Mērķauditorijas atlase ar laktātdehidrogenāzi A ar katehīnu resensibilizē SNU620/5FU kuņģa vēža šūnas pret 5-fluoruracilu, 2. daļa

Lūdzu sazinietiesoscar.xiao@wecistanche.comlai iegūtu vairāk informācijas

2.5. Ārstēšana ar CA un 5Fu izraisa mitohondriju ROS atkarīgu apoptozi

Tā kā LDHA inhibīcija tieši palielina mitohondriju ROS un tā membrānas potenciāla zudumu, pēc tam izraisot apoptozi [16, 29], tika pārbaudīti faktori, kas saistīti ar mitohondriju ROS mediēto apoptozi. CA vai 5FU vienreizēja apstrāde nedaudz palielināja mitohondriju ROS līmeni SNU620 / 5FU šūnās, mērot ar plūsmas citometriju, izmantojot MitoSOX. Tomēr kopīga apstrāde ar CA un 5FU ievērojami uzlaboja mitohondriju ROS veidošanos. Šo palielināto ROS ražošanu apvērsa Mito-TEMPO, uz mitohondrijiem mērķēts antioksidants (attēls 5A-C). Augšanas inhibīcija pēc apstrādes ar CA un 5FU tika atgūta arī pēc Mito-TEMPO apstrādes SNU620 / 5FU šūnās (5D attēls). Turklāt apoptoze tika novērtēta, izmantojot aneksīna V-FITC / PI krāsošanu SNU620 / 5FU šūnās. Kopīga apstrāde ar CA un 5FU palielināja apoptotisko šūnu skaitu SNU620 / 5FU šūnās (6.A, B attēls). Kodolmorfoloģiskā fragmentācija parādās apoptozes laikā, un to var novērot ar 4',6-diamidino-2-fenilindola (DAPI) iekrāsošanu [30,31]. Tika konstatēts, ka DNS fragmentācija ir ievērojami palielinājusies kopterapijas grupā, salīdzinot ar kontroles grupu (6.C attēls). Visbeidzot, tika pārbaudīti apoptozes biomarķieri, tostarp Bcl-2, Bax, Caspase-9, Caspase-3 un PARP. Proapoptotiskā kaskāde palielinājās pēc kopīgas apstrādes ar CA un 5FU SNU620/5FU šūnās (6.D attēls). Šie atklājumi liecina, ka vienlaicīga apstrāde ar CA un 5FU izraisa apoptozi SNU620 / 5FU šūnās.

5. attēls. Apstrāde ar katehīnu(CA) un 5-fluoruracilu(5FU) palielina mitohondriju ROS veidošanos:(A)SNU620/5FU šūnas tika apstrādātas ar norādītajām CA,5FU (10 μM) un Mito koncentrācijām. -TEMPO (20 μM) 48 stundas. Šūnu mitohondriju ROS mērīja, izmantojot FACS analīzi, izmantojot MitoSOXTM Red; (B) joslu diagramma parāda šūnu skaitu, kas bija pozitīvas attiecībā uz MitoSOX krāsošanu; (C) fluorescences mikroskopijas attēli (X100) SNU620/5FU šūnām, kas iekrāsotas ar MitoSOX tika prezentēti; (D) šūnu dzīvotspēja tika mērīta, izmantojot MTT testu. Rezultāti ir parādīti kā vidējais ± SEM.*p<><0.001, and=""><0.001, compared="" to="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

6. attēls. Apoptozes palielināšanās, lietojot katehīnu (CA) un 5-fluoruracilu (5FU); SNU620/5FU šūnas tika apstrādātas ar CA (10 uM) un/vai 5FU (10 μM) 48 h∶ (A) apoptotisko šūnu skaits tika analizēts, izmantojot FACS analīzi, izmantojot PI-Aneksīna V krāsošanu; (B) norāda joslu diagrammu. šūnu procentuālais daudzums agrīnā un vēlīnā apoptotiskajā fāzē. Rezultāti ir parādīti kā vidējais ± SEM.** lpp<0.001, compared="" to="" the="" control;(c)="" the="" nuclei="" of="" the="" cells="" were="" stained="" with="" dapl,="" and="" fluorescence="" microscopic="" images="" were="" taken="" (x200).="" the="" white="" arrowhead="" indicates="" apoptotic="" cells.="" scale="" bar,="" 10="" um;="" (d)the="" expression="" levels="" of="" proteins="" related="" to="" the="" apoptotic="" pathway="" were="" measured="" by="" western="" blot="" analysis.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Lūdzu, noklikšķiniet šeit, lai uzzinātu vairāk

