Mērķtiecība pret progresējošu prostatas vēzi, izmantojot STEAP1 himērisko antigēnu receptoru T šūnu un audzēja lokalizētu IL-12 imūnterapiju
Sep 18, 2023
Seši priekšdziedzera 1 transmembrānas epitēlija antigēni (STEAP1) ir šūnu virsmas antigēns terapeitiskai mērķēšanai prostatas vēža gadījumā. Šeit mēs ziņojam par STEAP1 plašo ekspresiju attiecībā pret prostatas specifisko membrānas antigēnu (PSMA) letālā metastātiskā prostatas vēža gadījumā un STEAP{4}}virzītas himēru antigēnu receptoru (CAR) T-šūnu terapijas attīstību. STEAP1 CAR T šūnas demonstrē reaktivitāti ar zemu antigēnu blīvumu, pretvēža aktivitāti metastātiska prostatas vēža modeļos un drošību cilvēka STEAP1 piespiedu peles modelī. STEAP1 antigēna aizbēgšana ir atkārtots ārstēšanas rezistences mehānisms, un tas ir saistīts ar samazinātu audzēja antigēna apstrādi un prezentāciju. Audzēja lokalizētas interleikīna-12 (IL-12) terapijas pielietošana kolagēnu saistošā domēna (CBD)-IL-12 saplūšanas proteīna veidā kombinācijā ar STEAP1 CAR T šūnu terapiju uzlabo pretvēža efektivitāti, pārveidojot imunoloģiski auksto prostatas vēža audzēja mikrovidi un apkarojot STEAP1 antigēna izkļūšanu, iesaistoties saimnieka imunitātei un epitopu izplatībai.
Ķīniešu herb cistanche augs-Pretaudzēju
Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80% mCRPC ar kaulu vai limfmezglu iesaistīšanos19, 62% no Ewing sarkomas20 un vairākiem citiem vēža veidiem21. STEAP1 pieder STEAP Metallo reduktāžu saimei, kas var veidot homotrimerus vai heterotrimerus ar citiem STEAP proteīniem22. STEAP1 ir noteikta funkcionāla loma vēža šūnu proliferācijas, invāzijas un epitēlija pārejas uz mezenhimālu veicināšanā –26.
Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības
Turklāt STEAP1 demonstrē ierobežotu ekspresiju normālos audos27, kas padara to par ļoti pārliecinošu mērķi vēža terapijai. Ir izstrādāti vairāki imūnterapijas līdzekļi, lai mērķētu uz STEAP1, taču neviens no tiem nav klīniski apstiprināts. MCRPC I fāzes klīniskajā pētījumā tika konstatēts, ka ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S), kas sastāv no humanizētas anti-STEAP1 IgG1 antivielas, kas saistīta ar monometilauristatīnu E, ir pieņemams drošības profils, taču tika novērotas dažas objektīvas audzēja atbildes reakcijas28. Pašlaik tiek novērtēts T-BsAb, kas ietver divus anti-STEAP1 fragmentu-antigēnu saistošos (Fab) domēnus, anti-CD3 vienas ķēdes mainīgo fragmentu (scFv) un fragmentu kristalizējamo (Fc) domēnu, kas izstrādāts tā, lai tam nebūtu efektora funkcijas, ko sauc par AMG 509. I fāzes klīniskajā pētījumā (NCT04221542) mCRPC29. Nesen tika ziņots, ka asimetrisks divvērtīgs T-BsAb, ko sauc par BC261, demonstrē spēcīgu pretvēža aktivitāti vairākos preklīniskajos prostatas vēža un Ewing sarkomas modeļos30. Turklāt ir pierādīts, ka cilvēka leikocītu antigēna (HLA) I klases ierobežotais T šūnu receptors (TCR), kas ir specifisks STEAP1 peptīdam, inhibē lokālu un metastātisku Ewing sarkomas augšanu preklīniskajā ksenotransplantāta modelī pēc transgēno T šūnu pārnešanas31. Šajā pētījumā mēs veicam STEAP1 un PSMA relatīvās ekspresijas salīdzinošu analīzi letālā mCRPC, lai izpētītu STEAP1 mērķauditorijas atlases lietderību pašreizējā PSMA teranostikas laikmetā. Mēs izstrādājam un pārbaudām otrās paaudzes STEAP1 CAR antigēnu specifiskai T-šūnu aktivācijai un mērķa šūnu citolīzei, lai iegūtu galveno kandidātu turpmākai raksturošanai. Mēs nosakām STEAP1 CAR T šūnu funkcionālo epitopu specifiku un profilējam STEAP1 CAR T šūnu produktu paplašināšanos un imūnfenotipu no vairākiem donoriem. Pēc tam mēs nosakām STEAP1 CAR T šūnu terapijas potenciālu un sākotnējo drošību attiecīgajos prostatas vēža preklīniskajos modeļos, bet novērojam atkārtotu STEAP1 antigēna ekspresijas zudumu kā ārstēšanas rezistences mehānismu. Lai atrisinātu šo problēmu, mēs novērtējam vienlaicīgu CBD-IL-12 ievadīšanu, kas pārveido prostatas vēža imūnsupresīvo audzēju mikrovidi un iesaista endogēno imunitāti, lai paplašinātu pretvēža reakcijas. Kopumā šie pētījumi sniedz spēcīgu pamatojumu STEAP1 CAR T šūnu terapijas klīniskajai tulkošanai vīriešiem ar mCRPC un virza stratēģijas, lai pārvarētu iespējamos terapeitiskās rezistences mehānismus.
Cistanche tubulosa-Antitumor priekšrocības
Rezultāti
STEAP1 plaši izpaužas ārstēšanai rezistentos mCRPC audos
We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) krāsojums bija 22-reizes (95% TI 6-173) augstāks STEAP1 nekā PSMA gadījumā, un H rezultāta izredzes ir lielākas vai vienādas ar 3{{ 27}} ir 84-reizes (95% TI 30-317) augstāki STEAP1 nekā PSMA. Vidējais STEAP1 H rādītājs kaulos (193; 95% TI 171 līdz 215) bija ievērojami augstāks nekā limfmezglu metastāzēm (atšķirība -48; 95% TI -21 līdz -76; p < 0,001) un ievērojami augstāka nekā viscerālās metastāzēs (starpība –59; 95% TI –42 līdz –77; p < 0,001). Nebija būtiskas atšķirības starp vidējo STEAP1 H rezultātu limfmezglu metastāzēs, salīdzinot ar metastāzēm viscerālos gadījumos (atšķirība 11; 95% TI –16 līdz 39; p=0.4) (papildu 1.c attēls). Mēs arī novērojām vairākus gadījumus ar neviendabīgu PSMA ekspresiju serdeņos (1.d attēls), kas atbilst nesenajam ziņojumam par intratumorālo PSMA neviendabīgumu mCRPC biopsijās14. Pacienta līmeņa analīze, izmantojot vidējo H punkta slieksni, kas ir lielāks par vai vienāds ar 30, un Maknemāra tests atklāja, ka 95% novērtējamo pacientu (42 no 44) bija audzēji ar STEAP1 ekspresiju, bet 68% (30 no 44) bija pozitīvi attiecībā uz PSMA. (Papildu 1.d attēls). Lai izpētītu ar STEAP1 un PSMA ekspresiju saistītās starppacientu un pacientu neviendabības modeļus, mēs izmantojām STEAP1 un PSMA H rādītājus, lai novērtētu hiperģeometriskos, Simpsona un Šenonas daudzveidības rādītājus. Mēs novērojām divus STEAP1 ekspresijas modeļus (1.e attēls) ar 68% (30/44) pacientu ar STEAP1 ekspresiju visās metastātiskajās vietās (augsts STEAP1) un 32% (14/44) pacientu, kuriem bija metastātiskas vietas ar un bez STEAP1 ekspresijas. (heterogēns STEAP1). Netika identificēts neviens pacients, kuram visiem metastātiskajiem audiem nebūtu STEAP1 ekspresijas. Līdzīga PSMA ekspresijas analīze tajā pašā kohortā atklāja 45% (20/44) pacientu ar augstu PSMA ekspresiju, 32% (14/44) ar neviendabīgu PSMA ekspresiju un 23% (10/44) bez PSMA ekspresijas. Pamatojoties uz mCRPC audu molekulāro apakšklasifikāciju, izmantojot AR un neiroendokrīno marķieru sinaptofizīna (SYP) ekspresiju, ko novērtēja IHC, lielākajai daļai pacientu ar augstu vai neviendabīgu STEAP1 un PSMA ekspresiju bija AR pozitīvs prostatas vēzis (AR+/SYP- vai AR+/SYP+), savukārt tiem. bez PSMA ekspresijas bija AR-nulle prostatas vēzis (AR-/SYP+ vai AR-/SYP-). Mēs noteicām pozitīvu korelāciju starp STEAP1 un AR ekspresiju (p < 0,001) ar pielāgotu lineāru jauktu modeli ar nejaušu efektu gadījumos, kas attēloti audu mikromasīvā (papildu 2.a, b attēls), kas bija sagaidāms, ņemot vērā, ka STEAP1 ir androgēns. -regulēts gēns33,34. Turpretim starp STEAP1 un SYP ekspresiju tika novērtēta negatīva tendence (papildu 2.c attēls). Šie atklājumi liecina, ka, tāpat kā PSMA35, STEAP1 ekspresija var tikt zaudēta ar prostatas vēža neiroendokrīno transdiferenciāciju.
Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, tumši pelēks). Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
Develspēcīga, antigēnam specifiska STEAP1 CAR
Ņemot vērā STEAP1 plašo izpausmi vēlīnās stadijas mCRPC un tā ziņoto funkcionālo lomu vēža progresēšanā27, 36, 37, mēs pēc tam sākām izstrādāt lentivīrusu STEAP{5}} specifisku otrās paaudzes CAR. Mēs izmantojām pCCL-c-MNDU3-X lentivīrusu mugurkaulu38, kas ir plaši izmantots hematopoētisko cilmes šūnu gēnu terapijā39, un tika pierādīts, ka CAR ekspresija T šūnās, ko virza iekšējais MNDU3 promotors, ir augstāka nekā tā, kas sasniegta ar EFS veicinātājs40. Priekšroka tika dota 4-1BB kostimulējošajam domēnam, jo tas ir saistīts ar T šūnu atmiņas veidošanos un ilgstošu noturību41, un tika ieviests CD28 transmembrānas domēns, jo ir pierādīts, ka tas samazina antigēna slieksni otrās paaudzes 4-1BB. CAR T šūnu aktivizēšana42. Mēs iekļāvām pilnībā humanizēto scFv, kas iegūts no vandora tuzumaba vedotīna, ADC, kas vērsts uz STEAP1 un kura attīstība tika pārtraukta pēc I fāzes klīniskā pētījuma28. Šis scFv ir humanizēts peles monoklonālās antivielas (mAb 120.545) variants, ko sākotnēji izstrādāja Agensys, Inc. un kas demonstrē 1 nM afinitāti šūnu saistīšanās testos43. Lai potenciāli pielāgotu CAR darbību, mēs ieviesām trīs dažādus eņģes / starplikas garumus, tostarp īsu (IgG4 vira), vidēju (IgG4 viru-CH3) un garu (IgG4 viru-CH2- CH3). Garais starplikas tika izstrādāts ar iepriekš aprakstītajām 4/2- NQ mutācijām44 CH2 domēnā, lai novērstu Fc-gamma receptoru saistīšanos un aktivācijas izraisītu šūnu nāvi, kas notiek, pārņemot garās starplikas CAR T šūnas uz imūndeficīta pelēm. Trīs CAR kandidāti tika klonēti lentivīrusu vektorā (2.a attēls), kas kā transdukcijas marķieris arī koekspresē saīsinātu epidermas augšanas faktora receptoru (EGFRt). Lentivīrusi tika radīti un izmantoti, lai transducētu cilvēka CD4 un CD8 T šūnas, kas bagātinātas no cilvēka donora perifēro asiņu mononukleārajām šūnām (PBMC), kas savāktas no ferēzes. Paplašinātajām CD4 un CD8 CAR T šūnām tika noteikts imūnfenotips (papildu attēls 3a) un atjaunotas noteikta sastāva šūnu produktos ar normālu CD4 / CD8 attiecību, lai novērtētu to funkcionālās aktivitātes. Lai kontrolētu STEAP1 ekspresiju izogēnā veidā, mēs koncentrējāmies uz 22Rv1 cilvēka prostatas vēža šūnu līniju, kas demonstrē STEAP1 dabisko ekspresiju, un veicām STEAP1 nokautu (ko), rediģējot CRISPR / Cas9 genomu. Pēc tam mēs izveidojām STEAP1 glābšanas līniju no 22Rv1 STEAP1 ko, transdukējot ar STEAP1 ekspresējošu lentivirus (2.b attēls). Pēc tam šīs līnijas tika izmantotas, lai pārbaudītu trīs īsas, vidējas un garas starplikas STEAP1 CAR T šūnas kopkultūras testos ar gamma interferona (IFN-) izdalīšanās nolasījumu kā T šūnu aktivācijas indikatoru. Tikai garās starplikas STEAP1 CAR T šūnas (turpmāk sauktas par STEAP1-BBζ CAR T šūnām) uzrādīja paredzamo antigēnam specifisko IFN izdalīšanās modeli, savukārt īsās un vidējas starplikas STEAP1 CAR T šūnas ne (2.c attēls). , Papildu attēls 3b, c). Turklāt STEAP1-BBζ CAR T šūnas uzrādīja būtisku no devas atkarīgu 22Rv1 šūnu citolīzi salīdzinājumā ar netransducētajām T šūnām (2.d attēls) un demonstrēja relatīvu 22Rv1 STEAP1 ko šūnu taupīšanu (2.e attēls). Pēc tam līdzīgi pētījumi tika veikti ar cilvēka prostatas vēža šūnu līniju DU145, kurai trūkst dabiskās STEAP1 ekspresijas, bet kas tika izstrādāta, lai izteiktu STEAP1 (DU145 STEAP1) ar lentivīrusu transdukciju (papildu attēls 4a). Šajā iestatījumā STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivācija tika novērota tikai kopkultūrās ar DU145 STEAP1 šūnām, nevis vecāku DU145 šūnām (papildu 4.b attēls). Citolītiskā aktivitāte tika novērtēta tikai ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām, nevis netransducētām T šūnām kopkultūrās ar DU145 STEAP1 šūnām (papildu attēls 4c). Pēc tam mēs analizējām lielāku cilvēka prostatas vēža šūnu līniju paneli, lai raksturotu to dabisko STEAP1 ekspresiju ar imūnblota analīzi. Šūnu līnijām ar zināmu AR ekspresiju/aktivitāti (LNCaP, 22Rv1, VCaP un LNCaP95) bija dažādi STEAP1 ekspresijas līmeņi, savukārt AR nulles šūnu līnijas (PC3, DU145, MSKCC EF1 un NCI-H660) neizpauda. nosakāmi STEAP1 līmeņi (2.f att.). Mēs turpinājām veikt STEAP{113}}BBζ CAR T kopkultūras ar šīm līnijām, lai vēl vairāk apstiprinātu to antigēnu specifisko aktivāciju, pamatojoties uz IFN izdalīšanos (2. g. att.). Tomēr mēs novērojām pretrunīgu konstatējumu, ka PC3 līnija, kas neuzrādīja acīmredzamu STEAP1 proteīna ekspresiju (2.f attēls), izraisīja būtisku STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivāciju. Iepriekšējā literatūrā tika ierosināts, ka STEAP1 tiek ekspresēts PC3 šūnu līnijā zemā līmenī45. Patiešām, ilgstoša imūnblota iedarbība atklāja joslu, kas liecina par ļoti zemu STEAP1 ekspresiju (2. att.). Lai apstiprinātu, vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivizēšanu izraisīja šī nelielā STEAP1 ekspresija PC3 šūnās, mēs izveidojām trīs PC3 STEAP1 ko apakšlīnijas (2.h att.) un vēlreiz veicām kopkultūras ar STEAP{133} }BBζ CAR T šūnas. STEAP1ko PC3 līnijā izraisīja STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivācijas atcelšanu (2.i att.), tālāk apstiprinot specifiskumu un sniedzot pierādījumus par STEAP1-BBζ CAR T šūnu jutīgumu pret zemu. antigēna blīvuma apstākļi.
STEAP1-BBζ CAR krusteniskās reakcijas trūkums ar peli Steap1 un cilvēka STEAP1B
cistanche papildinājuma priekšrocības - paaugstina imunitāti
Saskaņā ar vandora tuzumaba vedotīna specifiskumu pret cilvēkiem, STEAP1-BBζ CAR T šūnas neuzrādīja krustenisku reaktivitāti ar peles Steap1 (papildu 4.a, d, e attēls). Tomēr mēs to izmantojām kā iespēju, lai individuāli atjaunotu trīs cilvēka STEAP1 ekstracelulāros domēnus (ECD) uz peles Steap1 (papildu 4.f attēls), lai noteiktu, kuri ECD ir būtiski STEAP1-BBζ CAR T šūnu epitopu atpazīšanai. Kopkultūras eksperimenti tika veikti ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām un DU145 šūnām, kas izstrādātas, lai ekspresētu peles Steap1, atsevišķi aizstājot peles ECD ar cilvēka ECD. Mēs atklājām, ka cilvēka STEAP1 ECD2, bet ne ECD1 vai ECD3, bija saistīts ar STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivāciju (papildu 4. g. att.). Interesanti, ka cilvēka STEAP1 un peles Steap1 ECD2 uzrādīja 93,9% (31/33 aminoskābes) homoloģiju (papildu attēls 4.h), norādot, ka cilvēka STEAP1 Q198 un/vai I209 ir ļoti svarīgi STEAP1-BBζ produktīvai atpazīšanai. CAR T šūnas. Ir pierādīts, ka Q198 mijiedarbojas ar Fab 120.545 kā daļa no mijiedarbības karstā punkta, pamatojoties uz neseno struktūru, kas atrisināta ar kriogēno elektronu mikroskopiju22. No cilvēka STEAP proteīnu saimes STEAP1B ir vislielākā homoloģija ar STEAP145. Ir identificēti trīs STEAP1B transkripti, no kuriem visi parāda pilnīgu cilvēka STEAP1 ECD2 aminoskābju secības saglabāšanos (papildu 5.a attēls). Konsensa membrānas topoloģijas prognozēšanas algoritms TOPCONS46 paredzēja, ka ECD2 domēna sekvences ir ārpusšūnu sekvences trijās STEAP1B proteīna izoformās (papildu 5.b attēls), lai gan ar zemu STEAP1B uzticamības rādītājiem salīdzinājumā ar hSTEAP1, jo starp pieciem topoloģijas modeļiem nebija vienprātības. (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI un SPOCTOPUS), ko izmanto TOPCONS (papildu 5.c attēls). Iepriekšēja analīze, izmantojot citu in silico slēptu Markova modeli balstītu topoloģijas prognozēšanas rīku TMHMM47, arī liecināja, ka šī secība varētu būt intracelulāra, nevis ārpusšūnu STEAP1B proteīna izoformās 1 un 245. Tomēr STEAP1B kristāliskā struktūra vēl nav noteikta, lai to tieši pamatotu. šīs prognozes. Lai funkcionāli novērtētu, vai STEAP1- BBζ CAR T šūnas varētu būt reaktīvas arī pret STEAP1B, mēs veicām kopkultūras, izmantojot DU145 līnijas, kas izstrādātas, lai ekspresētu katru no trim STEAP1B izoformām. Mēs nekonstatējām STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivācijas pierādījumus (papildu 5.d att.), kas liecina, ka STEAP1-BBζ CAR T šūnu atpazītais STEAP1 epitops, iespējams, netiek attēlots kā daļa no ektodomēna. ar STEAP1B, neskatoties uz šķietamo secību homoloģiju.
2. att.|Otrās paaudzes 4-1BB himērisko antigēnu receptoru (CAR) skrīnings, lai identificētu STEAP1 CAR T šūnu terapijas potenciālu. lentivīrusa STEAP1 CAR konstrukcijas un variācijas shēma, kuras pamatā ir īsi, vidēji un gari starplikas. LTR garš terminālais atkārtojums, MNDU3 Moloney peles leikēmijas vīrusa U3 reģions, scFv vienas ķēdes mainīgais fragments, VL mainīgā vieglā ķēde, VH mainīgā smagā ķēde, tm transmembrāna, EGFRt saīsināts epidermas augšanas faktora receptors, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} CH2 domēna mutācijas, lai novērstu saistīšanos ar Fc-gamma receptoriem. b STEAP1 imūnbloti 22Rv1 vecāku šūnās, STEAP1 knockout (ko) šūnās un STEAP1 ko šūnās ar STEAP1 glābšanu. c IFN-enzīmu saistītā imūnsorbcijas pārbaude (ELISA) iegūta no netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu kopkultūras ar katru no 22Rv1 apakšlīnijām attiecībā 1:1 24 stundās (p < 0.001). (d) 22Rv1 un (e) 22Rv1 STEAP1 ko mērķa šūnu relatīvā šūnu dzīvotspēja laika gaitā, ko mēra ar dzīvu šūnu fluorescences attēlveidošanu pēc kopkultūras ar (pa kreisi) STEAP1-BBζ CAR T šūnām (p < 0,001) vai ( pa labi) netransducētās T šūnas ar mainīgu efektora un mērķa (E: T) šūnu attiecību. f Imunobloti, kas parāda STEAP1 ekspresiju androgēnu receptoru (AR) pozitīvās cilvēka prostatas vēža šūnu līnijās, bet ne AR negatīvās prostatas vēža šūnu līnijās. g IFN kvantitatīvā noteikšana ar ELISA metodi no netransducētu T šūnu vai STEAP1- BBζ CAR T šūnu kopkultūrām ar katru cilvēka prostatas vēža šūnu līniju f) apakšpunktā attiecībā 1:1 24 stundās. h STEAP1 imūnbloti 22Rv1, PC3 un PC3 STEAP1 ko apakšlīnijās. I IFN kvantitatīva noteikšana ar ELISA metodi no netransducētu T šūnu vai STEAP1- BBζ CAR T šūnu kopkultūrām ar katru šūnu līniju (h) ar attiecību 1:1 24 stundās (p < 0,001). Paneļiem (c–e, g un i) tika izmantoti n=4 bioloģiskie atkārtojumi katram stāvoklim, un kļūdu joslas attēlo vidējo ar SEM. Panelis (b, f, h) parāda rezultātus, kas reprezentē n=3 bioloģiskos atkārtojumus. GAPDH tika izmantots kā olbaltumvielu iekraušanas kontrole. Paneļiem (c) un (i) tika izmantota divvirzienu ANOVA ar Sidaka daudzkārtējiem salīdzināšanas testiem. Paneļiem (d) un (e) tika izmantota divvirzienu ANOVA ar Tukey vairāku salīdzinājumu testu. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
STEAP{0}}BBζ CAR T šūnu produktu raksturojums vairāku donoru vidū
Pēc tam mēs profilējām STEAP1-BBζ CAR T šūnu produktu paplašināšanos, transdukcijas efektivitāti un imūnfenotipu, izmantojot trīs neatkarīgas perifēro asiņu mononukleāro šūnu (PBMC) kopas, kas savāktas no veseliem donoriem. Mēs parasti novērojām 20- līdz 40-kārtīgu STEAP1-BBζ CAR T šūnu paplašināšanos 11 dienu laikā pēc kultivēšanas (papildu 6.a attēls). EGFRt+ CD8 T šūnu procentuālais daudzums bija robežās no 24,3 līdz 54,2%, savukārt EGFRt+ CD4 T šūnu procentuālais daudzums bija lielāks un svārstījās no 60,1 līdz 74,9% mūsu STEAP1-BBζ CAR T šūnu produktos (papildu 6.b attēls). Mēs pārbaudījām T šūnu izsīkuma marķieru PD-1 un LAG-3 ekspresiju netransducēto un STEAP1- BBζ CAR T šūnu apakškopās un nenovērojām būtisku ekspresijas palielināšanos (papildu 6.c att. ). Šis atklājums liecināja par zemu vai vispār neesošu STEAP1-BBζ CAR signālu pārraidi, kas bija iepriecinoši, jo konstitutīvā CAR signalizācija var negatīvi ietekmēt CAR T šūnu efektora funkciju48. Gan cilmes šūnu atmiņas T šūnu (Tscm), gan centrālās atmiņas T šūnu (TCM) fenotipi ir saistīti ar CAR T šūnu terapijas terapeitisko efektivitāti, jo tie veicina ilgstošu proliferāciju un noturību in vivo 49–51. Netransducēto un STEAP1-BBζ CAR T šūnu apakškopu imūnfenotipēšana uzrādīja augstāku Tscm šūnu biežumu, salīdzinot ar T šūnu apakškopām donoru PBMC, no kurām tika iegūti šūnu produkti (papildu 6.d attēls). Šis efekts, iespējams, ir saistīts ar IL-7 un/vai IL-15 pievienošanu T šūnu izplešanās barotnei, jo ir pierādīts, ka šie citokīni saglabā un uzlabo Tscm diferenciāciju51,52. Mūsu analīze atklāja arī Tcm populāciju bagātināšanos, īpaši CD8 STEAP1-BBζ CAR T šūnās (papildu 6.e attēls).
