Laminaria Japonica Fucoidan un Cistanche Tubulosa ekstrakta sinerģiska pretiekaisuma iedarbība

Kā imūnreakcija pret svešiem antigēniem makrofāgi atbrīvo pro-iekaisuma citokīnus, piemēram, audzēja nekrozes faktoru (TNF-), interleikīnu -1 (IL- 1), IL-6 un citus. Šādi citokīni izraisa granulocītu, monocītu, limfocītu un tuklo šūnu ķīmijtaktisko pieplūdumu bojātajos audos, kas veicina antigēna noņemšanu un audu atjaunošanos. Tomēr pārmērīga šūnu infiltrācija un aktivācija pastiprina audu bojājumus, izraisot tūsku (asinsvadu eksudāciju) un sāpes, kas ir labi zināmas iekaisuma parādības.

TNF- ir svarīgs faktors slāpekļa oksīda sintāzes (iNOS) gēna ekspresijas ierosināšanai vairākās šūnu līnijās. iNOS aktivācija izraisa slāpekļa oksīda (NO) veidošanos, kas ne tikai modulē vairākas fizioloģiskas funkcijas, piemēram, baktericīdas un vazodilatācijas, bet arī izraisa iekaisumu. Pēc audu traumas, šūnu membrānas fosfolipīdu degradācija ar fosfolipāzēm rada arahidonskābi. Arahidonskābi tālāk sadala ciklooksigenāze (COX) līdz prostaglandīniem (PG). Pārmērīgs PGE2 daudzums, ko veido COX-II, izraisa vairākus citokīnus iekaisumam. Tā kā gan NO, gan PGE2 darbojas kā galvenie iekaisuma un sāpju indukcijas faktori, TNF--NO un COX-II-PGE2 ceļi ir galvenās iekaisuma procesa plūsmas, kuras kavē kortikosteroīdi un nesteroīdie līdzekļi.pretiekaisuma līdzekļi(NPL).

Pat ja ir vairāki steroīdi un NPLiekaisuma slimību terapijaŠīs zāles var nelabvēlīgi ietekmēt imūnsistēmu, kuņģa-zarnu traktu, nieres, aknas, centrālo nervu sistēmu, asinsspiedienu un sirds un asinsvadu sistēmu. Tāpēc ir nepieciešams samazināt ķīmiskās terapijas nelabvēlīgo ietekmi, tos aizstājot vai lietojot kopā ar dabīgiem produktiem.

Fukoidāns, sulfātu polisaharīdu komplekss no jūras aļģēm, piemēram, Laminaria japonica un Cladosiphon okamuranus, kas plaši izplatīts daudzās valstīs, ir izmantots kā terapeitisks līdzeklis austrumu medicīnā ilgu laiku. Iepriekšējos pētījumos ir pierādīts, ka fukoidānam piemīt antioksidants, antikoagulants, pretvēža unpretiekaisuma aktivitātes. Attiecīgi fukoidāna labvēlīgā ietekme uz iekaisuma slimībām, išēmiju, imūnsistēmas disfunkciju un audzējiem piesaista pētnieku uzmanību. No otras puses,Cistanche tubulosa(CT) ir arī plaši izmantots kā tradicionāls medikaments Ķīnā. Tika ziņots, ka CT ekstrakti samazina TNF-á un IL- 4 veidošanos, kas ir galvenie NO veidošanās faktori iekaisuma ceļos [19].

Šādi iepriekšējie atklājumi lika mums izpētīt fukoidāna un CT ekstrakta kombinēto efektivitāti 2 galvenajos iekaisuma ceļos. Lai noskaidrotu darbības mehānismu, mēs analizējām NO un PGE2 eksudātos no karagināna izraisīta gaisa maisiņa iekaisuma.

