Policistiskās nieru slimības cēlonis

lai iegūtu plašāku informāciju:ali.ma@wecistanche.com

Pārmērīga PKD1 ekspresija izraisa policistisku nieru slimību

Kerolaina Tivjēža, Almira Kurbegoviča, Mārtins Kujards, Ričards Gijoms, Olivjē Kotē un Marija Trūda

Pamatā esošie patoģenētiskie mehānismiautosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība(ADPKD) vēl ir jānoskaidro. Lai gan ir pierādījumi, ka Pkd1(policistiska nieru slimība 1)gēnu haplo nepietiekamība un heterozigotiskuma zudums var izraisīt cistu veidošanos pelēm, paradoksāli augstu Pkd1(policistiska nieru slimība 1) ekspresija ir konstatēta ADPKD nierēs (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība) pacienti. Lai noteiktu, vai Pkd1(policistiska nieru slimība 1)funkcijas palielināšanās var būt patoģenētisks process, Pkd1 baktēriju mākslīgā hromosoma (Pkd1-BAC) tika modificēta ar homologu rekombināciju, lai tikai mērķētu uz ilgstošu Pkd1 ekspresiju, galvenokārt uz pieaugušo nierēm. Tika izveidotas vairākas transgēnas līnijas, kas īpaši pārmērīgi ekspresēja Pkdl transgēns nierēs 2- līdz 15-kārtīgi pārsniedz Pkd1 endogēno līmeni. Visām transgēnām pelēm reproducējami attīstījās tubulārās un glomerulārās izmaksas un nieru mazspēja, un tās nomira no nieru mazspējas. Šis modelis parāda, ka tikai savvaļas tipa Pkd1 pārmērīga ekspresija ir pietiekama, lai izraisītu cistoģenēzi, kas atgādina cilvēka ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība). Mūsu rezultāti atklāja arī pārsteidzoši palielinātu nieru c-myc ekspresiju pelēm no visām transgēnajām līnijām, norādot, ka c-myc ir būtisks Pkd1 pakārtotais efektors in vivo.(policistiska nieru slimība 1)molekulārie Dathwavs, Šis pētījums ne tikai radīja nenovērtējamu un pirmo PKD(policistiska nieru slimība)modelis, lai novērtētu molekulāro patoģenēzi un terapijas, bet arī sniedz pierādījumus, ka funkcijas palielināšana varētu būt ADPKD patoģenētisks mehānisms (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība).

Noklikšķiniet uz Cistanche, lai uzzinātu par nieru slimību

Autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība(ADPKD) ir viena no visbiežāk sastopamajām cilvēku ģenētiskajām slimībām. To raksturo pakāpeniska vairāku nieru cistu attīstība, kas ietekmē visus nefrona segmentus. Citas izpausmes ir cistu veidošanās aknās un aizkuņģa dziedzerī, kā arī intrakraniālas aneirismas un sirds un asinsvadu defekti. ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)parasti noved pie nieru mazspējas, progresējot līdz beigu stadijas nieru slimībai vēlīnā pusmūžā.

Aptuveni 85 procenti no ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)gadījumi ir saistīti ar mutācijām PKD1(policistiska nieru slimība 1)gēns. Šis PKD1(policistiska nieru slimība 1)gēns ir liels, aptver 54 kb un sastāv no 46 eksoniem. Tas ģenerē 14.2-kb transkriptu un kodē 4. — 302-aminoskābes proteīnu, ko sauc par policistīnu-1 (4, 9-11). Cilvēka PKD1 un policistīna{11}} ekspresija ir analizēta normālā un ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)nieres. Nieru attīstības laikā policistīns{0}} ir viegli nosakāms glomerulārās un tubulārās epitēlija šūnās (apskatīts 37. atsaucē un tajā esošajās atsaucēs). Normāliem pieaugušajiem mēs un citi esam parādījuši, ka PKD1(policistiska nieru slimība 1)RNS un olbaltumvielas tiek ekspresētas mērenā vai zemā līmenī savākšanas un distālās kanāliņos, turpretim ADPKD līmenis ir palielinājies (~{0}} reizes). (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)nieres (22, 39). Interesanti, ka noturīga vai pastiprināta policistīna-1 ekspresija tiek konstatēta lielākajā daļā nieru epitēlija cistu, lai gan ievērojamā daļā cistu nebija iekrāsošanās (29). Papildus nierēm PKD1(policistiska nieru slimība 1)ekspresija parasti ir plaši izplatīta citos pieaugušo audos, tostarp epitēlija un neepitēlija šūnu tipos (6, 14, 18, 29, 30, 39).

Vairāk nekā 200 dažādu PKD1(policistiska nieru slimība 1)ir aprakstītas mutācijas, no kurām lielākā daļa ir dzēšanas-ievietošanas, kadru nobīdes vai bezjēdzīgas mutācijas. Paredzams, ka tie radīs saīsinātas proteīna formas, kas atbilst vienas alēles inaktivācijai.

