Cikloastragenola mērķēšana uz katepsīnu B uzlabo CD8 T šūnu pretvēža imunitāti, inhibējot MHC-I degradāciju. 1. daļa

KOPSAVILKUMS

FonsAudzēja antigēnu zudums un CD8 T šūnu izsīkums, ko izraisa PD-1/PD-L1 ceļš, ir svarīgi faktori audzēja imūnās izkļūšanai. Pēdējos gados arvien vairāk tiek veikti pētījumi par tradicionālo ķīniešu medicīnu audzēju ārstēšanā. Ir konstatēts, ka cikloastragenolam (CAG), efektīvai Astragalus membranaceus aktīvajai molekulai, piemīt pretvīrusu, pretnovecošanās, pretiekaisuma un citas funkcijas. Tomēr tā pretvēža iedarbība un mehānisms nav skaidrs.

Cistanche glikozīds var arī palielināt SOD aktivitāti sirds un aknu audos un būtiski samazināt lipofuscīna un MDA saturu katrā audā, efektīvi attīrot dažādus reaktīvos skābekļa radikāļus (OH-, H2O₂ utt.) un aizsargājot no izraisītiem DNS bojājumiem. ar OH-radikāļiem. Cistanche feniletanoīda glikozīdiem ir spēcīga brīvo radikāļu attīrīšanas spēja, augstāka reducējošā spēja nekā C vitamīnam, tie uzlabo SOD aktivitāti spermas suspensijā, samazina MDA saturu un zināmā mērā aizsargā spermas membrānas darbību. Cistanche polisaharīdi var uzlabot SOD un GSH-Px aktivitāti eksperimentāli novecojošu D-galaktozes izraisītu peļu eritrocītos un plaušu audos, kā arī samazināt MDA un kolagēna saturu plaušās un plazmā, kā arī palielināt elastīna saturu. laba attīrošā iedarbība uz DPPH, pagarina hipoksijas laiku novecojošām pelēm, uzlabo SOD aktivitāti serumā un aizkavē plaušu fizioloģisko deģenerāciju eksperimentāli novecojošām pelēm Ar šūnu morfoloģisko deģenerāciju eksperimenti ir parādījuši, ka Cistanche ir labas antioksidanta spējas un tas var būt zāles ādas novecošanās slimību profilaksei un ārstēšanai. Tajā pašā laikā ehinakozīdam Cistančā ir ievērojama spēja attīrīt DPPH brīvos radikāļus un novērst reaktīvās skābekļa sugas un novērst brīvo radikāļu izraisītu kolagēna noārdīšanos, kā arī tam ir laba iedarbība uz timīna brīvo radikāļu anjonu bojājumiem.

Noklikšķiniet uz cistanche plusi un mīnusi

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】

MetodesCAG pretvēža iedarbība tika pētīta MC38 un CT26 peles transplantēto audzēju modeļos. CAG pretvēža iedarbība tika tālāk analizēta, izmantojot vienas šūnas multi-omikas sekvencēšanu. Lai atrastu CAG mērķa proteīnu, tika izmantota uz mērķi reaģējoša pieejamības profilēšanas tehnoloģija. Pēc tam CAG pretvēža mehānisms tika pētīts, izmantojot konfokālo mikroskopiju, imunoprecipitāciju un mutantu plazmīdu transfekciju. Visbeidzot, tika pētīta CAG un PD-1 antivielu kombinētā pretvēža iedarbība pelēm vai organoīdiem.

RezultātiMēs noskaidrojām, ka CAG efektīvi inhibēja audzēja augšanu in vivo. Mūsu vienšūnu multi-omikas atlants parādīja, ka CAG veicināja audzēja šūnu virsmas antigēnu prezentāciju un to raksturoja uzlabota CD8 plus T šūnu nogalināšanas funkcija. Mehāniski CAG saistījās ar tā mērķa proteīnu katepsīnu B, kas pēc tam inhibēja galvenā histokompatibilitātes kompleksa I (MHC-I) lizosomālo degradāciju un veicināja MHC-I agregātu n uz šūnu membrānu, pastiprinot audzēja antigēna priekšstaciju. . Tikmēr CAG kombinācija ar PD-1 antivielām efektīvi uzlaboja audzēju nogalinošo CD8 plus T šūnu ksenotransplantātu pelēm un kolorektālā vēža organoīdiem. Secinājums Mūsu dati pirmo reizi ziņoja, ka katepsīna B pazemināta regulēšana nodrošina pretvēža imunitāti un nosaka dabiskā produkta CAG pretvēža mehānismu.

