Metabolisma izmaiņas urīnā, kas pavada albumīnūrijas remisiju pēc kuņģa šuntēšanas operācijas 2. tipa cukura diabēta nieru slimības gadījumā Ⅱ

3. Diskusija

Šajā MOMS RCT [20] apakšpētījumā mēs pētījām urīna 1H-NMR metabolomiskās izmaiņas pēc ārstēšanas tikai ar medikamentiem vai ar RYGB plus medikamentiem.pacientiem ar aptaukošanos, 2. tipa cukura diabēts, unmikroalbuminūrija(8. attēls).

8. attēls. Pārskats par urīna metabolisma izmaiņām, kas notiek 6 mēnešus pēc CSM. Metabolīti, kas palielinājās no sākotnējā līmeņa līdz 6. mēnesim, ir iezīmēti sarkanā krāsā, bet tie, kas samazinājās, ir iezīmēti zilā krāsā. Izveidots ar BioRender.com. 1H-KMR, protonu kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopija; ACR,albumīna un kreatinīna attiecība; ĶMI, ķermeņa masas indekss; HbA1c, glikozēts hemoglobīns.

Salīdzinot ar MTA, ārstēšana ar CSM izraisīja atšķirīgu urīna metabolomisko profilu. CSM izraisītās urīna metabolomiskās izmaiņas ietvēra pastiprinātu saimniekorganisma un mikrobu kometabolītu N-fenilacetilglicīna, trimetilamīna N-oksīda un 4-aminobutirāta (GABA) [28–33] izdalīšanos, kā arī pastiprinātu aminoskābes arginīns un glutamīns. CSM samazināja arī aromātisko aminoskābju (fenilalanīna un tirozīna), kā arī BCAA (valīna un leicīna) un saistīto katabolisko starpproduktu (3-hidroksiizobutirāta, 3-hidroksiizovalerāta un 3-metil{) koncentrāciju urīnā. {9}}oksovalerāts). Lai gan aromātisko aminoskābju un BCAA samazināšanās var būt saistīta ar svara zudumu un uzlabotu jutību pret insulīnu pēc CSM [34–40], aromātisko aminoskābju koncentrācijas samazināšanās urīnā var būt arī tieši saistīta ar to samazinātu uzsūkšanos zarnās pēc RYGB, kā rezultātā uzlabojas. zarnu baktēriju metabolisms [30].

Wecistanche atbalsta dienests - lielākā cistanche eksportētāja Ķīnā:

E-pasts:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/Tel.:+86 15292862950

Iegādājieties sīkāku informāciju par specifikācijām:

Skatīt šeit: https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKŠĶINIET ŠEIT, LAI IEGŪTU DABĪGU ORGANISKO CISTANŠES EKSTRAKTU AR 25% EHINAKOZĪDU UN 9% AKTEOZĪDU NIERU FUNKCIJAI

Visredzamākās metabolomiskās izmaiņas, kas novērotas šajā pētījumā, bija saimniekorganisma un mikrobu kometabolītu, tostarp N-fenilacetilglicīna, trimetilamīna N-oksīda, 4-aminobutirāta (GABA) un arginīns. Svarīgi, ka izmaiņas urīna saimniekorganisma un mikrobu kometabolītos pēc CSM bija mērenas vai cieši saistītas ar asinsspiediena, triglicerīdu un uACR uzlabošanos līdz 2 gadiem pēc ārstēšanas uzsākšanas. Iepriekš tika ziņots par palielinātu saimniekorganisma un mikrobu kometabolītu izdalīšanos urīnā pēc RYGB, un tas ir saistīts ar sastāva un funkcionālām izmaiņām zarnu mikrobiotā, kas var izraisīt no svara zuduma neatkarīgus vielmaiņas uzlabojumus pēc procedūras [28–33, 41, 42 ]. Seifrīds u.c. parādīja palielinātu saimnieka un mikrobu kometabolītu fenilacetilglicīna, indoksilsulfāta un 4-krezilglikuronīda izdalīšanos ar urīnu 2 un 4 nedēļas pēc RYGB aptaukošanās Cucker žurku modelī [32]. Šīs izmaiņas netika novērotas tikai pēc kaloriju ierobežojuma dzīvnieku modelī. Mēs arī iepriekš esam novērojuši palielinātu N-fenilacetilglicīna un 3-indoksilsulfāta izdalīšanos ar urīnu 4 nedēļas pēc gan RYGB, gan RYGB kombinācijā ar fenofibrātu, metformīnu, ramiprilu un rosuvastatīnu Zucker Diabetic Sprague Dawley žurku modelī [33]. . Palielināta N-fenilacetilglicīna izdalīšanās ar urīnu norāda uz samazinātu aromātiskās aminoskābes fenilalanīna uzsūkšanos un attiecīgi pastiprinātu zarnu baktēriju metabolismu pēc RYGB [32]. Atbilstoši tam CSM grupā fenilalanīna izdalīšanās ar urīnu samazinājās no sākotnējā līmeņa līdz 6. mēnesim.

