Svertiajaponīns inhibē ādas pigmentāciju ar diviem mehānismiem, lai nomāktu tirozināzi 1. daļa

KOPSAVILKUMS

Daudzi ādu balinošie savienojumi ir vērsti uz tirozināzi, jo tas katalizē divus ātrumu ierobežojošus melanīna sintēzes posmus. Lai gan pašlaik ir pieejami daudzi tirozināzes inhibitori ādas balināšanas nolūkiem, tiek ziņots arī par nevēlamām blakusparādībām. Tādējādi ir veikti daudzi centieni, lai no dabīgiem produktiem izstrādātu drošākus tirozināzes inhibitorus. Saskaņā ar to mēs pārbaudījām piecdesmit flavonoīdus, dabiski sastopamu antioksidantu un metālu helātu grupu, un pārbaudījām swertiajaponīnu kā spēcīgāko tirozināzes inhibitoru eksperimentos bez šūnām. Swertiajaponīns neuzrādīja citotoksicitāti B16F10, HaCat un Hs27 šūnās, un eksperimentos, izmantojot bezšūnu sistēmu un B16F10 šūnas, tam bija spēcīga antioksidanta aktivitāte. Tas ievērojami kavēja MSH vai UVB izraisītu melanīna uzkrāšanos B16F10 šūnās un nomāca ādas pigmentāciju cilvēka ādas modelī. Kā pamatā esošie mehānismi in silico un Lineweaver-Burk diagrammas analīzēs parādīja, ka swertiajaponīns var tieši saistīties ar tirozināzes aktivitāti un inhibēt to, veidojot vairākas ūdeņraža saites un hidrofobu mijiedarbību ar tirozināzes saistīšanas kabatu. Turklāt Western blotēšanas rezultāti liecināja, ka swertiajaponīns inhibēja oksidatīvā stresa izraisīto MAPK / MITF signālu pārraidi, izraisot tirozināzes proteīna līmeņa pazemināšanos. Kopā swertiajaponīns nomāc melanīna uzkrāšanos, kavējot gan tirozināzes aktivitāti, gan proteīna ekspresijas līmeni. Tādējādi tā būtu jauna piedeva balinošajai kosmētikai.

Atslēgvārdi

swertiajaponīns; melanoģenēze; pigmentācija; cilvēka āda; tirozināze

IEVADS

Āda ir galvenā vieta, kur uzkrājas melanīna pigmenti. Melanīna sintēze un uzkrāšanās notiek kā aizsargmehānisms pret ultravioleto (UV) starojumu. Tādējādi cilvēkiem ar melnu ādu ir mazāks ādas vēža risks nekā tiem, kuriem ir bāla āda, jo viņi ir aizsargāti no UV mutagēnās iedarbības [1]. Tomēr nekontrolēta melanoģenēze ir cieši saistīta ar pigmentācijas traucējumiem, tostarp melismu, vasaras raibumiem un senils lentigines [2]. Turklāt patoloģiskas ādas krāsas izmaiņas rada nelabvēlīgas kosmētiskas problēmas un galu galā pasliktina dzīves kvalitāti. Tādējādi patoloģiskas melanoģenēzes novēršana ir piesaistījusi lielu uzmanību ādas balināšanas kosmētikas izstrādei [3–5].

Melanocīts ir galvenais šūnu veids, kas sintezē melanīnu ādas epidermā. Pēc sintēzes melanocīti caur dendritiem pārnes melanīnu uz keratinocītiem, izraisot ādas pigmentāciju. Melanīnu var sintezēt no L-tirozīna, izmantojot hidroksilēšanas un oksidācijas procesus, kuros daudzfunkcionālai vara saturošai tirozināzei ir galvenā loma melanīna sintēzē. Tirozināze katalizē divus ātrumu ierobežojošus posmus melanīna sintēzē; L-tirozīna mikofenolāta hidroksilēšana par 3,4-dihidroksi-L-fenilalanīnu (L-DOPA) un L-DOPA oksidēšana par DOPA hinīnu [6, 7]. Attiecīgi tirozināzes inhibīcija ir laba stratēģija, lai padarītu ādu gaišāku, taču citotoksicitāte un stabilitātes trūkums ir ierobežojuši dažādu tirozināzes inhibitoru pielietojumu medicīnisko produktu un kosmētikas jomā. Tādējādi ir veikti nemitīgi centieni, lai no dabīgiem avotiem atrastu drošākus tirozināzes inhibitorus ar spēcīgāku stabilitāti un selektivitāti.