IEVADS

Kolorektālais vēzis ir viens no visbiežāk sastopamajiem vēža veidiem visā pasaulē. Tās sastopamības biežums un mirstības līmenis ir viens no trim galvenajiem, nopietni apdraudot cilvēku dzīvību un veselību.1 Izplatītas ārstēšanas metodes ietver ķirurģisku ķīmijterapiju un staru terapiju, mērķtiecīgus medikamentus un imūnterapiju.2–4 Tomēr vēža šūnām parasti tiek zaudēti virsmas antigēni un tās ekspresē. augsts inhibējošo molekulu līmenis, lai izvairītos no imūno šūnu uzraudzības. Tāpēc, lai atrisinātu audzēja imūnsistēmas izbēgšanas problēmu, pētnieki ir izstrādājuši imūnkontroles punktu inhibitorus un neoantigēnu terapiju, lai bloķētu vēža šūnu aizsegšanu imūnās šūnās.5–8 Lai gan imūnās kontrolpunkta inhibitori var atjaunot noplicinātās imūnās šūnas, vēža virsmas antigēnu. šūnas nav būtiski imvedētas. Tāpēc ir īpaši svarīgi atrast zāles, kas var veicināt audzēja virsmas antigēnu prezentāciju. Vēža šūnu atpazīšana ar citotoksiskām CD8 plus T šūnām ir atkarīga no TCR/CD3/lielākā histokompatibilitātes kompleksa (MHC-I) ceļa. TCR saņem dendritisko šūnu/vēža šūnu membrānas proteīna CI antigēnu un pārraida signālu, lai cieši savienotu CD3, kas pēc tam izplatās dziļāk citoplazmā.{10}} Vienlaikus ar CD28/B7 signāla aktivizēšanu. , CD8 plus T šūnas var tikt koaktivētas, lai atpazītu un iznīcinātu vēža šūnas.11 Nesenie pētījumi atklāja, ka audzēja progresēšanas procesā lizosomas samazina MHC-I agregāciju uz vēža šūnu virsmas, kas nav efektīvi. klāt antigēnus.{16}} Liu et al ziņoja, ka PCSK9 inhibēšana var novērst MHC-I noārdīšanos lizosomās un ļaut MHC-I atgriezties šūnu membrānā, lai parādītu antigēnus.12 Tāpēc antigēnu prezentēšanas funkcijas atjaunošana. MHC-I ir īpaši svarīgi, lai bloķētu audzēja imūnsistēmu.

Arvien vairāk pētījumu atklāj, ka tradicionālās ķīniešu medicīnas aktīvo molekulu pielietošanai pretvēža iejaukšanās ir lielas perspektīvas.{0}} Cikloastragenols (CAG) ir efektīva Astragalus membranaceus aktīvā molekula, kurai piemīt pretvīrusu, antibakteriāla un pretvēža iedarbība. iekaisuma un citas farmakoloģiskas iedarbības, taču tās pretvēža iedarbība tiek ziņots reti.16–19 Šajā pētījumā mēs atklājām, ka CAG inhibēja resnās zarnas vēža audzēju tranzīto audzēju augšanu. Mehānisms galvenokārt bija saistīts ar MHC-I degradācijas kavēšanu, ko veic katepsīns B (CTSB), veicinot vēža šūnu antigēnu prezentāciju un pēc tam uzlabojot CD8 plus T šūnu nogalināšanas spēju.

MATERIĀLI UN METODES

Antivielas un reaģenti

CAG was obtained from Yongjian Pharmaceutical Technology (Jiangsu, China, purity >99 procenti). CTSB (Cat#12216-1-AP, PRID: AB_2086929), HLA (Cat#15240-1-AP, PRID: AB_1557426), aktīna (Kat#{{) antivielas 5}}Ig, PRID: AB_2782959 ), Tubulīns (Kat. Nr tika iegādāti no Proteintech. H2-Kd (Cat#sc-53852, PRID: AB_784514), LAMP1 (Cat#sc- 20011, PRID: AB_626853) antivielas, un CTSB (Cat#sc-365558, PRID: AB_10842446) tika iegādāti no Santa Cruz Biotechnology. Antiviela no Ki-67 (kat. Nr. 12202, PRID: AB_2620142) tika iegādāta no Cell Signaling Technology. Na/K ATPāzes antiviela (Cat# ab3528, RRID: AB_303877) tika iegādāta no Abcam. Plūsmas citometrijas antivielas CD45-V500 (Cat#561487, RRID: AB_1069704 6), CD3-APC (Cat#345767, RRID: AB_2833003) un CD{ {31}}PerCP (Cat#345774, RRID: AB_2868802) tika iegādāti no BD Bioscience. Gzmb-FITC plūsmas citometrijas antiviela (kata Nr. 515403, RRID: AB_2114575) tika iegādāta no BioLegend. NK1.1-PE-Cy7 (Cat#25-5941-81, RRID:AB_469664) un IFN- -PE (Kat#12-7311-81, RRID) plūsmas citometrijas antivielas :AB_466192) tika iegādāti no Thermo Fisher Scientific. DMEM barotne (Cat Nr. 01-052-1ACS), PenicilinStreptomicīns (Kat. Nr. 15140122) un Fetal Bovine Serum (Cat#C04001-500) tika iegādāti no Biological Industries. Kazas serums (Cat#88RNG001) un Pierce BCA proteīna testa komplekts (Cat#23225) tika iegādāti no Thermo Fisher Scientific. Antivielas pret cilvēka PD-1 (Cat#BE0188, RRID: AB_1095031 8) un anti-peles PD-1 (Cat#BE0146, RRID: AB_1094905 3) tika iegādāti no Bio X šūnas. MACS audzēja audu disociācijas komplekts (kat. Nr. 130-095-929) tika iegādāts no Miltenyi Biotec.

Šūnu kultūra

Peļu resnās zarnas vēža šūnu līnijas MC38 un CT26 tika uzturētas mūsu laboratorijā.20 Cilvēka resnās zarnas vēža l līnijas HCT-116 tika iegūtas no Ķīnas Zinātņu akadēmijas tipa kultūras kolekcijas (Šanhaja, Ķīna). MC38, CT26 un HCT-116 šūnas tika kultivētas DMEM barotnē, kas satur 10 procentus liellopu augļa seruma un 1 procentu penicilīna/streptomicīna 37 grādu temperatūrā 5 procentu CO2 inkubatorā.