Tomēr ievērojama daļa ir missense vai in-frame mutācijas, kas ir atrodamas visā gēnā un bieži vien ir unikālas konkrētai ģimenei (33, 34). Kā norāda nosaukums, ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)ir dominējošs un pārnēsātais mutācijas PKD1(policistiska nieru slimība 1)alēle ir pietiekama, lai izraisītu slimību. Tomēr ADPKD nieru cistu fokālais raksturs (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)liecina, ka PKD1 mutācijas mehānisms(policistiska nieru slimība 1)var būt divi sitieni vai heterozigotiskuma zudums. Atbalsts šim mehānismam tika iegūts, atklājot PKD1(policistiska nieru slimība 1)klonālās somatiskās mutācijas šūnās no ievērojamas cistu daļas (3, 21, 32). Heterozigotitātes zaudēšanas mehānisms varētu izskaidrot ļoti atšķirīgo fenotipu, kas parasti tiek novērots atsevišķās ģimenēs.

Pētījumi par peli Pkd1(policistiska nieru slimība 1)gēns var sniegt vērtīgu ieskatu PKD1 funkcijā(-s), jo cilvēka un peles gēns un gēnu produkts ir ļoti līdzīgi. Normālā attīstībā peles Pkd1 tiek ekspresēts augstā līmenī no morulas stadijas un tiek konstatēts visos neironu cekulas šūnu atvasinājumos. ieskaitot pieaugušo smadzenes, aortas arku, skrimšļus un mezenhimālo kondensāciju (16, 17). Ir ziņots, ka homozigotas mutantu peles, kuru mērķis ir Pkd1 dzēšana, mirst dzemdē un tām attīstās nieru un aizkuņģa dziedzera cistas (2, 19, 24-26, 40). Šie iepriekšējie mēģinājumi ģenerēt peles modeļus diemžēl nesniedza dzīvotspējīgus dzīvniekus pēcdzemdību periodā. Neskatoties uz to, nieru cistu rašanās šajās homozigotiskajās Pkd1 mutācijas pelēs atbilstu hipotēzei par divu sitienu mutācijas mehānismu cilvēkiem, kas ietver dzimumšūnas mutāciju un normālās alēles somatisko inaktivāciju. Tomēr pelēm, kas bija heterozigotas attiecībā uz Pkd1 mērķtiecīgu dzēšanu, parādījās arī PKD ar neregulārām aknu un aizkuņģa dziedzera cistām, neskatoties uz to, ka tās parādījās vēlīnā pieaugušā vecumā, atbalstot haploinsuficiences vai gēnu devas samazināšanas mehānismu. Turklāt heterozigotiskuma vai haploinsuficiences zudums var nebūt vienīgais ADPKD mehānisms. (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)patoģenēze. Patiešām, šie mehānismi ir pretrunā ar pastāvīgu vai pastiprinātu PKD1 ekspresiju(policistiska nieru slimība 1)novēro lielākajā daļā cilvēka nieru cistu, ja vien netiek ražoti nefunkcionāli proteīni. Šis konstatējums par ilgstošu vai palielinātu PKD1 ekspresiju rada jautājumu par to, vai funkcijas pieaugums vai pārmērīga ekspresija var būt operants. Lai izpētītu Pkd1 funkcijas palielināšanas patoģenētisko mehānismu, mēs esam izolējuši un raksturojuši peles Pkd1 baktēriju mākslīgo hromosomu (Pkd1-BAC), kas pēc tam tika modificēta ar homologu rekombināciju Escherichia coli, lai mērķētu Pkd1 ekspresiju.(policistiska nieru slimība 1)īpaši uz nierēm. Mēs ziņojam par trīs transgēnu līniju ražošanu, kas ekspresēja Pkd1 transgēnu dažādos līmeņos. Visām pelēm reproducējami bija vairākas līdzības ar cilvēka ADPKD, un tām konsekventi attīstījās agrīna parādīšanās ar strauju nieru morfoloģisko un funkcionālo izmaiņu progresēšanu un nomira no nieru mazspējas pusmūžā. Turklāt pašreizējā pētījumā ir aprakstīts in vivo mehānisms, ar kuru Pkd1 var būt starpnieks šajā PKD fenotipā. Šīs peles ir pirmais PKD modelis, ko rada ortoloģiskā PKD1 pārmērīga ekspresija nierēs.(policistiska nieru slimība 1)gēns.

MATERIĀLI UN METODES

Pkd1 saturošu BAC klonu izolēšana(policistiska nieru slimība 1)locus. Pkd1-BAC kloni no baktēriju saimniekcelma E. coli DH10B (RecA; RecBC) tika izolēti no 129Sv peles pBelo11BAC bibliotēkas (Research Genetics). BAC superpūlu skrīnings tika veikts ar PCR ar šādiem primeriem: 5 reģioni, 5-CTG ATGAGTTCTGGCCATGGATG-3 (uz priekšu Pkd1 eksons 1) un 5-CTGCCA GCCAATGCCATAGTCAC-3 (reverss). Pkd1 eksons 1); un 3 reģioni: 5-TCG GCCCTAGCGTCTGCAGCC-3 (uz priekšu Pkd1 eksons 39) un 5-TCCAGTCC CACCTACAGCCAAC-3 (reversais Pkd1 eksons 40). Viens pozitīvs klons abām amplifikācijai tika identificēts un analizēts ar standarta gēla un impulsa lauka gēla elektroforēzi (PFGE), kam sekoja Southern blotēšana. Southern blot analīzei ir izstrādātas septiņas peles Pkd1 zondes: genoma eksons 1 (516 bp; nukleotīdi [nt] no 1 līdz 516; NCBI reģistrācijas numurs U70209), genoma eksons 2-3 (220 bp), genoma eksons {{ 31}} (8479 bp), cDNS eksons 15-20 (1724 bp; nt no 6455 līdz 8179), cDNS eksons 25-34 (1315 bp; nt 9415 līdz 10730), cDNS eksons 36-45 ( 1655 bp; nt no 10963 līdz 12618) un genoma eksons 45-46 (1640 bp) (16). Ir arī sekvencēti vairāki reģioni, tostarp šīs peles Pkd1-BAC BAC ieliktņu ekstremitātes, un tika apstiprināts, ka tie ir ortoloģiski cilvēka PKD1 gēnam un blakus esošajiem reģioniem.

