Augšanas faktora-β (TGF-β) transformējošā loma nieru fibrozes attīstībā
Mar 26, 2022
Kontakti: Audrey Hu Whatsapp / hp: 0086 13880143964 e-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
I DAĻA: Cilvēka primārā nieru fibroblasta loma TGF-β1-mediētās fibrozes imitācijas ierīcēs
Seong-Hye Hwang, Yun-Mi Lee u.c.
1. Ievads
Nieru fibroze, kas ir neskaitāmu progresējošu nieru slimību galīgais kopīgais ceļš, raksturo ekstracelulārās matricas (ECM) olbaltumvielu ražošanas pieaugums, matricas degradācijas samazināšanās, šūnu matricas mijiedarbības disfunkcija, dzīvojošo šūnu transformācija un iekaisuma šūnu infiltrācija.Pārveidojošais augšanas faktors-β(TGF-β) ir daudzfunkcionāls dimērisks peptīds, kas regulē bioloģiskos procesus, piemēram, šūnu proliferāciju, diferenciāciju un imunoloģiskās reakcijas [1]. Starp daudzajiem fibrogēniem faktoriem TGF-β(Pārveidojošais augšanas faktors-β) ir galvenā loma, un tai ir pretiekaisuma iedarbība. TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)-peles ar deficītu mirst no masīva iekaisuma. Transgēnas peles, kas pārmērīgi ekspresē TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ir praktiski aizsargāti pret nieru fibrozes patoloģijas attīstību, galvenokārt ar pretiekaisuma iedarbību [2]. TGF-β profibrotiskās un pretiekaisuma īpašības(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ir divgriezīgi zobeni attiecībā uz TGF-β terapeitisko pielietojumu(Pārveidojošais augšanas faktors-β)Inhibīciju. Ir pieliktas ievērojamas pūles, lai kavētu TGF β(Pārveidojošais augšanas faktors-β)rīcību, lai kavētuNieruFibroze[3]. Lai gan cīņai ir izmantotas daudzas pieejasNieruFibroze, eksperimentāls modelis, lai novērtētu pašlaik pieejamās zāles, nav ideāls.
cistanche herb novērstnieru slimības
Kopumā pētījumiem ar dzīvniekiem ir galvenā loma preklīniskos testos farmakokinētikas un zāļu efektivitātes prognozēšanā. Tomēr starp dzīvniekiem un cilvēkiem pastāv dažādas atšķirības, kas liek mums apšaubīt uz dzīvniekiem balstītu zāļu efektivitātes un drošības testu precizitāti 4. Iepriekšējie ziņojumi ir bijuši atkarīgi no preklīniskiem pētījumiem ar dzīvniekiem zāļu izstrādes laikā, lai novērtētu zāļu nefrotoksicitāti un drošību. Dzīvnieku nieru darbība ir vairāk nekā divas reizes lielāka nekā cilvēka nierēm. Tādējādi dzīvniekiem narkotikas tiek metabolizētas ātrāk nekā cilvēkiem, tāpēc ir grūti noskaidrot zāļu toksicitātes testu rezultātus, izmantojot pētījumus ar dzīvniekiem. Turklāt eksperimentu ar dzīvniekiem rezultātus nevar izmantot, lai prognozētu zāļu atbildes reakciju uz cilvēkiem, jo dzīvniekiem ir atšķirīgas fizioloģiskās funkcijas. Dzīvniekbāzētsnieru fibrozemodeļiem ir grūtības reproducēt cilvēkunieru fibroze; tādējādi notiek pētījumi, lai pārvarētu pašreizējos šķēršļus un optimizētu narkotiku atklāšanas platformas [5].
Organ-on-a-chip (OoC) tehnoloģija ir kļuvusi par jaunu koncepciju, lai atrisinātu šos jautājumus. Šī platforma tika izstrādāta, ņemot vērā pašreizējos trūkumus, un tā ir parādījusi lielu solījumu nefroloģijas jomā [6]. Turklāt OoC modeļiem ir liels potenciāls aizstāt eksperimentālos dzīvnieku modeļus, tie nodrošina risinājumu starpsugu atšķirībām un var palīdzēt izbeigt cietsirdību pret dzīvniekiem un ētiskas debates [7]. Ir maz in vitro modeļu, kas vienlaikus izmanto primāros nieru fibroblastus ar endotēlija un epitēlija šūnām, kas ir svarīgas šūnasniereFibroze. Katras šūnas lomaFibrozetiek pētīts atsevišķi; tomēr ir ierobežotas zināšanas par šūnu mijiedarbību.