Transplantācijas audzēja eksperiments

Sešas astoņas nedēļas vecas mātītes C57BL/6JGpt peles, BALB/c peles un BALB/,c kailas peles tika iegādātas no GemPharmatech (Nanjing, Ķīna). MC38 vai CT26 vēža šūnas (1 × 106) tika inokulētas subkutāni katrā pelē. Kad audzējs izaug līdz 100 mm3, mikrofons tika nejauši sadalīts fosfātu buferšķīduma (PBS) grupā (piemēram, reizi dienā) un CAG grupā (piemēram, 50 mg/kg vienu reizi dienā). Audzēja tilpumi tika noteikti ar kalibra mērījumu, izmantojot formulu V=garums × platums2 /2. Kad PBS grupas peļu audzēja tilpums sasniedza 1000 mm3, peļu audzējs tika izņemts, nofotografēts un nosvērts.

Vienas šūnas disociācija no peles vienas šūnas RNS/ATACseq

Cietie audzēji no pelēm tika sagremoti, izmantojot audzēja disociācijas komplektu, lai iegūtu vienas šūnas vienšūnas. Single celSingle-cell s ar koncentrāciju 1000 šūnas/1000 šūnas, kas ielādētas uz 10×genomics hroma kontrollera vienas šūnas vienšūnas, ievērojot 10×genomics ražotāja protokolu. Reversās transkripcijas reaģenti, svītrkoda gēla lodītes un sadalošā eļļa tika sajaukti ar gēna šūnām, lai radītu gēla lodītes emulsijās (GEM) reversajai transkripcijai. scRNA-seq datu pirmapstrāde un kvalitātes kontrole.

Pamatojoties uz peles atsauces genomu GRCm38 (mm10), CellRanger V.4.0.0 cauruļvads (10×Genomics), lai apstrādātu vienas šūnas RNS secības dati katram eksperimentam (GSE197229). Digitālās gēnu ekspresijas matricas tika atlasītas R (V.4.{13}}.4), izmantojot Seurat (V.4.0.0) pakotni.21 Pirms dBeforem analīzes šūnas tika filtrētas pēc UMI numura (<100,000 UMIs), gene number (<6500 genes), and mitochondrial gene percentage ('percentage. MT'less than 10%). Normalization was performed with the SCTransform function with regression of percentage the of mitochondrial genes.22 For integration, 2000 shared highly variable genes were identified using the t SelectIntegrationFeatures function.23 Integration anchors were identified based on these genes using the FindIntegrationAnchors34 function with an'SCT'normalization method. The data were then integrated using the IntegrateData function. Principal component analysis (PCA) and t-distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) dimension reduction with the top 30 principal components were performed. A nearest-neighbor graph using the 30 dimensions of the PCA reduction was calculated using FindNeighbors, followed by clustering using FindClusters with a resolution of 0.8. Candidate Marker genes for each cell cluster were identified by the FindAllMarkers function. For each cluster of cells, up-specific differentially expressed genes were identified using the Wilcoxon Rank Sum test as implemented in FindAllMarkers.

SeaTac-seq datu pirmapstrāde un kvalitātes kontrole

Vienas šūnas ATAC-seq datus (GSE197229) iepriekš apstrādāja šūnu ranger-at (V.2.0.0) ar count komandrindu. Turpmākajai scATAC-seq datu apstrādei un analīzei izmantojām ArchR (V.1.0.1) pakotni.24 Pēc tam genoma anotācijai izmantojām funkciju addArchRGethe nome ('mm10') un izveidojām arrow fails ar cre ArrowFiles funkciju ar noklusējuma parametriem. Pēc tam mēs izmantojām filtruDoublets funkciju, lai izdzēstu potenciālos dubletus, un izveidojām ArchR projektu, izmantojot funkciju ArchRProject ar noklusējuma parametriem. Pēc tam mēs izmantojām Harmony pakotni, lai noņemtu pakešu efektu, izmantojot funkciju addHarmony.25 Lai samazinātu izmēru, mēs izmantojam funkciju addIterativeLSI programmā ArchR, lai palaistu ar def t parametriem. Vienšūnas iegulšanai mēs atlasījām redukētoDims objektu ar harmoniju un vizualizācijai izmantojām funkciju addTSNE ar parametru “perplexity=30”.

Integrēta siRNA-seq un scATAC-seq datu analīze

To integrate scATAC-seq data with matched scRNA-seq data, we first used the FindTransferAnchors function from the Seurat package and aligned the data with the addGeneIntegrationMatrix function in ArchR with  'unconstrained integration' mode. From the result, we found that most of the predicted scores were>0.5. Lai uzlabotu prognožu precizitāti, lai labāk integrētu abas datu kopas, mēs vēlreiz integrējām scATAC-seq un scRNA-seq datus, izmantojot “ierobežotās integrācijas” režīmu. Īsumā, mēs anotējām scATAC-seq datus ar šūnu tipiem, pamatojoties uz scATAC-seq gēnu rādītājiem. Pēc tam mēs izveidojām ierobežotu sarakstu tā, ka gēnu ekspresijas līdzība tika aprēķināta tikai tajā pašā šūnu tipā gan scATAC-seq, gan scRNA-seq. Neuzraudzīta klasterizācija ar t-SNE atklāja 13 apakššūnu kopas, kuras tiešsaistes papildu 1. tabulā atzīmēja ar zināmiem vai iespējamiem marķieriem.