Samazināta zarnu kustīgums pēc RYGB veicina olbaltumvielu pūšanu, nepilnīgi sagremotiem proteīniem sasniedzot resnās zarnas ķirurģiskas priekšējās zarnas apiešanas dēļ [29]. Ir ziņots par palielinātu GABA izdalīšanos ar fekālijām pēc RYGB grauzēju modeļos, un tas ir saistīts ar olbaltumvielu pūšanu un putrescīna mikrobu apstrādi, kas iegūts no ornitīna [29, 32, 43]. Palielināts GABA izkārnījumos ir saistīts ar labi raksturīgo glikagonam līdzīgā peptīda -1 (GLP-1) pieaugumu, kas novērots pēc RYGB, jo GABA var stimulēt GLP-1 izdalīšanos no enterocītiem, izmantojot jonotropo GABAA un GABAC receptori [44,45]. GLP-1-inducēta natriurēze ir saistīta ar RYGB antihipertensīvo un renoprotektīvo iedarbību [16,46]. GABA var ne tikai stimulēt GLP-1 sekrēciju, bet var arī radīt tiešu nātrijurētisko efektu un pazemināt asinsspiedienu, izmantojot vietēju nieru GABAerģisko sistēmu [47]. Tādējādi iespējamā tiešā un netiešā renoprotektīvā iedarbība, ko izraisa palielināta GABA izdalīšanās urīnā, kas novērota pēc CSM šajā pētījumā, ir pelnījusi turpmāku nopratināšanu.

Arginīna un glutamīna (arginīna prekursors [48]) izdalīšanās ar urīnu arī palielinājās pēc CSM, un abu aminoskābju koncentrācija urīnā bija mēreni cieši savstarpēji saistīta (r=0.6). Tika pierādīts, ka Wistar žurku modelī ar augstu tauku saturu uzturā RYGB maina mikrobu arginīna biosintēzi, kā rezultātā samazinās resnās zarnas arginīna koncentrācija un augstāka resnās zarnas aspartāta koncentrācija [42]. Šādas izmaiņas netika novērotas pēc līdzvērtīga svara zaudēšanas ar uztura līdzekļiem. Arginīna un glutamīna izmaiņas var arī norādīt uz pastiprinātu aminoskābju uzsūkšanos pēc RYGB. RYGB paātrina olbaltumvielu gremošanu un rada ātrāku un pārejošu cirkulējošo aminoskābju palielināšanos pēc ēšanas [49]. Aptaukojušos Cucker žurku modelī tika pierādīts, ka RYGB selektīvi palielina glutamīna uzsūkšanos biliopankreatiskajās un Roux ekstremitātēs, izmantojot B0AT1 glutamīna transportera transkripcijas augšupregulāciju [50]. Šādas izmaiņas aminoskābju transportēšanā var būt saistītas ar procedūras ieguvumiem vielmaiņas procesā, jo gan arginīns, gan glutamīns var stimulēt insulīna sekrēciju no aizkuņģa dziedzera šūnām, kā arī GLP{10}} no zarnu L-šūnām [51– 53].

Samazināta BCAA valīna un leicīna, kā arī BCAA katabolisko starpproduktu 3-hidroksibutirāts (valīna katabolīts), 3-hidroksiizovalerāts (leicīna katabolīts) un 3-metil-2- izdalīšanās ar urīnu. pēc CSM tika novērots oksovalerāts (izoleicīna katabolīts). 3-hidroksiizobutirāta, 3-metil-2-oksovalerāta un valīna izdalīšanās samazināšanās urīnā bija mērena vai cieši saistīta ar asinsspiediena uzlabošanos 6. un 24. mēnesī CSM grupā. Ņemot vērā konstatētās saiknes starp pieaugošo BCAA līmeni, insulīna rezistenci un hipertensiju [34–40], tas liecina, ka fizioloģiskām sekām, kas saistītas ar uzlabotu BCAA katabolismu skeleta muskuļos un taukaudos, var būt nozīme RYGB antihipertensīvajos un vielmaiņas ieguvumos [54]. ]. Patiešām, ir ziņots par cirkulējošo BCAA samazināšanos pēc RYGB un vertikālās piedurknes gastrektomijas [55, 56], lai gan cirkulējošo BCAA samazināšanās var nebūt nepieciešama, lai sasniegtu aptaukošanās operācijas labvēlīgo metabolisko ietekmi [57].

BCAA katabolismam var būt renoprotektīva iedarbība, piegādājot trikarbonskābes cikla starpproduktus, ja ir traucēta taukskābju oksidēšanās (FAO). Taukskābes ir galvenais enerģijas avotsproksimālais nieru kanāliņos, ļoti energoprasīgs reģions, kas ir jutīgs pret traumām, ja FAO ir traucēta [58]. Patiešām, proksimālās cauruļveida FAO traucējumi ir saistīti ar DKD patoģenēzi [58]. Krüpelam līdzīgā faktora 6 (KLF6), transkripcijas faktora, kas tiek inducēts proksimālajā kanāliņā agrīnā stadijā, proksimālā kanāliņu specifiskā nojaukšana.akūts nieru bojājumsun kas nomāc BCAA katabolismu, aizsargā peles pretakūts nieru bojājumsun fibroze [59]. Peles aizsargātas noakūts nieru bojājumstika pierādīts, ka tiem ir saglabājusies gēnu ekspresija, kas kodē BCAA kataboliskos enzīmus [59]. Tādējādi pastiprināts BCAA katabolisms var būt saistīts ar lielāku albuminūrijas samazināšanos, kas novērota pēc CSM 2-gadu novērošanas laikā.