STEAP1-BBζ CAR T šūnām ir būtiska pretvēža iedarbība izplatītā prostatas vēža modeļos ar dabisku STEAP1 ekspresiju, kas konstatēta pelēm ar imūndeficītu
cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu
Kā sākotnējais in vivo pretvēža aktivitātes skrīnings mēs izveidojām 22Rv1 subkutānus ksenotransplantāta audzējus NOD scid gamma (NSG) peļu tēviņiem. Kad audzēji pieauga līdz aptuveni 100 mm3, peles tika ārstētas ar vienu intratumorālu 5 × 106 netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu injekciju. Intratumorāla ārstēšana ar STEAP1- BBζ CAR T šūnām bija saistīta ar nozīmīgu audzēja augšanas inhibīciju, kas bija statistiski nozīmīga līdz 18. ārstēšanas dienai (3.a attēls). Peles tika nonāvētas 25. dienā, un atlikušajos audzējos no pelēm, kas tika ārstētas ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām, tika konstatēti lieli nekrotisku atlieku laukumi, un dzīvotspējīga audzēja apgabali tika infiltrēti ar CD3+ STEAP1-BBζ CAR T šūnas (papildu 7.a attēls). STEAP1 ekspresija tika saglabāta audzējos visās ārstēšanas grupās (papildu 7.b attēls). Mēs transducējām 22Rv1 šūnas ar lentivīrusu, lai pastiprinātu ugunspuķu luciferāzes (Luc) ekspresiju, un 106 22Rv1-fLuc šūnas tika ievadītas NSG peļu tēviņu astes vēnās. Metastātiskā kolonizācija tika vizualizēta ar dzīvu bioluminiscences attēlveidošanu (BLI) pēc divām nedēļām, un šajā brīdī peles tika ārstētas ar vienu intravenozu 5 × 106 netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu injekciju (3.b attēls). . Sērijveida BLI atklāja strauju slimības progresēšanu pelēm, kuras tika ārstētas ar netransducētām T šūnām, savukārt pelēm, kuras saņēma STEAP1-BBζ CAR T šūnas, novēroja ievērojamu audzēja progresēšanas aizkavēšanos (3.c un d. attēls) un dzīvildzes pagarināšanos (97 dienas pret 31 dienu). , p=0.0018 ar log-rank testu, 3.e attēls). Nebija būtisku atšķirību peļu svarā starp ārstēšanas grupām (papildu 7.c attēls). IHC audzēju krāsošana pētījuma beigās uzrādīja būtisku STEAP1 ekspresijas samazināšanos (papildu 7.d attēls), norādot, ka antigēna izplūde bija rezistences mehānisms. Tomēr tas bija maz ticams transdiferenciācijas rezultātā uz prostatas vēža stāvokļa variantu, jo mēs nenovērtējām morfoloģiskās izmaiņas, AR un PSMA ekspresijas zudumu53 vai SYP ekspresijas pieaugumu (papildu attēls 7d). Lai izpētītu STEAP1 zuduma globālo ietekmi uz prostatas vēzi, mēs veicām iepriekš sagatavoto izogēno 22Rv1 savvaļas tipa (wt), 22Rv1 STEAP1 ko un 22Rv1 STEAP1 ko + glābšanas šūnu līniju transkripta profilēšanu (2.b att.). Diferenciālā gēnu ekspresijas analīze, salīdzinot 22Rv1 STEAP1 ko šūnas ar 22Rv1 wt šūnām, identificēja ~ 1700 gēnu, kas ievērojami pazemināti (FDR mazāks vai vienāds ar 0, 05, reizes izmaiņas<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) ar STEAP1 pievienošanu (papildu 8.a attēls). Gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA) izvirzīja vairākus bioloģiskos ceļus, kurus var disregulēt, modulējot STEAP1 ekspresiju. Ievērojami starp tiem bija šūnu cikla progresēšana un vairāki vielmaiņas procesi, ieskaitot Kreba ciklu un glikolīzi, kurus negatīvi bagātināja STEAP1 nokauts un izglāba pēc STEAP1 pievienošanas (papildu 8.b attēls). Mēs saviem datiem izmantojām apstiprināto 31-gēnu šūnu cikla progresēšanas (CCP) parakstu54, kas liecināja par būtisku ar STEAP1 nokautu saistītā CCP paraksta pazemināšanos ar punktu –0,8, kas ievērojami palielinājās līdz {{ 14}}.5 ar STEAP1 izteiksmes glābšanu (papildu 8.c attēls). Šie dati atbilst iepriekšējai publikācijai, kas norāda, ka STEAP1 iznīcināšana LNCaP prostatas vēža šūnu līnijā pasliktina šūnu dzīvotspēju un proliferāciju, vienlaikus izraisot apoptozi37. Mēs arī atzīmējām, ka antigēnu apstrāde un prezentācija bija viens no visnozīmīgākajiem KEGG ceļiem ar STEAP1 izsitumu (papildu 8.b attēls). Mēs novērojām ievērojamu gēnu, tostarp PSME1 (proteasomas aktivatora 1. apakšvienības), kas ir imūnproteasomu kompleksa loceklis, TAP1 (transporteris 1, ATP saistošās kasetes apakšģimenes loceklis) loceklis, ievērojamu samazināšanos, kas ir būtiska galvenā histokompatibilitātes kompleksa (MHC) I klases peptīdam. ielādes komplekss un vairāki MHC I un II klases gēni, piemēram, MR1 (galvenais histokompatibilitātes komplekss, saistīts ar I klasi), HLA-DQ-B1 un HLA-DQB2 (papildu 8.d attēls). Tālāk mēs pētījām audzējus, kas iegūti no 22Rv1 izplatītajiem modeļiem, kas tika ārstēti ar STEAP1- BBζ CAR T šūnu terapiju, kas parādīja antigēna zudumu (3.c att., papildu 7.d attēls), izmantojot transkripta analīzi. Diferenciālā gēnu ekspresijas analīze un tai sekojošā GSEA, salīdzinot 22Rv1 metastātiskus audzējus no pelēm, kuras tika ārstētas ar STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju, ar pelēm, kuras tika ārstētas ar netransducētām T šūnām, uzrādīja negatīvu MHC, citotoksisko limfocītu un T šūnu aktivācijas ceļu bagātināšanos ( Papildu 9.a, b). Mēs arī īpaši novērtējām MHC I un II klases gēnu ekspresiju un novērojām to izteikto pazemināšanos 22Rv1 audzējos, kas tika ārstēti ar STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju (papildu 9.c attēls). Šo rezultātu vēl vairāk apstiprināja ievērojams HLA-A, B, C krāsojuma samazinājums ar IHC šajos audzējos (papildu 9. d attēls). Šo datu iespējamā ietekme ir tāda, ka ārstēšana ar STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju un līdz ar to STEAP1 audzēja antigēna ekspresijas zudums prostatas vēža gadījumā var izraisīt turpmāku imūnterapijas rezistenci, jo tiek traucēta antigēna apstrāde un prezentācija. Mēs arī inokulējām NSG peļu tēviņus ar C4-2B-fLuc šūnām, injicējot astes vēnā. C4-2B ir pret kastrāciju izturīga LNCaP55 apakšlīnija, kuras augšanas kinētika vairāk atbilst tipiskam prostatas vēzim. Četras nedēļas pēc injekcijas metastātisku kolonizāciju apstiprināja BLI, un peles tika ārstētas ar vienu intravenozu 5 × 106 netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu injekciju (3.b attēls). Sērijveida BLI uzrādīja pilnīgu atbildes reakciju visām pelēm, kuras saņēma STEAP1-BBζ CAR T šūnas piecu nedēļu laikā pēc ārstēšanas (3.f, g attēls). Mēs identificējām palielināta svara zuduma tendenci netransducēto T-šūnu ārstēšanas grupā (papildu 10.a attēls), taču tas nebija statistiski nozīmīgi. Ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām ārstēto peļu autopsija neuzrādīja makroskopisku slimību, un orgānu ex vivo BLI neatklāja nekādus signālus (papildu 10.b attēls), kas liecina, ka šīs peles, visticamāk, bija izārstētas. Eksperimenta beigās mēs identificējām STEAP1-BBζ CAR T šūnu perifēro noturību, pamatojoties uz nosakāmu CD3+ EGFRt+ splenocītu klātbūtni (3.h attēls).
