB can translocate to the nucleus and induce transcription of inflammatory factors. RelB proto-oncogene nuclear factor-kappa B subunit (RelB) is involved in the alternative (non-canonical) NF-κB pathway and induces inflammatory factor expression. RelB-p50 or -p52 dimers act as a transcription factor (NF-κB) when phosphorylation of p100 of RelB-p50-p100 or RelB-p100 complexes is done by IKKα homodimers and this step does not involve IκBα. In our dataset, both NFKBIA and RelB were differentially expressed reaching to log2-fold change >1 attiecīgi pēc 24 un 48 stundām (5.F attēls). Tas liek domāt, ka tiek inducēti cepuru gēni abos NF-κB ceļos, IκB (klasiskā) un RelB (alternatīvā). Tā kā CHOP (DDIT3) diferenciālā ekspresija pēc 24 stundām pārsniedz log2, kas ir lielāka par 1, peles nierēs tiek veikta UPR, tādējādi aktivētā PERK fosforilē eikariotu translācijas iniciācijas faktora 2. apakšvienību alfa (eIF2), lai kavētu NFKBIA translāciju [60]. Šī iemesla dēļ NFKBIA mRNS palielināšanās var nenomāc lielu daļu NF-κB ceļa, tāpēc ir atļauta iekaisuma faktoru transkripcija (5L attēls).

Sobbe et al. [61] parādīja, ka gan klasiskais (RelA-p50), gan alternatīvais (RelB-p52) NF-κB ceļi bija aktīvi ar Stx injicētām pelēm, atklājot RelA mērķa citokīnu CCL20, CXCL1 un CXCL10 regulēšanu, kas arī tika atšķirīgi izteikti mūsu organismā. datu kopa (5L attēls).

3.2.6. Aktivitāte (VI), Stxs izraisīta apoptoze

Šķeltā kaspāze 3 ir konstatēta ar Stxs saistītās šūnu nāves gadījumā [13, 15, 62]. Ir pierādīts, ka kaspāzes -3 aktivācija vai apoptozes indukcija ar Stxs notiek RSR un UPR kontekstā. Stxs izraisītā RSR ir iesaistīti gan p38 MAPK, gan JNK ceļi [15], kā arī tiek ziņots par ERK aktivāciju [55]. No otras puses, ir zināms, ka UPR inducē NF-κB, JNK un p38 MAPK ceļus. Ir pierādīts, ka CHOP (DDIT3) saskaņā ar UPR ir iesaistīts apoptozē [63], un tas ir pierādīts arī ar Stxs saistītā apoptozē [13]. Ir ziņots arī par JNK iesaistīšanos UPR izraisītā apoptozē [64]. Mūsu datu kopā vairāki DEG, piemēram, CHOP (DDIT3), NFKBIA, FOS, JUN un JUNB, ir iesaistīti RSR un UPR (attēls 5B, F).

3.3. Diennakts disregulācija ar Stx2

Seruma endotelīna-1 (ET-1, EDN1) palielināšanās notiek STEC-HUS pacientiem [65]. Arī eksperimentāli Stx2 inducē EDN1 ekspresiju, aktivizējot signālu transdukcijas kaskādes, iesaistot MAPK [66], savukārt UPR ir zināms, ka tas inducē EDN1 transkripciju [67]. Mūsu datu kopā Stx2 terapijas izraisītā EDN1 ekspresija gan peles nierēs, gan cilvēka proksimālajās cauruļveida šūnās (5G attēls). Tā kā EDN1 gēna ekspresija bija peles nieru un cilvēka proksimālo tubulāro epitēlija šūnu kopsaucējs, tas parāda, ka EDN1 ekspresija vismaz daļēji notiek proksimālajās cauruļveida epitēlija šūnās in vivo papildus endotēlija šūnām. Turklāt izdalītais ET-1 inducē EGR1 ekspresiju, aktivizējot MAPK [68]. Mūsu dati apstiprina EGR1 regulēšanu laikā, kad EDN1 tiek regulēts (5H attēls). EGR1 inducē diennakts ritma atslēgas faktora PER1 ekspresiju [69], tādējādi pielāgojot citu diennakts faktoru amplitūdu (5H attēls).