Šajā pētījumā mēs izstrādājāmFibroze-atdarināšanas ierīces, kurās izmanto cilvēka primāros fibroblastus. Mēs apstiprinājām, ka TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšanai ir dažādas ietekmes uznieru fibrozeModelis. Proti, fibroblastiem ir galvenā loma kā efektoru šūnām, tie veicina pro-fibrotiskas mikrovides veidošanos un izdala augšanas faktorus un citokīnus. Tāpēc, pamatojoties uz šo jauno metodi, fibroblasti var nodrošināt ideālu šūnu modeļa sistēmu nieru slimību izpētei. Mēs novērtējām, vai fibrotiski nieru slimības radīti fibroblasti ietekmē trīs dimensijās (3D) kultivēto šūnu integritāti. Visbeidzot, mēs piedāvājam principa pierādījumu pētījumu, kas parāda cilvēka potenciālunieru fibroze-atdarināšanas ierīces kā paraugs, lai prognozētu reakciju uz cilvēku;nieru fibroze.
cistanche iedarbība: ārstē nieru infekciju
2. Rezultāti
2.1.Alfa gludās muskulatūras aktīna (a-SMA) un keratīna-8(KRT-8)identifikācija ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)HK-2 šūnās
Sākotnējā posmā mēs pārbaudījām zināmos marķierusFibrozeun citoskelets divdimensiju (2D) kultūrās. Imunofluorescējošas krāsošanas pārbaudes tika veiktas, lai novērtētu fibrozes un cauruļveida epitēlija α-SMA ekspresiju līdz mezenhimālajam pārejas (EMT) marķierim un KRT8 līmeņiem kā citoskeletona marķierim. Imunofluorescences krāsošana parādīja, ka α-SMA ekspresija sākotnēji bija vāja un KRT8 līmenis bija augsts monoslāņa HK-2 epitēlija šūnās. TGF-β1 fluorescences intensitāte būtiski nemainījās(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(5 ng/ml) vai HK-2 epitēlija šūnu specifiska inhibitoru ārstēšana 24 stundas (1. attēls).
1. attēls. Imunofluorescence liecina, ka alfa-SMA un keratīna-8(KRT8) ekspresija saglabājās, ārstējot TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai inhibitors HK-2 šūnās.Ā) priekšsēdētāja kungs, dāmas un kungi! Alfa-SMA un (B)CCK-8 ekspresija neietekmēja TGF-β1 HK-2cellus(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(5ng/ml) vai inhibitors. Šūnas sākotnēji tika uzsētas ar blīvumu 1×10° uz vienu iedobi (a-c)neārstēta kontrole un (d-f)stimulētas ar5ng/ml TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai(g-i)10 μM inhibitors(SB431542) 24 h un fiksēts ar 4% paraformaldehīdu. Pēc tam šūnas 20 minūtes tika iekrāsotas ar anti-α-SMA un anti-citokeratīnu-8. Tika veikta līdzkrāsošana ar Hoechst krāsvielu H33342, lai identificētu šūnu kodolus. Mēroga joslas mikrogrāfos norāda 200 um.
cistanche pulveris uzlabo nieru darbību
2.2. KRT8 ekspresija samazināta par TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)uz mikroshēmas
Tālāk mēs novērtējām α-SMA un KRT8 ekspresijas līmeņus 3D kultivētā HK-2 un ar TGF-β1 ārstēto GFP-cilvēka nabas vēnu endotēlija šūnu (HUVEC) kopējo garumu(Pārveidojošais augšanas faktors-β)un specifisks inhibitors. Lai to paveiktu, mēs vispirms izveidojām audu mikroshēmu modeli, kas sastāv no diviem šūnu tipiem, HK-2 epitēlija šūnām un GFP-HUVECs. Pēc konstrukcijas apstiprināšanas mēs atklājām audu mikroshēmu ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(5 ng/ml) vai specifisks inhibitors (10 um SB431542) 24 stundas.
Kā parādīts 2A-C attēlā, α-SMA izteiksmi TGF-β1 īpaši nemainīja(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai specifisko inhibitoru terapiju. Tomēr KRT8 ekspresija tika samazināta divu šūnu tipa kokultivētajā mikroshēmā. Turklāt TGF-ß1 inhibitora pievienošana palielināja KRT8 ekspresiju.