3. Diskusija

Šajā pētījumā, lai raksturotu un novērtētu ķīmisko rezistenci pret 5FU, mēs izmantojām SNU620/5FU šūnas, kuras tika izveidotas, ilgstoši pakļaujot 5FU ar sērijveida zāļu koncentrācijas pieaugumu [32]. Ir ziņots, ka vecāku SNU620 šūnās ir p53 mutants ar homozigotu dzēšanu 5. eksonā [33]. Pamatojoties uz DNS mikromasīvu, SNU620/5FU šūnās ir paaugstināti vairāki gēni, kas iesaistīti ķīmiskajā rezistencē, tostarp timidilāta sintetāze, bojājumam specifiskais DNS saistošais proteīns 2, klasterīns un midkine [32]. Vairākos iepriekšējos pētījumos SNU620/5FUcell līnija ir izmantota kā modelis, lai novērtētu zāļu in vitro efektivitāti pret rezistenci pret 5FU, izmantojot pretmitozi, AMPK aktivāciju un kanabinoīdu receptoru signālu pārraidi [34-36]. Tomēr ar vielmaiņu saistīto gēnu vielmaiņas īpašības un ekspresijas līmeņi SNU620 / 5FU šūnās un to loma ķīmiskajā rezistencē nav plaši pētīti.

Šeit mēs parādījām, ka SNU620 / 5FU šūnām ir uzlaboti glikolītiskie fenotipi, tostarp paaugstināta laktāta ražošana un enzīmu ekspresija, kas saistīti ar piruvāta pārvēršanu laktātā, piemēram, LDHA. PDHA1 fosforilācija, kas atspoguļo samazinātu PDH aktivitāti ar paaugstinātu PDK2 un PDK3, palielinājās arī pret SNU620 / 5FU rezistentajās šūnās, salīdzinot ar SNU620 vecāku šūnām. Tomēr rezistentās šūnās OCR nebija ievērojami samazināts. Šīs neatbilstības iespējamais izskaidrojums ir vēža šūnu barības vielu plastiskums TCA ciklam, tas ir, aminoskābes vai taukskābju atvasinātais acetil-CoA, ne tikai no glikozes iegūtais acetil-CoA, varētu nodrošināt substrātus TCA ciklam [37]. ]. Saistībā ar to 5FU rezistentās kuņģa vēža šūnas veicina stublāju veidošanos, izmantojot mitohondriju taukskābju oksidāciju [38]. Turklāt 5FU rezistence ir saistīta ar palielinātu mitohondriju masu un aktivitāti, tostarp elektronu transporta ķēdes (ETC) enzīmu ekspresiju un skābekļa patēriņu [39, 40]. Tādējādi mēs koncentrējāmies uz LDHA modulāciju, lai atjaunotu 5FU rezistenci. Pamatojoties uz mūsu rezultātiem, LDHA aktivitātes kavēšana ar oksamātu vai CA veiksmīgi nomāca rezistentu SNU620 / 5FU šūnu augšanu un atjaunoja tās jutīgumu pret 5FU ārstēšanu. Šie atklājumi liecināja par labu korelāciju ar iepriekšējo pētījumu rezultātiem, kuros ziņots, ka LDHA ģenētiskā vai farmakoloģiskā inhibīcija veiksmīgi samazināja rezistenci pret ķīmijterapiju, tostarp 5FU [19, 41, 42]. Tādējādi mēs pieņēmām, ka LDHA inhibīcija varētu būt pietiekama, lai nomāktu pretestību pret 5FU SNU620 / 5FU šūnās.

Cistanche var uzlabot imunitāti

Vairākas sintētiskas molekulas, piemēram, oksamāts, FX11, PSTMB un GNE-140, ir izveidotas kā mazmolekulāri LDHA inhibitori [11,43]. Starp tiem ir ziņots, ka FX11 ir sensibilizators pret ķīmijterapiju rezistentās audzēja šūnās [44]. Tomēr, lai gan daudzi LDHA inhibitori tiek rūpīgi pārbaudīti apstiprināšanai kā jaunas pretvēža zāles, neviens no tiem vēl nav apstiprināts. Tādējādi, lai radītu jaunus LDHA inhibitorus, ir nepieciešams vairāk zālēm līdzīgu kandidātu [45]. Dabiskie savienojumi ir uzskatīti par potenciāliem pretvēža zāļu resursiem, jo ​​īpaši, lai pārvarētu ķīmisko rezistenci kā kombinētu terapiju [46, 47]. Tāpēc vēža metabolisma, īpaši glikozes metabolisma, mērķēšana ar augu izcelsmes dabīgiem produktiem ir jauna pētniecības tendence jaunu vēža terapijas līdzekļu izstrādē [48].