3. att.|STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapijas pretvēža aktivitāte in vivo prostatas vēža modeļos ar dabisku STEAP1 ekspresiju. a 22Rv1 subkutāno audzēju apjomi NSG pelēm (n=4 netransducētu T šūnu grupai un n=5 STEAP1-BBζ CAR T šūnu grupai) laika gaitā pēc vienas 5 intratumorālas injekcijas × 106 netransducētas T šūnas vai STEAP{{10}}BBζ CAR T šūnas ar normālu CD4/CD8 attiecību. p < 0.0001 20. un 25. dienā. Joslas apzīmē vidējo vērtību ar SEM. b Audzēja provokācijas eksperimentu shēma 22Rv1 (augšpusē) un C4-2B (apakšā) izplatītajiem modeļiem. Luc firefly luciferāze, BLI bioluminiscences attēlveidošana. c Sērijveida dzīvās bioluminiscences attēlveidošana (BLI) NSG pelēm, kurām ir iepotētas 22Rv1-fLuc metastāzes un kas apstrādātas ar vienu intravenozu 5 × 106 netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu injekciju normālā CD4/ CD8 attiecības 0. dienā. Sarkanais X apzīmē mirušas peles. Tiek parādīta spožuma skala. d Diagramma, kas parāda kopējās plūsmas kvantitatīvo noteikšanu laika gaitā no katras peles dzīvā BLI (c). e Kaplan-Meier izdzīvošanas līknes pelēm (c) ar statistisko nozīmīgumu, kas noteikts ar log-rank (Mantel-Cox) testu. Paneļiem (c–e) tika izmantotas n=5 peles katrā stāvoklī. f Sērijveida dzīvu BLI no NSG pelēm, kurām ir potētas C4-2B metastādes un kuras dienā tika ārstētas ar vienu intravenozu 5 × 106 netransducētu T šūnu vai STEAP1-BBζ CAR T šūnu injekciju ar normālu CD4/CD8 attiecību. 0. Sarkanais X apzīmē mirušas peles. Tiek parādīta spožuma skala. g Diagramma, kas parāda kopējās plūsmas kvantitatīvo noteikšanu laika gaitā no katras peles dzīvā BLI (f) punktā. Paneļiem (f, g) n=4 peles tika izmantotas netransducēto T šūnu grupā un n=5 peles STEAP1-BBζ CAR T šūnu grupā. h CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T šūnu kvantitatīva noteikšana, izmantojot plūsmas citometriju no peļu splenocītiem, kas apstrādātas ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām (n=4) beigās no eksperimenta 49. dienā. Joslas attēlo vidējo. Panelam (a) tika izmantota divvirzienu ANOVA ar Sidaka daudzkārtējo salīdzināšanas testu. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
Pele-pelē STEAP1 CAR T šūnu pētījumi pierāda pretvēža terapeitisko efektivitāti
STEAP1-BBζ CAR T šūnu aktivācija un citolītiskā aktivitāte, kas novērota PC3 šūnu līnijas ļoti zemā STEAP1 antigēna blīvuma (~1500 molekulas/šūnā) kontekstā (2. g–i. att., 11. a un b att. ) un pierādījumi par in vivo pretvēža aktivitāti izplatītā PC3-fLuc audzēja modelī (papildu 11.c–e attēls) radīja bažas par iespējamu mērķtiecīgu toksisku ietekmi uz audzēju. Lai novērtētu iespējamo toksicitāti izsekojamā paraugorganismā, mēs izveidojām cilvēka STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) peli, kurā cilvēka STEAP1 gēns tika iesists peles Steap1 gēna lokusā uz C57Bl/6 fona ( 4.a att.). Peļu kolonija tika izveidota ar genotipēšanu, kas veikta ar astes DNS polimerāzes ķēdes reakciju (PCR) (4.b attēls). Gan homozigotām, gan heterozigotām hSTEAP1-KI pelēm, salīdzinot ar savvaļas tipa metiena biedriem, nebija redzamu fenotipa vai reproduktīvo anomāliju. Audu apsekojums cilvēka STEAP1 ekspresijai, pamatojoties uz kvantitatīvo reversās transkripcijas PCR (qRT-PCR), tika veikts heterozigotu hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/+) peļu tēviņiem un mātītēm un atklāja vislielāko relatīvo ekspresiju. prostatā, kam seko dzemde un virsnieru dziedzeris (4.c att.). Turpmāka vīriešu hSTEAP1-KI/+ prostatas un virsnieru dziedzeru in situ analīze ar STEAP1 IHC atklāja cilvēka STEAP1 ekspresiju, kas aprobežojas ar prostatas luminālajām epitēlija šūnām (4.d attēls) un ekspresiju virsnieru garozā (4.e attēls). . STEAP1 CAR murinizēta versija, ko sauc par STEAP1-mBBζ CAR, kurā tika saglabāts scFv un IgG4 viras-CH2-CH3 starplikas, bet CD28 transmembrānas domēns, 4-1BB kostimulējošais domēns , un CD3ζ aktivācijas domēns tika aizstāts ar to peles ortologiem tika klonēts gammaretrovīrusu konstrukcijā (4.f att.). Turklāt cilvēka EGFRt transdukcijas marķieris tika aizstāts ar saīsinātu peles CD19 (mCD19t), lai samazinātu iespējamo imunogenitāti. Mēs apstiprinājām no peles splenocītiem bagātināto T šūnu efektīvu retrovīrusu transdukciju (4.g attēls) un parādījām peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnu spēju izraisīt RM9 peles prostatas vēža šūnu līnijas56 citolīzi, kas izstrādāta cilvēka STEAP1 ekspresijai. (RM9- hSTEAP1) ar lentivīrusu transdukciju (4.h att.). Peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnu in vivo efektivitāte tika apstiprināta izplatītā RM9-STEAP1-fLuc audzēja modelī NSG pelēm (papildu 12.a attēls). Nedēļu pēc RM9-STEAP1-fLuc šūnu astes vēnā injekcijas peles tika apstrādātas ar 5 × 106 netransducētām peles T šūnām vai peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnām, injekciju astes vēnā . Pelēm, kuras saņēma netransducētas peles T šūnas, tika novērota nekontrolēta slimības progresēšana, turpretim pelēm, kas tika ārstētas ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām, vienmērīgi bija strauja slimības regresija, kam sekoja recidīvs pēc desmit dienām (papildu 12.b, c attēls). STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapija bija saistīta ar statistiski nozīmīgu dzīvildzes ieguvumu (22 dienas pret 12 dienām, p=0,0039 ar log-rank testu, papildu 12.d attēls). Svara zudums bija acīmredzams abās ārstēšanas grupās, jo audzēja slodze palielinājās pirms nāves (papildu 12.e, f attēls). Autopsijas laikā savākto peles splenocītu analīze parādīja STEAP1-mBBζ CAR T šūnu perifēro noturību, konstatējot mCD3+ mCD19t+ šūnas līdz 24 dienām pēc adoptēšanas (papildu 12. g. attēls). Plaušas tika iegūtas no pelēm abās ārstēšanas grupās, un STEAP1 IHC uzrādīja STEAP1 ekspresijas zudumu plaušu metastāzēs pelēm, kas tika ārstētas ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām (papildu attēls 12.h). Pēc tam mēs paplašinājām klonālās RM9-STEAP1-fLuc līnijas, lai noteiktu, vai novērotā audzēja antigēna izplūde varētu būt STEAP1 ekspresijas jau esošas neviendabības rezultāts. Eksperiments tika atkārtots ar klonālu, izplatītu RM9-STEAP1- fLuc audzēja modeli NSG pelēm (papildu 13.a attēls). Šajā kontekstā pelēm, kas tika ārstētas ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām, bija tūlītēja un ilgstoša pilnīga reakcija (papildu 13.b–d attēls). Šie atklājumi izceļ STEAP1-mBBζ CAR T šūnu potenciālu STEAP1+ prostatas vēža izskaušanā un liek domāt, ka var būt nepieciešamas papildu terapeitiskās stratēģijas, lai pārvarētu rezistenci progresējoša prostatas vēža pacientu apakšgrupās, kur STEAP1 ir neviendabīga. izteiksme ir klāt (1.e attēls).
cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu
Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus
【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
STEAP1 CAR T šūnu terapija ir droša humanizētā STEAP1 peles modelī
Lai izpētītu gan STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapijas preklīnisko drošību, gan efektivitāti, mēs heterozigotu hSTEAP1-KI peļu tēviņiem inokulējām ar singēnu, neklonālu RM9-STEAP{{4}. }fLuc šūnas ar astes vēnu injekciju (5.a attēls). Pēc tam, kad aptuveni nedēļu vēlāk BLI apstiprināja metastātisku kolonizāciju, peles saņēma iepriekšēju ciklofosfamīdu 100 mg/kg intraperitoneālas injekcijas veidā57. Dienu vēlāk peles tika nejaušināti iedalītas ārstēšanai ar 5 × 106 netransducētām peles T šūnām vai peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnām ar astes vēnu injekciju. Visām pelēm, kuras saņēma peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnas, pirmajā ārstēšanas nedēļā tika novērota audzēja slodzes samazināšanās, pamatojoties uz BLI (5.b, c attēls). Novērotā atbilde bija īslaicīga, bet izraisīja nelielu dzīvildzes pagarinājumu (21 diena pret 12 dienām, p=0.0138 ar log-rank testu, 5.d attēls) — līdzīgi kā konstatējumi no neklonālās RM 9-STEAP1-fLuc eksperimenti ar NSG pelēm (papildu 12. d attēls). Ar peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapiju šajā devas līmenī nebija nopietnas toksicitātes vai priekšlaicīgas nāves gadījumu, kad tika novēroti skaidri pierādījumi par pretaudzēju efektivitāti. Svara zudums bija saistīts ar palielinātu audzēja slodzi, bet bija kopīgs abām ārstēšanas grupām (5.e, f attēls). Lai tālāk novērtētu STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapijas iespējamo toksicitāti, līdzīgs eksperiments tika veikts paralēli ar heterozigotām hSTEAP1-KI pelēm ar RM9-hSTEAP1 audzējiem un bez audzējiem. Pelēm bez audzējiem, kas tika ārstētas ar netransducētām T šūnām vai STEAP1- mBBζ CAR T šūnām, netika konstatētas nekādas atšķirības izdzīvošanā (papildu 14.a attēls) vai bruto toksicitāte, tostarp ķermeņa masas zudums (papildu 14.b attēls). Tā kā STEAP1-BBζ CAR sastāv no modificēta IgG4 starplikas, kas varētu būt imunogēns, šajā eksperimentā mēs novērtējām peles anti-human antivielu (MAHA) reakciju, savācot retroorbitālās asiņošanas no pelēm. 8. dienā pēc apstrādes ar STEAP1-BBζ CAR T šūnām peļu serumos netika konstatētas anti-cilvēka IgG un IgM antivielas (papildu 14.c attēls).
Svarīgi ir tas, ka heterozigotām hSTEAP1-KI pelēm, kas tika ārstētas ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām, netika konstatēti acīmredzami audu bojājumi vai palielināta CD3+ T šūnu infiltrācija prostatā (papildu 15.a, b att. ) vai virsnieru dziedzeri (papildu 15.c, d attēls), salīdzinot ar to kolēģiem, kas apstrādāti ar netransducētām T šūnām, kas liecina, ka nav audzēja toksiskas ietekmes uz mērķa. Eksperimenta beigās savāktās plaušas parādīja cilvēka STEAP1 ekspresiju RM9-hSTEAP1 plaušu metastāzēs ar reģionālu neviendabīgumu pelēm, kas tika ārstētas ar netransducētām peles T šūnām (5.g attēls). No otras puses, audzēji no pelēm, kas tika ārstētas ar peles STEAP{11}}mBBζ CAR T šūnām, atkal parādīja cilvēka STEAP1 ekspresijas neesamību (5.h attēls). Lai novērtētu, vai peles STEAP1- mBBζ CAR T šūnu terapija un cilvēka STEAP1 antigēna zudums var ietekmēt arī antigēna prezentāciju RM9-hSTEAP1 audzējos, mēs veicām IHC peles beta{18}}mikroglobulīnam (B2m). ), kas ir MHC I klases molekulu galvenā sastāvdaļa. Mēs novērojām ievērojamu B2m ekspresijas pazemināšanos progresējošos audzējos pēc ārstēšanas ar peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnām, salīdzinot ar netransducētām T šūnām (papildu 15.e, f attēls), kas atbilst mūsu konstatējumiem 22Rv1 modelī.