Pseidolaika līnijas trajektorija

Vēža šūnu šūnu līnijas trajektorija tika izsecināta, izmantojot Monocle2 (V.2.18.0) R pakotni.26 Monocīti apgūst skaidru galveno grafiku no vienas šūnas genomikas datiem, izmantojot Reversed Graph Embedding, lai sakārtotu šūnas, tādējādi atrisinot sarežģītās problēmas. Mēs izmantojām funkciju ''differentialGeneTest'', lai no katra klastera iegūtu DEG, un pēc šūnu trajektorijas konstruēšanas mēs pseidolaikā noteicām atšķirīgi izteiktos gēnus. Visi no pseido laika atkarīgie gēni tika vizualizēti, izmantojot diagrammas _pseidolaika_ siltuma kartes funkciju, izmantojot CellDataSet objektu. Lineage trajektoriju diagrammas un gludas izteiksmes līknes, pamatojoties uz CellDataSet, tika ģenerētas, izmantojot plot_cell_trajektoriju un plot_gēnus_attiecīgi_pseidolaikā.28

Vienas šūnas kopijas numura variācijas izsaukšana

Lai identificētu ļaundabīgas šūnas ar klonālām liela mēroga hromosomu kopiju skaita variācijām (CNV), mēs izmantojām inferCNV R paketi, lai secinātu katras šūnas ģenētiskos profilus, pamatojoties uz lielu gēnu kopu vidējo ekspresiju katrā audzēja genoma hromosomu reģionā, salīdzinot ar Normālas šūnas.29 Paraugam atsevišķi imūnās šūnas tika izmantotas kā atsauce, lai novērtētu CNV ar vēzi saistītajās šūnās.

Bagātināšanas analīze

KEGG ceļa un GO anotāciju analīzes tika veiktas, izmantojot R pakotnes clusterProfiler (V.3.11.1) ar parametriem PValueCutoff=0.05, PAdjustMethod=BH, QValueCutoff{{6} }.05, MingsSize=10 un MaxGSSize=500.20 Gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA) tika izmantota, izmantojot 50 pazīmju gēnu kopas (h.all.V.7.4.symbols. gmt), lai identificētu ievērojami bagātinātus. funkcionālie ceļi, izmantojot GSEA programmatūru (V.4.1.0), ar nominālās P vērtības skrīninga kritērijiem<0.05and false discovery rate q<0.250.30

Kvantitatīvā reāllaika PCR analīze

MC38 un HCT-116 šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs 6 stundas un pēc tam apstrādātas ar CAG vēl 24 stundas. Šūnas trīs reizes mazgāja ar aukstu PBS un centrifugēja pie 180g 5 minūtes 4 grādu temperatūrā. Tajā pašā laikā pēc audzēja audu slīpēšanas. Kopējā RNS tika ekstrahēta no MC38, HCT-116 šūnām un audzēja audiem, izmantojot TRIzol reaģentu saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Reakcijas tilpums bija 20 µL, kas satur: 1 µg RNS, 5 µL 5×Hiscript III qRT SuperMix un RNase Free dH2O. cDNS tika pakļauts kvantitatīvai PCR, ar reakcijas tilpumu 10 µL ar 1 µL cDNS, 5 µL 0.5 µL qPCR 5µM maisījumu. (Forward and Reverse) un 3,25 µL bez RNāzes dH2O. Praimerus sintezēja GenScript Biotech Corporation (Nanjing, Ķīna) saskaņā ar šādām secībām (tiešsaistes papildu tabula 2).

Mērķa noteikšana, izmantojot uz mērķi reaģējošu pieejamības profilēšanas pieeju

CAG saistošo proteīnu skrīnings tika veikts, kā aprakstīts iepriekš.{1}} Īsumā, uz mērķi reaģējošās pieejamības profilēšanas (TRAP) pieeja tika izmantota, lai atklātu CAG saistošos proteīnus šūnu vidē, pārraugot ligandu iesaistīšanās izraisīto lizīnu. pieejamība mainās proteomu līmenī. Īsumā divus šūnu traukus apstrādāja attiecīgi ar 10µM CAG un dimetilsulfoksīdu (DMSO). Pēc 1-stundu ilgas inkubācijas šūnas tika caurlaidīgas ar M-PER buferi (Thermo Scientific), un iegūtie lizāti tika kovalenti marķēti, pievienojot formaldehīda un borāna piridīna kompleksu, kas kopā istabas temperatūrā īpaši iezīmē proteīna lizīna atlikumus, lai veiktu pieejamības profilu. . Pēc tam lizātus nogulsnēja ar organisko šķīdinātāju, un savāktās granulas tika atkārtoti izšķīdinātas 8 mol/L urīnvielā, reducētas ar ditiotreitolu (DTT) 56 grādos 30 minūtes, kam sekoja alkilēšana, izmantojot jodacetamīdu (IAA) tumsā 30 minūtes. Atkal tika pievienots atbilstošs DTT šķīduma daudzums, lai reaģētu ar lieko IAA. Pēc tam proteomu atšķaidīja ar amonija bikarbonāta šķīdumu, līdz galīgā urīnvielas koncentrācija sasniedza 1 mol / l. Savāktie proteīnu sagremojumi tika atsālīti uz C18 HLB kolonnām (Waters, Milford, Masačūsetsa, ASV), un bagātinātie peptīdi tika žāvēti un atjaunoti 0, 1 procenta skudrskābes (FA) ūdens šķīdumā. AnanoLCSYNAPT G2 Si Q-TOF sistēma (Waters) tika izmantota, lai analizētu paraugus lizīna pieejamības izmaiņu kvantitatīvai profilēšanai, reaģējot uz CAG saistīšanos mērķa noteikšanai. Datu iegūšanai tika izmantota datu atkarības iegūšana pozitīvajā režīmā. Datu analīze tika veikta, izmantojot PEAKS Studio V.8.5 (BSI Solutions, Waterloo, Kanāda). Konkrēti, cys alkilēšana tika izvēlēta kā fiksēta modifikācija, un metionīna oksidēšana un lizīna dimetilēšana, kas panākta ar TRAP marķēšanu, tika iestatītas kā mainīgas modifikācijas. Īsumā, peptīdi, kas satur TRAP izraisītu dimetilāciju un uzrādīja ievērojamas pārpilnības izmaiņas ar un bez CAG inkubācijas, tika piešķirti kā uz mērķi reaģējoši peptīdi. Katra ar TRAP iezīmētā peptīda pārpilnības attiecība norāda pieejamības izmaiņu pakāpi un ir cieši saistīta ar ligandu saistošo afinitāti. Tika veikts Studenta t-tests, lai novērtētu, vai marķēto peptīdu konstatētās pieejamības izmaiņas ir statistiski nozīmīgas. Starpgrupu p vērtība (lpp<0.001) and R-value (TRAP ratio > 2 or <0.5) were set as the cut-off to screen the target responsive peptides belonging to the CAG binding proteins from the whole quantified proteome.