Mūsu pētījums ir jāinterpretē noteiktu ierobežojumu kontekstā. Pētījuma apjoms bija neliels, kopā 97 paraugi tika pakļauti 1H-NMR divās pētījuma grupās (MTA un CSM) un divos laika punktos (sākotnējais stāvoklis un 6. mēnesis). Tomēr fakts, ka šis apakšpētījums tika iekļauts vienā no pirmajiem RCT, lai novērtētu RYGB ietekmi uzprimārais nieru mērķa kritērijsir izteikta pētījuma plāna stiprā puse [19,20]. Šajā apakšpētījumā iekļauto pacientu etniskās piederības ziņā starp abām pētījuma grupām bija atšķirības, un lielākai daļai pacientu CSM grupā bija kaukāziešu etniskā piederība. Līdzīgi atklājumi tika novēroti galvenajā pētījuma grupā [20]. Tomēr PLS modelis, kurā tika salīdzināta urīna 1H-KMR maksimālā intensitāte starp baltās rases (n=18) un citu etnisko piederību (n=10) indivīdiem sākotnējā līmenī MTA grupā, nesniedza pierādījumus par sistemātiskām urīna atšķirībām. metabolomiskie profili, kas saistīti ar etnisko piederību šajā pētījumā (S2 attēls). Metabolisma analīzes tika veiktas agri no rīta, nevis urīna savākšanas laikā. Ne visi šajā pētījumā analizētie paraugi bija pāru paraugi no vieniem un tiem pašiem indivīdiem gan sākotnējā līmenī, gan 6. mēnesī. Tomēr mēs veicām jutīguma analīzes, kas aprobežojās ar pāru paraugu apakškopu (gandrīz puse no visiem paraugiem), un konstatējām līdzīgus rezultātus.

PLS, atšķirībā no ortogonālajiem daļējiem mazākajiem kvadrātiem (OPLS), šajā pētījumā tika ieviesti klasifikācijas modeļi. Lai gan OPLS modeļi piedāvā priekšrocības, novēršot sistemātisku datu kopas dispersiju, kas nav saistīta ar izlases klasi [60], PLS modeļi, kas veikti ar R pakotni MUVR, gūst labumu no ligzdotas atkārtotas dubultās savstarpējās validācijas procedūras, kas samazina modeļa pārmērīgas pielāgošanas risku. [61]. Pretēji tradicionālajiem PLS algoritmiem, kas nodrošina aprēķinus no piemērotības prognozēšanas modeļiem un savstarpējās validācijas rezultātiem kā salīdzināšanas punktu, MUVR algoritms nodrošina tikai savstarpējās validācijas aprēķinus, lai samazinātu modeļa pārmērīgas pielāgošanas un kļūdaini pozitīvu atklājumu iespējamību [61]. . Tas ir svarīgs apsvērums tādā pētījumā kā šis ar salīdzinoši nelielu izlases lielumu [61,62]. Diemžēl pagaidām nav iespējams realizēt OPLS klasifikācijas modeļus, izmantojot R pakotni MUVR [61]. Tādējādi, neskatoties uz to, ka nav novērtējuma par prognozes mainīgo, kas ir ortogonāli pret atbildi, mēs uzskatām, ka šajā pētījumā ir vēlams uzrādīt rezultātus no PLS modeļiem, kas ieviesti, izmantojot MUVR, nevis OPLS modeļus, kas veikti bez atkārtotas dubultās savstarpējās validācijas.

4. Materiāli un metodes

4.1. MOMS RCT: Pētījuma plāns un rezultāti

Mikrovaskulārie rezultāti pēc vielmaiņas ķirurģijas (MOMS) ir viena centra, randomizēts, neatklāts, kontrolēts klīnisks pētījums (NCT01821508), kurā tiek pētīta kombinētas vielmaiņas ķirurģijas un medicīniskās terapijas (CSM) efektivitāte salīdzinājumā ar medicīnisko terapiju atsevišķi (MTA), lai panāktu slimības remisiju. albuminūrija pieaugušajiem ar 1. klases aptaukošanos, 2. tipa cukura diabētu un mikroalbuminūriju [20]. Galvenie iekļaušanas kritēriji bija vecums 18–65 gadi, ķermeņa masas indekss (ĶMI) 30–35 kg/m2, 2. tipa diabēts ar HbA1c < 12% un uACR > 30 mg/g. Primārais pētījuma rezultāts bija mikroalbuminūrijas remisija (uACR < 30 mg/g). Studiju darbā pieņemšana notika no 2013. gada 1. aprīļa līdz 2016. gada 31. martam.