REZULTĀTI

SBPkdl ražošana(policistiska nieru slimība 1) rAc-BAC ar homologu rekombināciju. Lai noteiktu, vai tikai funkcijas Pkd1 pastiprinājums ir pietiekams, lai izveidotu ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)fenotipa gadījumā mēs vispirms izolējām genoma klonu, kas satur visu Pkdl gēnu BAC vektora 129/Sv bibliotēkā. Šī bibliotēka tika pārbaudīta ar PCR ar diviem Pkd1 gēna praimeru komplektiem, kas aptvēra 1. eksonu 5' galā un 39. līdz 40. eksonus 3' gala virzienā (1. att.). Tika identificēts pozitīvs BAC klons Pkd1 gēnam, kas ietvēra visu blakus esošo Tsc2 gēna ķermeni. Pkd1 ieliktnis tika detalizēti raksturots, lai nodrošinātu, ka genoma struktūra atbilst endogēnā Pkd1 struktūrai.(policistiska nieru slimība 1)129/Sv peles celma gēns, no kura tika iegūts ieliktnis, un no C57BL/6J inbred celma. Pkd1 lokusa genoma kartes BAC un šajos inbred celmos ar Southern blot analīzi ar četriem restrikcijas enzīmu sagremojumiem un septiņām zondēm, kas aptver visu Pkdl gēnu, izrādījās identiskas, bez pārkārtošanās pierādījumiem (1. att.). Šis BAC saturēja ~121-kb ieliktni, tostarp -37 kb augšup pa straumi un -39 kb lejpus Pkd1 secības(policistiska nieru slimība 1)gēns, ko nosaka ar elektroforēzi un sekvencēšanu.

Šis Pkd1-BAC klons tika modificēts ar diviem secīgiem homologiem rekombinācijas notikumiem E.coli. Pkd1(policistiska nieru slimība 1)gēns tika iezīmēts 10. eksonā, aizstājot nukleotīdu (G uz A), lai izveidotu jaunu EcoRI vietu 2355. pozīcijā cDNS kartē. Šī klusā punkta mutācija tika izveidota, lai atšķirtu Pkd1(policistiska nieru slimība 1)gēns un BAC transkripts no endogēnas izcelsmes. Turklāt mēs esam aizstājuši Pkd1-BACgēna 5' regulējošos elementus, izmantojot iepriekš identificētos "SB" nieru epitēlijam raksturīgos elementus no SBM (saistīts ar c-Myc) vai SBF, kas saistīts ar c- fos)konstrukt-trans-gēns, lai ierobežotu ekspresiju nierēs (36,38) (2.a attēls).

Šis jaunais SBPkd1TAc-BAC tika sagremots ar Notl, unikālu vietu, kas atrodas tieši augšpus SB elementiem, un ClaI Tsc2 gēna ķermenī, saīsinot Tsc2 regulējošos elementus un gēna ķermeņa 5' pusi, lai nodrošinātu Tsc2 eksogēnās ekspresijas trūkumu. visos audos un noņemt prokariotu BACvektoru sekvences (1. un 2. att.). Šis 70-kb Notl-Clal linearizētais fragments tika izolēts, attīrīts un kvantitatīvi noteikts oocītu mikroinjekcijai (36).

SBPkd1rAc transgēno peļu ražošana un analīze. Četri transgēni dibinātāji, kuriem ir vairākas SBPkd1rAc transgēna kopijas, konsekventi izstrādāja PKD(policistiska nieru slimība). No četrām SBPkdlrAc dibinātāju pelēm, kas noteiktas ar Southern analīzi, tika izveidotas trīs SBPkd1rAG transgēnās līnijas ar divām līdz deviņām transgēna kopijām (2.b attēls). Transgēna integritātes raksturojums šajās līnijās tika uzraudzīts ar 5', iekšējām un 3' zondēm, kā parādīts reprezentatīvajos piemēros 2.b attēlā. Transgēnās līnijas atklāja ar 5'"SB" zondi 10,9 kb joslu, kas atbilst SBPkd1rAc transgēnam, kas ir integrēts virzienā no galvas līdz asti, un ar 3' zondi atklāja 71- kb joslu. (2.b att.). Turklāt iekšējā zonde atklāja transgēna 94-kb endogēno Pkd1 joslu, kā arī 69-kb un 25-kb joslu EcoRI ievietošanas vietas dēļ. eksonā 10 (2.b att.). Šīs peles saturēja pilnīgas transgēna kopijas, pamatojoties uz genoma pārklāšanās struktūras analīzi.