Mēs pārbaudījām 3D cauruļveida kapilāriem līdzīga tīkla veidošanos ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana HUVECs gadījumā, jo endotēlija šūnas var spontāni veidot 3D cauruļveida kapilāriem līdzīgu tīklu. Saskaņā ar mūsu kultūras apstākļiem biezu līniju veidošanās bija ievērojami samazināta. Tomēr kapilāriem līdzīgas plānas līnijas tika palielinātas TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)apstrādāti GFP-HUVECs. TGF-β1 gadījumā(Pārveidojošais augšanas faktors-β)inhibitoru ārstēšana ar 3D kultivēto mikroshēmu, biezo un biezo līniju kopējais garums parādīja pretēju tendenci uz TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)Ārstēšanas. Tika novērots biezās līnijas garuma pieaugums, salīdzinot ar neapstrādāto kontroles grupu. Līdzīgs modelis tika novērots biezas līnijas diametrā GFP-HUVEC pēc TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana un inhibitoru ārstēšana. GFP-HUVEC diametru nomāca TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana, bet palielinājās neatkarīgi no inhibitora līnijas biezuma, salīdzinot gan ar kontroli, gan TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β). TGF-β1 inhibitoru terapijas rezultātā tika ievērojami palielināts biezās līnijas kopējais garums un diametrs, salīdzinot ar neārstētu kontroli un TGF-β1 terapiju. Proti, iegūtie rezultāti liecināja par palielinātu mazo kuģu blīvumu TGF-β(Pārveidojošais augšanas faktors-β)-ārstēto grupu salīdzinājumā ar to neārstētajiem līdziniekiem. Turpretī biezo kuģu blīvums TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšanas grupa bija zemāka nekā neapstrādātajā kontroles grupā (2.D, E attēls).
2. attēls. KRT8 izteiksme HK-2 un HUVECs kopējais garums un diametrs.Ā) priekšsēdētāja kungs, dāmas un kungi! Imunofluoreescence liecina, ka α-SMA ekspresija saglabājās un KRT8 ekspresija dramatiski samazinājās, ārstējot TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)HK-2. Šūnas tika pārklātas un stimulētas ar 5ng / ml TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai 10 μm inhibitors (SB 431542) 24 stundas un fiksēts ar 4% paraformaldehīdu. Šūnas 20 minūtes tika iekrāsotas ar anti-α-SMA un anti-citokeratīnu-8. Tika veikta līdzkrāsošana ar Hoechst krāsvielu H33342, lai identificētu šūnu kodolus. α-SMA(a-c) ekspresijai nebija nekādu izmaiņu, bet KRT8(d-f) HK-2 šūnās un GFP HUVEC (g-i) ekspresijā būtiski mainījās ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(5 ng/ml) un inhibitors(B, C). HUVECs kopējā garumā plānais kuģis tika palielināts, bet biezais kuģis tika samazināts par TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β). Diametrs tika palielināts gan plānos, gan biezos traukos. Šos rezultātus apvērsa inhibitors SB431542 (D, E). Skalas joslas mikrogrāfos norāda 100 μm.*p<><><0.001 versus="" the="" control=""><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" statistical="" significance="" of="" the="" length="" compared="" to="" the="" non-treated="" cells="" is="" represented="" in="" the="" graph.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
kādam nolūkam lieto cistanche: hronisku nieru slimību ārstēšanai
2.3. TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)Ietekmē trīs mikroshēmas šūnu tipus ar vairāku nodalījumu struktūru
Izpētīt TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ierosinātās 3D mikroshēmas atbildes reakcijas, mēs veicām imūnstainingu katram nodalījumam atsevišķi (3. attēls). Šajā analīzē tika izmantoti primārie cilvēka nieru fibroblasti. Paraugi tika analizēti, izmantojot FACS, un tika apstiprināts, ka tie ir pozitīvi attiecībā uz fibroblastu marķieru antivielu. Pēc trīs šūnu tipu inkubācijas ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)24 stundas tika veikta imūnkrāsošana, lai novērtētu α-SMA un KRT8 ekspresiju. A-SMA ekspresiju regulēja ārstēšana ar TGF-1, un, lietojot TGF-β1, tika novēroti pretēji rezultāti.(Pārveidojošais augšanas faktors-β)inhibitoru ārstēšana. Un otrādi, KRT8 izteiksmi pazemināja TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)un parādīja pretēju reakciju uz TGF-β(Pārveidojošais augšanas faktors-β)inhibitors (4.A-C attēls).