Diennakts regulējumā CLOCK-BAML1 (ARNTL) heterodimērs pārregulē PER1 un CRY1. Savukārt PER1-CRY1 heterodimērs saistās ar CLOCK-BAML1 (ARNTL), lai nomāktu tālāku savu transkripciju, tādējādi veidojot negatīvu diennakts ritma cilpu. Tādējādi pozitīvo regulatoru gēnu (CLOCK un BAML1 (ARNTL)) un negatīvo regulatoru gēnu (PER1 un CRY1) ekspresijas maksimumi notiek alternatīvā stundā, kad CLOCK un BAML1 (ARNTL) ekspresija palielinās, PER1 un CRY1 samazinās, un modelis pārslēdzas nākamajās stundās. Kad diagrammai pievienojām CLOCK un BAML1 (ARNTL) log2-reizes izmaiņu vērtības (5.J attēls), iepriekšējos laika punktos PER1 un BAML1 (ARNTL) parādīja pretēju ritmisku modeli ar asām/šaurām virsotnēm, tomēr pēc 24 h maksimumi sāka kļūt blāvi un nepārtraukti pieaugt bez ritma. Tas nozīmē, ka Stx2 ietekmēja nieru diennakts ritmu, tostarp proksimālajos kanāliņos. Lai gan ir nepieciešams turpmāks apstiprinošs eksperiments, mūsu dati kopā ar publicēto literatūru, kurā aprakstīta PER1 ietekme uz nieru diennakts regulēšanu uz stimuliem [70, 71], liecina par iespējamu Stx2 iesaistīšanos diennakts ritma traucējumos un ietekmi uz proksimālajām kanāliņu funkcijām, samazinot nieru pulksteņa gēnus. regulēti faktori, piemēram, SGLT1 (SLC5A1) (5K attēls). Patiešām, mēs novērojām glikozūriju Stx2-injicētām pelēm, kuras vairojas citā pētījumā ar Stx1-injicētām pelēm [21], kas liecina par SGLT1 (SLC5A1) disfunkciju proksimālajās kanāliņos (3. tabula). Cik mums ir zināms, šis ir pirmais ziņojums, kas norāda uz Stx2 iesaistīšanos nieru diennakts ritma traucējumos.

4. Secinājumi

Mēs noteicām svarīgus gēnus, kas attiecas uz proksimālajām kanāliņām saistītām izpausmēm, kuras mainīja Stx2. Tiek pieņemts, ka šo gēnu diferenciālā ekspresija ir Stx2 aktivitāšu rezultāts, piemēram, UPR indukcija, ar rRNS depurināciju saistīta RSR un signāla transdukcija, ko izraisa plazmas membrānas receptoru Gb3 saistīšanās. Visaugstāk izteiktais gēns GDF15 var ietekmēt svara zudumu, ko izraisa Stx2, izmantojot smadzeņu stumbra ierobežotos receptorus, samazinot pārtikas uzņemšanu. Ekstracelulāro matricu un šūnu adhēziju var ietekmēt PDK4, NHERF1 (SLC9A3R1), CYR61 un CTGF, kas izraisa Stx{15}}specifisku histopatoloģiju un sliekšanos. Turklāt Stx2 izraisīti nieru diennakts ritma traucējumi var izraisīt proksimālus kanāliņu funkcionālus defektus, piemēram, glikozes reabsorbciju.

