Konservētais ar cisteīnu bagātais sekrēcijas proteīns MaCFEM85 mijiedarbojas ar MsWAK16, lai aktivizētu augu aizsardzību

Abstract: Metarhizium anisopliaeir entomopatogēna sēne, kas var uzlabot augu augšanu un rezistenci, darbojoties kā endofīts saimniekaugos. Tomēr maz ir zināms par olbaltumvielu mijiedarbību vai to aktivizēšanas mehānismiem. Sēnīšu ekstracelulārās membrānas (CFEM) proteīni ir identificēti kā augu imūnregulatori, kas nomāc vai aktivizē augu rezistences reakcijas. Šeit mēs identificējām CFEM domēnu saturošu proteīnu MaCFEM85, kas galvenokārt tika lokalizēts plazmas membrānā. Rauga divu hibrīdu (Y2H), glutationa-S-transferāzes (GST) nolaižamās un bimolekulārās fluorescences komplementācijas testi parādīja, ka MaCFEM85 mijiedarbojas ar ārpusšūnu domēnu.Medicago sativa(lucernas) membrānas proteīns, MsWAK16. Gēnu ekspresijas analīzes parādīja, ka MaCFEM85 un MsWAK16 tika ievērojami pārregulētiM. anisopliaeunM. sativa, attiecīgi, no 12 līdz 60 stundām pēc kopinokulācijas. Papildu rauga divu hibrīdu testi un aminoskābju vietai specifiska mutācija liecināja, ka MaCFEM85 mijiedarbībai ar MsWAK16 bija nepieciešams CFEM domēns un 52. cisteīns. Aizsardzības funkciju testi parādīja, ka JA tika regulēts, bet Botrytis cinerea bojājuma lielums un Myzus persicae reprodukcija tika nomākta ar pārejošu MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresiju saimniekauga Nicotiana benthamiana modelī. Kopumā šie rezultāti sniedz jaunu ieskatu molekulārajos mehānismos, kas ir pamatā M. anisopliae mijiedarbībai ar saimniekaugiem.

cistanche papildinājuma priekšrocības - paaugstina imunitāti

Atslēgvārdi: ar sienu saistītā kināze; CFEM; Metahizium anisopliae; augu imunitāte; Medicago sativa