Lai atrastu savienojumus labākai un drošākai ādas balināšanas iedarbībai, mēs pārbaudījām piecdesmit dabiski pieejamos flavonoīdus, lai noteiktu to inhibējošo iedarbību uz tirozināzi, un pārbaudījām swertiajaponīnu kā spēcīgāko tirozīnazes inhibitoru. Mēs tālāk pētījām tā ietekmi uz ādas pigmentāciju, izmantojot šūnu un cilvēka ādas modeļus ar dažādiem bioloģiskiem testiem un in silico analīzi.

Cistanche ir izplatīts augs, kas pazīstams kā "brīnumaugs, kas pagarina mūžu". Tās galvenā sastāvdaļa ir cistanozīds, kam ir dažādi efekti, piemēram, antioksidants, pretiekaisuma līdzeklis un imūnās funkcijas veicināšana. Mehānisms starp cistanche un ādas balināšanu slēpjas cistanche glikozīdu antioksidanta iedarbībā.

Noklikšķiniet uz Cistanche, lai uzlabotu ādas balināšanu

Jautājiet vairāk:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Melanīns cilvēka ādā rodas tirozīna oksidācijas rezultātā, ko katalizē tirozināze, un oksidēšanās reakcijā ir nepieciešama skābekļa līdzdalība, tāpēc skābekļa brīvie radikāļi organismā kļūst par svarīgu faktoru, kas ietekmē melanīna veidošanos. Cistanche satur cistanozīdu, kas ir antioksidants un var samazināt brīvo radikāļu veidošanos organismā, tādējādi kavējot melanīna veidošanos.

Turklāt cistanche veic arī kolagēna ražošanu, kas var palielināt ādas elastību un spīdumu un palīdzēt atjaunot bojātās ādas šūnas.

Cistanche feniletanola glikozīdiem ir ievērojama tirozināzes aktivitātes samazinoša ietekme, un ir pierādīts, ka ietekme uz tirozināzi ir konkurētspējīga un atgriezeniska inhibīcija, kas var nodrošināt zinātnisku pamatu balinošo sastāvdaļu izstrādei un izmantošanai Cistanche.

Tāpēc cistanšai ir galvenā loma ādas balināšanā. Tas var kavēt melanīna ražošanu, lai samazinātu krāsas maiņu un blāvumu; un veicina kolagēna ražošanu, lai uzlabotu ādas elastību un mirdzumu. Tā kā šie cistanche efekti ir plaši atzīti, daudzi ādas balināšanas produkti ir sākuši lietot augu izcelsmes sastāvdaļas, piemēram, Cistanche, lai apmierinātu patērētāju pieprasījumu, tādējādi palielinot Cistanche komerciālo vērtību ādas balināšanas produktos.

Rezumējot, cistanche lomai ādas balināšanā ir izšķiroša nozīme. Tās antioksidanta iedarbība un kolagēnu veidojošais efekts var samazināt krāsas maiņu un blāvumu, uzlabot ādas elastību un spīdumu un tādējādi panākt balinošu efektu. Arī Cistanche plašais pielietojums ādas balināšanas produktos pierāda, ka tā lomu komerciālajā vērtībā nevar novērtēt par zemu.