3. attēls. Attēla paraugs ar ierīces shematisku izgatavošanas un eksperimentālā grafika demonstrāciju.Ā) priekšsēdētāja kungs, dāmas un kungi! Divos augšējos attēlos ir redzams izkārtojums. Kreisajā attēlā redzams vispārējs ierīces fotoattēls no augšas uz leju. Apakšējos attēlos redzams šķērsgriezums. Shematisks skats, kurā sīki aprakstīti šķidruma vadotņu izmēri. punkta B) apakšpunktā. Šajā attēlā aprakstīti eksperimentālie grafikiFibroze-atdarināšanas ierīces. Četru soļu iekraušanas process katrai iedobei. Katra hidrogēla raksta laukuma atrašanās vieta, kā arī datu nesēja izvietojums no augšas uz leju un izometriskā šķērsgriezumā. (1) Kopumā 1,5 uL hidrogēla 1 spontāni ievirza centrālajā kanālā. (2) Centrālais kanāls ir piepildīts ar5uL hidrogēla. (3) Kopumā 10uL hidrogēla 3 ir rakstīti uz rezervuāra grīdas. (4)Kopā tiek izdalīti 200 μL barotnes. Sarkanas skalas josla =9 mm.
Kā parādīts 4D-G attēlā, kapilāriem līdzīgās plānās līnijas garumu ievērojami palielināja TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana GFP-HUVECs. Tomēr TGF-β1 biezās līnijas biezums tika samazināts(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēti HUVECs. Huvecs plānajiem un biezajiem kuģiem diametrs tika samazināts vidēji. TGF-β1 gadījumā(Pārveidojošais augšanas faktors-β)inhibitoru ārstēšana ar 3D kultivēto mikroshēmu, biezo un biezo līniju kopējais garums parādīja pretēju tendenci TGF-β1 ārstēšanai. Turklāt biezās līnijas garums tika palielināts, salīdzinot ar neapstrādāto kontroles grupu.
4. attēls. 3D kultūru HK-2 un HUVEC izmaiņas ar primāriem nieru fibroblastiem.Kopējās šūnas tika pārklātas ar blīvumu 5×10° uz 3D mikroshēmu un stimulētas ar5 ng / ml TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai 10 μm inhibitors (SB 431542) 24 stundas un fiksēts ar 4% paraformaldehīdu. (A) Šūnas 3D mikroshēmā tika iekrāsotas ar anti-oα-SMA un anti-citokeratīnu-8. palielinājās α-SMA (a-c) ekspresija, un KRT8(d-f) ekspresija ievērojami samazinājās par TGF-β1(5 ng/ml). HUVECs kopējais garums; plānie kuģi tika dramatiski palielināti, un biezie kuģi tika samazināti par TGF-ß1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(D, E). Diametrs tika samazināts plāniem un bieziem kuģiem(F, G). Šos rezultātus apvērsa inhibitors SB431542. Skalas joslas mikrogrāfos norāda 100 μm.*p<><0.01，and **=""><0.001 versus="" the="" control=""><><><0.001 versus="" the="" tgf-β1="" group.="" each="" value="" represents="" three="" technical="" replicates="" of="" each="" of="" the="" three="" biological="" replicates.="" thin="" vessels="" mean="" a="" length="" shorter="" than="" 50="" um="" and="" thick="" vessels="" represent="" a="" length="" longer="" than="" 50="">
2.4.TGF-81 Modulē iekaisuma mediatoru un augšanas faktorus
Tālāk mēs pētījām iekaisuma citokīnus un augšanas faktorus centrifugātā; IL-1β, FGF-2, TGF-β2(Pārveidojošais augšanas faktors-β), un TGF-β3(Pārveidojošais augšanas faktors-β)olbaltumvielu sekrēcija bija ievērojami lielāka 3D kultivētās mikroshēmās nekā 2D fibroblasts, kas tika kultivēts labi, lai gan tiem bija vienāds kopējais šūnu skaits. Tomēr TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)līmeņi bija līdzīgi, jo 2D vai 3D kultivētie modeļi tika apstrādāti ar līdzīgām TGF-β1 koncentrācijām(Pārveidojošais augšanas faktors-β)(5.A-E attēls). Jo īpaši FGF-2 izdalīšanās no cilvēka primārajiem nieru fibroblastiem bija 20,9 ± 0,4 pg/dienā/5× 10° 2D monoslāņu kultūras šūnas un 3094,8± 0,2 pg/dienā/5× 10° šūnas, ieskaitot 3D kultivētās mikroshēmas HUVECs un HK-2 neapstrādātajā kontrolē. FGF-2 sekrēcija ar TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)stimulācija bija 31,0±0,2pg/dienā/5×10°šūnas 2D kultūrai un 3683,9± 0,8 pg/dienā/5×10° šūnas 3D kultivētajai mikroshēmai. Šis FGF-2 proteīna ražošanas pieaugums 2D monoslāņu kultūrā tika paralēls ar 3D kultivētās mikroshēmas modeļa pieaugumu par TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana (5.B attēls).