Roux-en-Y kuņģa apvedceļš (RYGB) bija vielmaiņas ķirurģija, ko izmantoja MOMS pētījumā, un to laparoskopiski veica viens ķirurgs (RVC) ar 30 ml kuņģa maisiņu, 150 cm barības ekstremitāšu un 80 cm biliopankreatisko ekstremitāšu. Medikamenti, kas labvēlīgi ietekmē 2. tipa diabēta mikrovaskulāros un makrovaskulāros rezultātus, tika ievadīti agri pēc izmēģinājuma sākuma, ja pacienti tos vēl nesaņēma. Medicīniskās ārstēšanas algoritmi atbilda diabēta sabiedrības vadlīnijām, kas tika atjauninātas pētījuma novērošanas laikā [63]. Sīkāka informācija par pētījuma ārstēšanu ir pieejama pētījuma protokolā un 24-mēneša rezultātu dokumentā [19,20].

Pētījuma rezultāti, kas novērtēti sākotnējā stāvoklī, kā arī 6. un 24. mēnesī un sniegti šajā apakšpētījumā, ietver uACR, seruma kreatinīnu, HbA1c, asins lipīdus (kopējais holesterīns, zema blīvuma lipoproteīnu holesterīns (ZBL-C), augsta blīvuma lipoproteīnu holesterīns (ABL-C) un triglicerīdi), asinsspiediens un antropometrija (ķermeņa svars, vidukļa apkārtmērs un ĶMI). Asins un urīna paraugi tika iegūti pēc vismaz 8-h badošanās. Urīna paraugi tika savākti agrā rītā. Laboratorijas mērījumus veica tā pati centrālā laboratorija, kas sertificēta ar ISO9001 un ISO14001 un akreditēta Amerikas Patologu koledžā. Asinsspiedienu mēra ar kalibrētu aneroidālo sfigmomanometru pēc 5 minūšu atpūtas. Sistoliskais asinsspiediens (SBP) un diastoliskais asinsspiediens (DBP) tika aprēķināts kā divu rādījumu vidējais aritmētiskais, kas iegūts ar 5 minūšu intervālu. Vidējais arteriālais asinsspiediens (MAP) tika aprēķināts, DBP pievienojot 1/3 no pulsa spiediena.

Pētījums tika veikts saskaņā ar Helsinku deklarācijas vadlīnijām, un to apstiprināja slimnīcas Alemão Os waldo Cruz Institucionālās pētniecības ētikas komiteja (pētījuma numurs: NCT01821508). Visi dalībnieki sniedza oficiālu rakstisku informētu piekrišanu.

4.2. Metabolisma analīzes: Kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopija

Urīna metaboloms tika novērtēts ar 1H-kodolmagnētiskās rezonanses (NMR) spektroskopiju urīna paraugos, kas savākti sākotnējā stāvoklī un 6 mēnešus pēc iejaukšanās pacientu apakšgrupā, kas tika iekļauti MOMS pētījumā. Kopumā tika analizēti 97 paraugi no abiem laika punktiem; apakškopa no 46 no šiem paraugiem bija pārī paraugi no tiem pašiem indivīdiem abos laika punktos. Analizēto paraugu skaits, stratificēts pēc pētījuma grupas un laika punkta, ir parādīts 4. tabulā.

1H-KMR spektroskopija tika veikta pēc standarta Bruker In Vitro Diag nostic Research (IVDr) metodēm [64]. Urīna paraugi tika atkausēti istabas temperatūrā 20 minūtes pirms īsas izgriešanas ar 2000 g 4 ◦C temperatūrā 10 minūtes. KMR paraugi 5 mm SampleJet statīviem tika sagatavoti, sajaucot 9 daļas urīna ar 1 daļu urīna buferšķīduma (1,5 M KH2PO4 pD 6,95, 0,5% m/v NaN3, 0,1% (w/v) 3-trimetilsililpropionskābe-2). ,2,3,3 skābes nātrija sāls D4 (TSP-d4) 99,8% D2O), izmantojot Samplepro Tube L šķidruma apstrādes robotu (Bruker BioSpin, Etlingena, Vācija), saglabājot temperatūru 279 K visā parauga sagatavošanas procesā. Lai noslēgtu paraugu mēģenes, pirms statnes ievietošanas atdzesētajā SampleJet paraugu mainītājā uz spektrometra tūbiņu vāciņiem tika pievienotas POM bumbiņas.