Turklāt vairāki ziņojumi liecina, ka dabiskie produkti, piemēram, gosipols, galloflavīns, krocetīns, mašīna A un EGCG, ir spēcīgi LDHA inhibitori [43, 49, 50]. Lai gan gosipolam ir visspēcīgākā inhibējošā iedarbība uz LDHA (IC50=9.8 uM), tas arī inhibē LDHB aktivitāti, kas pārvērš laktātu piruvātā [51]. Mūsu rezultāti parādīja, ka EGCG, kas ir LDHA inhibitors un sensibilizators pret 5FU ķīmijterapiju [22-25], inhibē gan LDHA, gan LDHB aktivitātes. No dabīgiem produktiem iegūtiem LDHA inhibitoriem, kas uzrāda LDHA specifiskas inhibējošas aktivitātes, piemēram, mašīna A(IC50 =84 μM）), krocetīns (IC50 =54.9 μM）) un CA (IC{13}). }.69 μM）【49,50】, CA uzrādīja vislabāko nomācošo ietekmi uz LDHA aktivitāti attiecībā uz ICsn vērtību. Lai gan CA un EGCG ķīmiskās struktūras ir ļoti līdzīgas, izņemot papildu gallskābes daļu, to inhibējošā selektivitāte bija Turklāt, neskatoties uz to, ka CA ir vienkāršākais savienojums, salīdzinot ar tā atvasinājumiem, tas uzrādīja vislabāko inhibējošo iedarbību gan uz laktāta veidošanos, gan uz LDHA aktivitāti. Tādējādi ir jāveic plašs struktūras un aktivitātes attiecību pētījums, lai pierādītu CA kā potenciāls jauns pamats specifisku un spēcīgu LDHA inhibitoru izstrādei.

Ir zināms, ka EGCG ir konkurējošs NADPH inhibitors. Turklāt EGCG inhibē NADPH oksidāzes translokāciju un reprodukciju [52-54]. Tomēr saskaņā ar molekulārās modelēšanas rezultātiem CA un EGCG strukturāli atrodas dažādās vietās (3.A, B attēls). Turklāt tie neuzrādīja specifiskuma korelāciju LDHA un LDHB aktivitātes inhibīcijā, kas izmanto NADH. un NAD plus attiecīgi kā kofaktors. No šiem datiem mēs pieņēmām, ka CA nav tiešas korelācijas ar EGCG mehānismā, kas konkurē ar NAD (P) H. Starp citu, LDHA inhibēšana ar vairākiem inhibitoriem, piemēram, FX11, GSK 2837808A, NCI-737 un NCI-006, samazināja NADt veidošanos un palielināja NADH uzkrāšanos, tādējādi samazinot NAD plus attiecību. /NADH[16,17,55]. Apoptozi, ko izraisa p53/NAD atkarīgais DNS bojājuma ceļš, izraisa arī LDHA inhibīcija, izmantojot siRNS vai ķīmisko inhibitoru NH-2 [56]. GCN2-ATF4 signālu ceļš tika ziņots arī kā vēl viens mehānisms, kas ir atbildīgs par LDHA inhibitora GSK 2837808A izraisītu apoptotisko šūnu nāvi [17]. Tā kā NAD / NADH attiecībai ir galvenā loma redoksu homeostāzē un šūnu proliferācijā [5758], CA kā LDHA inhibitors var ietekmēt 5FU rezistentās vēža šūnas, modulējot NAD plus / NADH attiecību.