1. Ievads

Mijiedarbība starp augiem un mikrobiem ir plaši izplatīta un ir pagātnes un notiekošās kopevolūcijas rezultāts. Šīm mijiedarbībām var būt labvēlīgi, neitrāli vai nelabvēlīgi rezultāti katram dalībniekam [1–3]. Labvēlīga rizosfēras mikrobiota var veicināt augu augšanu un uzlabot vispārējo veselību, aizsargājot pret augsnes izraisītām slimībām vai uzlabojot barības vielu uzņemšanu [4,5]. Plašs labvēlīgo mikrobu klāsts var uzlabot augu spējas, piemēram, barības vielu uzņemšanu, augšanu un patogēnu un kukaiņu aizsardzību [6, 7]. Metarhizium Sorok¯ın ir svarīga entomopatogēno sēņu ģints ar spēju kolonizēt augus [8], taču ir arī pierādījumi, kas liecina, ka ģints pārstāvji var uzlabot augu patogēnu rezistenci. Piemēram, laboratorijas pētījums atklāja 60% Fusarium solani (Mart.) Sacc. Metarhizium robertsii (agrāk pazīstama kā M. anisopliae) klātbūtnē, salīdzinot ar kontrolēm bez M. robertsii [9]. Dažiem Metarhizium celmiem ir potenciāls uzlabot augu izturību pret kukaiņu kaitēkļiem un slimībām, mainot augu aizsardzības gēnu ekspresiju. Endofītiskā kolonizācija ar M. Robertsu aktivizē gan jasmonskābes (JA), gan salicilskābes (SA) aizsardzības ceļu ekspresiju kukurūzas lapās; turklāt šāda kolonizācija ir saistīta ar augu augšanas veicināšanu un Agrotis epsilon (Hufnagel) kāpuru attīstības nomākšanu [10]. Metarhizium guizhouense aktivizēja -1,3-glikanāzi un hitināzi Lansium parasiticum augļu mizā, kā rezultātā tika kavēta Botrytis sp. un Fusarium sp. uz Aglaia dookkoo Griff augļiem [11]. Turklāt, kad M. anisopliae tika uzklāts uz zemesriekstu stādiem, tika aktivizēti dažādi transkripcijas faktori, tostarp WRKY, MYC, TGA un uz etilēnu reaģējoši transkripcijas faktori, savukārt nitrātu transportētāji un proteīni, kas saistās ar dehidratāciju reaģējošiem elementiem, tika atšķirīgi izteikti [12]. . Tas liecina, ka M. anisopliae regulē augu aizsardzības gēnus, kad tas kolonizē augu. Tomēr salīdzinoši maz ir zināms par mehānismiem, kas ir pamatā augu aizsardzības reakcijai pēc inficēšanās ar Metarhizium. Efektori ir izplatīts līdzeklis, ar kuru mikroorganismi regulē augu rezistenci [13]. Augu rezistences aktivizēšanu parasti raksturo oksidatīvs uzliesmojums un hormonu, metabolītu un citu signālu indukcija [13]. Augu hormoniem SA un JA ir svarīga loma augu rezistences izraisīšanā, nodrošinot divus atsevišķus aizsardzības signalizācijas ceļus [14]. SA signalizācijas ceļš galvenokārt darbojas augu alerģiskajā reakcijā un sistēmiskā iegūtā rezistencē pret patogēniem, taču tas var būt iesaistīts arī netiešās augu aizsardzības reakcijās, ko izraisa dzeloņu kukaiņu barošana [15]. SA uzkrāšanās ir saistīta ar paaugstinātu gēnu ekspresiju, kas kodē lipīdu pārneses proteīnus (LTP) un fenilalanīna amonjaka liāzi (PAL) [16], kas ir starpnieks pakārtoto specializēto metabolītu, piemēram, flavonoīdu un lignīna, sintēzē un uzkrāšanā [17]. JA signalizācijas ceļš darbojas tiešā un netiešā reakcijā uz mehāniskiem bojājumiem, sēnīšu patogēniem un kukaiņu kaitēkļiem. Pētījumi liecina, ka JA signalizācijai ir regulējoša ietekme uz specializētu metabolītu, piemēram, terpenoīdu, fenilpropanoīdu un alkaloīdu, sintēzi, kam ir plašs bioloģisko funkciju klāsts [18]. Ir pierādīts, ka daži specializēti metabolīti uzkrājas augu šūnās pēc apstrādes ar metilJA (MeJA), tostarp paklitakselu Taxus sugās [19,20], terpenoīdus Centella Asiatica (L.) Urban [21] un saponīnus žeņšeņā [22]. . SA un hitozāna (CHT) kā ierosinātāju lietošana izraisīja lignīna uzkrāšanos un aizsardzības enzīmu reakcijas tomātos, kas samazināja Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi infekcijas sastopamību [23]. Turklāt JA un SA līmenis kviešos tika ievērojami uzkrāts, pielietojot elicatoru PeaT, uzlabojot aizsardzības reakciju pret auzu laputu Sitobion avenae (Fabricius) [24]. Tas norāda, ka augu imunitāti var regulēt šie efektori, izmantojot augu hormonus un metabolītus.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Sēnīšu ekstracelulārās membrānas (CFEM) olbaltumvielas ir sastopamas daudzās sēnēs. Tie kodē domēnus, kas parasti ir 60 aminoskābes (aa) gari un satur astoņus raksturīgus cisteīnus [25]. CFEM domēni ir līdzīgi epidermas augšanas faktoram (EGF) līdzīgiem domēniem, kas darbojas kā ekstracelulāri receptori, signālu pārveidotāji vai adhēzijas molekulas saimnieka un patogēna mijiedarbībā [26]. Olbaltumvielas, kas satur CFEM domēnus, var manipulēt ar augu rezistences reakciju, darbojoties kā efektori. Kviešu lapu rūsas sēnē Puccinia triticina Erikas CFEM efektora kandidāts PTTG_08198 paātrināja šūnu nāves gaitu un veicināja reaktīvo skābekļa sugu (ROS) uzkrāšanos [27]. Antracnozes sēne Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils satur piecus efektorus (CgCFEM6, 7, 8, 9 un 15), kas, kā pierādīts, nomāc BAX izraisītu programmētu šūnu nāvi Nicotiana benthamiana Domin [28]. Tika ziņots, ka fitosimbotiskā mikorizas sēne Laccaria bicolor (Maire) PDOrton simbiotiskos audos izdala vairākus CFEM proteīnus, piemēram, Lac310796, Lac296573 un Lac296572 [29]. Lai gan šo proteīnu sarežģītās funkcijas mikorizas simbiozē nav pētītas, iepriekšējie rezultāti liecina, ka CFEM proteīni var darboties signalizācijā starp sēnītēm un augiem. M. anisopliae saimniekaugā var darboties kā entomopatogēna vai endofītiska sēne [30]. Tomēr vēl nav ziņots par CFEM proteīnu lomu. Iepriekš mēs identificējām CFEM domēnu saturošu proteīnu M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Šeit mēs ziņojam par saistību starp MaCFEM85 un Medicago sativa sienu saistīto kināzi MsWAK16. Mēs analizējām MaCFEM85 secību un veicām eksperimentus, lai noteiktu, kuri atlikumi ir kritiski mijiedarbībā ar MsWAK16. Visbeidzot, izmantojot N. benthamiana kā mūsu modeļa augu, mēs novērtējām augu aizsardzības reakcijas pret Botrytis cinerea un laputu Myzus persicae ar un bez pārejošas MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresijas.

Citanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

2. Rezultāti

2.1. MaCFEM85 bija visciešāk saistīts ar nepatogēniem sēnīšu CFEM un lokalizēts plazmas membrānā

Tika izveidots filoģenētisks koks, lai analizētu attiecības starp MaCFEM85 un citiem CFEM proteīniem no patogēnām un nepatogēnām modeļa sēnēm. Tie ietvēra Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl), Neurospora crassa Shear & BODodge un Beauveria bassiana (Bals.) (sk. 4. sadaļu). MaCFEM85 bija visciešāk radniecīgs B. bassiana CFEM proteīniem un tāpēc evolūcijas ziņā tuvāks nepatogēnām, nevis patogēnām sēnēm (1.a attēls).

1.a attēls

2.2. MaCFEM85 tika pārregulēts mijiedarbības laikā ar M. sativa

Ar sienu saistītās receptoriem līdzīgās kināzes (WAK) ir apakšgrupa receptoriem līdzīgo proteīnkināžu (RLK) virsģimenē un ietver ārpusšūnu domēnu, transmembrānu spirāli un intracelulāro kināzes domēnu. Viņiem ir svarīga loma augu augšanas, attīstības, stresa reakcijas un patogēnu rezistences signālu ceļu regulēšanā [32]. RNS tika iegūta no M. anisopliae hyphae un M. sativa saknēm pēc kopinkubācijas, lai izpētītu MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresijas modeļus. Gan MaCFEM85, gan MsWAK16 tika izteikti ievērojami augstākos līmeņos līdzinkubācijas laikā no 12 līdz 6 0 h (1.c, d attēls). No 0 līdz 36 stundām MaCFEM85 ekspresija pakāpeniski palielinājās, sasniedzot maksimumu 36 stundās. Tas bija × 593 reizes izteiktāks M. anisopliae un M. sativa kombinācijā, salīdzinot ar M. anisopliae, kas audzēts atsevišķi. Lai gan MaCFEM85 ekspresija bija nedaudz samazināta 48–60 stundu periodā, tā joprojām bija izteikta ievērojami augstākā līmenī nekā M. anisopliae, kas audzēta atsevišķi. MsWAK16 tika arī ievērojami paaugstināts, un ekspresija sasniedza maksimumu 36 stundās. M. sativa, kas inficēts ar M. anisopliae, MsWAK16 bija × 89,06 reizes izteiktāks nekā M. sativa bez M. anisopliae. No 36 līdz 60 stundām MsWAK16 līmenis nedaudz samazinājās, bet tā ekspresija joprojām bija ievērojami augstāka nekā neinokulētiem augiem.