Organoīdu kultūra

Cilvēka kolorektālā vēža organoīdus konstruēja un kultivēja uzņēmums Chongqing Kingbiotech.33 Ķirurģiskās operācijas laikā iegūtie pacientu audu paraugi tika sasmalcināti pēc iespējas mazākos gabaliņos ar sterilām šķērēm. Audu gabali tika rūpīgi sajaukti ar Matrigel (Corning, Cat#356231) aptuvenā attiecībā 1:4 uz ledus. Turpmākā apstrāde attiecās uz publicētajiem protokoliem. Īsumā, gabaliņi-Matrigel suspensijas tika ātri iesētas daudzu iedobju plāksnē, veidojot puslodes pilienus, un 15–20 minūtes pārnesa uz 37 grādiem, ļaujot pilieniem sacietēt. Katrai iedobei pievienoja atbilstošu barotnes daudzumu (KingcultureTM Organoid Growth Medium, Cat#KCW-2) ​​un mainīja barotni ik pēc 2–4 dienām.

Cilvēka CD8 T šūnu izolēšana un kultivēšana

Veselu cilvēku perifērajām asinīm, kas satur antikoagulantus, pievienojiet tādu pašu daudzumu parastā fizioloģiskā šķīduma, lai atšķaidītu visas asinis. Pievienojiet noteiktu daudzumu atdalīšanas šķīduma 15 ml centrifūgas mēģenē, lēnām pievienojiet atšķaidītās asinis gar mēģenes sieniņu līdz atdalīšanas šķīduma augšdaļai un centrifugējiet ar 750 g 20 minūtes. Pēc centrifugēšanas izmantojiet pipeti, lai uzmanīgi iesūktu monocītus vidējā baltajā slānī 15 ml centrifūgas mēģenē, pievienojiet noteiktu tilpumu PBS, lai atkārtoti suspendētu, centrifugējiet 250 g 5 minūtes un izmetiet supernatantu. Pēc cilvēka CD8 magnētisko lodīšu pievienošanas šūnu nogulsnēm CD8 T šūnas tika sakārtotas ar LS šķirošanas kolonnu. CD8 T šūnas tika pievienotas perforētajai plāksnei, kas iepriekš pārklāta ar 5 µg/ml CD3 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0032-38, RRID: AB_2865578) antivielu un pēc tam 10 ng/ml IL{{15} } (Peprotech Cat# 212-12) un 5 µg/mL CD28 (Thermo Fisher Scientific Cat# 16-0281-81, RRID: AB_468920) tika pievienotas funkcionālās antivielas, kuras kultivēja 24 stundas.

Kokultūra

Pēc organoīdu inkubācijas ar CAG 24 stundas, svaigā barotne tika aizstāta, un pēc tam organoīdi un aktivētās CD8 T šūnas tika suspendētas matricas gēlā, pēc tam suspensiju pievienoja sešu iedobju plāksnei un ievietoja 37. grādu inkubatorā 15 minūtes, un pēc tam 24 stundas pievienoja 2 ml pilnu barotni, kas nesatur serumu.

Western blot

MC38 un HCT-116 šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs 6 stundas un pēc tam apstrādātas ar CAG vēl 24 stundas. Šūnas trīs reizes mazgāja ar aukstu PBS un centrifugēja pie 180 g 5 minūtes 4 grādu temperatūrā. Kopējais proteīns tika lizēts ar WB-IP līzi, kas satur 1 procentu proteāzes inhibitoru, 30 minūtes uz ledus. Kopējais proteīna daudzums tika novērtēts, izmantojot BCA proteīna kvantitatīvās noteikšanas komplektu. Olbaltumvielu paraugi tika atdalīti ar 10–12 procentu SDS poliakrilamīda gēla elektroforēzi un pārnesti uz PVDF (polivinilidēna fluorīda) membrānām pie 350 mA 90 minūtes. PVDF membrānas tika bloķētas ar 5% BSA 1 stundu, sloksnes ar norādīto primāro antivielu nakti un sekundāro antivielu inkubēja 90 minūtes istabas temperatūrā. Visbeidzot, sloksnes tika noteiktas, izmantojot LumiGLO ķīmiski luminiscējošu substrāta sistēmu (KPL, Gaithersburg, Maryland, ASV).

Plūsmas citometrija

Pēc audzēja audu sagremošanas tika sagatavota vienšūnu suspensija. Virsmas krāsošana tika veikta ar virsmas antigēnu antivielām FCM (plūsmas citometrijas) buferšķīdumā (PBS, kas satur 1 procentu FBS) un 30 minūtes krāsoja uz ledus ar atbilstošām antivielām. Lai likvidētu atmirušās šūnas, tika izmantotas reaktīvās krāsvielas (eBioscience). Intracelulārā citokīnu krāsošana tika veikta ar BD šūnu fiksācijas šķīdumu / ārpusšūnu membrānas šķīdumu, un šūnas tika fiksētas un caurlaidīgas, un pēc tam iekrāsotas ar antivielām pret citokīniem Perm / Wash buferī (BD Biosciences).