CA izraisīja šūnu nāvi gan vecāku SNU620, gan pret 5FU rezistentās SNU620 / 5FU šūnās. Tomēr CA izraisītā šūnu nāve bija atkarīga no LDHA, jo SNU620 / 5FU šūnās tika samazināts shRNS. Turklāt CA un 5FU kopīgā apstrāde uzrādīja papildu pretvēža iedarbību uz 5FU rezistentām šūnām. Kā ziņots iepriekš [16, 59], LDHA inhibīcija palielina ROS un tādējādi nomāc vēža šūnu augšanu. Kad LDHA tika inhibēts, enerģijas metabolisms tika pārveidots no glikolīzes uz TCA ciklu un mitohondriju oksidatīvo fosforilāciju [60]. Tādējādi vēža šūnas ražo vairāk ROS, kā rezultātā tiek bojāta mitohondriju membrāna un notiek mitohondriju izraisīta apoptoze [61,62]. Labi saskan ar iepriekšējiem pētījumiem, CA inducē apoptotisku šūnu nāvi, izmantojot mitohondriju ROS atkarīgo ceļu. Paaugstināta ROS aizsardzības spēja un samazināti apoptotiskie signāli ir ķīmiski rezistentu vēža šūnu kopīgas īpašības, īpaši 5FU rezistentās šūnās 3, 63]. Turklāt izmaiņas vēža metabolismā, īpaši glikozes vielmaiņā, arī izraisa rezistenci pret ķīmijterapiju, mainot šūnu aktivitātes, piemēram, novirzot DNS atjaunošanos, pastiprinātu autofagiju, samazinātu apoptozi, aizsardzību pret ROS un palielinātu eksosomu sekrēciju [9,64,651 . Tādējādi glikolītisko enzīmu, tostarp LDHA, mērķēšana ar CA varētu būt alternatīva stratēģija ķīmiskās rezistences pārvarēšanai, īpaši 5FU rezistenta kuņģa vēža gadījumā. Parasti ātri dalošie ļaundabīgi audzēji ir ļoti jutīgi pret DNS sintēzes inhibitoriem, tostarp 5FU, salīdzinot ar normāliem audiem. Tomēr dažas vēža šūnas var attīstīt rezistenci pret ārstēšanu, izmantojot vairākus mehānismus, kā aprakstīts iepriekš [34-36]. Kopīgai ārstēšanai ar bioaktīviem savienojumiem un tradicionālajai ķīmijterapijai ir lielāka ietekme, salīdzinot ar vienu savienojumu, palēninot rezistences attīstību |66. Tāpēc specifisku fitoķīmisko vielu bioloģiskajai iedarbībai ar pierādītu citotoksisku iedarbību, ko lieto kopā ar parasto ķīmijterapiju, lai vēža šūnās mērķētu uz plašāku signalizācijas ceļu klāstu, tostarp vēža metabolismu un mitohondriju funkcijas, vēža ārstēšanā jābūt labākam par atsevišķiem savienojumiem, jo ​​tie var aizkavēt. rezistences attīstība [67]. Šajā pētījumā CA un 5FU kombinācija uzrādīja lielāku šūnu dzīvotspējas inhibīciju, salīdzinot ar vienu ārstēšanu. Turklāt mēs parādījām, ka LDHA aktivitātes inhibīcija un sekojošā mitohondriju ROS starpnieka apoptoze varētu būt mehānisms, kas ir pamatā CA sensibilizējošajai iedarbībai uz 5FU rezistentām šūnām (7. attēls).

Papildus LDHA inhibīcijas iedarbībai un specifiskumam CA ir drošāka nekā iepriekš izveidotie dabiskie LDH inhibitori. Turklāt CA ir labi zināma zaļās tējas ķīmiskā sastāvdaļa, un tās drošums un farmakodinamiskās īpašības ir apstiprinātas iepriekšējos pētījumos [68-70]. Tomēr precīzs CA un 5FU vienlaicīgas lietošanas toksicitātes novērtējums vēl nav veikts. Turklāt šajā pētījumā netika pārbaudīta CA in vivo efektivitāte pret 5FU rezistentām vēža šūnām. Tomēr iepriekšējos pētījumos ziņots par CA un tās atvasinājumu in vivo pretvēža efektivitāti, lai pārvarētu ķīmisko rezistenci, tostarp 5FU rezistenci cilvēka kuņģa un resnās zarnas vēža gadījumā [71-77]. Šajā pētījumā mēs koncentrējāmies uz LDHA inhibīciju kā galveno CA molekulāro mehānismu, lai pārvarētu rezistenci pret 5FU. Tāpēc, lai izstrādātu CA kā jaunu adjuvantu ķīmijizturīgām vēža šūnām, CA un 5FU kopterapijas efektivitāte un drošība in vivo jānovērtē, izmantojot plašus pētījumus ar dzīvniekiem, tostarp ksenotransplantāta modeļus un labus laboratorijas toksicitātes novērtējumus.