5. attēls. 2D un 3D kultivēto modeļu salīdzinājums kā nieru fibrozes imitācijas platformas.Šūnas tika pārklātas ar blīvumu 5×10° uz 2D iedobi vai 3D mikroshēmu un stimulētas ar5ng/ ml TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai 10 um inhibitors (SB 431542) 24 stundas. Primārie cilvēka nieru fibroblasti tika izmantoti 2D kultūrā un 3D kultūras modelī. Fibroblasti tika izmantoti ar blīvumu 8× 10*, kas kultivēti ar HUVECs un HK-2. Primārā cilvēka nieru fibroblastu un HUVEC attiecība jeb F: H attiecība bija 1:5, lai novērtētuFibroze. HK-2 šūnas tika izmantotas ar blīvumu 2×104. (A)IL-1β,(B)pamata fibroblastu augšanas faktora (FGF-2) un(C-E)TGF-beta 1, 2 un 3 noteikšana centrifugātā tika veikta, veicot citokīnu un multipleksa lodīšu imūnanalīzes multipleksu analīzi. Katra josla apzīmē vidējo± SE.*p<0.05,***><0.001 versus=""><0.01,##><0.001 versus="">(Pārveidojošais augšanas faktors-β).
cistanche tubolosa ieguvumi: nieru slimību ārstēšana
Turklāt mēs novērtējām iekaisuma citokīnu, piemēram, IL-1β, IL-6, IL-8 un TNF-α, mRNS ekspresiju. Rezultātus ievērojami samazināja rekombinants cilvēka TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)ārstēšana 3D kultivētā mikroshēmā kā TGF-β pretiekaisuma īpašība(Pārveidojošais augšanas faktors-β). Mēs konstatējām, ka mRNS ekspresiju regulēja TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)inhibitors (SB431542). Turklāt IL-6, IL-8 un TNF-α ekspresija, kuras mediācija bija inhibitoru mediēta, bija īpaši pazemināta, salīdzinot ar neapstrādāto kontroli (6.A-D attēls). FIBROZES FAKTORA VEGF mRNS līmeni ievērojami palielināja TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)Ārstēšanas. VEGF mRNS līmeni samazināja TGF-β1 inhibitors (6.E attēls), bet IL-10 mRNS ekspresija ar anti-fibrotisku iedarbību samazinājās fibrotiskos apstākļos, ko izraisīja TGF-β1. Turpretī I-10mRNS ekspresiju palielināja ārstēšana ar TGF-β1inhibitoru (6.F attēls).
6. attēls. Reāllaika PCR parāda 3D mikroshēmas vispārējo mRNS izteiksmi.Šūnas tika pārklātas ar blīvumu 5×10° uz 3D mikroshēmu un stimulētas ar5ng / ml TGF-β1(Pārveidojošais augšanas faktors-β)vai 10 um inhibitors(SB431542)24h. Kopējā RNS, kas iegūta no 3D kultivētās mikroshēmas. (A)IL-1 mRNS ekspresija β,(B)TNF-α,(C)IL-6 un (D)IL-8 atspoguļo TGF-β1 pretiekaisuma iedarbību(Pārveidojošais augšanas faktors-β)Ārstēšanas. E) priekšsēdētāja kungs, dāmas un kungi! Palielinājās VEGF ekspresija kā angiogēns faktors. Punkta F) apakšpunktā. IL-10 ekspresiju kā anti-fibrotisku faktoru ievērojami samazināja TGF-β1.*p<><><0.001 versus=""><><><0.001 versus="">(Pārveidojošais augšanas faktors-β).