REZULTĀTI UN DISKUSIJA

Swertiajaponīns ir spēcīgākais piecdesmit flavonoīdu tirozināzes inhibitors

Ir zināms, ka no dažādiem dabīgiem savienojumiem flavonoīdi, dabiski sastopamu antioksidantu un metālu helātu grupa, nomāc tirozināzes aktivitāti, jo tie spēj veidot vara-flavonoīdu kompleksus [8, 9]. Mēs izmantojām piecdesmit flavonoīdus, kas bija komerciāli pieejami, lai pārbaudītu, vai tiem ir inhibējoša iedarbība pret sēņu tirozināzi. Kojīnskābe, labi zināms tirozināzes inhibitors, tika izmantota kā pozitīva kontrole, lai pārbaudītu labākus tirozināzes inhibitorus (1. A-1B attēls). Rezultātā paraugam Nr. 40 (svertiajaponīns) (1. C attēls) bija visspēcīgākā inhibējošā aktivitāte pret tirozināzi nekā citiem flavonoīdiem (1. A-1B attēls un 1. papildu attēls). Kad inhibējošā aktivitāte tika tālāk pārbaudīta ar no koncentrācijas atkarīgu eksperimentu, kojskābes IC50 vērtība bija 41,26 μM un svertiajaponīna vērtība bija 43,47 μM (1D attēls), kas norāda, ka svertiajaponīna tirozināzes aktivitātes inhibīcija ir salīdzināma ar kojskābes inhibīciju. par eksperimentiem ar mēģenēm.

Swertiajaponīns neuzrāda citotoksicitāti in vitro

Swertiajaponīns pieder flavonoīdu C-glikozīdu grupai. Tas satur ogļhidrātu daļu, kas ir C-glikozīdiski saistīta ar vienu no flavonoīdu mugurkauliem (1.C attēls). Ir ziņots, ka tas ir savienojums, kas atrodams visā Swertia japonica zālē [10]. Lai gan dažos pētījumos ziņots, ka Swertia japonica Japānā klīniski tiek izmantots kā kuņģa-zarnu trakta simptomu līdzeklis [11], ir pieejami daži pētījumi par swertiajaponīna bioloģiskajām funkcijām. Tādējādi mēs tālāk pētījām tā ietekmi uz melanoģenēzi. Tā kā citotoksicitāte ir galvenā sintētisko tirozināzes inhibitoru problēma, mēs pārbaudījām, vai swertiajaponīns uzrādīja šūnu toksicitāti, izmantojot vairākas šūnu līnijas, tostarp HaCat (cilvēka keratinocītu), B16F10 (peles melanomu) un Hs27 (cilvēka fibroblastu). Swertiajaponīns neuzrādīja citotoksicitāti šajās šūnu līnijās (attēls 2A-2C).

Swertiajaponīns kavē melanoģenēzi B16F10 šūnās

Mēs pētījām tā ietekmi uz melanoģenēzi, izmantojot B16F10 šūnas, kas iepriekš apstrādātas ar kojskābi vai svertiajaponīnu, kam sekoja UVB vai MSH iedarbība, kas ir spēcīgākie melanogēnie induktori. Kā gaidīts, UVB vai MSH iedarbība ievērojami palielināja melanīna līmeni B16F10 šūnās (2. attēls-2F), un svertiajaponīna terapija samazināja šūnu melanīna saturu atkarībā no devas pēc UVB vai MSH iedarbības (2. D attēls{10). }}F). Šūnu pētījumos svertiajaponīna anti-melanogēnā iedarbība šķiet spēcīgāka nekā kojskābei (2. E- 2F attēls). Līdzīgi šūnu granulu krāsa, kas pirms MSH apstrādes tika apstrādāta ar swertiajaponīnu, tika gaišāka, salīdzinot ar ar MSH apstrādātajām šūnām (2.D attēls), norādot, ka swertiajaponīns inhibē UVB vai MSH izraisītu melanoģenēzi.

Swertiajaponīns inhibē melanoģenēzi cilvēka ādas modelī

Lai apstiprinātu, ka swertiajaponīns nomāc ādas pigmentāciju cilvēkiem, mēs kultivējām dzīvotspējīgu, trīsdimensiju, atjaunotu cilvēka epidermu, kas sastāv no cilvēka melanocītiem un keratinocītiem, kuri, kā zināms, laika gaitā iziet spontānu melanoģenēzi [12]. Mēs iepriekš apstrādājām cilvēka ādas modeli ar swertiajaponīnu 1 stundu un kultivējām to uzturēšanas vidē 5 dienas. Salīdzinot ar 1. dienu, cilvēka ādas modelis bija tumšāks 5. dienā, un ārstēšana ar swertiajaponīnu to novērsa atkarībā no koncentrācijas (3.A-3B attēls). Tāpat Fontana-Masson krāsošana parādīja, ka svertiajaponīns ievērojami samazināja melanīna līmeni epidermā (2.C attēls), kas liecina, ka swertiajaponīns samazina pigmentācijucilvēka ādas modelis.