4. Materiāli un metodes

4.1.Materiāli

Antivielas pret poli(ADP-ribozes)polimerāzi, kaspāzi-3 un kaspāzi-9 tika iegādātas no Cell Signaling Technology (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, ASV). Antivielas pret LDHA, gliceraldehīda 3-fosfāta dehidrogenāzi (GAPDH) un PDHA1 tika iegādātas no Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, ASV), un antivielas pret fosfora-PDHA1 un PDK3 tika iegādātas no Abcam ( Abcam, Kembridža, MA, ASV). Turklāt antivielas pret PDK2 un PDK4 tika iegādātas no Signalway Antibody (Signalway Antibody, Dallas, TX, ASV), tās pret PDK1 tika iegūtas no Enzo Life Sciences (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, ASV) un antivielas pret B-šūnu. limfomas-2(Bcl-2) un ar Bcl-2-saistīto X proteīnu iegādājās no uzņēmuma Novus Biologicals (Novus Biologicals, Littleton, CO, ASV). MitoSOX iegādājās no Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, ASV). Ķimikālijas un reaģenti, tostarp 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolija bromīds(MTT),4',{{22} }diamidino-2-fenilindols, oksamāts, nikotīnamīda adenīna dinukleotīds, CA un CA atvasinājumi (EC GC, EGC un EGCG) tika iegādāti no Merck (Merck, Darmstadt, Vācija). -nikotīnamīda adenīna dinukleotīds (oksidēta forma) tika iegādāts no Tokijas ķīmiskās rūpniecības (Tokyo Chemical Industry, Tokija, Japāna).

4.2. Šūnu kultūra

Cilvēka kuņģa vēzis SNU620, SNU620/5FU un AGS, aizkuņģa dziedzera vēzis Panic-1 un MIA PaCa-2, kā arī resnās zarnas vēzis LS174T un RKO šūnas tika iegūtas no Korean Cell Line Bank (KCLB, Seula, Korea). ).SNU620, SNU620/5FU, AGS un LS174T šūnas tika kultivētas Roswell Park Memorial Institute vidē 1640 (RPMI-1640) (Welgene, Daegu, Korea), kas papildināta ar 10 procentiem termiski inaktivētu liellopu augļa serumu (FBS). ) (Gibco, Ņujorka, NY, ASV) un 1% penicilīna/streptomicīna (Invitrogen), un Panc-1, MIA PaCa-2 un RKO šūnas tika kultivētas Dulbecco modificētajā Ērgļa barotnē (Welgene). ), kas satur 10 procentus termiski inaktivēta FBS un 1 procentu penicilīna/streptomicīna. Visas šūnas tika kultivētas mitrinātā CO, inkubatorā 37 grādu temperatūrā un 5% CO2.

4.3. Šūnu dzīvotspējas tests

CA un 5FU citotoksicitātes līmeņi SNU620 un SNU620/5FU šūnās tika mērīti, izmantojot MTT testu. Šūnas tika kultivētas 24-iedobju plāksnēs (2 × 104 šūnas/iedobē) ar norādītajām CA un 5FU koncentrācijām norādītajā dienā. Pēc tam katrai iedobei pievienoja MTT šķīdumu (2,0 mg/ml), kam sekoja 3-4 h inkubācijas 37 grādu temperatūrā un 5% CO, šūnu kultūras inkubatorā. Pēc tam barotne tika noņemta, un formazāna kristālu absorbcija tika veikta no dzīvām šūnām. Formazāna kristālu izšķīdināšanai tika pievienots DMSO, un tas tika mērīts pie 540 nm, izmantojot Spectramax M2 Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, ASV).