Katram paraugam tika iegūta 1D kodola Overhauzera efekta spektroskopija (NOESY) un 2D J izšķirtspējas eksperimenti ar 600 MHz Bruker Avance III HD spektrometru 300 K temperatūrā, kas aprīkots ar 5 mm BBI istabas temperatūras zondi. , izmantojot IVDr standarta parametru kopas impulsu secībām “noesygppr1d” un “jresgpprqf”. 1D NOESY eksperiments ietvēra 32 skenējumu vākšanu 64 000 datu punktos ar spektrālo platumu 20 ppm, iegūšanas laiku 2,726 s, relaksācijas aizkavi 4 s, NOESY sajaukšanas laiku 10 ms, 4 fiktīvus skenējumus uztvērēja pastiprinājuma iestatījums 90,5 un priekšpiesātinājuma nobīde, kas centrēta uz ūdens signālu. 2D J atrisinātajam eksperimentam pēc 16 fiktīviem skenēšanas gadījumiem divi skenējumi katrā pieaugumā tika savākti 40 savienojumos netiešajā dimensijā ar 8 000 datu punktiem tiešajā dimensijā un iegūšanas laikiem 0,4085 s un 0,2137 s tiešajam un netiešajam. izmēri, attiecīgi. Relaksācijas aizkave bija 2 s. Spektra logs bija attiecīgi 16,7 ppm un 93,6 Hz tiešajā un netiešajā dimensijā. Uztvērēja pastiprinājums tika iestatīts uz 90,5, un ūdens slāpēšana tika panākta, veicot priekšpiesātinājumu relaksācijas aizkaves laikā, līdzīgi kā 1D NOESY eksperimentā.

Urīna paraugi tika randomizēti paraugu sagatavošanas laikā, lai datu iegūšanas laikā paraugi no dažādām pētījuma grupām un laika punktiem būtu vienmērīgi sadalīti. TSP-d4 tika izmantots iekšējai ķīmiskai nobīdei.

Desmit apvienotie paraugi (n=5 katrs satur paraugu alikvotas no abiem laika punktiem, bāzes līnijas un 6. mēneša) tika iekļauti kā iekšējās kvalitātes kontroles. Procentuālais PQN normalizētās maksimuma intensitātes variācijas koeficients starp bāzes līniju un 6. mēneša apvienotajiem paraugiem tika aprēķināts katram anotētajam 1H-NMR maksimumam (n=208) šādi:

Aprēķini tika veikti atsevišķi bāzes līnijai un 6. mēneša apvienotajiem paraugiem, un katras anotētās maksimuma variācijas koeficienta vērtības ir augšupielādētas vietnē https: //osf.io/vs2dg/ (piekļuve 2022. gada 15. janvārī). Tika izveidots blīvuma grafiks, kas iezīmē variācijas koeficienta vērtību sadalījumu katram anotētajam 1H-NMR maksimumam. Blīvuma diagrammas x-ass tika logaritmiski pārveidota, izmantojot 'log1p' transformāciju no R paketes skalām [25]. PQN normalizētu apvienoto paraugu spektru ilustratīvie grafiki tika ģenerēti noteiktām virsotnēm, kuras CSM mainīja, izmantojot daudzfaktoru analīzi, izmantojot funkciju 'ROIplot' no R pakotnes speaq [26], tādējādi demonstrējot zemo pīķu intensitātes variāciju starp apvienotajiem paraugiem. .

Lai atvieglotu metabolītu anotāciju, ar Oxford 800 MHz magnētu, kas aprīkots ar Bruker Avance III HD konsoli un 3 mm TCI kriozondi, tika iegūts 2D eksperimentu komplekts ar atlasītajiem paraugiem. Daudzkārt rediģēti 13C-HSQC tika iegūti, izmantojot impulsu secību 'hsqcedetgpsisp2.3', izmantojot spektrālo platumu attiecīgi 20 un 90 ppm tiešajā un netiešajā dimensijā, savācot 64 skenējumus ar soli, kopā 512 palielinājumus un 2048 datu punktus. Iegūšanas laiki bija attiecīgi 63, 9 un 14 ms tiešajiem un netiešajiem izmēriem, un relaksācijas aizkave bija 1, 5 s. 1H-1H TOCSY tika iegūti, izmantojot impulsu secību 'dipsi2esgpph' ar slaucīšanas platumu abos dimensijās 12 ppm, savācot 16 skenējumus ar soli 512 soļos un 8192 datu punktos. Iegūšanas laiki bija attiecīgi 0,426 s un 26,6 ms tiešajām un netiešajām dimensijām. TOCSY pārsūtīšanas aizkave bija 60 ms, un relaksācijas aizkave starp skenēšanu bija 1 s. 1H-1H-COSY tika iegūti ar impulsu secību “cosygpppqfpr”. Slaucīšanas platums bija 13,95 ppm abos izmēros; Tika savākti 4 skenējumi ar katru soli, kopā 1024 savienojumi un 2048 datu punkti. Iegūšanas laiks bija 92 ms un relaksācijas aizkave 2 s. Visi 2D spektri tika attiecināti uz TSP-d4. Ķīmisko pārvietojumu tabulas, kurās izklāstītas 13C-HSQC, 1H-TOCSY un 1H-COSY nobīdes vērtības visām virsotnēm (n=475) un anotēto pīķu apakškopai (n=208), ir pieejamas vietnē https: ://osf.io/vs2dg/, piekļūts 2022. gada 15. janvārī.

4.3. 1H-KMR spektrālā apstrāde

1D NOESY spektri, kas paredzēti pīķu atlasei un daudzfaktoru analīzei, tika apstrādāti ar automātisko IVDr AU programmu, kas nozīmē, ka tie tika divas reizes aizpildīti ar nulli pirms Furjē pārveidošanas 128 000 datu punktos, pievienojot 0,3 Hz eksponenciālu līniju paplašināšanu un atsaucoties uz TSP-d4. Spektri tika apstrādāti programmā TopSpin3.5pl7 (Bruker BioSpin, Et tlingen, Vācija). 1D NOESY spektri tika ielādēti MATLAB, izmantojot RBNMR [65]. Spektru bāzes līnijas korekcija tika veikta sakarā ar augsto glikozes koncentrāciju urīnā bāzes paraugos, izmantojot komandu 'msbackadj' ar loga lielumu iestatīts uz 2000, kvantile iestatīts uz 0,1 un soļa lielumu iestatīts uz 1000 [66 ]. Sākotnēji koriģētie 1D NOESY spektri un pievienotās daļas uz miljonu (ppm) ķīmiskās nobīdes vektors, kā arī parauga metadati ir pieejami vietnē https://osf.io/vs2dg/, piekļūts 2022. gada 15. janvārī.

Turpmākā KMR datu analīze tika veikta, izmantojot R statistikas programmēšanas valodu (4.1.1) [67]. Spektri un ppm ķīmiskās nobīdes vērtības tika importētas un apstrādātas maksimālās intensitātes matricā saskaņā ar standarta darbplūsmu, izmantojot R pakotni speak [26]. Pīķa noteikšana tika veikta, izmantojot Meksikas cepures viļņa metodi, ko īstenoja funkcija “getWaveletPeaks”. Konstatētās virsotnes tika izlīdzinātas un grupētas vienā ppm indeksa vērtībā, izmantojot funkciju "PeakGrouper". Neapstrādātu spektru, pīķu noteikšanas un pīķu grupēšanas/līdzināšanas diagrammas, izmantojot speaq, tika ģenerētas, izmantojot funkciju 'ROIplot', un manuāli pārskatītas katrai interesējošajai virsotnei. Viena šāda diagrammas ilustratīvs piemērs ir parādīts 9. attēlā. PDF fails, kurā izklāstīti neapstrādātu spektru, pīķu noteikšanas, pīķu izlīdzināšanas un pīķu intensitātes diagrammas pa grupām visām anotētajām virsotnēm (n=208), ir pieejams vietnē https. ://osf.io/vs2dg/, piekļūts 2022. gada 15. janvārī.

9. attēls. Izvēlētā urīna 1H-KMR spektroskopijas pīķa neapstrādātie spektri un spektrālā apstrāde. (A) Izvēlētā N-fenilacetilglicīna pīķa neapstrādāti 1H-KMR spektri. Katra līnija atbilst viena parauga spektram. (B) Pīķu noteikšana spektros, izmantojot Meksikas cepures viļņa transformāciju. Katrs punkts apzīmē viena parauga maksimālo intensitāti. (C) Pīķu izlīdzināšana, grupējot, lai ņemtu vērā pīķu nobīdes starp spektriem parauga vides un/vai eksperimentālo apstākļu atšķirību dēļ. Katrs punkts apzīmē viena parauga maksimālo intensitāti. Spektru manuāla pārbaude un spektrālā apstrāde speaq tika veikta, kā aprakstīts šeit pīķiem, kas tika identificēti kā svarīgi klasifikācijas veiktspējai, izmantojot daudzfaktoru modeļus, lai nodrošinātu, ka identificēto pīķu atšķirības starp grupām nav artefaktas un tās var droši identificēt spektros. 1H-KMR spektroskopija, protonu kodolmagnētiskās rezonanses spektroskopija; CSM, kombinētā vielmaiņas ķirurģija un medicīniskā terapija; CSM0, bāzes paraugi no CSM grupas; CSM6, 6. mēneša paraugi no CSM grupas; MTA, medicīniskā terapija vienatnē; MTA0, bāzes paraugi no MTA grupas; MTA6, 6.mēnesis paraugi no MTA grupas; PPM, daļas uz miljonu ķīmiskā nobīde attiecībā pret TSP-d4.

Silueta vērtības tika aprēķinātas kā pīķu grupēšanas kvalitātes metrika, izmantojot funkciju "SilhouetR". Pīķu grupas, kuru silueta vērtība ir mazāka par {{0}}.6, tika noņemtas, un virsotnes tika pārgrupētas ar funkciju "pārgrupēt" — šis process tika atkārtots iteratīvi, līdz visu pīķu grupu silueta vērtība bija lielāka vai vienāda ar 0.6. Pīķa aizpildīšana tika veikta, lai noteiktu maksimumus, kas, iespējams, tika izlaisti pirmajā pīķa noteikšanas kārtā.