5. Materiāli un metodes

5.1. Dzīvnieki Peles

(C57BL/6, tēviņš, 19–22 g, bez specifiskiem patogēniem) tika iegādāti no Charles River Laboratories Japan, Inc. (Jokohama, Japāna). Ēdiens un ūdens tika doti ad libitum. Peles tika uzturētas ar standarta 12 h: 12 h gaismas-tumsas ciklu, kurā gaisma ir ieslēgta pulksten 7:00 un izslēgta pulksten 19:00. Dzīvnieku istabas temperatūra tika uzturēta aptuveni 24 ◦C. Visas procedūras apstiprināja Universitātes Dzīvnieku aprūpes komiteja.

5.2. Cilvēka nieres audi

Šajā pētījumā tika izmantoti līķu audi bez personas identifikatoriem, un tas tiek uzskatīts par izņēmumu saskaņā ar Universitātes cilvēka izmeklēšanas vadlīnijām.

5.3. Šūnu kultūra

Cilvēka nieru proksimālo tubulāro epitēlija šūnu (RPTEC) primārā kultūra tika iegādāta no Clonetics (Walkersville, MD, ASV) un tika uzturēta 37 ◦C, 5% CO2 atmosfērā. Šūnas tika kultivētas nieru epitēlija šūnu augšanas vidē, kas papildināta ar cilvēka epidermas augšanas faktoru, hidrokortizonu, epinefrīnu, insulīnu, trijodtironīnu, transferīnu, GA-1000 un FBS.

5.4. LPS nesaturoša Stx2 attīrīšana LPS noņemšana no Stx2 tika veikta, kā aprakstīts iepriekš [72]. Īsumā, anti-Stx2 11E10 antivielu konjugētā kolonna tika izmantota, lai iegūtu Stx2 frakciju, un frakcija pēc tam tika izlaista caur Detoxi-gel (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ASV). lai noņemtu LPS. Stx2 frakcija tika filtrēta ar 0,2 µm filtru, un LPS līmenis tika pārbaudīts ar Limulus amebocyte lizāta testu (Pyrotell, Associates of Cape Cod Incorporated, East Falmouth, MA, ASV). Tika noteikts, ka Stx2 frakcija satur mazāk nekā 0,03 endotoksīna vienības (EU)/ml. Stx2 varianta veids bija Stx2a.

5.5. Stx2 ievadīšana pelēm 2LD50 deva (5 ng Stx2/20 g ķermeņa svara), kas nogalina peles četru dienu laikā (S3A attēls), tika injicēta pelēm intraperitoneāli 0,1 ml tilpumā LPS nesaturošā fizioloģiskā šķīdumā. (Otsuka farmācija, Japāna). Toksīna injekcija tika veikta no pulksten 7 līdz 9, kurā ilgākā laika posmā peles saņēma Stx2 pulksten 7:00 un pēc tam pulksten 7:00 sekoja 24, 48 un 72 stundu paraugu ņemšana.

5.6. Urīna savākšana un urīna glikozes mērīšana Pēc 2, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 60 un 84 h Stx2 injekcijas tika paņemts urīns un 10 µL tika pilināti uz Fuji sausās ķīmijas priekšmetstikliņa GLU- P III (FUJIFILM, Kanagawa, Japāna) un glikozes līmenis urīnā tika mērīts ar Fuji Dry Chem 7000 V (FUJIFILM) pārvaldītajā iekārtā. Urīns no injekcijas pirms Stx2 tika izmantots kā 0 stundu paraugs. Urīna savākšana tika veikta ar divām pelēm

5.7. Audu apstrāde Pēc 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48 un 72 h Stx2 injekcijas trīs peles vienā laika punktā tika eitanāzijas ar CO2 un tika savāktas nieres. Puse no vienas nieres tika fiksēta ar 4% paraformaldehīda/fosfāta buferšķīdumu 7 dienas 4 ◦C temperatūrā un apstrādāta parafīna sekcijai. Vēl viena puse nieres tika izmantota, lai iegūtu RNS mikroarray analīzei. Trīs peles bez jebkādas ārstēšanas tika izmantotas kā parastā (naiva vai 0 h) kontrole. Trīs peles tika injicētas ar PBS (nesējs) un nonāvētas 72 stundās un kalpoja kā nesēja kontrole, lai parādītu, ka gēnu ekspresijās ir nenozīmīgas izmaiņas salīdzinājumā ar parasto kontroli.

5.8. Periodiskās skābes-Šifa (PAS) traipu parafīna sekcijas tika hidratētas un iekrāsotas ar 0,5% periodiskās skābes šķīdumu, kam sekoja skalošana ar destilētu ūdeni. Sekcijas tika pārnestas uz Šifa reaģentu. Pēc tam, kad sekcijas tika rūpīgi mazgātas ar 0,6% nātrija bisulfīta šķīdumu, tās tika iekrāsotas ar hematoksilīnu.

5.9. Stx2 apstrāde cilvēka RPTEC RPTEC šūnas tika apstrādātas ar 10 ng/ml Stx2 6, 13 un 19 stundas 37 ◦C temperatūrā, 5% CO2. Kā kontrole tika izmantota RPTEC bez Stx2 apstrādes. Vienā laika punktā tika veiktas divas bioloģiskās kopijas. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas tika izmantotas RNS ekstrakcijai.

5.10. Brīvi peldoša imunofluorescences krāsošana Brīvi peldošas sekciju apstrādei parastā pele tika perfūzēta-fiksēta, kā aprakstīts Obata et al. [69]. Pēc tam peļu nieres tika sadalītas un iegremdētas 4% PFA/PBS 3 stundas 4 ◦C temperatūrā, viegli maisot. Audi tika mazgāti ar PBS un krioaizsargāti ar 30% saharozes/PBS 4 ◦ C temperatūrā nakti vai līdz nogrimšanai apakšā. Biezas saldētas sekcijas (50 µm) tika sagrieztas ar bīdāmu mikrotomu ar sasaldētiem iestatījumiem. Sekcijas tika bloķētas ar 1:50 kazas anti-žurku IgM antivielu PBS (F104UN, American Qualex International, Inc., Sanklemente, CA, ASV) 1 stundu un inkubētas ar anti-Gb3/CD77 antivielu 1:100 bloķēšanā. šķīdums vai izotipa kontrole (žurkas IgM) saskaņotā koncentrācijā kā primārā antiviela uz nakti 4 ◦C temperatūrā. Pēc mazgāšanas sekcijas inkubēja ar sekundāro antivielu (anti-žurka IgM Alexa Fluor 488, 1:2000 atšķaidījums PBS) 2 stundas 4 ◦C temperatūrā. Sekcijas tika iekrāsotas citām zondēm AQP1 (1:1000 atšķaidījums, Sigma-Aldrich Japāna, Tokija, Japāna) un CD31 (550274, 1:50 atšķaidījums, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, ASV) ar sekundārām antivielām pret trušu IgG Alexa Alexa. Attiecīgi Fluor 546 (1:2000 atšķaidījums PBS) un anti-peļu IgG Alexa Fluor 647 (1:2000 atšķaidījums PBS). Pēc mazgāšanas ar PBS, 40 µl,6-diamidino-2-fenilindola (DAPI, D21490, Thermo Fisher) krāsošana tika veikta 15 min 4 ◦C temperatūrā. Sekcijas tika iegremdētas šķidrumos 96-iedobes plāksnes (U veida) iedobē ar nelielu sārtumu katru reizi, kad tika mainīts šķīdums. Mazgāšanas posms tika veikts lielākās iedobēs, piemēram, 12- vai 6-iedobju plāksnēs. Pārklājumam tika izmantots ūdens saturošs montāžas materiāls. Cilvēka audu sagatavošanai pēcnāves nieres tika fiksētas 20% formalīnā 2 nedēļas un apstrādātas brīvi peldošai sagatavošanai, kā tas tika darīts peles audiem, izņemot antivielu pret cilvēka CD31 (CBL468, 1:20 atšķaidījums, Merck KGaA, Darmštate , Vācija) tika izmantots.

5.11. Mikromasīvu analīze

Puse nieres ir iegremdēta 2 ml RNALater (Ambion, Austin, TX, ASV) 4 ◦ C temperatūrā, un kopējā RNS tika ekstrahēta ar Rneasy Midi komplektu (Qiagen, Santa Clarita, CA, ASV). Tika izmantoti Mouse Genome 430A 2.0 masīvi (Affymetrix, Santa Clara, CA, ASV). CEL faili tika iegūti un normalizēti, izmantojot stabilu vairāku mikroshēmu vidējo noteikšanu (RMA), RNS kopiju skaita aprēķinu un locījuma izmaiņas pret 0 h tika veiktas R (v.3.6.0) ar tā pakotni. affy [73] un RankProd 2.0 [74]. Dati tiek rādīti log2-reizes izmaiņu vērtībās. Datu kopa tiek deponēta Gene Expression Omnibus (GEO) (piekļuves numurs GSE172465). No RPTEC šūnām kopējā RNS tika ekstrahēta ar RNAgents Total RNA Isolation System (Promega, Tokija, Japāna). Mikroarray eksperimentiem tika izmantots visa cilvēka genoma oligonukleotīdu mikromasīvs (44K oligonukleotīdu DNS mikromasīvs, Agilent Technologies, Tokija, Japāna). Kopējie RNS paraugi tika izmantoti Cy5- un Cy3- iezīmēto cDNS zondu sagatavošanai. Ar fluoroforu iezīmētie paraugi tika hibridizēti uz katra stikla priekšmetstikliņa un mazgāti, pēc tam skenēti ar DNS mikromasīva skeneri (modelis G2505A; Agilent Technologies). Iezīmju ekstrakcijas un attēlu analīzes programmatūra (Agilent Technologies) tika izmantota, lai atrastu un norobežotu katru masīva vietu un integrētu intensitātes, kuras pēc tam tika filtrētas un normalizētas, izmantojot lokāli svērto izkliedes diagrammas izlīdzināšanas metodi. Mikroarray analīzes reproducējamība tika novērtēta ar diviem krāsu maiņas atkārtojumiem katrā eksperimentā. Tika salīdzinātas mRNS ekspresijas atšķirības starp kontroles un Stx2-apstrādāto RPTEC, kas iegūtas pēc 6, 10 vai 19 stundām. TXT formāta dati no programmatūras GeneSpring tika izmantoti, lai noteiktu gēnu nosaukumus no zondes ID un pārveidotu locījuma izmaiņas par log2-locījuma izmaiņām. Datu kopa tiek deponēta GEO (piekļuves numurs GSE172466).

5.12. Mikromasīvu datu bioinformātiskā analīze un vizualizācija Gan peles nieru, gan RPTEC mikromasīvu datos gēni, kas ir kopīgi abiem un kuros ekspresijas izmaiņas bija vairāk nekā 2-kārtīgas samazināšanās vai palielināšanās (vai log2-kārtīgas izmaiņas ir vai nu mazāks par –1, vai lielāks par 1) jebkurā laika punktā izvēlējās R. Turklāt peles nieru mikromasīva datos. Gēnu izmaiņas, kas atbilst kubiskām līknēm, tika izvēlētas, izmantojot R pakotni maSigPro [https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/maSigPro.html (pēdējo reizi piekļūts 2022. gada 4. janvārī)] [75]. Kubiskā līkne ir piemērota, lai pielāgotu šo gēnu pieaugumu vai samazināšanos laika gaitā. Augstāka polinoma pakāpe, piemēram, kubiskā līkne, ļauj atlasīt gēnus ar vairākām izmaiņām laika gaitā labāk nekā kvadrātiskā līkne. Gēni, kas darbojās pēc līdzīgas trajektorijas, tika sagrupēti, un to samazināšanās/palielināšanās modeļi tika vizualizēti ar siltuma karti, izmantojot R pakotnes gplots [https://CRAN.R-project.org/package=gplots (pēdējo reizi piekļūts 4. janvārī 2022)] [76]. Gēnu ontoloģija (GO) tika piešķirta, un GO funkcijas starp parastajiem gēniem tika bagātinātas, izmantojot Metascape [http://metascape.org (pēdējo reizi piekļūts 2022. gada 4. janvārī)] [77]. Kopējo gēnu savienojums/attiecības tika analizētas, izmantojot STRING [https://string-db.org/ (pēdējo reizi piekļūts 2022. gada 4. janvārī)] [78]. Saistība starp parastajiem gēniem tika meklēta manuāli, kā arī izmantojot STRING teksta ieguves funkciju.