4.4. Ārpusšūnu paskābināšanās ātrums (ECAR) un skābekļa patēriņa ātrums (OCR)

ECAR un OCR, kas norāda attiecīgi šūnu glikolīzes un oksidatīvās fosforilācijas ātrumu, tika uzraudzīti ar Seahorse XF analizatoru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ASV), kā aprakstīts iepriekš [78, 79]. Īsumā, 60, 000 SNU620 vai SNU620/5FU šūnas katrā iedobē tika iesētas Seahorse XF sešu iedobju plāksnēs RPMI barotnē, kas papildināta ar 1 procentu penicilīna/streptomicīna. Pēc 30 minūšu inkubācijas barotne no katras iedobes tika aizstāta ar 80 µL iepriekš uzsildītas barotnes, kas nesatur serumu ar 5 mM oksamātu, standarta LDH inhibitoru [11]. Pēc tam šūnas 24 stundas inkubēja 37 ° C temperatūrā. Pēc inkubācijas barotne no katras iedobes tika aizstāta ar 180 μL iepriekš uzsildītas XFbase barotnes (satur 10 mM glikozes, 2 mM glutamīna un 1 mM nātrija piruvāta; pH 7,4), lai izmērītu ECAR un OCR. Rezultāti tika analizēti, izmantojot Wave 2.6.0.31 programmatūru (Agilent Technologies).

4.5. Kvantitatioe Reversās transkripcijas-polimerāzes ķēdes reakcija (qRT-PCR)

Kopējā RNS tika ekstrahēta, izmantojot RiboEx Total RNA Extraction Kit (GeneAll Biotechnology, Seula, Korea), un cDNS tika sintezēta, izmantojot reversās transkriptāzes komplektu (Promega, Madison, WI, ASV). Reversajā transkripcijā tika izmantots 1 ug kopējās RNS. , un kopējais sintezētās cDNS daudzums ir 20 μL. Katrs komplekts tika izmantots saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Kvantitatīvā PCR tika veikta, izmantojot StepOneTM Real-Time PCR sistēmu (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV), ar Real HelixgPCR Komplekts (NanoHelix, Daejeon, Korea), 40 cikliem, kas sastāv no 15 s 95 grādos un 1 minūtē 60 grādos. Relatīvais mRNS līmenis tika normalizēts līdz 18S ribosomu RNS līmenim, kas kalpoja kā endogēna kontrole. Praimeru secības qRT-PCR izmantotie ir uzskaitīti 1. tabulā.

4.6. Wester" blot analīze

Šūnas tika mazgātas ar 1 × PBS, un kopējais proteīnu daudzums tika ekstrahēts no šūnām, izmantojot RIPA buferšķīdumu un 1% NP-40 līzes buferšķīdumu, kas satur proteāzes inhibitoru kokteiļu tabletes (Roche, Basel, Šveice). Katra proteīna koncentrācija tika mērīta, izmantojot Bio-Rad proteīna testu. No katra parauga, izmantojot 8-15 procentus SDS-PAGE, tika frakcionēti vienādi olbaltumvielu daudzumi, un pēc tam proteīni tika pārnesti uz nitrocelulozes membrānām (GE Healthcare, Minhene, Vācija), izmantojot elektroforēzi. Membrānas tika bloķētas istabas temperatūrā (20-25 grādi) 1 stundu, izmantojot 5% beztauku sauso pienu, un inkubētas ar primārajām antivielām 4 grādu temperatūrā nakti. Pēc tam šīs membrānas trīs reizes mazgāja ar 1 × Tris buferšķīdumu 10 minūtes. Specifiskas proteīnu joslas tika mērītas ar hemiluminiscences attēlveidošanas sistēmu (ImageQuant LAS 4000; GE Healthcare). Olbaltumvielu ekspresija tika koriģēta ar GAPDH. 4.7.Laktāta ražošanas tests

Laktāta ražošana tika mērīta SNU620, SNU620/5FU, AGS, Panc-1, MIA PaCa-2, LS174T un RKO šūnu barotnēs. Šīs šūnas tika inkubētas 1 dienu 37 grādos, un barotne pēc tam tika aizstāta ar barotni, kas nesatur fenolu sarkanā krāsā, kam sekoja inkubācija 1 stundu 37 grādos. Pēc tam katras šūnas barotne tika novērtēta, izmantojot komerciālu laktāta fluorometrisko testu komplektu (BioVision, Milpitas, CA, ASV).