NATURAL CISTANCHE TUBULOSA NOVĒRŠANAIIEKAISUMA DARBĪBASPHGS75% ECH 30% ACT 12%

Materiāli un metodes

Materiāli

Daļēji attīrīts fukoidāns un CT ūdens ekstrakts tika iegūts no Misuba RTech Co., Ltd. (Asana, Koreja). Fukoidāns un CT ekstrakts tika turēti 4 grādu temperatūrā, pirms lietošanas tika sajaukti (1:3), izšķīdināti attīrītā ūdenī un ievadīti iekšķīgi 5 ml/kg tilpumā.

Šūnu kultūra un NO kvantitatīva noteikšana

Peļu makrofāgu RAW 264.7 šūnu līnija tika iegādāta no American Type Culture Collection (Manasasa, ASV) un kultivēta Dulbecco modificētajā Eagle barotnē (Sigma, Sentluisa, ASV), kas satur 10% liellopu augļa seruma un antibiotikas [100 V/mL. penicilīns (Sigma) un 100 µg/ml streptomicīns (Sigma)]. Šūnas tika inkubētas mitrinātā 5% CO2 atmosfērā 37 grādu temperatūrā.

Lai novērtētu fukoidāna un CT ekstrakta ietekmi uz NO sekrēciju, RAW 264.7 šūnas (1×106 šūnas/ml) inkubēja ar fukoidānu vai CT ekstraktu (1–320 µg/ml) 5 minūtes. , kam seko interferons- (IFN-, 10 U/mL) un lipopolisaharīds (LPS, 10 µg/ml) 24 stundas. Mūsu provizoriskajos pētījumos tika apstiprināts, ka apstrāde ar IFN-plus LPS RAW 264.7 šūnu aktivizēšanai neietekmēja šūnu dzīvotspēju līdz 24 stundām un ka fukoidāns un CT ekstrakts nebija citotoksiski līdz 1 mg/ml. Kā NO indikators tika mērīta NO oksidētā produkta nitrīta (NO2 – ) koncentrācija. Kultivēšanas barotne tika sajaukta ar vienādu tilpumu Griess reaģenta (1% sulfanilamīds, 0,1% naftiletilēndiamīns 2,5% fosforskābē) [21] un inkubēts istabas temperatūrā 10 minūtes. Nitrītu koncentrācija tika analizēta pie 540 nm, kur standarta līknes izveidošanai tika izmantots NaNO2.

Dzīvnieki un ārstēšana

ICR peļu tēviņi (7 nedēļas veci) tika iegādāti no Daehan Biolink (Eumseong, Koreja) un tika izmitināti telpā ar nemainīgiem vides apstākļiem (22±2ºC; 40-70% relatīvais mitrums; 12-stundu gaisma). -tumšs cikls; 150-300 luksa spilgtums). Granulu barība un attīrīts ūdens bija pieejami ad libitum. Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Korejas Čungbukas Nacionālās universitātes (CBNU) Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (IACUC), un tie tika veikti saskaņā ar CBNU laboratorijas dzīvnieku pētniecības centra standarta darbības procedūrām (SOP).

Peles (n=8/grupa) iekšķīgi ārstēja ar fukoidānu (18 vai 54 mg/kg), CT ekstraktu (54 vai 162 mg/kg) vai to maisījumu (18+54, {{6). }} vai 90+270 mg/kg) vienu reizi dienā 7 dienas. Zemas fukoidāna (18 mg/kg) un CT ekstrakta (54 mg/kg) devas tika iegūtas no aprēķinātajām devām cilvēkam 100 mg/ķermenim (70 kg) un 300 mg/ķermenim pēc ķermeņa masas virsmas laukuma pārrēķināšanas (Km{14). }} cilvēkam/km=3 pelei). Lielas fukoidāna un CT ekstrakta devas tika iestatītas 3 reizēs atsevišķi vai maisījumā, un lielākās devas maisījums tika fiksēts 5 reizēs, lai novērtētu maksimālo sinerģisko efektu.