4. att.|Peles-pelē sistēmas izveide ar cilvēka STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) peles modeli un murinizētu STEAP1 CAR. shēma, kurā parādīta homologā rekombinācijas stratēģija, izmantojot mērķēšanas vektoru, lai cilvēka STEAP1 eksonus 2–5 ievadītu peles Steap1 lokusā uz C57Bl/6 fona. FRT Flippase atpazīšanas mērķis. b PCR produktu vizualizācija no savvaļas tipa (+/+), heterozigotu (KI/+) vai homozigotu (KI/KI) peļu astes gala genotipēšanas, izmantojot primeru pārus, kas paredzēti savvaļas tipa vai hSTEAP1-KI alēļu daļu pastiprināšanai. . NTC nulles veidnes vadība. Reprezentatīvs gēla attēls no n=3 bioloģiski neatkarīgiem eksperimentiem. c qPCR cilvēka STEAP1 ekspresijai normalizēts līdz 18S ekspresijai hSTEAP1-KI/+ peļu audu aptaujā. n=3 dzimumam raksturīgiem orgāniem un n=6 kopējiem orgāniem. Joslas apzīmē vidējo vērtību ar SEM. Fotoattēlu mikrogrāfijas ar STEAP1 IHC krāsošanu (d) prostatas audiem no (pa kreisi) +/+ un (pa labi) KI/+ pelēm un (e) virsnieru dziedzera no KI/+ peles. Mēroga joslas=50 µm. Panelim (d, e) STEAP1 imūnkrāsošana tika veikta n=3 bioloģiski neatkarīgiem paraugiem. f Retrovīrusu murinizētās STEAP1 CAR konstrukcijas shēma. MuLV peles leikēmijas vīruss, mCD19t peles saīsināts CD19. g Aktivēto peles T šūnu retrovīrusu transdukcijas efektivitātes kvantitatīva noteikšana no trīs neatkarīgiem eksperimentiem, pamatojoties uz peles CD3+ CD19t+ šūnu biežumu ar plūsmas citometriju (p {{40}}.0003). h RM9 vai RM9-hSTEAP1 mērķa šūnu relatīvā šūnu dzīvotspēja laika gaitā, ko mēra ar dzīvu šūnu fluorescences attēlveidošanu pēc kopkultūras 1:1 attiecībā ar peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnām vai netransducētām T šūnām (p < 0,0001). n=4 bioloģiskie atkārtojumi katram nosacījumam. Kļūdu joslas attēlo vidējo vērtību ar SEM. Panelim (g) tika izmantots nesapārots Stjudenta t-tests ar Velča korekciju. Panelā (h) tika izmantota divvirzienu ANOVA ar Sidaka daudzkārtējo salīdzināšanas testu. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
5. att.|Peļu STEAP1-mBBζ CAR T šūnu efektivitātes un drošības noteikšana hSTEAP1-KI pelēm, kurām ir singēns, izplatīts prostatas vēzis.
Kolagēnu saistošā domēna-IL-12 saplūšanas citokīns izraisa pretvēža reakcijas, uzlabojot T šūnu receptoru signālu pārraidi un antigēnu prezentāciju
IL{{0}} ir heterodimērs citokīns, kas sastāv no p40 un p35 apakšvienībām, kas regulē T šūnu atbildes reakciju un izraisa IFN- veidošanos. Pārsteidzošas pretvēža atbildes reakcijas, kas saistītas ar sistēmisku IL-12 ievadīšanu, ir pierādītas vairākos preklīniskos modeļos58,59, taču šīs terapeitiskās pieejas pāreja uz klīniku apstājās devu ierobežojošas toksicitātes un neefektivitātes dēļ60–63. Alternatīvas stratēģijas šo problēmu apiešanai ir vērstas uz IL{{10}} lokalizāciju audzējos, izmantojot intratumorālu ievadīšanu vai IL-12 saplūšanas proteīnu inženieriju, lai izmantotu audzēja mikrovides unikālās īpašības. Viena nesen aprakstītā pieeja ir saplūšana ar fon Vilebranda faktora A3 domēnu, kas kalpo kā kolagēnu saistošs domēns (CBD, 6.a attēls) un ļauj savienoties saplūstiem proteīniem ar atklātu kolagēnu nesakārtotā audzēja asinsvadu sistēmā64. Tika pierādīts, ka sistēmiskā CBD-IL-12 terapija pārveido imunoloģiski "aukstā" peļu krūts vēža un melanomas modeļu audzēju mikrovidi, izmantojot uzlabotu IFN signālu pārraidi, un sadarbojas ar anti-PD{{20}} imūnās kontrolpunkta kavēšana, lai izraisītu audzēja izskaušanu65. Mēs jautājām, vai CBD-IL{23}} varētu būt efektīvs, lai pārvērstu prostatas vēzi no “aukstā” uz “karstu” un izraisītu pretvēža reakcijas. Subkutāni, singēni RM9 un Myc-CaP audzēji tika konstatēti attiecīgi C57Bl/6 un FVB peļu tēviņiem, un peles tika randomizētas ārstēšanai ar nesēju, anti-PD-1 vai CBD-IL-12 . Sistēmiskā CBD-IL-12 ievadīšana izraisīja būtisku audzēja augšanas inhibīciju gan singēnu RM9, gan Myc-CaP audzēju modeļos, kas citādi slikti reaģēja uz anti-PD-1 terapiju (6.b attēls, papildu 16.a attēls). . Lai iegūtu plašāku ieskatu CBD-IL-12 darbības mehānismos, mēs veicām vienas šūnas RNS-seq (scRNA-seq) analīzi RM9 audzējiem no pelēm, kas tika ārstētas ar nesēju vai CBDIL-12. Vienotās kolektora aproksimācijas un projekcijas diagrammas atklāja būtisku audzēja epitēlija, fibroblastu un endotēlija šūnu nodalījumu samazināšanos (papildu 16.b attēls), kas atbilst pretvēža aktivitātei. Iedzimto un adaptīvo imūnšūnu apakškopu profilēšana (6.c, d. att.) scRNA-seq datos atklāja būtisku CD8+ T šūnu skaita pieaugumu (7,55 pret 0,76%). , antigēnu krusteniski prezentējošās šūnas, tostarp XCR1+ IRF8+ parastā 1. tipa dendritiskā šūna (cDC1, 1,33 pret 0%), CD86+ INOS2+ M1 polarizētie makrofāgi ( 2,26 pret 0%) un CD64+ F4/ 80+ monocīti/makrofāgi (29,2 pret 4,43%) audzējos no CBDIL-12 ārstēšanas grupas, salīdzinot ar nesēja kontroles grupu. Imūnsupresīvo CD163+ CD206+ M2 polarizēto makrofāgu (0 pret 0,25%) un Ly6G+ neitrofilu (0,52 pret 1,08%) samazināšanās arī bija saistīta ar CBD-IL-12 terapiju. IHC analīze apstiprināja, ka RM9 audzējiem, kas tika ārstēti ar nesēju, parasti trūka CD8+ T šūnu, savukārt audzējiem, kas tika ārstēti ar CBD-IL-12, tika konstatēta acīmredzami nozīmīga CD8+ T šūnu infiltrācija (16. papildu attēls). . Audzēja šūnas demonstrēja proteasomu un imūnproteasomu apakšvienību Psmb8 un Psmb9 bagātinātu ekspresiju un galveno histokompatibilitātes kompleksa I klases (MHC I) gēnu H2-}K1, H2-D1 un B2m, kas atbilst antigēnu apstrādes regulēšanai. un prezentācijas iekārtas (6.e attēls, 16.d papildu attēls). Paralēli T šūnām bija pastiprināta gēnu ekspresija, kas saistīta ar T šūnu receptoru signalizāciju un imūnregulācijas mijiedarbību starp limfoīdo un nelimfoīdu šūnu (6.f attēls, papildu 16.e attēls). Mononukleāro fagocītu sistēmas (MPS) šūnām bija bagātināta gēnu ekspresija, kas saistīta ar antigēnu apstrādi un savstarpēju prezentāciju, kā arī citokīnu signalizāciju (papildu 16.f, g). Šie pētījumi atklāja CBD-IL{113}} pretvēža aktivitāti prostatas vēža modeļos, pārprogrammējot audzēja mikrovidi un iesaistot gan iedzimto, gan adaptīvo imūnsistēmu.
Uzlabota audzēja kontrole ar vienlaicīgu STEAP{0}}mBBζ CAR T šūnu un CBD-IL-12 terapiju
Pēc tam mēs izvirzījām hipotēzi, ka pretvēža imūnās atbildes paplašināšana ar CBD-IL-12 terapiju varētu uzlabot STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapijas terapeitisko efektivitāti prostatas vēža gadījumā, apkarojot audzēja antigēnu neviendabīgumu un antigēnu apstrādes glābšanu un prezentācija. Tāpēc mēs noteicām singēnas, neklonālas RM9-STEAP1-fLuc metastāzes heterozigotu hSTEAP1-KI peļu tēviņiem un nejauši izvēlējāmies ārstēšanai ar 5 × 106. netransducētas peles T šūnas vai peles STEAP1-mBBζ CAR T šūnas ar injekciju astes vēnā ar vai bez iknedēļas CBD-IL-12 terapijas ar retroorbitālu sinusa injekciju. Grupas, kas saņēma CBD-IL-12 terapiju atsevišķi vai kombinācijā ar STEAP1-mBBζ CAR T terapiju, nesaņēma limfas noārdošo ciklofosfamīdu (7.a attēls). Sērijveida BLI atklāja strauju slimības progresēšanu pelēm, kuras tika ārstētas ar netransducētām T šūnām un CBD-IL-12, savukārt pelēm, kuras saņēma STEAP1-BBζ CAR T šūnas kombinācijā ar CBD-IL-12 terapiju, novēroja nozīmīgu audzēja progresēšanas kavēšanās (7.b, c att.). Svarīgi, ka kombinēta ārstēšana ar peles STEAP1- mBBζ CAR T šūnām un iknedēļas CBD-IL-12 bija saistīta ar statistiski nozīmīgu kopējās dzīvildzes pagarināšanos, salīdzinot ar visām pārējām ārstēšanas grupām (7.d attēls). Plazmas citokīnu analīze retroorbitālai asiņošanai, kas iegūta ārstēšanas 0. un 8. dienā, uzrādīja būtisku proinflammatorisko citokīnu IFN-, TNF-, IL-6 un IL-4 līmeņa paaugstināšanos (7.e att., papildu attēls). 17) pelēm, kas ārstētas ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām un CBD-IL-12. Atlikušie audzēji tika savākti autopsijas laikā, un STEAP1 IHC uzrādīja antigēna zudumu audzējos no pelēm, kas tika ārstētas gan ar STEAP1- mBBζ CAR T šūnām atsevišķi, gan kombinācijā ar CBD-IL-12 (8.a attēls). Turklāt mēs novērojām audzēja B2m ekspresijas palielināšanos (8.a attēls), kas saistīta ar CBD-IL-12 terapiju. CD3+ T šūnas palielinājās arī audzēju apstākļos, kas pakļauti IL-12 terapijai, taču, lai gan tendence tika novērtēta, mēs neatradām statistiski nozīmīgu intratumorālo T šūnu pieaugumu starp STEAP1-mBBζ CAR T šūnu un kombinētās STEAP1-mBBζ CAR T šūnu un CBD-IL-12 ārstēšanas grupas. Atlikušie audzēji, tostarp audzēji no pelēm, kas tika ārstētas ar kombinētām STEAP1-mBBζ CAR T šūnām un CBD-IL-12, tika savākti pie maksimālās ārstēšanas atbildes reakcijas (nadir) 10. dienā un līdzjūtīgiem audzēja progresēšanas (recidīva) galapunktiem. disociēti ar atsevišķām šūnām un imūno šūnu apakškopas tika raksturotas ar daudzparametrisko plūsmas citometriju (18. papildu attēls). Saskaņā ar mūsu scRNA-seq rezultātiem, CBD-IL{60}} ārstēšana atsevišķi vai kombinācijā ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnām izraisīja ievērojamu CD11b+ Ly6C-/+F4/{68 pieaugumu. }} MHC-II+ makrofāgi (8.c, d att., papildu 19.a att.). CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ šūnas ir nobrieduši antigēnu prezentējoši makrofāgi66, un šī populācija tika īpaši bagātināta un demonstrēja paaugstinātu inducētās slāpekļa oksīda sintāzes (iNOS) ekspresiju kā proinflammatoriskās M1 polarizācijas marķieri ar CBD-IL{84} } terapija. Mēs arī novērojām cDC1 populācijas paplašināšanos un parasto 2. tipa dendritisko šūnu (cDC2) populācijas samazināšanos (8.e att., 19.b papildu attēls). cDC1 ir iesaistīts pretvēža citotoksisko CD8+ T šūnu aktivācijā un iespējamajos terapeitiskās rezistences mehānismos. Mēs neatradām nekādas pazīmes, kas liecinātu par šūnu migrāciju uz audzēju, savukārt cDC2 ir svarīgas, lai aktivizētu būtiskas atšķirības starp KLRG1+ un KLRG1- dabisko CD4+ T šūnu, tostarp Tregs67, slepkavām. . Saskaņā ar cDC2 konstatējumiem šūnas visās ārstēšanas grupās (papildu attēls 19d). CD4+ FOXP3+ Treg frekvenču profilēšana atklāja Tregs samazināšanos F40/80+ SiglecF+ eozinofilu skaita samazināšanos, bet Ly6G+ tika neitralizēts ar CBD-IL-12 terapiju (papildu 19.c attēls). Interesanti, ka, pievienojot STEAP1- CBD-IL{111}}, trofilu skaits tika samazināts, mēs novērojām, ka recidivējošu audzēju gadījumā pēc kombinētās STEAP1-mBBζ mBBζ CAR T šūnu terapijas (8.f attēls, g). Proti, šo CAR T šūnu un CBD-IL{116}} terapijas biežums izraisīja cDC1 samazināšanos un ar audzēju saistīto neitrofilo leikocītu skaita palielināšanos, palielinoties Tregs līmenim, kas nozīmē samazinātu citotoksiskā CD8 STEAP ievadīšanu.{120 }}mBBζ CAR T šūnas, salīdzinot ar netransducētām T šūnām (54 pret T šūnām un imūnsupresīvās Treg signālu bagātināšanās par 34%), CBD-IL-12 terapijas apstākļos samazinājās, bet palielinājās pēc audzēja recidīva pēc kombinētās STEAP 1-mBBζ CAR T šūnu un CBD-IL-12 terapija (19 līdz 42%). Šie atklājumi liecina, ka ar audzēju saistīto neitrofilu imūnsupresīvajām īpašībām var būt nozīmīga loma ārstēšanas rezistences un audzēja progresēšanas starpniecībā. Kopumā šīs analīzes liecina, ka ārstēšana ar CBD-IL-12 atgriež naidīgo imūnsupresīvo audzēju vidi uz pro-iekaisuma stāvokli un paplašina pretvēža aktivitāti saistībā ar adoptēti pārnesto STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapiju. Tālāk mēs veicām TCR repertuāra analīzi, izmantojot multipleksu PCR balstītu TCR beta ķēdes sekvencēšanu68 uz plaušu nesējiem audzējiem, kas savākti no katras ārstēšanas grupas autopsijas laikā. Mēs novērojām ievērojamu Simpsona klonalitātes samazināšanos paraugos no pelēm, kas tika ārstētas tikai ar CBD-IL{139}} un kombinācijā ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapiju, kas liecināja par palielinātu intratumorālo T šūnu daudzveidību (att. 8h). Šie atklājumi liecina, ka CBD-IL-12 pievienošana kā papildinājums STEAP1 CAR T šūnu terapijai var būt izdevīga, pārveidojot prostatas vēža audzēja mikrovidi, uzlabojot antigēnu apstrādi un prezentāciju, kā arī iesaistot saimniekorganisma imunitāti, lai veicinātu epitopu izplatīšanos.
6. att.|Sistēmiskā kolagēnu saistošā domēna IL-12 (CBD-IL-12) citokīnu saplūšanas terapija kavē prostatas vēža audzēja augšanu un pārprogrammē audzēja imūno mikrovidi. CBD-IL-12 shēma, kas sastāv no p35 un p40 apakšvienībām, kas savienotas ar CBD no fon Vilebranda faktora domēna A3. b RM9 zemādas audzēju apjomi singēnu C57Bl/6 pelēm laika gaitā, ārstējot ar nesēju, anti-PD-1 (klons 29 F.1A12) 200 Μg intraperitoneāli injekcijas veidā ik pēc 5 dienām, vai CBD-IL-12 25 Μg intravenozas injekcijas veidā ik pēc 5 dienām, sākot no 0. dienas. n=7 peles grupās ar nesēju un CBD-IL-12 un n=8 peles anti- -PD1 ārstētā grupa. p < 0,0001 9. un 12. dienā. Joslas apzīmē vidējo vērtību ar SEM. P vērtības ir iegūtas no divvirzienu ANOVA ar Daneta vairāku salīdzinājumu testu, ns nav nozīmīga. c Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) diagrammas dažādām imūno šūnu apakšgrupām (augšpusē) no vienas šūnas RNS-seq (scRNA-seq) analīzes pieciem RM9 audzējiem, katrs agregēts no pelēm, kas ārstētas ar nesēju vai CBD-IL{41} }. UMAP diagrammas, kas iekrāsotas ar imūnšūnu apakškopas specifisko marķieru gēnu ekspresiju pan-monocītiem/makrofāgiem, M1 un M2 polarizētiem makrofāgiem, parastajām 1. tipa dendrītiskajām šūnām (cDC1), dabīgajām slepkavām (NK) šūnām un 1. tipa T helperam (Th1) šūnas. d Diagrammas, kas parāda specifisku imūno šūnu populāciju biežumu (attiecībā pret CD45 + imūnšūnām), kas identificētas ar scRNS-seq analīzi, ieskaitot CD4+ un CD8+ T šūnas, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) un Th2 (cMAF+ Gata3+ ) šūnas, Ly6C+/− monocīti/makrofāgi (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 makrofāgi (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), M2 makrofāgi (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), parastās 2. tipa dendritiskās šūnas (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), migrējošās CD103+ dendritiskās šūnas (Itgae+ ), eozinofīli (SiglecF+ ), neitrofīli (Ly6G+) un NK šūnas (Klrb1c+ Ncr1+ ) audzējos, kas ārstēti ar nesēju vai CBDIL-12. Vulkānu diagrammas, kas parāda atšķirīgu gēnu ekspresiju (e) audzēja šūnās un (f) T šūnās no RM9 audzējiem pelēm, kas ārstētas ar CBD-IL-12, salīdzinot ar tām, kas ārstētas ar nesēju. FC locījuma maiņa, FDR viltus atklāšanas līmenis. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
Diskusija
CAR T šūnu terapijas un citu uz imūnsistēmu balstītu mērķtiecīgu terapiju efektivitāte ir ļoti atkarīga no konsekventas antigēna ekspresijas visās vai lielākajā daļā šūnu, kas ietver audzēju populāciju atsevišķā pacientā. Tomēr antigēnu neviendabīgums ir izteikts cietos audzējos, ieskaitot prostatas vēzi, kur progresēšana līdz mCRPC un rezistence pret ārstēšanu ir saistīta ar atšķirīgu slimības apakštipu parādīšanos, ko raksturo atšķirīgas transkripcijas programmas-71 un šūnu virsmas antigēna ekspresija. Lai gan PSMA tiek uzskatīts par vienu no galvenajiem prostatas vēža biomarķieriem ar ievērojamu pārmērīgu ekspresiju visā slimības progresēšanas spektrā, mūsu darbs apstiprina nesenās publikācijas14 konstatējumus, kas norāda, ka PSMA ekspresija ir neviendabīga letālā mCRPC. Mēs parādām, ka STEAP1 šajā iestatījumā ir plašāk izteikts nekā PSMA, bet nekādā gadījumā nav izteikts vienmērīgi augstā līmenī visos mCRPC audos. Neviena uz antigēnu vērsta terapija, tostarp CAR T šūnu terapija, nevar pārvarēt jau esošo audzēja antigēna neviendabīgumu mCRPC. Tādējādi ir ļoti svarīgi rūpīgi noteikt papildu terapeitiskos mērķus, piemēram, STEAP1 mCRPC, kas var nodrošināt kombinatoriskas terapijas, kas rada nepārvaramu terapeitisko spiedienu. Tie ietver dubultās uz antigēnu mērķētas (piemēram, PSMA un STEAP1) CAR T šūnu terapijas vai multimodālas stratēģijas, kas apvieno CAR T šūnu terapiju ar ADC, T-BsAb vai citu ārstēšanu, kas spēcīgi veicina no antigēniem neatkarīgu un atkarīgu audzēju nogalināšanu. Mēs izstrādājām STEAP{12}}mērķtiecīgu CAR T šūnu terapiju, kas ir ļoti specifiska antigēnam un funkcionāli lokalizēja CAR atpazīto epitopu STEAP1 otrajā ECD. Mūsu STEAP1-BBζ CAR T šūnas demonstrē būtisku pretaudzēju aktivitāti pret vairākiem izplatītiem prostatas vēža modeļiem gan pētījumos, kad tiek veikti cilvēki-pelē, gan pele-pelē. Svarīgi, ka mūsu STEAP1-BBζ CAR spēj izraisīt T šūnu aktivāciju un mērķa šūnu citolīzi pat zema antigēna blīvuma apstākļos, par ko liecina reaktivitāte pret PC3 prostatas vēža modeli. Tomēr šī STEAP1-BBζ CAR T šūnu jutība pret zemiem STEAP1 ekspresijas līmeņiem var būt izdevīga no pretaudzēju efektivitātes paaugstināšanas viedokļa, taču tā var arī pastiprināt saistības, ko rada mērķtiecīga ārpusaudzēja toksicitāte. Iepriekš tika ziņots, ka STEAP1 sistēmiskā ekspresija normālos cilvēka audos praktiski nav sastopama 18, 72, izņemot prostatas dziedzeri, kur ir aprakstīta membrānas ekspresija prostatas epitēlija šūnās27. Lai izpētītu STEAP1-BBζCAR T šūnu terapijas drošību preklīniskajā vidē, mēs izveidojām humanizētu STEAP1 peles modeli. hSTEAP1-KI peles modelis apkopoja cilvēka STEAP1 ekspresiju prostatas dziedzerī un parādīja ekspresiju virsnieru garozā. Pārliecinoši, ka STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapija ar devu, kas bija pietiekama, lai izraisītu pretvēža aktivitāti, neizraisīja acīmredzamu sistēmisku toksicitāti hSTEAP1-KI pelēm, tostarp mērķtiecīgu toksisku ietekmi uz audzēju cilvēka STEAP1 vietās. izteiksme. Mūsu pētījumos atkārtots prostatas vēža recidīva un progresēšanas mehānisms pēc STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapijas bija audzēja antigēna izvadīšana. No vienas puses, šis atklājums uzsver STEAP{40}}BBζ CAR T šūnu terapijas kopējo efektivitāti. Tomēr nav skaidrs, vai audzēja STEAP1 ekspresijas zudums ir saistīts tikai ar audzēja antigēna neviendabīgumu, vai arī pastāv STEAP1 ekspresijas adaptīva pazemināšana. Nesen publicētā publikācija parādīja, ka STEAP1 promotora metilēšana modulē STEAP1 ekspresiju, un epiģenētiskā deregulācija ar DNS metiltransferāzes un histona dezacetilāzes inhibīciju bija pietiekama, lai ievērojami paaugstinātu STEAP1 ekspresiju73. Ārstēšana ar epiģenētiskiem inhibitoriem kombinācijā ar STEAP1 CAR T šūnu terapiju varētu vienlaikus uzlabot audzēja STEAP1 ekspresiju un pārprogrammēt CAR T šūnas labvēlīgos pret izsīkumu rezistentos diferenciācijas stāvokļos74, 75, tādējādi mazinot audzēja antigēna zudumu un uzlabojot pretvēža efektivitāti prostatas vēža gadījumā. Mūsu pētījums arī norāda, ka STEAP1 spēlē funkcionālu lomu šūnu cikla progresēšanas un šūnu metabolisma regulēšanā prostatas vēža gadījumā. STEAP1 ir unikāls no citiem STEAP ģimenes locekļiem (STEAP2, 3 un 4), jo tam trūkst intracelulāra oksidoreduktāzes domēna22, kas nepieciešams metaloreduktāzes aktivitātei. Rezultātā STEAP1 homotrimeriem, bet ne heterotrimeriem ar citiem STEAP proteīniem, trūkst fermentatīvās funkcijas, lai samazinātu Fe3+ par Fe2+ un Cu2+ par Cu1+. Vēl ir jānosaka, vai un kā STEAP1 iesaistīšanās metālu jonos un šūnu metabolismā veicina vēža progresēšanu, un tas ir turpmākas izpētes vērts. Prostatas vēža imunoloģiski “aukstā” audzēja mikrovide ir galvenais šķērslis vēža imūnterapijas efektivitātei. Piemēram, izpētes pētījumi, kas saistīti ar PSMA CAR T šūnu terapijas I fāzes klīnisko izpēti, kas bruņota, lai izteiktu dominējošo negatīvo transformējošo augšanas faktora receptoru (TGF R-DN) mCRPC, parādīja, ka imūnsupresīvo signalizācijas molekulu ekspresija audzēja mikrovidē palielinās. pēc CAR T infūzijas13. Mūsu pētījumos būtisks atklājums bija saistība starp STEAP1 ekspresijas zudumu un antigēna apstrādes un prezentācijas samazināšanos gan STEAP1 knockout šūnās, gan STEAP1 antigēna zuduma audzējos pēc STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapijas. Tādējādi STEAP1 antigēna zudums prostatas vēža gadījumā veicina ne tikai tiešu rezistenci pret STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju, bet arī var ierobežot saimniekorganisma adaptīvo pretvēža imunitāti. Audzēja mērķa antigēna ekspresijas zudums un pārvēršanās imūnsupresīvākā stāvoklī ar palielinātu Tregs infiltrāciju un augstāku imūnsupresīvo molekulu ekspresiju tika novērota arī I fāzes pētījumā par EGFR-vIII CAR T šūnām dalībniekiem ar recidivējošu glioblastomu76. Būs nepieciešams papildu darbs, lai izprastu funkcionālos mehānismus, kas ir STEAP1 antigēna zuduma pamatā, un vispārīgāk, kā adoptētās CAR T šūnu terapijas dinamiskā iedarbība var veicināt antigēna zudumu un imūnrediģēšanu, modulējot audzēja-imūnās-stromas mijiedarbību cietos audzējos.
7. att.|CBD-IL-12 apvienošana ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapiju uzlabo vispārējo dzīvildzi un iekaisuma citokīnu līmeni. audzēja provokācijas eksperimenta shēma RM9-hSTEAP1 izplatītajam modelim hSTEAP1-KI/+ pelēm, kas pēta CBD-IL-12 un STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR T šūnu terapija. Cy ciklofosfamīds (iepriekšējai sagatavošanai). Izveidots ar BioRender.com. b Sērijveida dzīvā BLI hSTEAP1-KI/+ pelēm, kurām ir transplantētas RM9-hSTEAP1- fLuc metastādes un kas apstrādātas ar vienu intravenozu 5 × 106 netransducētu peles injekciju T šūnas vai STEAP1-mBBζ CAR T šūnas 0. dienā ar vai bez CBD-IL- 12 ārstēšanas katru nedēļu. Sarkanais X apzīmē mirušas peles. Tiek parādīta spožuma skala. (c) diagramma, kas parāda kopējās plūsmas kvantitatīvo noteikšanu laika gaitā no katras peles dzīvā BLI (b). d Peļu Kaplan-Meier izdzīvošanas līknes (b) ar statistisko nozīmīgumu, kas noteikts ar log-rank (Mantel-Cox) testu (p=0,002). e Diagrammas, kas parāda IFN- (pa kreisi, p=0.002) un TNF- (pa labi, p < 0,0001) citokīnu līmeni serumā, pamatojoties uz ProcartaPlex imūntestiem no hSTEAP1-KI/+ peļu retroorbitālās asiņošanas ( n=4 peles katrā grupā), kurām bija RM9-hSTEAP1-fLuc metastāzes pirms (0. diena) un pēc apstrādes (8. diena) ar netransducētām peles T šūnām vai peles STEAP{38} }mBBζ CAR T šūnas ar vai bez CBD-IL{40}} terapijas. Kļūdu josla apzīmē vidējo ar SEM. Panelam (e) p vērtības tika iegūtas no divvirzienu ANOVA ar Sidaka vairāku salīdzinājumu testu. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
8. att.|CBD-IL-12 apvienošana ar STEAP1-mBBζ CAR T šūnu terapiju pārprogrammē audzēja imūno mikrovidi un veicina antigēna prezentāciju un epitopu izplatīšanos. a STEAP1 (augšā), B2m (vidū) un CD3 (apakšā) RM9-hSTEAP1 plaušu audzēju IHC krāsojuma mikrogrāfijas pēc apstrādes ar peles netransducētām T šūnām vai STEAP1-mBBζ CAR T šūnām ar vai bez ārstēšanas ar CBD-IL{11}}. Mēroga joslas=50 µm. b Joslu diagramma, kas parāda CD3 pozitīvo šūnu IHC kvantitatīvo noteikšanu, kas infiltrējas metastātiskajos plaušu audzējos (n=4 audzēji katrā grupā). Vienvirziena ANOVA p=0.{{80}}021. Kļūdu josla apzīmē vidējo ar SD. Diagrammas, kas parāda (c) Ly6C−F4/{{20}} MHC-II+ frekvences (pa kreisi, vienvirziena ANOVA p=0.00{ {98}}5) un Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (pa labi, vienvirziena ANOVA p=0.0017) makrofāgi, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } MHC-II+ (pa kreisi, vienvirziena ANOVA p=0.0038) un Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (labajā pusē, vienvirziena ANOVA p=ns) makrofāgi, (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (vienvirziena ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eozinofīli (vienvirziena ANOVA p=0). 0008), un (g) Ly6G+ neitrofīli (vienvirziena ANOVA p=0.0035), kas normalizēti līdz kopējām CD45+ šūnām, kā noteikts ar daudzparametrisko plūsmas citometriju pēc apstrādes ar netransducētām T šūnām, STEAP{{67 }}mBBζ CAR T šūnas, netransducētas T šūnas un CBD-IL-12, un STEAP1- mBBζ CAR T šūnas un CBD-IL-12 pie maksimālās ārstēšanas atbildes reakcijas (nadir) un audzēja recidīva (recidīvs). h Joslu diagrammas, kas attēlo Simpsona klonalitāti kā TCR repertuāra “vienmērīguma” mēru, kas analizēts ar TCRB sekvencēšanu uz audzēju infiltrējošām šūnām, kas savāktas no pelēm (a). n=4 audzēji katrā grupā. P vērtības netransducētajām T šūnām + CBD-IL-12 salīdzinājumā ar netransducētām T šūnām un STEAP1-mBBζ CAR T šūnām ir attiecīgi 0,008 un 0,02; un STEAP1-mBBζ CAR T šūnas + CBD-IL-12 salīdzinājumā ar netransducētajām un STEAP1-mBBζ CAR T šūnām ir attiecīgi 0,004 un 0,01. Kļūdu josla apzīmē vidējo ar SD. Paneļiem (c–g) n=3 audzēju grupā, *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001, p-vērtības paneļos (b–h) ir no vienvirziena ANOVA ar Danna vairāku salīdzinājumu testu. Avota dati tiek sniegti avota datu failā.
Lai paplašinātu pretvēža reakciju, mēs pētījām CBD-IL-12 sistēmisku ievadīšanu kombinācijā ar STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju izplatītā, singēnā RM9-hSTEAP1 audzēja modelī hSTEAP. 1-KI pelēm, lai tuvinātu mCRPC imūnsupresīvo raksturu, pamatojoties uz iepriekšēju RM9 kā vāji imunogēna modeļa raksturojumu57,77. Vienlaicīga ārstēšana ar CBD-IL12 uzlaboja vispārējo dzīvildzi, citokīnu veidošanos, audzēja antigēnu prezentāciju un intratumorālo T šūnu daudzveidību, kas atbilst epitopu izplatībai. Rūpīga audzēja imūnās mikrovides izpēte atklāja, ka CBD-IL-12 pievienošana STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapijai izraisa audzēja stromas reversiju un uzlabo aktivētos makrofāgus un cDC1, vienlaikus samazinot ar audzēju saistīto neitrofilu skaitu. Tomēr mūsu pētījumos izārstēšana netika sasniegta, un mēs izceļam iespējamos kompensējošos, adaptīvos rezistences un audzēja progresēšanas mehānismus, tostarp paaugstinātu imūnsupresīvo neitrofilu un cDC2 biežumu, kas var veicināt Treg indukciju. Ir svarīgi atzīmēt, ka var būt nepieciešama turpmāka CBD-IL-12 devas un ievadīšanas grafika optimizācija, lai palielinātu pretvēža atbildes reakciju. Tomēr šie rezultāti atbalsta kombinatorisko imūnterapijas metožu izpēti, piemēram, CAR T šūnu apbruņošanu, lai ekspresētu rekombinantos citokīnus78 (piemēram, IL-2, IL-12, IL-15 vai IL{{24 }}), vienlaicīga ārstēšana ar imūnmodulatoriem (piemēram, anti-PD-1/PD-L1 vai anti-CTLA4) vai uz audzēju vērsta staru terapija, lai pārveidotu prostatas vēža audzēja mikrovidi un uzlabotu CAR T šūnu efektora funkciju. Kamēr šis manuskripts tika sagatavots, pētījums no grupas Norvēģijā ziņoja par STEAP1 CAR T šūnu terapijas preklīnisko attīstību ar pretvēža aktivitāti zemādas 22Rv1 modelī pelēm ar novājinātu imunitāti79. Ziņotais STEAP1 CAR atšķiras no STEAP1-BBζ CAR, jo tajā ir iekļauts sintētisks scFv, ko sauc par Oslo1, un CD8 viras un transmembrānu domēns. Vēl viena atšķirīga iezīme ir tāda, ka STEAP1-BBζ CAR T šūnas tiek sagatavotas kā definēts produkts ar normālu CD4/CD8 T šūnu attiecību, savukārt Oslo1 STEAP1 CAR T šūnas nav sagatavotas. Nav ziņots par rezistences mehānismiem un drošības pētījumiem, kas saistīti ar Oslo1 STEAP1 CAR T šūnu terapiju. Tomēr būs interesanti redzēt, kā šīs atšķirības CAR inženierijā un šūnu produktu sastāvā var ietekmēt pretaudzēju efektivitāti, noturību un drošību gan Oslo1 STEAP1 CAR T šūnu terapijai, gan mūsu STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapijai. programmas tiek tulkotas klīnikā. Mūsu pētījumu rezultāti ir noveduši pie partnerības ar Nacionālā vēža institūta (NCI) Eksperimentālās terapijas (NExT) programmu, lai pārvērstu STEAP1-BBζ CAR T šūnu terapiju par pirmo izmēģinājumu ar cilvēkiem vīriešiem ar mCRPC. Drošības un efektivitātes signāli no šī agrīnās fāzes klīniskā pētījuma palīdzēs noteikt, vai var būt vērtīga arī šīs terapeitiskās pieejas izpēte citiem vēža veidiem, kas ļoti ekspresē STEAP1.
Atsauces
1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Cancer statistika, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).
2. Ārmstrongs, AJ et al. Piecu gadu dzīvildzes prognoze un drošības rezultāti, lietojot enzalutamīdu vīriešiem ar iepriekš ķīmijterapiju nesaņemtu metastātisku, kastrācijas rezistentu prostatas vēzi no PREVAIL izmēģinājuma. Eiro. Urol. 78, 347–357 (2020).
3. Fizazi, K. et al. Abiraterons plus prednizons metastātiska, kastrācijai jutīga prostatas vēža gadījumā. N. Engl. J. Med. 377., 352.–360. (2017).
4. Scher, HI et al. Paaugstināta dzīvildze ar enzalutamīdu prostatas vēža gadījumā pēc ķīmijterapijas. N. Engl. J. Med. 367, 1187–1197 (2012).