4.8. LDHA un LDHB aktivitātes testi

Lai noteiktu LDHA aktivitāti, norādītās CA koncentrācijas tika inkubētas 20 min buferšķīdumā, kas satur 2 mM piruvātu, 20 μM NADH un 20 mM HEPES-K plus (pH7,2). LDHBaktivitātei tika izmantots buferšķīdums, kas satur 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 25 mM NAD plus un 2 M nātrija L-laktātu. Īsumā, 10 nanogrami katra attīrīta rekombinantā LDHA un LDHB proteīna tika izmantoti in vitro LDHA un LDHB aktivitātes pārbaudēm. Viens mikrograms kopējā proteīna no šūnu lizātiem tika izmantots intracelulārajos LDHA un LDHB aktivitātes testos kā enzīmu avots. NADH fluorescence pie ierosmes viļņa garuma 340 nm un emisijas viļņa garuma 460 nm tika noteikta, izmantojot spektrofluorometru (Spectramax M2; Molecular Devices), kā aprakstīts iepriekš [80]. LDHA aktivitāte tika mērīta ar samazinātu NADH daudzumu, savukārt LDHIB aktivitāte tika novērtēta, mērot NADH daudzumu, kas pārveidots no NAD plus .

4.9. Olbaltumvielu un mazo molekulu mijiedarbība

Mijiedarbība starp olbaltumvielām un mazajām molekulām tika prognozēta, izmantojot Pyrex programmu. Pyrex tika izmantotas LDHA (PDB ID: 1l10) molekulas un CA un EGCG 2D struktūras, kas iegūtas no NCBI PubChem savienojumu datu bāzes. CA ID bija 9064 un EGCG ID bija 65064. Virsmas lādiņa relatīvais sadalījums tika parādīts ar skābo reģionu sarkanā krāsā, bāzes reģionu zilā krāsā un neitrālo reģionu baltā krāsā. Ūdeņraža saites LDHA kompleksos ar attiecīgi CA vai EGCG tika parādītas kā melnas punktētas līnijas. Sekvences tika iegūtas no UniProt (https://www.uniprot.org, piekļūts 2020. gada 9. novembrī) ar piekļuves numuriem P00338 (LDHA).

4.10. Īsas matadata RNS (shRNS) transfekcija

Kā aprakstīts iepriekš [50], tika izmantots pLKO.1 izspēles vektors un shRNS mērķa LDHA vektors. Šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs (2 × 10 grādu šūnas / iedobē) un inkubētas nakti. SNU620/5FU šūnas tika transficētas, izmantojot polietilēnimīnu (PED) (Polyplus-transfection, llkirch, Francija), gēnu un PEI attiecība ir 1:3. Pēc tam transfektētās šūnas 1 nedēļu apstrādāja ar 1 ug / ml puromicīna. Kontroles šūnu līnija tika izveidota pēc inficēšanas ar kodētu plazmīdu.

4.11.LDHA pārmērīga ekspresija

Plazmīda pDEST27-LDHA tika izveidota, subklonējot LDHA cDNS (iegādāta no Korea Human Gene Bank, Daejeon, Korea) pDEST27 (Invitrogen) vektoros. Tika veikti divi LDHA subklonētu komplekti. Lai rekonstruētu LDHA, SNU620/5FU-shLDHA šūnas tika transficētas ar pDEST27-LDHA un tukšu pDEST27 plazmīdu. Īsumā, šūnas tika kultivētas līdz 70 procentiem saplūšanas. Pēc tam šūnas 48 stundas apstrādāja ar maisījumu, kurā bija 3 ug DNS un Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Pēc inkubācijas šūnas tika atlasītas ar 200 ug / ml G418 1 nedēļu. Pēc tam, lai apstiprinātu transfekcijas efektivitāti, mēs veicām Western blot testu.

4.12.Apoptozes analīze

Apoptotiskās šūnas tika noteiktas, izmantojot Annexin V-FITC Apoptozes noteikšanas komplektu (BD Biosciences, Sanhosē, CA, ASV), saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs (2 × 10 grādu šūnas / iedobē) un 2 dienas apstrādātas ar norādītajām CA un 5FU koncentrācijām. Pēc 2 dienu ilgas apstrādes šūna tika mazgāta ar 1 × PBS. Šūnas tika suspendētas 500 μL saistīšanas buferšķīduma un apstrādātas ar 5 ul aneksīna V-FITC un 5 μL propīdija jodīda (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO, ASV), kam sekoja inkubācija 15 minūtes istabas temperatūrā tumšs. Fluorescences intensitātes tika pārbaudītas, izmantojot BD FACS CANTO ⅡI (BD Biosciences).