Pirmajā fukoidāna un CT ekstrakta apstrādes dienā pelēm aizmugurējā pusē subkutāni injicēja 10 ml sterila gaisa, lai izveidotu maisiņu [22, 23]. Pēc 2 un 5 dienām maisiņš tika atkārtoti ievadīts ar 5 ml gaisa. Vienu stundu pēc pēdējās apstrādes maisiņā tika ievadīts 1 ml karagināna (1% sāls šķīdumā; Sigma) vai tā nesējs (fizioloģiskais šķīdums).

Eksudātu analīzes

Gaisa maisiņš tika mazgāts ar 1 ml auksta fizioloģiskā šķīduma 6 stundas pēc karagināna injekcijas, un tika reģistrēts skalošanas šķidruma neto tilpums. Kopējais iekaisuma šūnu, neitrofilu, monocītu un limfocītu skaits tika noteikts, izmantojot coulter skaitītāju. NO un PGE2 koncentrācijas tika noteiktas ar Griesa reaģentu (Sigma) un enzīmu imūntestu (EIA), izmantojot attiecīgi Correlate-EIA komplektu (Assay Designs, Ann Arbor, Ann ArboUSA).

NATURAL CISTANCH TUBULOSA, lai bloķētu darbību UZ IEKAISUMA ŠŪNU HEMOTAKSI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Histopatoloģiskā izmeklēšana

Maisiņu pārklājuma audi tika noņemti un fiksēti neitrālā formalīna šķīdumā. Parafīnā iestrādātie audu priekšmetstikliņi tika iekrāsoti ar hematoksilīna-eozīnu un tika pārbaudīti gaismas mikroskopā, lai noteiktu iekaisuma bojājumus.

Statistiskā analīze

Rezultāti ir parādīti kā vidēji ± SE. Eksperimentālo grupu salīdzinājumi tika veikti ar vienvirziena dispersijas analīzi, kam sekoja Tukey testa korekcija. AP vērtība<0.05 was considered statistically significant.

Rezultāti

In vitro RAW 264.7 šūnu kultūra, IFN- un LPS apstrāde ievērojami palielināja NO veidošanos (1. attēls). Iepriekšēja apstrāde ar fukoidānu (1–320 µg/ml) neietekmēja NO izdalīšanos no makrofāgu šūnu līnijas (1.A attēls). Salīdzinājumam, CT ekstrakts (32–320 µg/mL) ievērojami nomāca NO veidošanos, kas liecina par pretiekaisuma aktivitāti (1.B attēls).

Karagināna ievadīšana peles gaisa maisiņā ievērojami palielināja eksudāta tilpumu maisiņā (2. attēls). Šādu palielinātu eksudāciju mazināja apstrāde ar fukoidānu (18 mg/kg) un CT ekstraktu (54 un 162 mg/kg). Proti, fukoidāna un CT ekstrakta kombinētā apstrāde vēl vairāk samazināja eksudātu daudzumu, salīdzinot ar individuālo iedarbību, lai gan lielākas devas kombinācijas (54+162 mg/kg un 90+270 mg/kg) neuzrādīja papildu efektivitāti. līdz mazākajai devas kombinācijai (18+54 mg/kg) (2.A attēls). N pakāpes saturs maisiņā arī krasi palielinājās pēc karagināna injekcijas (2.B attēls). Salīdzinot ar vieglo fukoidāna iedarbību, CT ekstrakts ievērojami pazemināja N pakāpes oncentrāciju. Fukoidāna un CT ekstrakta kombinācija vēl vairāk samazināja NO līmeni atkarībā no devas. Līdzīgi palielināto PGE2 saturu sinerģiski nomāca fukoidāna un CT ekstrakta kombinētā terapija (2.C attēls).

Paralēli iekaisuma mediatoriem maisiņā ar karagināna injekciju krasi palielinājās iekaisuma šūnu skaits: neitrofilu, monocītu un limfocītu kontroles līmeņa attiecīgi 37,8, 4,8 un 24,1 reizes (1. tabula). Tomēr fukoidāns un CT ekstrakts ievērojami samazināja iekaisuma šūnu infiltrāciju, kurā fukoidāns bija nedaudz pārāks par CT ekstraktu. Negaidīti sinerģisks efekts iekaisuma šūnu infiltrācijā netika sasniegts, vienlaikus lietojot fukoidānu un CT ekstraktu.

Kā secināts no iekaisuma šūnu infiltrācijas eksudātos, zemādas audos, kas ieskauj gaisa maisiņus, bija smagi iekaisuma bojājumi (3. attēls). Tika novērots ārkārtīgi daudz šūnu sabiezētajos zemādas audos, kas pakļauti karagināna iedarbībai (3.B attēls), salīdzinot ar gandrīz normālām pazīmēm kontroles dzīvniekiem (3.A attēls). Šādi iekaisuma bojājumi tika ievērojami vājināti, apstrādājot ar fukoidānu (3.C un 3D attēls) vai CT ekstraktu (3.E un 3F attēls).

Konkrēti, augstāku pretiekaisuma iedarbību ieguva kombinētā terapijā ar fukoidānu un CT ekstraktu (3G-3I attēls).

Diskusija

Izmantojot in viv pakāpes arrageenāna izraisītu gaisa maisiņu iekaisuma modeli, gaisa ievadīšana grauzēju mugurās izraisa šūnu proliferāciju, kas noslāņojas uz dobuma virsmas, veidojot sinovijai līdzīgu struktūru. Šajā modelī karagināna izraisītas iekaisuma šūnu infiltrācijas injekcija palielināja eksudātu, kas liecina par asinsvadu noplūdi. Gaisa maisiņš kalpo kā iekaisuma šūnu un mediatoru rezervuārs, ko var viegli izmērīt šķidrumā, kas uzkrājas lokāli.

Starp dažādiem iekaisuma mediatoriem, kas var izraisīt asinsvadu caurlaidību, ir labi zināms, ka NO un PGE2 ir galvenie faktori, kas iesaistīti daudzu iekaisuma slimību patoģenēzē. Tie ir pazīstami arī kā sāpju indukcijas un uztveres mediatori. iNOS, kas tiek ekspresēts un aktivizēts dažādos šūnu tipos, stimulējot ar TNF- un/vai LPS iekaisuma laikā, rada augstu, noturīgu NO koncentrāciju. NO ir svarīga regulējoša molekula dažādās fizioloģiskās funkcijās, piemēram, vazodilatācijā, kas izraisa asinsvadu noplūdi. PGE2, kas tiek ģenerēts no arahidonskābes, izmantojot COX, veicina daudzu iekaisuma slimību attīstību, un PGE2 pārprodukcija, reaģējot uz dažādām iekaisuma stimulācijām, ir saistīta ar COX-II līmeņa regulēšanu un iekaisuma progresēšanu. Tāpēc TNF- - NO un COX-II-PGE2 ceļi tika uzskatīti par divām galvenajām iekaisuma procesu plūsmām, kuras attiecīgi bloķē iNOS (kortikosteroīdu) un COX (NPL) inhibitori.

DABĪGA CISTANCHE TUBULOSA IEKAISUMU SLIMĪBU AIZLIEGŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Šajā pētījumā fukoidāna un CT ekstrakta vienlaicīga lietošana samazināja eksudāta tilpumu maisiņā, kas liecina, ka tiem piemīt nomācoša darbība pret asinsvadu noplūdi (2.A attēls). Salīdzinot ar katra fukoidāna un CT ekstrakta individuālo iedarbību, kombinētā ārstēšana vēl vairāk palielinājās, kas nozīmē, ka divu grādu ampounds darbojas sinerģiski. Šādu sinerģisko efektu starp fukoidānu un CT ekstraktu atbalstīja to aktivitātes NO un PGE2 līmeņos eksudātos (3.B un 2.C attēls).

Interesanti, ka tomēr tika apstiprināts, ka fukoidāns tieši neinhibē makrofāgu aktivāciju in vitro testā (1.A attēls). Tāpat fukoidāna inhibējošais potenciāls NO un PGE2 uzkrāšanās in vivo testā bija salīdzinoši zemāks nekā CT ekstraktam (2.B un 2.C attēls). Šāds fukoidāna darbības mehānisms atšķiras no tiešas šūnu inaktivācijas ar CT ekstraktu (1.B attēls). Salīdzinājumam, fukoidānam bija augsta efektivitāte iekaisuma šūnu infiltrācijas kavēšanā maisiņos (1. Fukoidāns bija pārāks par CT ekstraktu, bloķējot neitrofilu, monocītu un limfocītu migrāciju uz karagināna izraisītām audu bojājumu vietām. Interesanti, ka nebija sinerģiska pretmigrācijas efekta, kas liecinātu par dažādiem darbības mehānismiem starp fukoidānu un CT ekstraktu: ti, fukoidāns bloķē iekaisuma šūnu infiltrāciju, bet CT ekstrakts kavē šūnu aktivāciju.

Polimorfonukleārās šūnas, īpaši neitrofīli, ir galvenie šūnu komponenti, kas tiek piesaistīti akūtām iekaisuma vietām, ko izraisa karagināns. Turklāt sekojošajām iekaisuma šūnām, piemēram, makrofāgiem un limfocītiem, arī ir galvenā loma iekaisuma procesā, izdalot citokīnus. Iepriekš apstrādājot ar fukoidānu vai CT ekstraktu, balto asins šūnu skaits, kas migrēja ar karaginānu ievadītajos gaisa maisiņos, tika ievērojami samazināts. Šis rezultāts atbilda efektam, ko iegūtu kortikosteroīdi, piemēram, deksametazons, bet ne NPL, tostarp indometacīns. Tāpēc tiek pieņemts, ka fukoidānam un CT ekstraktam daļēji ir steroīdu īpašība.

Papildus bloķējošajai iedarbībai uz iekaisuma šūnu ķemotaksi, CT ekstrakts, šķiet, nomāc makrofāgu aktivāciju. To apstiprināja tā inhibējošā iedarbība uz NO in vitro un in vivo, kas ir galvenais iekaisuma mediators, ko ražo makrofāgi. Tādējādi CT ekstrakta ietekme uz makrofāgiem var būt saistīta ar mRNS ekspresijas nomākšanu un / vai tiešu iNOS aktivitātes kavēšanu šajās šūnās.

PGE2 ir arī viens no galvenajiem iekaisuma mediatoriem. Tas palielinās paralēli audu tūskai, ko nomāc NPL, COX inhibitori. Karagināns var palielināt PGE2 ražošanu, inducējot COX-II mRNS un COX-II proteīnu maisiņa eksudātā. Šajā modelī karagināns ievērojami palielināja PGE2 daudzumu, un to būtiski nomāca CT ekstrakts. Interesanti atzīmēt, ka šis rezultāts atbilda efektam, ko iegūtu NPL indometacīns. Tāpēc no rezultātiem var secināt, ka CT ekstraktam piemīt NPL papildu īpašības. Kopumā tiek uzskatīts, ka CT ekstraktam bija gan kortikosteroīdiem, gan NPL līdzīga iedarbība karagināna izraisītā iekaisuma modelī un ka fukoidāns uzlabojaCT ekstrakta pretiekaisuma iedarbībabloķējot iekaisuma šūnu infiltrāciju.

Lai gan precīza darbības mehānisma noteikšanai ir nepieciešama turpmāka izpēte, fukoidāna un CT ekstrakta maisījums ievērojami mazināja iekaisuma pazīmes, bloķējot TNF-NO un COX-II-PGE2 ceļus karagināna izraisītā gaisa maisiņa iekaisumā. Šie atklājumi liecina, ka kombinēta fukoidāna un CT ekstrakta ārstēšana varētu būt daudzsološs kandidāts dažādu veidu iekaisuma mazināšanai, kas reaģē uz kortikosteroīdiem vai NPL.

DABĪGA CISTANCHE TUBULOSA IEKAISUMU SLIMĪBU AIZLIEGŠANAI PHGS75% ECH 30% ACT 12%