Pkd1(policistiska nieru slimība 1)funkcijas pieaugums pieaugušām SBPkdlrAc transgēnām pelēm. SBPkdlrAG transgēna un Pkd1 gēna ekspresija tika pētīta dažādos orgānos. Transkripta līmeņu kvantitatīvā noteikšana no transgēna un/vai endogēnā gēna tika veikta ar Northern blot analīzi (3.a attēls). Kā gaidīts, transgēnu un endogēno gēnu transkripti bija līdzīga garuma (14, 2 kb). Pamatojoties uz kontroles GAPDH ekspresiju, nierēm no visām SBPkd1TAG peļu līnijām bija konsekventi paaugstināta transkripta ekspresija, salīdzinot ar normālu Pkdl līmeni līdzīga vecuma pieaugušo nierēs (n=3). Nieru transgēna un endogēnā ekspresija dažādām transgēnām līnijām uzrādīja diapazonu no 2- līdz 15- reizes virs kontroles nieres endogēnā Pkd1 līmeņa (3.a attēls). Jo īpaši transgēnā līnija 39 (n {{11} }) uzrādīja augstāku Pkd1(policistiska nieru slimība 1)līmeņos nekā 3. (n=3) un 41. rinda (n =4). Turklāt Pkd1 ekspresijas līmeņi, kas izmērīti ar Northern blot analīzi, korelēja ar tiem, kas iegūti ar reāllaika PCR, izmantojot primerus 1. un 2. eksonā (3.b attēls).

Īpaši transgēnu ekspresijas līmeņu kvantitatīvā noteikšana tika veikta ar reāllaika PCR un puskvantitatīvo RT-PCR trīs transgēnu līnijās pieaugušā vecumā, izmantojot primerus 5' netranslētajā reģionā (B, -globīna promotors) un Pkd1 2. eksonā.(policistiska nieru slimība 1)(3.b att.). SBPkdlrAc ekspresija transgēnās pelēs tika salīdzināta ar S16 ribosomu proteīna gēna produktu kā iekšējo standartu. Puskvantitatīvās RT-PCR amplifikācijas apstākļi bija lineārā diapazonā. Transgēnu ekspresija ar reāllaika PCR un puskvantitatīvo RT-PCR konsekventi un specifiski uzrādīja augstāko ekspresiju nierēs no visām transgēnajām līnijām, salīdzinot ar citiem orgāniem (3.b un c. attēls). Nieru ekspresijas līmeņi atsevišķam paraugam bija reproducējami ar jebkuru no izmantotajām noteikšanas metodēm. Augstākie Pkd1 līmeņi(policistiska nieru slimība 1)transgēna nieru ekspresija tika mērīta 39. un 41. līnijai. Lai uzraudzītu, vai palielināts Pkd1(policistiska nieru slimība 1)ekspresija radās no transgēna vai endogēnā gēna, tā pati peļu grupa no trim transgēnajām līnijām tika salīdzināta ar Pkd1 transgēna ekspresiju nierēs un Pkd1 kopējo (transgēnu un endogēno) ekspresiju ar reāllaika PCR. Interesanti, ka 39. un 41. līnija attiecībā pret 3. līniju parādīja, ka palielinātā Pkdl transgēna nieru ekspresija bija līdzīga Pkd1 kopējai nieru ekspresijai vai augstāka par to, norādot uz transgēnu, kas ir īpaši atbildīgs par šo inducēto ekspresiju. Dažādos orgānos (tostarp sirdī, plaušās, smadzenēs, aknās, aizkuņģa dziedzerī un liesā) SBPkd1rAg transgēns uzrādīja ļoti vāju ekspresiju, kas dažkārt tika konstatēta liesā un plaušās, bet citos orgānos ekspresija bija neliela vai nenosakāma (3.b attēls). Kvantitatīvā noteikšana ar reāllaika PCR parādīja, ka transgēna ekspresijas līmenis ekstrarenālos audos ir 10- līdz 1,{13}}reizi zemāks, salīdzinot ar nieru ekspresiju (3.c attēls). SBPkdlrA transgēna "SB" regulējošie elementi piešķīra preferenciālu nieru ekspresiju; šis konkrētais orgānu sadalījums tika noteikts arī tad, kad to izmantoja transgēnos, kas saistīti ar c-myc (SBM) un c-fos (SBF) (36, 38).

C-myc, Pkd1 pakārtotais efektors(policistiska nieru slimība 1)signalizācijas ceļi SBPkdlrAc pelēm. Lai gūtu ieskatu SBPkdlrAg transgēno peļu intracelulārajā patoģenētiskajā mehānismā, mēs pēc tam centāmies uzraudzīt c-myc nieru ekspresijas līmeni, pamatojoties uz mūsu iepriekšējiem novērojumiem par c-myc deregulāciju cilvēka ADPKD. (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)nieres(22).Nieru analīze tika veikta no visām trim transgēnajām līnijām 3(n =4), 39(n =7) un 41(n=4), kā arī kontroles. (n=4). Kā parādīts 3.d attēlā, SBPkd1TAG pelēm ir būtiska endogēnā c-myc ekspresija, salīdzinot ar līdzīga vecuma kontroles pelēm. Interesanti, ka c-myc ekspresijas līmenis dažās SBPkd1-c nierēs. jo īpaši 39. līnija sasniedza līmeni, kas ir salīdzināms ar to, kas novērots PKD SBM transgēnās peles modelī, ko radīja nieru c-myc ekspresija.

Nieru anomālijas SBPkd1raG pelēm, kas līdzīgas PKD(policistiska nieru slimība). To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size(Fig.4a and b). SBPkdl-AG kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n =25;n>6 katrai līnijai) attīstījās vairākas cauruļveida (T) un glomerulāras cistas (G) (4.d, f un g att.). Cistas tika novērotas kanāliņos no kortikālā un medulārā reģiona, kā arī savācot kanāliņus no papillas (att. 4). 4d un e). Transgēnām pelēm novēroja cauruļveida epitēlija hiperplāziju (bultas galviņu), kas ietvēra gan cistiskas, gan necistiskas kanāliņus un biežu hipertrofiju (4.g un h att.), taču smaguma pakāpe dažādām pelēm bija atšķirīga. Bieži tika novērota intersticiāla fibroze (F), perivaskulāri limfoīdie infiltrāti un olbaltumvielas (P) (4.d un e attēls).

Lai precīzāk definētu palielinātā Pkd1 lokalizācijas vietu(policistiska nieru slimība 1)ekspresiju nierēs, mēs veicām in situ hibridizāciju, izmantojot iepriekš izmantoto eksona 36-45 zondi (16). Hibridizācijas signāls tika lokalizēts īpaši epitēlija šūnās, kas klāj cistas un hiperplastiskās kanāliņus, kā arī glomerulārās cistas. Turklāt pār noncistisku vai nedaudz paplašinātu kanāliņu epitēliju tika novērots zināms signāls, kas, iespējams, identificēja kanāliņus, kas bija paredzēti turpmākām cistiskām izmaiņām (4.i un j att.).

Nieru histoloģiskā analīze tika veikta arī transgēnām pelēm dzimšanas brīdī (n =8), 10. pēcdzemdību dienā (P10) (n =3), P20 (n =5), P35 (n { {7}}), un P45(n=3), salīdzinot ar negatīvajiem tās pašas vecuma grupas metiena biedriem (n 2 līdz 4). Interesanti, ka visām jaundzimušajām transgēnajām pelēm bija vērojama cauruļveida un glomerulāra dilatācija salīdzinājumā ar kontroles negatīvajiem metiena biedriem (4.k un l. attēls), kas norāda, ka nieru anomālijas, kas sākās dzemdē, kā novērotas SBM pelēm un ADPKD. (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)pacientiem. Cauruļveida un glomerulārās dilatācijas izmērs un skaits palielinājās līdz ar vecumu. Pēc P35 transgēnām pelēm bija smagāka hiperplāzija un glomerulosklerozes pierādījumi. Mainītas nieru fizioloģiskās funkcijas SBPkd1TAG pelēm. Visu transgēno peļu nieru fizioloģiskajām funkcijām bija līdzīgas pazīmes kā PKD(policistiska nieru slimība), savukārt netransgēniem metiena biedriem slimība nekad nav attīstījusies. Dažu mēnešu laikā pēc piedzimšanas skartajiem dzīvniekiem attīstījās hroniska nieru mazspēja. Šiem dzīvniekiem tika uzraudzīti nieru funkcionālie parametri, mērot seruma un urīna līmeni, urīnvielas slāpekļa (BUN) un kreatinīna līmeni asinīs, urīna osmolalitāti, urīna proteīnu un jonu izdalīšanos (1. Visām pelēm no trim līnijām, salīdzinot ar kontrolēm, bija koncentrācijas defekti, kas ir bieži sastopams ADPKD konstatējums, un līdz ar to tām bija samazināta BUN, kreatinīna, olbaltumvielu un dzelzs koncentrācija urīnā. Transgēnie SBPkd1TAG dibinātāji un pēcnācēji (n 6) no katras līnijas tika kvalitatīvi uzraudzīti attiecībā uz proteīnūriju urīna paraugos ar SDS-PAGE (5. att.). Pelēm, kas vecākas par 2 mēnešiem, bija neselektīva proteīnūrija, kas progresēja līdz ar vecumu. Turklāt tika paaugstināts BUN un seruma kreatinīna līmenis, atklājot nieru mazspēju (2. tabula). Tā kā hroniska nieru mazspēja parasti izraisa hematoloģisko parametru izmaiņas, tās tika pārbaudītas SBPkd1TAG transgēnām pelēm vecumā no 3 līdz 14 mēnešiem (2. Šīs transgēnās peles bija anēmiskas, par ko liecina ievērojami samazināts sarkano asins šūnu skaits, hemoglobīnam un hematokrītam sasniedzot pusi no normālā līmeņa. Citi sarkano asins šūnu parametri, piemēram, retikulocītu procentuālais daudzums, netika ietekmēti, kā paredzēts, ja tos izraisīja nieru defekts. Šie dzīvnieki konsekventi nomira no nieru mazspējas 5.{12}}.8 mēnešu vecumā (n 42) transgēnai līnijai 39 un vēlākā vecumā, 14.6 3.1 mēneša (n 20) un 11 gados. .7 6.5 mēneši (n 7) attiecīgi 3. un 41. rindiņai.

Zīm. 1. Peļu Pkd1-BAC shematisks attēlojums un detalizēta restrikcijas kartes analīze.

Pkd1 genoma DNS gremošanas modeļi(policistiska nieru slimība 1)-BAC tika salīdzināti ar Pkd1(policistiska nieru slimība 1)lokuss 129Sv un C57Bl/6J inbred peļu celmos. Tika ražotas septiņas zondes, kas aptver lielāko daļu peles Pkd1 gēna:

(a) eksons 1, (b) eksons 2-3, (c) eksons 7-15, (d) eksons 15-20, (e) eksons 25-34, (f ) eksons 36-45 un (g) eksons 45-46, kas genoma Pkd1 apzīmēts no a līdz g(policistiska nieru slimība 1)attēlojumu un pār atsevišķiem blotiem.

Southern blot analīze pēc genoma DNS restrikcijas (BamHI, EcoRI, HindIII un KpnI) no Pkd1-BAC un peles Pkd1(policistiska nieru slimība 1)loki parādīja identiskus modeļus ar visām septiņām zondēm. M, HindIII marķieris; 129, 129/Sv; C57, C57Bl/6J.

DISKUSIJA

Šeit mēs ziņojam par peles Pkd1-BAC izolāciju un raksturojumu. Šis Pkd1(policistiska nieru slimība 1)gēns tika marķēts un regulējošie elementi tika aizstāti, lai mērķētu ekspresiju tieši uz nierēm ar diviem secīgiem homologiem rekombinācijas notikumiem. Transgēnām pelēm, kas ražotas ar šo jauno SBPkd1TAG gēnu, Pkd1 ekspresija palielinājās 2- līdz 15- reizes un reproducējami attīstījās agrīnas nieru morfoloģiskas izmaiņas, kas raksturīgas PKD. Nieru mazspēja ir redzama pusmūžā, un peles priekšlaicīgi mirst no nieru mazspējas. Mūsu rezultāti arī norāda, ka Pkd1 pārmērīgas ekspresijas mehānisms, kas ir atbildīgs par šo fenotipu, ir saistīts ar c-myc signālu aktivāciju in vivo. Šis pētījums parāda, ka peles Pkd1 funkcijas pieaugums nierēs ir pietiekams, lai radītu PKD nieru fenotipu. Tā kā peles Pkd1 gēns netiek dublēts, kā tas ir cilvēkiem (27), mēs esam tieši identificējuši un izolējuši BAC klonu, kas satur visu Pkd1 gēnu. Pilnīgs 129/Sv peles Pkd1-BAC raksturojums, netiešs salīdzinājums ar diviem citiem inbred peļu celmiem, apstiprināja Pkd1 lokusa integritāti. Pkd1-BAC ieliktnis saturēja no 37 līdz 39 kb augšpus un lejpus Pkd1 gēna sekvences. Mūsu analīze parādīja, ka Pkd1 gēns šajā BAC bija bona fide peļu savvaļas tipa lokuss, kas varētu kalpot turpmākiem pētījumiem. Lai gan ir pārliecinoši pierādījumi, ka ADPKD veidojas cistas (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)var rasties heterozigotiskuma zuduma dēļ pēc normāla PKD1 somatiskas inaktivācijas(policistiska nieru slimība 1)alēle (3, 21, 32), ir arī pierādījumi par ilgstošu vai pat palielinātu policistīna -1 ekspresiju cistiskā kanāliņu epitēlijā (22, 29). Pēdējais novērojums rada jautājumu par to, vai Pkd1 pārmērīga ekspresija pati par sevi ir pietiekams tuvs cistoģenēzes cēlonis. Transgēnām pelēm, kurām ir cilvēka PKD1(policistiska nieru slimība 1), TSC2, RAB 26, NTHL1 un SLC9A3R2 gēniem, tikai nelielai daļai peļu attīstījās cistas, un nevienai no tām nebija nosakāma transgēna ekspresija pieaugušā vecumā, neskatoties uz 30 transgēna kopijām (31). Šajās transgēnajās pelēs bija grūti noteikt skaidru Pkd1 pārmērīgas ekspresijas lomu cistoģenēzē. Mūsu modelis atšķiras, jo transgēnās pelēs tika integrētas divas līdz deviņas savvaļas tipa Pkd1 kopijas bez blakus esošajiem gēniem. Tā kā Pkd1 gēnam ir būtiskas funkcijas dažādos orgānos vai audos, kā aprakstīts daudzām pelēm ar Pkd1 gēna ablāciju, sistēmiska Pkd1 pārmērīga ekspresija var izraisīt papildu neskaidras sekas. Līdz ar to mēs esam pievērsušies Pkd1 funkcijas pieauguma lomai, izmantojot pieeju, kas Pkd1 ir īpaši vērsta uz nierēm. Ar homologu rekombināciju mēs vispirms esam aizstājuši Pkd1 augšpus regulējošo reģionu ar "SB" nieres ierobežotiem regulējošiem elementiem, tādējādi novēršot samazinātu gēnu ekspresiju, kas parasti tiek novērota Pkd1 pieaugušā vecumā, kā arī iespējamo sekundāro atgriezeniskās saites cilpas regulējumu (36, 38). Otrkārt, mēs esam iezīmējuši peles Pkd1 transgēnu (Pkd1TAG) ar klusā punkta mutāciju eksonā 10, bet neievietojām epitopa marķējumu, lai nodrošinātu, ka tiks ražots pilnībā funkcionāls "savvaļas tipa" proteīns ar konservētu struktūru un integritāti. No šī modificētā BAC tika attīrīts SBPkd1TAG fragments no Tsc2 gēna un BAC vektora, lai novērstu Tsc2 gēna traucējumus, kas var izraisīt arī cistisko fenotipu (8, 20, 28), kā arī lai izvairītos no inhibējošās iedarbības. prokariotu sekvences (5).

Ar specifisku nieru Pkd1 tika izveidotas četras dažādas SBPkd1TAG transgēnās dibinātāja peles un trīs neatkarīgas līnijas.(policistiska nieru slimība 1)- uzlabota izteiksme. Īpaši pārsteidzoša ir pilnīga fenotipa iespiešanās šajās transgēnajās pelēs. SBPkd1TAG dibinātājam un peles līnijām bija vairākas kopīgas fiziopatoloģiskas iezīmes ar ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība). Tie ietver cistu veidošanos garozā, smadzenēs un glomerulos kopā ar epitēlija hiperplāziju, intersticiālu fibrozi un fokusa intersticiālu iekaisumu.

Tā kā PKD(policistiska nieru slimība)fenotips tika konsekventi novērots visās dažādajās transgēnu dibinātāju pelēs, un transgēna integrācija peles genomā ir nejauša parādība, fenotips nevar rasties no hromosomu stāvokļa efekta, bet tikai no palielinātas Pkd1 ekspresijas. Patiešām, tika pierādīts, ka Pkd1 transgēna ekspresija visās līnijās ir ierobežota ar nierēm, kā iepriekš tika novērots citiem transgēniem, kurus regulē "SB" elementi (36, 38). Turklāt šo palielināto Pkd1 ekspresiju izraisīja transgēns, nevis netieša endogēna Pkd1 aktivācija. Tādējādi mūsu rezultāti sniedz skaidrus pierādījumus tam, ka savvaļas tipa funkcionālā Pkd1 funkcijas pieaugums var radīt vairākas nieru cistas. Svarīgi ir tas, ka šīs SBPkd1TAG peles ir pirmais peles modelis, ko ģenerē vienīgā cilvēka PKD1 gēna peles ortologa pārmērīga ekspresija.

SBPkd1TAG peles parāda, ka Pkd1(policistiska nieru slimība 1)pārmērīga ekspresija ir primārais nieru cistoģenēzes patoģenētiskais mehānisms. Svarīgi, ka augstākie transgēnu ekspresijas līmeņi nierēs korelē ar fenotipa progresēšanu un smagumu. Mēs arī atklājām, ka Pkd1 pārmērīga ekspresija SBPkd1TAG fenotipa attīstībā, iespējams, norāda uz c-myc aktivāciju in vivo. Iespējams, ka šī aktivizēšana varētu būt pat tieši caur policistīna -1 C-gala asti, kurā notiek proteolītiskā šķelšanās un kodola translokācija (7). Tā kā tika pierādīts, ka c-myc pastiprināta nieru ekspresija pieaugušām pelēm inducē PKD, būtu ļoti konsekventi atbalstīt c-myc kā galveno Pkd1 signalizācijas ceļu pakārtoto efektoru. Šis rezultāts korelēja arī ar mūsu iepriekšējiem konstatējumiem par palielinātu c-myc ekspresiju visu cilvēka ADPKD nierēs (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)analizēts (22). Kopumā šie rezultāti liecina, ka c-myc ir galvenais Pkd1 starpnieks(policistiska nieru slimība 1)cistoģenēze. Mūsu rezultāti no Pkd1 funkcijas palielināšanas modeļa, kā arī peļu Pkd1 haploinsufficience un funkcijas zudums liecina, ka jebkura Pkd1 disregulācija var izraisīt cistoģenēzi (2, 19, 23–26, 31, 40).

Smags Pkd1(policistiska nieru slimība 1)nelīdzsvarotība pelēm, ko izraisa Pkd1(policistiska nieru slimība 1)ablācija vai transgēna pārmērīga ekspresija izraisīja nieru cistu agrīnu parādīšanos un strauju progresēšanu, kā arī ietekmēja lielu daļu kanāliņu. Turpretī maigāka Pkd1 nelīdzsvarotība, piemēram, haploinsufficience, izraisīja lēnāku PKD progresēšanu ar vairāk fokusa cistu. Līdzīga fenotipa šķietamo paradoksālo attīstību, izmantojot pretēju policistīna-1 disregulāciju, var izskaidrot ar kopējo rezultātu, proti, relatīvo proteīnu koncentrācijas nelīdzsvarotību, kas varētu mainīt aktīva policistīna daudzproteīnu kompleksa veidošanos vai darbību. Kopumā mūsu un citu pētnieku rezultāti apgalvo, ka cistu veidošanās mehānisms ADPKD (autosomāli dominējošspolicistiska nieru slimība)visticamāk, rodas no trim patoģenētiskiem mehānismiem: funkcijas palielināšanās, funkcijas zuduma un gēnu devas ietekmes. Jaunās SBPkd1TAG peles ir spēcīgs nieru cistoģenēzes modelis, kas var sniegt nozīmīgu ieskatu PKD patofizioloģijā(policistiska nieru slimība), Pkd1(policistiska nieru slimība 1)signālu pārraides ceļi un mijiedarbības partneri. Šī modeļa izpēte var arī novest pie jaunu terapeitisko stratēģiju izstrādes, lai atjaunotu normālu olbaltumvielu līdzsvaru Pkd1 multimēru kompleksā.

ATSAUCES

1. Blouin, MJ, H. Beauchemin, A. Wright, MEDe Peepe, M. Sorette, A.-M. Bleau.B. Nakamoto. C.-N, Ou, G. Stamatovannopoulos un M. Trudel 2000. Sirpjveida šūnu slimības ģenētiskā korekcija: ieskats, izmantojot transgēno peļu modeļus. Nat. Med. 6:177-182.

2. Boulter, C., S. Mulroy, S. Web, S. Fleming, K. Brindle un R. Sandford. 2001. Sirds un asinsvadu, skeleta un nieru defekti pelēm ar mērķtiecīgu Pkd1 traucējumu(policistiska nieru slimība 1)gēns.Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 98:12174-12179.

3. Brasier, JL un EPHenske.1997. Loss of thepolicistiska nieru slimība(PKD1) hromosomas 16p13 reģions nieru cistu šūnās atbalsta cistu patoģenēzes funkciju zaudēšanas modeli. Dž.Klins. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connors, WRDackowski, LRPetry, TJVan Raay, JM Millholand, M. Venet, G. Miller, RM Hakim, GMLandes, KW Klinger, F. Qian, LF Onuchic, T. Watnick, GG Germino un NA Doggett.1995. Analysis of the genomic sequence for theautosomāli dominējošs policistiska nieru slimība(PKD1) gēns prognozē ar leicīnu bagāta atkārtojuma klātbūtni. Hum. Mol. Genet.4:575-582.

5. Čada, K., Dž.Magrams, K. Rafaels, G. Radisa, E. Leisijs un F. Kostantīni.1985. Svešglobīna gēna specifiska ekspresija transgēnu peļu eritroīdās šūnās. Nature 314:377-380.

6. Šovē, V, F. Cjaņs, N. Buts, Y. Cai, B. Phakdeekitacharoen, L. F. Onučiks, T. Atijs-Bitahs, L. Guičarnauds, O. Devuists, GG Germino un M.-C. Gublers.2002. PKD1 izpausme(policistiska nieru slimība 1)un PKD2(policistiska nieru slimība 2)transkripti un proteīni cilvēka embrijā un normālas nieru attīstības laikā. Am. J. Pathol, 160:973-983.

7.Chouvet, V., X. Tian, ​​H. Husson, DHGrimm, T. Wang, T. Hiesberger, P. Igarashi, AM Bennett, O. Ibraghimov-Beskrovnava, S. Somlo un MJ Caplan.2004. Mehāniskie stimuli izraisa policistīna -1 C gala šķelšanos un kodola translokāciju. Dž.Klins. Izpētīt. 114:1433-1443.

8. Cheadle, JPMP Reeve, JR Sampson un DJ Kwiatkowski.2000. Molekulārā ģenētiskā attīstība bumbuļu sklerozes gadījumā. Hum. Genet.107:97-114. 9. Konsorcijs, EPKD1993. Bumbuļu sklerozes gēna identifikācija un raksturojums 16. hromosomā. 75. šūna:1305-1315.

10. Consortium, EPKD1994. Policistiskās nieru slimības 1 gēns kodē 14 kb transkriptu un atrodas dublētajā 16. hromosomas reģionā. 77. šūna:881-894.

11. Konsorcijs, IPKD1995. Policistiskā nieru slimība: pilnīga PKD1 struktūra(policistiska nieru slimība 1)gēns un tā proteīns. 81. šūna:289-298.

12. Kuljērs, M., R. Gijoms, N. Tanji, V. DAgati un M. Trudel.2002. c-myc izraisīta apoptoze policistisku nieru slimībā nav atkarīga no FasL Fas mijiedarbības. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, ME un M. Trudel.1994. Transgēnā SAD pele: cilvēka sirpjveida šūnu glomerulopātijas modelis. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. Gengs, L., Y. Segals, B. Peisels, N. Dens, Y. Pejs, F. Carone, HGRennke, AM Glücksmann-Kuis, MC Schneider, M. Ericsson, STreeders un J. Zhou. 1996. Policistīna, PKD1, identifikācija un lokalizācija(policistiska nieru slimība 1)gēnu produkts. Dž.Klins. Izpētīt. 98:2674-2682.

15. Gong, S., XWYang, C. Li un N. Heintz.2002. Ļoti efektīva baktēriju mākslīgo hromosomu (BAC) modifikācija, izmantojot jaunus atspoles vektorus, kas satur R6Ky replikācijas sākumu. Genome Res. 12;1992-1998.