4.13. Mitohondriju reaktīvo skābekļa sugu (ROS) noteikšanas tests

Mitohondriju ROS ražošana tika noteikta, izmantojot MitoSOX sarkano mitohondriju superoksīda indikatoru (Thermo Fisher Scientific). Šūnas tika iesētas sešu iedobju plāksnēs (2 × 10 grādu šūnas/iedobē) un Mito-TEMPO (20 μM); Sigma-Aldrich ） tika iepriekš apstrādāts 1 stundu pirms ārstēšanas ar zālēm. Šūnas tika atkārtoti suspendētas 1 ml 1 × fosfātu buferšķīduma (PBS), pēc tam pievienojot 5 μM MitoSOX. Pēc tam šūnas inkubēja 10 minūtes 37 grādu temperatūrā. Fluorescences intensitāte tika analizēta, izmantojot BD FACS CANTO II (BD Biosciences). Fluorescences attēls tika noteikts ar fluorescences mikroskopu (palielinājums, 100 ×) (Axioimager M1 mikroskops, Carl Zeiss, Oberkochen, Vācija).

4.14. Kodola DAPI krāsošana

SNU620/5FU tika iesēts 24- iedobes plāksnē (5 × 104 šūnas/iedobē) un apstrādāts ar norādītajām CA un 5FU koncentrācijām 48 stundas. Pēc mazgāšanas ar 1 × PBS šūnas tika atkārtoti suspendētas 1- ml 1 × PBS. Pēc tam šūnas tika iekrāsotas ar 4 ug / ml DAPI 30 minūtes istabas temperatūrā un pārbaudītas ar fluorescences mikroskopu (palielinājums, 200 ×) (Carl Zeiss).

4.15. Statistiskā analīze

Šūnu dzīvotspējas, laktāta ražošanas, ECAR, OCR, qRT-PCR, LDHA, LDHB aktivitāšu, apoptozes un mitohondriju ROS rezultāti tika norādīti attiecībā pret kontroles vērtībām un izteikti kā vidējā ± standarta kļūda no trīs neatkarīgu eksperimentu vidējās vērtības. Atšķirības, kas pārsniedz katras grupas vidējo vērtību, tika analizētas ar Stjudenta t-testu, savukārt atšķirības starp grupām tika analizētas ar vienvirziena dispersijas analīzi ar Tukey post hoc testu, izmantojot GraphPad Prism (5. versija.0, GraphPad Software, San). Djego, Kalifornija, ASV).

5. Secinājumi

Kopumā rezistentām kuņģa vēža SNU620/5FU šūnām ir glikolītiski fenotipi, tostarp paaugstināta laktāta ražošana un augstāka LDHA ekspresija nekā vecāku SNU620 šūnās. Glikolīzes ierobežošana ar CA kā LDHA specifisku inhibitoru sensibilizē SNU620/5FU šūnas pret 5FU. Turklāt ārstēšana ar CA un 5FU palielināja mitohondriju ROS un apoptotisko šūnu nāvi 5FU rezistentās šūnās. Mūsu atklājumi liecina, ka CA var būt daudzsološs kandidāts adjuvanta zāļu izstrādei, kas samazina rezistenci pret 5FU balstītu ķīmijterapiju, ierobežojot LDHA aktivitāti.

Papildu materiāli: šādi ir pieejami tiešsaistē vietnē https://www.mdpi.com/article/10 .3390/ijms22105406/s1, S1 attēls: 5FU ietekme uz SNU620/5FU cll dzīvotspēju, S2 attēls: SNU620 pieaugums. un SNU620/5FU šūnas, ko mēra ar šūnu skaitīšanu, S3 attēls: SNU620 un SNU620/5FU šūnu laktāta ražošanas līmeņi, S4 attēls: PDK izotipu izpausmes SNU620 un SNU620/5FU šūnās, S5 attēls: oksamāta ietekme uz SNU620 un SNU620 dzīvotspēju. SNU620/5FU šūnas, S6 attēls: EGCG ietekme uz LDHA un LDHB aktivitātēm, S7 attēls: katehīna (CA) ietekme uz p-PDHA1, PDHA1 un PDK proteīnu ekspresijas līmeņiem, S8 attēls: izotermiskās titrēšanas kalorimetrijas (ITC) analīze. LDHA un CA, S9 attēls: LDHA ekspresija SNU620/5FU šūnās, kas transficētas ar shLDHA, S10 attēls: glikolītisko fenotipu un šūnu dzīvotspējas mērīšana dažādās vēža šūnās, S11 attēls: Western blot testa neapstrādātie dati.

Šis raksts ir izvilkts no Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms