Svertiajaponīns inhibē ādas pigmentāciju ar diviem mehānismiem, lai nomāktu tirozināzi 2. daļa

Cistancheir izplatīts augs, kas pazīstams kā "brīnumaugs, kas pagarina mūžu". Tās galvenā sastāvdaļa ir cistanozīds, kam ir dažādi efekti, piemēram, antioksidants, pretiekaisuma līdzeklis un imūnās funkcijas veicināšana. Mehānisms starp cistanche un ādas balināšanu slēpjas cistanche glikozīdu antioksidanta iedarbībā.

Melanīns cilvēka ādā rodas tirozīna oksidācijas rezultātā, ko katalizē tirozināze, un oksidēšanās reakcijā ir nepieciešama skābekļa līdzdalība, tāpēc skābekļa brīvie radikāļi organismā kļūst par svarīgu faktoru, kas ietekmē melanīna veidošanos.Cistanchesatur cistanozīdu, kas ir antioksidants un var samazināt brīvo radikāļu veidošanos organismā, tādējādi kavējot melanīna veidošanos.

Noklikšķiniet uz Cistanche Tubulosa, lai uzlabotu ādas balināšanu

Jautājiet vairāk:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Papildus,cistancheir arī funkcija veicināt kolagēna ražošanu, kas var palielināt ādas elastību un spīdumu un palīdzēt atjaunot bojātās ādas šūnas.

CistancheFeniletanola glikozīdiem ir ievērojama tirozināzes aktivitātes samazinoša ietekme, un ir pierādīts, ka ietekme uz tirozināzi ir konkurētspējīga un atgriezeniska inhibīcija, kas var nodrošināt zinātnisku pamatu balinošo sastāvdaļu izstrādei un izmantošanai Cistanche.

Tāpēccistancheir galvenā lomaādas balināšana. Tas var kavēt melanīna ražošanu, lai samazinātu krāsas maiņu un blāvumu; un veicina kolagēna ražošanu, lai uzlabotu ādas elastību un mirdzumu. Tā kā šie cistanche efekti ir plaši atzīti, daudzi ādas balināšanas produkti ir sākuši lietot augu izcelsmes sastāvdaļas, piemēram, Cistanche, lai apmierinātu patērētāju pieprasījumu, tādējādi palielinot Cistanche komerciālo vērtību ādas balināšanas produktos.

Rezumējot, cistanche lomai ādas balināšanā ir izšķiroša nozīme. Tās antioksidanta iedarbība un kolagēnu ražojoša iedarbība var samazināt krāsas maiņu un blāvumu, uzlabot ādas elastību un spīdumu un tādējādi sasniegtbalinošs efekts. Arī Cistanche plašais pielietojums ādas balināšanas produktos parāda, ka tā nozīmi komerciālajā vērtībā nevar novērtēt par zemu.

Swertiajaponīns inhibē UVB izraisītu MAPK aktivāciju

Ir pierādīts, ka oksidatīvais stress stimulē melanoģenēzi, palielinot ar mikroftalmiju saistīto transkripcijas faktoru (MITF), kas ir transkripcijas faktors, kas ierosina tirozināzes gēna ekspresiju [4, 14]. Mēs pētījām, vai swertiajaponīna antioksidatīvais efekts var regulēt MITF aktivitāti. Western blotēšanas dati parādīja, ka UVB iedarbība palielināja fosforilēto MITF, kas ir aktīva MITF forma, savukārt apstrāde ar swertiajaponīnu pie 10 μM to samazināja (6.A attēls). Konsekventi, UVB izraisītais tirozināzes proteīna līmeņa paaugstināšanās tika samazināta, ārstējot ar swertiajaponīnu (6.A attēls). Tā kā ir pierādīts, ka oksidatīvais stress aktivizē MITF, izmantojot mitogēnu aktivētu proteīna kināzi (MAPK) [15, 16], tika pētīts, vai swertiajaponīns var kontrolēt MAPK signālu pārraidi. UVB iedarbība ievērojami palielināja ERK, JNK un p38 fosforilēšanos (6.B attēls), kas ir saistīta ar UVB izraisītu ROS un ONOO veidošanos B16F10 šūnās (5. C- 5D attēls). Ārstēšana ar swertiajaponīnu tikai pie 10 μM samazināja MAPK olbaltumvielu līmeni (6.B attēls). Šis rezultāts atbilst svertiajaponīna antioksidatīvajai aktivitātei, jo UVB izraisītā šūnu oksidatīvā stresa samazināšanās bija skaidra tikai pie 10 μM svertiajaponīna (attēls 5C-5D).

Lai gan swertiajaponīns ir galvenais savienojums no visa Swertia japonica garšauga, kas ir izmantots kā japāņu zāles, mūsu pētījums nesniedza pārliecinošus pierādījumus par swertiajaponīna drošību, lietojot to uz cilvēka ādas. Tomēr mūsu eksperimentālajā vidē swertiajaponīnam nebija citotoksicitātes Hs27 (cilvēka fibroblastu), HaCat (cilvēka keratinocītu) un B16F10 (peles melanomas) šūnu līnijās. Turklāt nebija redzamu citotoksicitātes pazīmju, tostarp šūnu atlieku veidošanās vai šūnu atdalīšanās, pamatojoties uz mikroskopisku novērojumu, kad swertiajaponīns tika apstrādāts cilvēka ādas modelī ar koncentrācijām, kas neuzrādīja citotoksicitāti šūnu līnijās. Ņemot vērā, ka pašlaik pieejamo ādas balināšanas savienojumu galvenās bažas rada drošības jautājumi, ir nepieciešami turpmāki in vivo pētījumi, lai pārbaudītu to drošību fizioloģijā.

Kopā svertiajaponīns inhibēja melanīna uzkrāšanos līdz apmierinošai robežai gan šūnu, gan cilvēka ādas modeļos, izmantojot divus mehānismus, lai nomāktu tirozināzi, tieši saistoties ar tirozināzi un konkurētspējīgi inhibējot to un nomācot oksidatīvā stresa izraisīto MAPK / MITF signālu pārraidi (7. attēls). Ņemot vērā zināmo ādas balināšanas līdzekļu, piemēram, kojskābes un arbutīna, nelabvēlīgo ietekmi un ilgtermiņa efektivitātes trūkumu [17], svertiajaponīnu var drošāk lietot, lai nomāktu ādas pigmentāciju, un tā būtu jauna piedeva balinošajai kosmētikai.

MATERIĀLI UN METODES

Tirozināzes aktivitātes tests, izmantojot sēņu tirozināzi

Swertiajaponīns un kojskābe (50 μM) tika ievietoti 96-iedobes mikroplatē (Nunc, Dānija) tirozināzes buferšķīdumā (200 μL), kas satur sēņu tirozināzi (1000 U), 1 mM L-tirozīna šķīdumu un 50 mM fosfātu. buferšķīdums (pH 6,5) [5]. Plāksni inkubēja 37 grādu temperatūrā 15 minūtes, un dopahinonu novērtēja ar spektrofotometriju (450 nm). Pamatojoties uz mērījumu, IC50 tika aprēķināts, izmantojot log-lineārās līknes un to vienādojumus.

Svertiajaponīna un tirozināzes dokstacijas simulācija

AutoDock Vina tika izmantots in silico proteīna-ligandu dokstacijas simulācijai. Tirozināzes trīsdimensiju struktūra tika izmantota Agaricus bisporus kristāliskajā struktūrā (PDB ID: 2Y9X). Iepriekš noteiktā tirozīna saistīšanās vieta tika izmantota kā dokstacijas kabata. Pēc tam, kad tika veiktas dokošanas simulācijas starp tirozināzi un svertiajaponīnu vai kojskābi, tika izmantota programmatūra LigandScout 3.0, lai prognozētu saistīšanās atlikumus starp dažādiem savienojumiem un tirozināzi.

Svertiajaponīna tirozināzes inhibīcijas kinētiskā analīze

L-DOPA tika sagatavota koncentrācijās 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 un 0,0625 mM, un swertiajaponīns tika sagatavots pie 20, 40 un 80 μM. Reakcijas maisījuma šķīdumu sagatavoja 96-iedobes plāksnē, kurā bija 20 μL tirozināzes substrāta (L-DOPA), 10 μL sēņu tirozināzes ūdens šķīduma (200 U) un 50 mM kālija fosfāta buferšķīdums (pH). 6.5) tika pievienoti. Reakcijas maisījuma dopahroma ražošanas ātrums tika mērīts pie viļņa garuma 450 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju. Pēc tam tika aprēķināts svertiajaponīna tirozināzes inhibīcijas līmenis, izmantojot Lineweaver-Burk diagrammas analīzi. Mihaelisa konstante (Km) un maksimālais ātrums (Vmax) tika aprēķinātas arī Lineweaver-Burk diagrammās ar dažādām L-DOPA substrāta koncentrācijām [3].

Šūnu kultūras un dzīvotspējas tests

B16F10 melanomas šūnas tika iegādātas no Korea Cell Line Bank. Šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (DMEM) ar 5 procentiem liellopu augļa seruma (FBS) un 1 procentu penicilīna, streptomicīna, L-glutamīna un nātrija piruvāta. Šūnas tika uzturētas 37 grādu temperatūrā mitrinātā 95% gaisa/5% CO2 atmosfērā. Šūnu dzīvotspējas testam šūnas tika iesētas 96-iedobju plāksnēs. B16F10 melanomas šūnas tika apstrādātas ar swertiajaponīnu dažādās koncentrācijās 48 stundas. Katrai iedobei pievienoja Ez-Cytox (10 μL) un inkubēja 2 stundas. Veidotie formazāna kristāli tika mērīti ar spektrofotometriju pie 450 nm. Šūnu dzīvotspēja tika aprēķināta, izmantojot šūnas bez swertiajaponīna apstrādes kā kontroles grupu.

Melanīna saturs B16F10 šūnās

Melanīna līmenis tika mērīts, izmantojot iepriekš aprakstīto metodi ar nelielām izmaiņām [18]. B16F10 šūnām tika atļauts augt līdz 70-80 procentiem saplūšanas 6-iedobju plāksnēs. Šūnas 2 stundas iepriekš apstrādāja ar swertiajaponīnu vai kojskābi. Pēc tam MSH vai UVB tika apstrādāts ar swertiajaponīnu vai kojskābi saturošu barotni un inkubēts vēl 48 stundas. Pēc mazgāšanas ar PBS šūnas tika atdalītas, izmantojot tripsīnu un izšķīdinātas 90 μL 1 N NaOH šķīdumā, kas satur DMSO (5 procenti). Pēc inkubācijas 60 grādu temperatūrā 1 stundu melanīna saturs tika noteikts, mērot absorbciju pie 405 nm. B16F10 šūnu UVB iedarbībai tika izmantota komerciāli pieejama UV kamera (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Koreja).

Western blotēšana

Olbaltumvielu paraugi, kas izolēti no B16F10 šūnām (30 ug), tika atdalīti ar nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi, izmantojot 10-12 procentus akrilamīda gēlus, un pārnesti uz polivinilidēna fluorīda membrānām, kuras pēc tam nekavējoties ievietoja bloķējošā buferī ( 5 procenti beztauku piena) 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl un 0,1 procenti Tween 20. Membrānu 30 minūtes mazgāja TBS-Tween buferšķīdumā un pēc tam inkubēja ar specifiskām primārajām antivielām (1:1{). {24}} atšķaidījums), kas norādīts skaitļa leģendās 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc mazgāšanas ar TBS-Tween buferšķīdumu membrāna tika inkubēta ar mārrutku peroksidāzi konjugētu anti-peļu antivielu (Santa Cruz, 1:10, 000), antivielu pret trušiem (Santa Cruz, 1:10, 000), vai antivielu pret kazu (Santa Cruz, 1: 10 000) 25 grādu temperatūrā 1 stundu. Imunobloti tika vizualizēti, izmantojot Western Bright Peroxide šķīdumu (Advansta, CA, ASV) un ChemiDoc Touch attēlveidošanas sistēmu (Bio-Rad, ASV) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Šajā pētījumā izmantotās antivielas: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tirozināze (šūnu signalizācija-104976), pMITF (Abcam{{40). }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (šūnu signalizācija-921L), p38 (šūnu signalizācija-9212S), pERK (šūnu signalizācija-4370L ), ERK (šūnu signalizācija-9201L), pJNK (šūnu signalizācija-9251L), JNK (šūnu signalizācija-9252S) un -aktīns (Santakrusa{52}}) .

ROS un ONOO līmeņu mērīšana

Svertiajaponīna antioksidatīvā aktivitāte tika pārbaudīta, izmantojot fluorescējošu 2,7-dihlordihidrofluoresceīna diacetātu (DCFDA) ROS un dihidrorodamīnu (DHR) 123 ONOO-. Īsumā, lai noteiktu ROS līmeni, šūnu homogenātiem tika pievienots DCFDA (25 μM) galīgajam tilpumam 250 ul. Lai izmērītu ONOO līmeni, 10 ul šūnu homogenātu pievienoja rodamīna šķīdumam (50 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 90 mM nātrija hlorīds, 5 mM dietilēntriamīnpentaetiķskābe [DTPA] un DHR123). Abos testos fluorescence tika mērīta ik pēc 5 minūtēm 30 minūtes ar fluorescences plākšņu lasītāju, ierosmes un emisijas viļņu garumiem attiecīgi 485 un 530 nm.

Melanīna uzkrāšanās cilvēka ādas modelī

Dzīvotspējīga, atjaunota, trīsdimensiju cilvēka epiderma (Neoderm-ME, Tego Science) tika izmantota, lai pārbaudītu swertiajaponīna anti-melanogēno iedarbību cilvēka ādas modelī. Cilvēka ādas modelis tika iepriekš apstrādāts ar DMSO (nesējs) vai svertiajaponīnu 1 stundu un kultivēts uzņēmuma nodrošinātajā uzturēšanas barotnē 5 dienas ar DMSO vai swertiajaponīna apstrādi. Mikroskopiskā analīze tika veikta no 1. līdz 5. dienai, lai novērotu ādas pigmentāciju. Mikroskopiskie attēli tika analizēti ar Image J programmatūru, lai daļēji kvantitatīvi noteiktu ādas tumšumu. Fontana-Masson krāsošanai ādas paraugus nakti istabas temperatūrā fiksēja 4% paraformaldehīdā, un paraugus analizēja komerciāli pieejams uzņēmums (Garam Meditech, Dienvidkoreja).

Statistiskā analīze

Visi dati ir parādīti kā vidējais ± SEM. Dažādas grupas tika salīdzinātas, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi, kam sekoja Daneta pēctests. P < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.

INTEREŠU KONFLIKTI

Nav interešu konfliktu, kas jādeklarē.

FINANSĒJUMS

Šo darbu atbalstīja Korejas Republikas Izglītības, zinātnes un tehnoloģiju ministrijas (MEST) Korejas Austrumu medicīnas institūta Grants K17281.

ATSAUCES

1. Bradford PT. Ādas vēzis ādas krāsā. Dermatol Nurs. 2009. gads; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Ķīmiskās un instrumentālās pieejas hiperpigmentācijas ārstēšanai. Pigment Cell Res. 2003. gads; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(benzo[d]tiazol-2-ilamino)-5- (aizvietots benzilidēns) tiazol-4(5H)-ona atvasinājumi kā jauni tirozināzes inhibitori. Biol Pharm Bull. 2015. gads; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P u.c. (Z)-5-(2,4-dihidroksibenzilidēns)tiazolidīns- 2,4-dions novērš UVB izraisītu melanoģenēzi un grumbu veidošanos, nomācot oksidatīvo stresu cilvēkresursu vadības sistēmā{{7} } bezspalvas peles. Oxid Med Cell Longev. 2016. gads; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR u.c. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihidroksifenil)tiazolidīna- 4-karbonskābe novērš UV izraisītu grumbu veidošanos, kavējot NF-kappaB izraisītu iekaisumu. J Dermatol Sci. 2015. gads; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonols no Heterotheca ietver: tirozināzes inhibējošo aktivitāti un strukturālos kritērijus. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Aktīvās vietas atlikumu identificēšana, kas iesaistīti metāla kofaktora saistīšanā un stereospecifiskā substrāta atpazīšanā zīdītāju tirozināzē. Ietekme uz katalītisko ciklu. Bioķīmija. 2002. gads; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoīdi kā sēņu tirozināzes inhibitori: fluorescences dzēšanas pētījums. J Agric Food Chem. 2006. gads; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoīdu atvasinājumi kā spēcīgi tirozināzes inhibitori — neseno atklājumu aptauja starp 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014. gads; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Pētījumi par Swertia japonica sastāvdaļām. II. Jaunā flavonoīda, svertiajaponīna, izolācija un struktūra. Chem Pharm Bull (Tokija). 1967. gads; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Swertia japonica ekstrakta un tā galvenā savienojuma svertiamarīna ietekme uz kuņģa iztukšošanos un kuņģa-zarnu trakta kustīgumu pelēm. Fitoterapija. 2011. gads; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. 2-metilnafto[1,2,3-de]hinolīna-8-one inhibējošā iedarbība uz melanosomu transportēšanu un ādas pigmentāciju. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Flavonoīdu loma oksidatīvajā stresā. Curr Top Med Chem. 2001. gads; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Jaunās niedru lapas (Phragmites communis) nomāc melanoģenēzi un oksidatīvo stresu B16F10 melanomas šūnās. Biomed Pharmacother. 2017. gads; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalizācijas ceļi melanoģenēzē. Int J Mol Sci. 2016. gads; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihidromiricetīns no Ampelopsis grossedentata inhibē melanoģenēzi, samazinot MAPK, PKA un PKC signālu ceļus. Chem Biol Interact. 2016. gads; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Ganoderma formosanum micēlija ekstrakts kā ļoti spēcīgs tirozināzes inhibitors. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimulē tirozināzes gēna ekspresiju un melanoģenēzi diferencētos melanocītos. Pigment Cell Res. 2001. gads; 14: 328-36.