CTSB mutantu plazmīdas transficētas

HCT-116 šūnas tika iesētas 6-iedobju plāksnēs 12 stundas un pēc tam 36 stundas transfektētas ar CTSB-WT-EGFP vai CTSB mutantu plazmīdām (Y75A, A77V un G198A).

CTSB transfekcijas traucējumi vai pārmērīga ekspresija MC38 šūnās vai HCT-116 šūnās

MC38 šūnas (1 × 106 iedobē) tika inokulētas 6- iedobju plāksnēs 6 stundas, pēc tam 48 stundas transfektētas ar CTSB traucējošo RNS (secība: Forward-GGACAUAGAUCUACCUGAATT un Reverse-UUCAGGUAGAUCUAUGUCCTT) un mRNS vai proteīna ekspresijas līmeņus. no Ctsb un H2-k1. HCT-116 šūnas (1 × 106 iedobē) tika inokulētas 6-iedobju plāksnēs 6 stundas, pēc tam 48 stundas transfektētas ar CTSB interferenci (secība: GCTGGTCA ACTATGTCAACAA) vai pārmērīgas ekspresijas plazmīdu un mRNS. vai tika konstatēti CTSB un HLA-A proteīnu ekspresijas līmeņi.

Docking tehnoloģija

CTSB 3D struktūra tika lejupielādēta no proteīnu datu bāzes (PDB ID: 2iPP), un CAG struktūras tika lejupielādētas no PubChem. Docking process tika veikts Autodock 2 ar rupju dokošanu, izmantojot simulētu atkausēšanas algoritmu un sekojošu pilnveidošanu, izmantojot ģenētisko algoritmu.

Šūnu termiskās nobīdes tests

MC38 šūnas tika iesētas 10 cm plāksnēs uz nakti un pēc tam apstrādātas ar CAG vai 0,1 procentu DMSO vēl 2 stundas. Šūnas tika savāktas, mazgātas ar aukstu PBS un centrifugētas pie 180 g 5 minūtes. Pēc tam šūnas tika vienmērīgi sadalītas centrifugēšanas mēģenēs (katrā mēģenē 70 µL) un karsēja 3 minūtes šādā temperatūrā: 46, 49, 52, 55, 58, 61, 64 un 67 grādi, paraugus atdzesēja 3 minūtes temperatūrā un tad tur uz ledus. Pēc tam paraugus uz nakti ievietoja ledusskapī -80 grādu temperatūrā. Paraugi tika atkausēti istabas temperatūrā 30 minūtes un pēc tam atdzesēti -80 grādu temperatūrā 4 stundas. Visbeidzot, paraugus centrifugēja pie 12, 000g 25 minūtes, supernatantu pievienoja iekraušanas buferšķīdumam un analizēja ar Western blot metodi.

Imūnhistoķīmiskā krāsošana

Audzēja audu parafīna sekcijas tika iegremdētas ksilolā uz 20 minūtēm, lai attīrītu to, un pēc tam uz 10 minūtēm 100%, 75% un 50% etanolā. Pēc tam, kad šķēles tika pakļautas antigēna remontam ar nātrija citrāta antigēna remonta šķīdumu, endogēnais ūdeņraža peroksīds tika inaktivēts ar 3% ūdeņraža peroksīdu. Pēc 1 stundu ilgas bloķēšanas ar 5% kazas serumu, tika pievienota anti-Ki67 antiviela (1:200) un inkubēta nakti 4 grādu temperatūrā. Tika pievienots pretpeles/truša HRP marķētais polimērs (100 µL) un paraugus inkubēja 37 grādu temperatūrā 30 minūtes, kam sekoja 100 µL DAB darba šķīduma un inkubēja istabas temperatūrā 5 minūtes. Pēc 1 minūtes krāsošanas ar hematoksilīnu paraugi tika mazgāti 50 procentu, 75 procentu un 100 procentu etanolā un ksilolā 5 minūtes, un plēves aizzīmogošanai tika izmantota neitrāla gumija. Filma tika novērota un fotografēta mikroskopā.

Statistikasanalīze

Statistiskā analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism programmatūru (V.8.{1}}). Visi rezultāti ir izteikti kā trīs neatkarīgu eksperimentu vidējais ± SEM. Lai novērtētu atšķirības, ja bija vairāk nekā divas grupas, tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze, kam sekoja Daneta post hoc tests. Stjudenta t-tests tika izmantots, lai novērtētu būtisko atšķirību starp abām grupām. Statistiskā nozīmība tika noteikta p<0.05.

REZULTĀTI

CAG vienšūnu multi-omikas analīze, kas kavē transplantēta resnās zarnas vēža augšanu pelēm

Lai noskaidrotu, vai CAG ir pretvēža iedarbība, mēs vispirms transplantējām MC38 vēža šūnas C57BL / 6 pelēm. Mēs atzīmējām, ka CAG ievērojami kavē audzēju augšanu (tiešsaistes papildu attēls S1A, B). Pēc tam mēs pārstādījām CT26 šūnas BALB / c pelēm un atklājām, ka CAG arī kavē audzēju augšanu (tiešsaistes papildu attēls S1C, D).