Visbeidzot, tika izveidota pīķa intensitātes matrica ar grupētiem pīķiem (identificēti pēc to ppm nobīdes vērtībām) kā kolonnas un paraugus kā rindas. Pīķa intensitātes matricai [68,69] tika piemērota varbūtības koeficienta normalizācija (PQN), kas pēc tam tika izmantota kā daudzfaktoru statistikas ievade. Neapstrādātas un ar PQN normalizētas maksimālās intensitātes matricas, kā arī metadatu paraugi ir pieejami vietnē https://osf.io/vs2dg/, piekļūts 2022. gada 15. janvārī. Apstrādāto spektru anotācija tika veikta, izmantojot programmatūru Chenomx 8.6 (Chenomx Inc.) , cilvēka metabolisma datu bāze (HMDB; https://hmdb.ca/; piekļūta 2022. gada 15. janvārī), Bioloģiskās magnētiskās rezonanses datu banka (BMRB; https://bmrb.io/; piekļūta 2022. gada 15. janvārī) un iegūtie 2D KMR dati atlasītajiem paraugiem [70–72].

4.4. 1H-NMR datu galveno komponentu analīze

Klasterizācija ar galveno komponentu analīzi (PCA) tika veikta ar PQN normalizētām KMR maksimumu intensitātēm, izmantojot funkciju “prcomp”, un attēlota pēc fenotipa gar galvenajiem komponentiem 1-3, izmantojot funkciju “scatter3D” no R pakotnes plot3D [73]. . Sākotnējie paraugi no CSM un MTA grupām tika izskatīti kopā, lai palielinātu skaidrību PCA diagrammā. Centroīdi tika aprēķināti kā vidējie rādītāji saskaņā ar galvenajiem komponentiem 1–3 trim grupām: sākotnējais līmenis, MTA6 un CSM6. Elipsoīdi tika aprēķināti pa galvenajiem komponentiem 1–3, izmantojot funkciju “makeEllipsoid” no R pakotnes ChemoSpec, un attēloti, izmantojot “scatter3D” [27, 73]. Slodzes tika iegūtas no galvenā komponenta objekta un attēlotas, izmantojot funkciju “scatter3D”, ar atlasītajām virsotnēm, kas apzīmētas [73].

4.5. 1H-NMR datu salocīšanas maiņas pārbaude

Interesējošajiem grupu salīdzinājumiem tika aprēķinātas PQN normalizētās urīna 1H-NMR maksimālās intensitātes izmaiņas. Grupu salīdzināšanai, izmantojot visus pieejamos paraugus, tika veikti nesapārotie t testi, izmantojot R pakotni static, lai salīdzinātu katra pīķa intensitāti starp abām paraugu grupām [74]. Grupu salīdzināšanai, izmantojot tikai pāru paraugus, pāru t-testi tika veikti, izmantojot R paketes statisko [74]. p-vērtības tika daudzkārt koriģētas salīdzinājumu (pīķu) skaitam, izmantojot Benjamini–Hochberg metodi [75]. Salīdzināšanai starp grupām, izmantojot visus pieejamos paraugus, katras grupas vidējā maksimālā intensitāte tika iegūta no nesapārotā t-testa objekta. Pāru paraugu salīdzināšanai starp grupām vidējā maksimālā intensitāte pa grupām tika aprēķināta, izmantojot bāzes R funkciju “vidējais”, jo vidējie aprēķini netika atgriezti pārī savienotajos t-testa objektos [67]. Log2 reizes izmaiņas tika aprēķinātas šādi:

Reizes izmaiņu pārbaudes rezultāti salīdzināšanai, izmantojot visus pieejamos paraugus (MTA{{0}} pret CSM0, MTA0 pret MTA6, CSM0 pret CSM6 , un MTA6 pret CSM6) ir parādīti kā vulkāna diagrammas ar log2 reižu izmaiņām uz x ass un –log10 no daudzkārtības koriģētās p vērtības uz y ass. Log2 reizes izmaiņu vērtības un saistītās p-vērtības CSM0 un CSM6 visiem pieejamajiem paraugiem, CSM0 un CSM6 sapārotajiem paraugiem un MTA6 pret CSM6 salīdzinājumiem ir arī apkopoti tabulā par maksimumiem, kas identificēti kā mainījušies CSM no sākotnējā līmeņa uz 6. mēnesi. ar daudzfaktoru daļējo mazāko kvadrātu (PLS) klasifikācijas modeļiem

4.6. 1H-KMR klasifikācijas modelēšana

Lai noskaidrotu atšķirības urīna metabolomā starp pacientiem, kuri tika ārstēti ar CSM un MTA, R pakete MUVR tika izmantota, lai pielāgotu daudzfaktoru PLS klasifikācijas modeļu sēriju divu paraugu grupu salīdzināšanai vienlaikus [61]. MUVR modeļi tika aprīkoti ar PQN normalizētām 1H-NMR maksimālās intensitātes matricām (X matricām), kas satur katra salīdzinājuma attiecīgos paraugus [61]. Katram uzraudzītajam modelim tika ievadīts AY atbildes vektors, kas norāda izlases grupas piešķiršanu.