Swertiajaponīns var saistīties ar tirozināzi un inaktivēt to

Pēc tam mēs pētījām mehānismus, kas ir pamatā swertiajaponīna mediētajai anti-melanogēnajai iedarbībai, izmantojot B16F10 šūnas. Tā kā swertiajaponīns nomāca tirozināzes aktivitāti bezšūnu eksperimentos, izmantojot sēņu tirozināzi (1.B attēls), mēs izvirzījām hipotēzi, ka tas tieši saistās ar tirozināzi un deaktivizē to. Lai to pārbaudītu, tika veikta proteīna ligandu dokstacijas simulācija, lai prognozētu saistīšanās afinitāti, izmantojot AutoDock Vina. Paredzamā saistīšanās afinitāte starp tirozināzi un kojskābi bija -5,4 kcal/mol, un afinitāte starp tirozināzi un svertiajaponīnu bija -6,3 kcal/mol (4A un 4C attēls), kas liecina, ka svertiajaponīns var saistīties tirozināzei ar spēcīgāku afinitāti nekā kojskābei. Lai turpinātu pētīt saistīšanās režīmu starp savienojumiem un tirozināzi, tika veikta farmakofora analīze, izmantojot LigandScout 3.1 programmatūru. Lai gan kojskābe var saistīties ar tirozināzi galvenokārt caur ūdeņraža saitēm ar tirozināzes ASN260 vai GLU256 atlikumu (4.B attēls), svertiajaponīns veido vairākas ūdeņraža saites ar HIS85, ASN81, ASN260, HIS244, ASN260, HIS244 un PH 244 rezidīnas VAL2748 un ARG 268 rezidīnasēm. , un tirozināzes PHE264 atlikums (4.D attēls), kas, iespējams, izskaidro swertiajaponīna augstāku saistīšanās afinitāti ar tirozināzi.

Tā kā iepriekš noteikta tirozīna saistīšanās vieta tika izmantota kā dokstacijas kabata proteīna-ligandu savienošanas simulācijā [3], iespējams, ka swertiajaponīns var konkurētspējīgi saistīties ar tirozīnu ar tirozīnu. Lai to pārbaudītu, tika veikta Lineweaver-Burk analīze. Paaugstinoties svertiajaponīna koncentrācijai, palielinājās arī Km vērtības, savukārt Vmax vērtības bija nemainīgas (4. E-4F attēls), norādot, ka svertiajaponīns ir konkurējošs tirozināzes inhibitors.

Swertiajaponīns ir antioksidants, kas nomāc UVB izraisītu MITF / tirozināzes signālu

Lai gan svertiajaponīna IC50 vērtība ir līdzīga kojskābes vērtībai eksperimentā bez šūnām, faktiskā melanoģenēzes inhibīcija šūnās, kas apstrādātas ar svertiajaponīnu, ir lielāka nekā šūnās, kas apstrādātas ar kojīnskābi, norādot, ka tiešā saistīšanās ar tirozināzi var nebūt vienīgais mehānisms, kas ir pamatā swertiajponīna mediētai melanoģenēzes inhibīcijai. Ir labi dokumentēts, ka flavonoīdu bioloģiskās funkcijas ir saistītas ar to antioksidatīvo iedarbību [13]. Tāpēc mēs pētījām, vai swertiajaponīns regulē oksidatīvo stresu, izmantojot bezšūnu reaktīvā skābekļa (ROS) un peroksinitrīta (ONOO-) attīrīšanas testus. Swertiajaponīnam bija spēcīgas ROS un ONOO attīrīšanas aktivitātes, kas ir salīdzināmas ar Trolox un penicilamīnu, labi zināmiem ROS un ONOO inhibitoriem (attēls 5A-5B). Tālāk mēs pārbaudījām, vai swertiajaponīna antioksidatīvā aktivitāte tika parādīta arī B16F10 šūnās pēc UVB iedarbības. UVB iedarbība ievērojami palielināja ROS un ONOO veidošanos, bet svertiajaponīns tos samazināja atkarībā no koncentrācijas, kas liecina, ka svertiajaponīns ir antioksidants (5. C-5D attēls).

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501