Lai vēl vairāk atklātu specifisko mehānismu, ar kuru CAG inhibē audzēja augšanu, mēs to analizējām, izmantojot scRNA-seq un scATAC-seq metodes (1.A attēls). Mēs sadalījām šūnu populāciju četrās grupās: vēža šūnas, fibroblasti, mieloīdās šūnas un limfocīti (1B attēls, tiešsaistes papildu attēls S2A, B). Mēs atklājām, ka vēža šūnas (52 procenti) un fibroblasti (41 procents) galvenokārt tika infiltrēti audzēja audos, savukārt imūnās šūnas veidoja tikai 7 procentus. Pēc tam mēs sadalījām vēža šūnas astoņās apakšgrupās un fibroblastus trīs apakšgrupās (attēls 1C – E). Pēc tam ļoti izteiktu gēnu bagātināšanas analīze katrā šūnu populācijā parādīja, ka MHC-I molekulārie ceļi vēža šūnās tika bagātināti, tāpat kā T šūnu un NK šūnu pretvēža signāli (tiešsaistes papildu attēls S2C). Pēc tam tika atrastas arī četras šūnu grupas, izmantojot scATAC-seq un scRNA-seq integrācijas analīzi (attēls 2D – G). Pēc salīdzināšanas mēs noskaidrojām, ka vēža šūnas (C01, C03 šūnas), CD8 plus T šūnas, Spp1 plus TAM šūnas un fibroblasti (F01 un F02 šūnas) parādījās ATAC sekvencēšanā (attēls 1F, G) un tālāk ļoti izteikti. šajās šūnās tika bagātināti transkripcijas faktori (1H attēls). Izmantojot šīs analīzes, mēs domājam, ka CAG audzēja augšanas kavēšana ir cieši saistīta ar izmaiņām šajās šūnās.

Cag veicina audzēja šūnu antigēna prezentāciju

Lai analizētu CAG pretvēža mehānismu, mēs vispirms analizējām audzēja šūnu populāciju un sadalījām vēža šūnas astoņās apakšgrupās (attēls 2A, B, tiešsaistes papildu attēls S3A). Rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar PBS grupu, C05 grupas šūnas ievērojami samazinājās, bet C07 grupas šūnas palielinājās (2.C attēls). Tikmēr, lai pārbaudītu mūsu audzēja šūnu klasterizācijas precizitāti, mēs salīdzinājām limfocītu un mieloīdo šūnu CNV kā atsauces šūnas. Rezultāti parādīja, ka vēža šūnu CNV bija ievērojami augstāks nekā imūno šūnu CNV (tiešsaistes papildu attēls S3B). Analizējot vēža šūnu apakškopas, mēs noskaidrojām, ka interferona atbildes gēni Isg15, Irf7, Ifit3 un Ifi47 bija ļoti izteikti CAG grupas C07 un C08 šūnu populācijās, salīdzinot ar PBS grupu (tiešsaistes papildu attēls S3C). Audzēja šūnu populācijas analīze atklāja, ka ar antigēnu prezentāciju saistītie ceļi bija ievērojami bagātināti vairākās šūnu populācijās. Tāpēc mēs domājam, ka CAG var veicināt vēža šūnu antigēnu prezentāciju, lai spēlētu pretaudzēju lomu (2D attēls). Pēc tam mēs atlasījām ar antigēna prezentāciju saistītos gēnus un atklājām, ka ekspresijas līmenis CAG grupā bija ievērojami augstāks nekā PBS grupā (attēls 2E, tiešsaistes papildu attēls S3D). Mēs arī atklājām, ka CAG veicināja antigēna prezentāciju audzēja audos (attēls 2F, G).

Pēc tam mēs izmantojām scATAC-seq, lai analizētu konkrētos CAG veicinošo audzēja šūnu antigēna prezentācijas iemeslus. Mēs noskaidrojām, ka audzēja šūnu populācija ļoti izteica transkripcijas faktorus Fos, Junb, Jund, Fosb un Fosl1 (attēls 2H, I). Pēc tam mēs izveidojām transkripcijas faktoru un atbilstošo gēnu mijiedarbības karti, lai izskaidrotu, ka CAG veicināja ar audzēja šūnu antigēnu prezentējošu gēnu ekspresiju (2J attēls). Audzēja audos mēs arī atklājām, ka transkripcijas faktori Junb, Fos, Jund un Fosb tika ievērojami pārmērīgi ekspresēti PBS grupā CAG terapijas laikā (attēls 2K – N, tiešsaistes papildu attēls S3E-I). Līdz šim mēs esam atklājuši, ka CAG var veicināt ar antigēnu prezentējošu gēnu transkripcijas faktoru ekspresiju, tādējādi uzlabojot vēža šūnu antigēnu prezentācijas funkciju. Tomēr joprojām nav skaidrs, kā šīs vēža šūnas reaģē uz imūno šūnu reakcijām.

Lai atklātu parādību, ar kuru CAG veicina vēža šūnu antigēnu prezentāciju, mēs veicām trajektorijas analīzi, lai izpētītu, kā vēža šūnas maina viena otru, reaģējot uz imūno šūnu reakcijām. Mēs noskaidrojām, ka laika gaitā C07 vēža šūnas transformējās par C05, C06 un C08 šūnām, un gēnu bagātināšana arī parādīja, ka vēža šūnas pārveidosies par antigēna prezentāciju (3A–E attēls).

CAG uzlabo imūno šūnu nogalināšanas funkciju

Šie rezultāti liecina, ka CAG var uzrādīt audzēja šūnu antigēnus, tāpēc vai audzēja šūnu antigēna prezentācijas uzlabošana uzlabos imūno šūnu funkciju? Lai to noskaidrotu, mēs analizējām attiecīgi limfocītus un mieloīdās šūnas. Rezultāti parādīja, ka CAG veicināja CD8 plus T šūnu infiltrāciju audzēja audos, un palielinājās arī CD8 plus T šūnu un NK šūnu infiltrācija, ko noteica plūsmas citometrija (tiešsaistes papildu attēls S4A-F). Mēs arī novērojām, ka CAG uzlaboja Ifitm2, Cxcr6 un S100a6 gēnu ekspresiju CD8 plus T šūnās,

Fcer1g, Gzmb, AW112010 un Zfp36i2 gēni NK šūnās un Nfkbia un Junb gēni CD4 plus T šūnās (tiešsaistes papildu attēls S4G). Tika ievērojami uzlabota arī Ifng un Gzmb ekspresija CD8 plus T šūnās, kā to noteica plūsmas citometrija (tiešsaistes papildu attēls S4H, I). Turklāt mēs atklājām, ka pēc CAG apstrādes inhibējošo receptoru Lag3, Tigit un Havcr2 ekspresija uz CD8 plus T šūnu virsmas samazinājās un gēnu Cd28, Cd69, Gzmk, Ccl5 un Pdcd1 ekspresija, kas raksturo CD8 plus T šūnu aktivizēšana, ievērojami palielinājās (tiešsaistes papildu attēls S4J). Lai vēl vairāk pārbaudītu, vai CAG uzlaboja CD8 plus T šūnu nogalināšanas funkciju, veicinot uzlabotu audzēja antigēna prezentāciju, mēs pārstādījām CT26 šūnas pārstādītos audzējos plikām pelēm un novērojām, ka CAG nevarēja efektīvi kavēt audzēju augšanu (tiešsaistes papildu attēls S4K-M ).

Pēc tam mēs analizējām mieloīdās šūnas un atklājām, ka Spp1 plus TAM šūnas palielinājās pēc CAG terapijas, savukārt C1qc plus TAM šūnu skaits samazinājās un Il1b plus monocītu skaits palielinājās (tiešsaistes papildu attēls S5A-D). Pēc CAG terapijas Spp1 plus TAM un C1qc plus TAM šūnas bija jutīgākas pret iekaisumu veicinošu TAM transformāciju. Bagātināšanas analīze atklāja, ka tā galvenokārt koncentrējās uz Tnf-, Ifn-g un iekaisuma reakcijas signalizācijas ceļu (tiešsaistes papildu attēls S5E-H). Pamatojoties uz iepriekšminētajiem rezultātiem, mēs secinām, ka CAG uzlabo imūno šūnu atpazīšanu un nogalināšanas funkciju, veicinot antigēnu prezentāciju vēža šūnās. Tomēr nav skaidrs, kā CAG tiek regulēta.

CAG mērķa proteīna CTSB atklāšana ar slazdu

Tālāk mēs izpētīsim specifisko CAG mērķa proteīnu, kam ir pretvēža loma. Mēs izvēlējāmies vēža šūnas kā pētījuma objektu, jo atklājām, ka CAG var uzlabot vēža šūnu antigēnu prezentāciju, tādējādi uzlabojot imūno šūnu nogalināšanas funkciju. Vispirms mēs sintezējām CAG biotīna atvasinājumu un atklājām, ka reaģēt var tikai 3-OH (tiešsaistes papildu attēls S6A). Pēc tam mēs pētījām, vai CAG-biotīns veicina arī ar antigēnu prezentāciju saistīto gēnu ekspresiju peles MC38 audzēja šūnu līnijā. Rezultāti liecina, ka CAG-biotīns neietekmēja H2-K1, Cd74 un Anxa1 gēnu ekspresiju (tiešsaistes papildu attēls S6B-D).

Tāpēc laboratorijā izmantojām iepriekšējo TRAP mērķa meklēšanas metodi.32 CAG un DMSO tika inkubēti ar MC38 šūnu līniju (4.A attēls). Mēs izvēlējāmies proteīnu ar FC lielāku vai vienādu ar 2 un ap mazāku vai vienādu ar 0.05 kā CAG mērķa proteīnu. Ievērojot principu, ka mazu molekulu saistīšanās ar olbaltumvielām novedīs pie zemas lizīna marķēšanas efektivitātes, mēs izvēlējāmies CTSB pētījumam (4.B attēls). Tālāk mēs izmantojām šūnu termiskās nobīdes testu (4.C attēls) un mikromēroga termoforēzi (MST) (4D attēls), lai pārbaudītu saistīšanos starp CAG un CTSB, un konstatējām, ka afinitāte starp CAG un CTSB bija 26,6 nM (4.D attēls). Pēc tam mēs paredzējām saistīšanās vietas starp CAG un CTSB atbilstoši CTSB proteīna kristāliskajai struktūrai PBP bibliotēkā. Mēs noskaidrojām, ka hidroksilgrupas abos CAG galos un CTSB ALA77 un GLY198 vietās bija saistītas ar ūdeņraža saiti, savukārt CAG un CTSB TYR75, PRO76 un ALA173 vietas saistīja van der Vāls spēks (4E attēls). . Lai pārbaudītu saistīšanās vietu starp CAG un CTSB, mēs transfektējām CTSB mutantu plazmīdu HCT-116 šūnās. Rezultāti liecina, ka afinitāte starp mutantu plazmīdu pie A77V un G198A un CAG bija simtiem reižu augstāka nekā WT plazmīdai (attēls 4F, G). Nākamajā sadaļā mēs izpētām īpašo mehānismu, ar kuru CAG spēlē pretvēža lomu, izmantojot CTSB.

【Lai iegūtu plašāku informāciju:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:8613632399501】