Paraugu grupas, kas izmantotas MUVR modeļu salīdzināšanai, ir norādītas 5. tabulā, kā arī katrā modelī ievadīto paraugu skaits, kā arī modeļa rezultātu atrašanās vieta manuskriptā. Kā norādīts iepriekš 4. tabulā, ne visi paraugi no sākotnējā stāvokļa līdz 6. mēnesim noteikti bija no tiem pašiem indivīdiem. Lai maksimāli palielinātu paraugu izmantošanu, kā arī statistisko jaudu, primārie PLS modeļi tika palaisti uz visiem pieejamajiem paraugiem (nesapārotu un pārī savienotu paraugu maisījums) konkrētam salīdzinājumam. Kā jutīguma analīzes PLS modeļi tika piemēroti arī pāru paraugu apakškopai no tiem pašiem indivīdiem abos laika punktos attiecīgajiem salīdzinājumiem. Šajos pāra paraugu modeļos tika ievadīti paraugu ID, cenšoties samazināt modeļu pārmērību, nodrošinot, ka viena un tā paša indivīda paraugi tiek turēti kopā savstarpējās validācijas segmentos.

5. tabula. MUVR modeļu pārskats un rezultātu atrašanās vieta manuskriptā 1 .

1 CSM, kombinēta vielmaiņas ķirurģija plus medicīniskā terapija; CSM0, bāzes paraugi no CSM grupas; CSM6, 6. mēneša paraugi no CSM grupas; MTA, medicīniskā terapija vienatnē; MTA0, bāzes paraugi no MTA grupas; MTA6, 6.mēnesis paraugi no MTA grupas; MUVR, daudzfaktoru metodes ar objektīvu mainīgo izvēli R.

MUVR algoritms samazina pārmērību daudzfaktoru modelēšanā, veicot vismazāk informatīvo mainīgo rekursīvu elimināciju atkārtotā dubultās savstarpējās validācijas procedūrā [61]. Tika izmantoti šādi modelēšanas parametri, kā ieteikts: nOuter=8 (ārējo savstarpējās validācijas segmentu skaits, lai nodrošinātu, ka abas klases ir visos modeļa segmentos), nRep=100 (modeļa atkārtojumu skaits, liels skaits tika izvēlēts, lai uzlabotu reproducējamību), un varRatio=0.85 (datos saglabāto mainīgo lielumu proporcija vienā modeļa iterācijā mainīgā likvidēšanas laikā) [61].

MUVR atgriež trīs konsensa modeļus (“min”, “vidējais” un “maksimālais”) ar līdzīgu piemērotību [61]. “Max” modelis, kurā tiek ņemti vērā visi attiecīgie prognozētāji, neapdraudot klasifikācijas veiktspēju, tika izvēlēts, lai identificētu pēc iespējas vairāk urīna 1H-NMR pīķu, kas bija svarīgi urīna paraugu klasificēšanai saskaņā ar grupu piešķiršanu. Modeļa stabilitāte 100 atkārtojumos tika nodrošināta, pārbaudot atlasīto mainīgo skaitu un proporciju, kā arī nepareizo klasifikāciju skaitu vienā atkārtojumā un kumulatīvi; konverģence notika ar 20 atkārtojumiem visiem modeļiem.

Lai novērtētu modeļa veiktspēju, tika izmantots laukums zem uztvērēja darbības raksturlīknes (AUC) un vairākas modeļa nepareizas klasifikācijas. Nepareizu klasifikāciju skaits tiek izmantots, lai novērtētu MUVR PLS klasifikācijas modeļu piemērotību, nevis tādus rādītājus kā R2X, R2Y un Q2 [61]. AUC un ar to saistītais 95% ticamības intervāls tika aprēķināts, ievadot faktisko izlases klasi līdzās prognozētajai izlases klases varbūtībai (kas iegūta no MUVR modeļa) funkcijai “roc” no R pakotnes pROC [76]. Uztvērēja darbības raksturlīknes (ROC) tika ģenerētas, izmantojot funkciju 'ggroc' no proOC pakotnes [76]. Papildu veiktspējas rādītāji saistībā ar modeļa klasifikāciju, tostarp vispārējā klasifikācijas precizitāte, Kappa statistika, jutīgums, specifiskums, pozitīva paredzamā vērtība un negatīvā paredzamā vērtība, tika aprēķināti, ievadot faktisko izlases klasi līdzās prognozētajai izlases klasei pie 50% varbūtības sliekšņa. (iegūta no MUVR modeļa) uz funkciju 'apjukuma matrica' no R pakotnes caret [77]. Šie veiktspējas rādītāji ir parādīti tabulā katram modelim, kas sagatavots, izmantojot funkciju 'ggtexttable' no R pakotnes ggpubr [78]. Katram MUVR modelim tika uzzīmēta neskaidrības matrica, kas iezīmēja pareizo un nepareizo modeļu klasifikāciju skaitu un proporciju, izmantojot pielāgotu ggplot2 diagrammas funkciju [79].