Atsauces

1. Džanantonio, C.; Vitako, M.; Mendilaharzu, F.; Rūtijs, A.; Mendilaharzu, J. Hemolītiski-urēmiskais sindroms.J. Pediatr.1964, 64, 478–491. [CrossRef] 

2. Vitskis, BH; Suzuki, Y.; Štrauss, L.; Churg, J. Hemolītiski-urēmiskais sindroms: nieru patoloģisku izmaiņu pētījums.Am. J. Pathols.1969, 57, 627–647. 

3. Takeda, T.; Dohi, S.; Igaraši, T.; Jamanaka, T.; Jošija, K.; Kobayashi, N. Tubulārās funkcijas verotoksīna radītais traucējums veicina nieru bojājumus, kas novēroti hemolītiski urēmiskā sindroma gadījumā.J. Inficēt.1993, 27, 339–341. [CrossRef] 

4. Katagiri, YU; Mori, T.; Nakadžima, H.; Katagiri, C.; Taguči, T.; Takeda, T.; Kijokava, N.; Fujimoto, J. Src ģimenes kināzes aktivizēšana jā, ko izraisa Shiga toksīna saistīšanās ar globotriaozilkeramīdu (Gb3/CD77) zema blīvuma, mazgāšanas līdzekļos nešķīstošos mikrodomēnus.J. Biol. Chem.1999, 274, 35278–35282. [CrossRef] 

5. Takenouchi, H.; Kijokava, N.; Taguči, T.; Matsui, J.; Katagiri, YU; Okita, H.; Okuda, K.; Fujimoto, J. Shiga toksīna saistīšanās ar globotriaozilkeramīdu inducē intracelulārus signālus, kas mediē citoskeleta remodelāciju cilvēka nieru karcinomas atvasinātās šūnās.J. Cell Sci.2004, 117, 3911–3922. [CrossRef] [PubMed] 

6. Garred, O.; van Deurs, B.; Sandvig, K. Furīna izraisīta Shiga toksīna šķelšanās un aktivācija.J. Biol. Chem.1995, 270, 10817–10821. [CrossRef] 

7. Majouls, I.; Ferrari, D.; Söling, HD Olbaltumvielu disulfīda saišu samazināšana oksidējošā vidē. Holēras toksīna A-apakšvienības disulfīda tilts ir samazināts endoplazmatiskajā retikulumā.FEBS Lett.1997, 401, 104–108. [CrossRef] 

8. Spooner, RA; Vatsons, PD; Marsden, CJ; Smits, DC; Mūrs, KAH; Pavārs, JP; Kungs, JM; Roberts, LM Olbaltumvielu disulfīda izomerāze samazina ricīnu līdz tā A un B ķēdēm endoplazmatiskajā retikulumā.Biochem. Dž.2004, 383, 285–293. [CrossRef] 

9. Jū, M.; Haslam, DB Shiga toksīns tiek transportēts no endoplazmatiskā retikuluma pēc mijiedarbības ar luminālo pavadoni HEDJ/ERdj3.Inficējiet. Immun.2005, 73, 2524–2532. [CrossRef] 

10. Falguieres, T.; Johannes, L. Shiga toksīna B-apakšvienība saistās ar šaperonu BiP un nukleolāro proteīnu B23.Biol. Šūna2006, 98, 125–134. [CrossRef]