5. Parker, C. et al. Alfa emitētāja rādijs-223 un izdzīvošana metastātiska prostatas vēža gadījumā. N. Engl. J. Med. 369, 213–223 (2013).
6. Sartor, O. et al. Lutēcijs-177–PSMA-617 pret metastātisku kastrāciju rezistentu prostatas vēzi. N. Engl. J. Med. 385, 1091–1103 (2021).
7. Kantoff, PW et al. Sipuleucel-T imūnterapija pret kastrāciju rezistentu prostatas vēzi. N. Engl. J. Med. 363, 411–422 (2010).
8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Driving CAR T-cells forward. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).
9. Weiner, GJ Labāku monoklonālo antivielu terapijas veidošana. Nat. Rev. Cancer 15, 361–370 (2015).
10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-šūnu terapija B-šūnu limfomām: pieejamo produktu klīnisko pētījumu rezultāti. Terapeitiskā Adv. Hematols. 10, 2040620719841581 (2019).
11. Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T šūnu terapija: pašreizējie ierobežojumi un iespējamās stratēģijas. Asins vēzis J. 11, 69 (2021).
12. Slovins, SF et al. P-PSMA-101 CAR-T šūnu 1. fāzes pētījums pacientiem ar metastātisku pret kastrāciju rezistentu prostatas vēzi (mCRPC). Dž.Klins. Oncol. 40, 98–98 (2022).
13. Narajans, V. et al. PSMA mērķa TGF nejutīgas bruņu CAR T šūnas metastātiska kastrācijas rezistenta prostatas vēža gadījumā: 1. fāzes pētījums. Nat. Med. 28, 724–734 (2022).
14. Paschalis, A. et al. Prostatas specifiskā membrānas antigēna neviendabīgums un DNS remonta defekti prostatas vēža gadījumā. eiro. Urol. 76, 469–478 (2019).
15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Driving CARs on the uneven road of antigen heterogeneity in solid tumors. Curr. Atzinums. Immunol. 51, 103–110 (2018).
16. Morgan, RA et al. Gadījuma ziņojums par nopietnu nevēlamu notikumu pēc T šūnu ievadīšanas, kas transducētas ar himērisku antigēna receptoru, kas atpazīst ERBB2. Mol. Tur. J. Am. Soc. Gene Ther. 18, 843–851 (2010).
17. Lee, JK et al. Sistēmiskā virsmas profilēšana identificē mērķa antigēnus imūnterapijai progresējoša prostatas vēža apakštipos. Proc. Natl. Akad. Sci. USA 115, E4473–e4482 (2018).
18. Hubert, RS et al. STEAP: prostatas specifisks šūnu virsmas antigēns, kas ļoti izteikts cilvēka prostatas audzējos. Proc. Natl Acad. Sci. USA 96, 14523–14528 (1999).
19. Nolan-Stevaux, O. Abstract DDT02-03: AMG 509: Jauna, humanizēta, pagarināts pussabrukšanas periods, bispecifiska STEAP1 × CD3 T šūnas, kas piesaista XmAb® 2+1 antivielu. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).
20. Grunewald, TG et al. Augsta STEAP1 ekspresija ir saistīta ar uzlabotiem rezultātiem Ewinga sarkomas pacientiem. Ann. Oncol. Izslēgts. J. Eur. Soc. Med. Oncol. 23, 2185–2190 (2012).
21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 ir pārāk izteikts vēža gadījumā: daudzsološs terapeitiskais mērķis. Biochem. Biofizija. Res. Commun. 429, 148–155 (2012).
22. Oosterheert, W. & Gros, P. Krioelektronu mikroskopijas struktūra un potenciālā enzīmu funkcija cilvēka sešu transmembrānu prostatas epitēlija antigēnam 1 (STEAP1). J. Biol. Chem. 295, 9502–9512 (2020).
23. Jiao, Z. et al. Prostatas 1 ekspresijas sešu transmembrānu epitēlija antigēns veicina olnīcu vēža metastāzes, palīdzot progresēt pārejai no epitēlija uz mezenhimālu. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).
24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 ir pārmērīgi izteikts prostatas vēža un prostatas intraepiteliālās neoplāzijas bojājumu gadījumā, un tas ir pozitīvi saistīts ar Glīsona punktu skaitu. Uroloģiskajā onkoloģijā: semināri un oriģinālie izmeklējumi. sēj. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).
25. Huo, S.-f. un citi. STEAP1 atvieglo plaušu adenokarcinomas metastāzes un epitēlija-mezenhimālo pāreju, izmantojot JAK2 / STAT3 signalizācijas ceļu. Biosci. Rep. 40, BSR20193169 (2020).
26. Gomes, IM et al. STEAP1 iznīcināšana kavē šūnu augšanu un izraisa apoptozi LNCaP prostatas vēža šūnās, novēršot androgēnu iedarbību. Med. Oncol. 35, 1–10 (2018).
27. Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, CR STEAP proteīni: no struktūras līdz lietojumiem vēža terapijā. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).
28. Danila, DC et al. I fāzes pētījums par DSTP3086S, antivielu un zāļu konjugātu, kura mērķis ir sešu transmembrānu epitēlija antigēns prostatas 1, metastātiska kastrācijas rezistenta prostatas vēža gadījumā. Dž.Klins. Oncol. Izslēgts. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518–3527 (2019).
29. Kelly, WK et al. I fāzes pētījums par AMG 509, STEAP1 x CD3 T šūnu, kas piesaista XmAb 2+1 imūnterapiju, pacientiem ar metastātisku pret kastrāciju rezistentu prostatas vēzi (mCRPC). Dž.Klins. Oncol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).
30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Jauna spēcīga anti-STEAP1 bispecifiska antiviela, lai novirzītu T šūnas vēža imūnterapijai. J. Immunother. Cancer 9, e003114 (2021).
31. Schober, SJ et al. MHC I klase — ierobežotas TCR transgēnās CD4(+) T šūnas pret STEAP1, kas mediē vietējo Ewinga sarkomas audzēju kontroli in vivo. Cells 9, 1581 (2020).
32. Roudier, MP et al. Kaulu metastātiskas prostatas karcinomas beigu stadijas fenotipiskā neviendabība. Hum. Pathol. 34, 646–653 (2003).
33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ Prostatas 1 sešu transmembrānas epitēlija antigēnu samazina dzimumhormoni prostatas šūnās. Prostate 73, 605–613 (2013).
34. Sharp, A. et al. Androgēnu receptoru savienojuma varianta -7 ekspresija parādās ar kastrācijas rezistenci prostatas vēža gadījumā. Dž.Klins. Invest. 129, 192–208 (2019).
35. Bakht, MK et al. Prostatas vēža neiroendokrīnā diferenciācija izraisa PSMA nomākšanu. Endokr.-Relat. Cancer 26, 131–146 (2018).
36. Ihlaseh-Catalano, SM et al. STEAP1 proteīna pārmērīga ekspresija ir neatkarīgs marķieris bioķīmiskā atkārtošanās gadījumā prostatas karcinomas gadījumā. Histopatology 63, 678–685 (2013).
37. Gomes, IM et al. STEAP1 iznīcināšana kavē šūnu augšanu un izraisa apoptozi LNCaP prostatas vēža šūnās, novēršot androgēnu iedarbību. Med. Oncol. 35, 40 (2018).
38. Logans, AC et al. Faktori, kas ietekmē lentivīrusu vektoru titru un infekciozitāti. Hum. Gene Ther. 15, 976–988 (2004).
39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Hematopoētisko cilmes šūnu gēnu terapija: progress un gūtās atziņas. Cell Stem Cell 21, 574–590 (2017).
40. Larson, SM et al. Hematopoētisko cilmes šūnu gēnu modifikācijas ar himērisko antigēnu receptoriem pirmsklīniskā attīstība vēža imūnterapijai. Hum. Vakcīna imūnsistēma. 13, 1094–1104 (2017).
41. Salter, AI et al. Himērisko antigēnu receptoru signalizācijas fosfoproteomiskā analīze atklāj kinētiskās un kvantitatīvās atšķirības, kas ietekmē šūnu darbību. Sci. Signāls. 11, eaat6753 (2018).
42. Majzner, RG et al. Antigēna blīvuma prasības pielāgošana CAR T-šūnu aktivitātei. Vēža disks. 10, 702–723 (2020).
43. Challita-Eid, PM et al. Monoklonālās antivielas pret sešiem transmembrānas prostatas epitēlija antigēniem-1 inhibē starpšūnu komunikāciju in vitro un cilvēka audzēja ksenotransplantāta augšanu in vivo. Cancer Res. 67, 5798–5805 (2007).
44. Hudecek, M. et al. Himērisko antigēnu receptoru nesignalizācijas ekstracelulārais starplikas domēns ir izšķirošs in vivo pretvēža aktivitātei. Cancer Immunol. Res. 3, 125–135 (2015).
45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 un STEAP1B ekspresija prostatas šūnu līnijās un iespējamā STEAP1 regulēšana ar pēctranskripcijas un pēctranslācijas mehānismiem. Genes Cancer 5, 142–151 (2014).
46. Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: vienprātības prognozēšana membrānas proteīna topoloģijā. Nucleic Acids Res. 37, W465–W468 (2009).
47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Transmembrane proteīnu topoloģijas prognozēšana ar slēptu Markova modeli: pielietojums, lai pabeigtu genomus. J. Mol. Biol. 305, 567–580 (2001).
48. Long, AH et al. 4-1BB kostimulācija uzlabo T šūnu izsīkumu, ko izraisa himērisko antigēnu receptoru tonizējoša signalizācija. Nat. Med. 21, 581–590 (2015).
49. Berger, C. et al. Efektoru CD8+ T šūnu, kas iegūtas no centrālās atmiņas šūnām, adoptīva pārnešana nodrošina noturīgu T šūnu atmiņu primātiem. Dž.Klins. Izpētīt. 118, 294–305 (2008).
50. Gattinoni, L. et al. Cilvēka atmiņas T šūnu apakškopa ar cilmes šūnām līdzīgām īpašībām. Nat. Med. 17, 1290–1297 (2011).
51. Xu, Y. et al. Cieši saistītās T-atmiņas cilmes šūnas korelē ar CAR.CD19-T šūnas saglabā IL-7 un IL-15 in vivo. Blood 123, 3750–3759 (2014).
52. Cieri, N. et al. IL-7 un IL-15 dod norādījumu ģenerēt cilvēka atmiņas cilmes T šūnas no naiviem prekursoriem. Blood 121, 573–584 (2013).
53. Hansel, DE et al. Kopīga TP53 gēna mutācija morfoloģiski un fenotipiski atšķirīgā vienlaicīgā primārajā sīkšūnu neiroendokrīnajā karcinomā un prostatas adenokarcinomā. Prostate 69, 603–609 (2009).
54. Cuzick, J. et al. RNS ekspresijas paraksta prognostiskā vērtība, kas iegūta no šūnu cikla proliferācijas gēniem pacientiem ar prostatas vēzi: retrospektīvs pētījums. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).
55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA PAGE-1 un GAGE-7 izolēšana un raksturojums. Jauni gēni, kas izteikti LNCaP prostatas vēža progresēšanas modelī, kuriem ir homoloģija ar melanomu saistītajiem antigēniem. J. Biol. Chem. 273, 17618–17625 (1998).
56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Progression to androgen nesensitivity in a new in vitro mouse model for prostatas vēzi. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403–413 (1995).
57. Murad, JP et al. Iepriekšēja sagatavošana modificē TME, lai uzlabotu cieto audzēju CAR T šūnu efektivitāti un endogēno aizsargājošo imunitāti. Mol. Tur. J. Am. Soc. Gene Ther. 29, 2335–2349 (2021).
58. Brunda, MJ et al. Interleikīna 12 pretvēža un antimetastātiskā aktivitāte pret peļu audzējiem. J. Exp. Med. 178, 1223–1230 (1993).