2.3. MaCFEM85 mijiedarbojas ar MsWAK16 in vitro un in vivo

Lai izpētītu MaCFEM85 iespējamo funkcionālo mehānismu, reaģējot uz M. anisopliae ārstēšanu, tika veikts rauga divu hibrīdu (Y2H) skrīnings, lai provizoriski identificētu saimniekproteīnus, kas mijiedarbojas ar MaCFEM85. Mijiedarbība starp MsWAK16 (MsWAK16-ED) un MaCFEM85 ekstracelulāro domēnu tika pārbaudīta ar vienu pret vienu rauga divu hibrīdu testu, izmantojot MaCFEM85 pGBKT7 kā BD vektoru un MsWAK16 pGADT7 kā AD vektoru. Viss transformētais raugs labi auga barotnē ar SD-T/L deficītu, un pozitīvās kontroles grupa un eksperimentālā grupa veiksmīgi auga uz barotnes ar SD-T/L/H/A + X{17}}gal deficītu. Tas norādīja, ka MaCFEM85 var mijiedarboties ar MsWAK{19}}ED (2.a attēls).

2. attēls. MaCFEM85 un MsWAK16 mijiedarbības validācija.

In vitro validācijai pGEX6-P2 tika ievietots ar glutationa-S-transferāzes (GST) marķēts MsWAK16-ED (kodē 60 kDa produktu) un ar polihistidīnu (His) marķēts MaCFEM85 ( kas kodē 17 kDa produktu), tika ievietots pET{10}}b. Imunoblotēšana ar His un GST antivielām parādīja, ka rekombinantais proteīns MaCFEM{11}}His mijiedarbojās ar GST-MsWAK16-ED upuri, bet ne tikai ar GST un ka GST-MsWAK16- ED mijiedarbojas ar His. -MaCFEM85 (2.b attēls). Lai vēl vairāk apstiprinātu mijiedarbību starp MaCFEM85 un MsWAK16, mēs veicām bimolekulārās fluorescences komplementācijas (BiFC) testu ar MaCFEM85-YFPN un MsWAK16-YFPC konstrukcijām. MaCFEM85-YFPN un MsWAK16-YFPC koekspresija tabakas lapās radīja dzeltenu fluorescences signālu, kas norāda, ka MaCFEM85 mijiedarbojās ar MsWAK16 (2.c attēls).

2.4. Galvenās vietnes MaCFEM85 un MsWAK16 mijiedarbībai

Lai noteiktu MaCFEM85 reģionu, kas nepieciešams mijiedarbībai ar MsWAK16-ED, ar tiešsaistes programmatūru SMART tika prognozēti proteīnu domēni (3.a attēls). MaCFEM85 saturēja CFEM domēnu 19-86 aa reģionā. Tika prognozēta arī terciārā struktūra (3.b attēls). Astoņi cisteīni šajā domēnā radīja četras disulfīda saites (CYS26 un CYS69, CYS30 un CYS64, CYS43 un CYS50 un CYS52 un CYS85), saglabājot proteīna stabilitāti (3.b attēls). Lai apstiprinātu iespējamo mijiedarbības vietu(-es) MaCFEM85, tika izveidotas septiņas mutācijas proteīna versijas un ievietotas pGBKT7 kā ēsmas proteīni. Katrs rekombinantais vektors tika kotransfektēts ar AD-MsWAK16-ED Y2H Gold celmā. Celms ar mutāciju CYS52 neauga uz selektīvas barotnes (3.c attēls, iezīmēts sarkanā krāsā), norādot, ka CYS52 ir nepieciešams MaCFEM85 mijiedarbībai ar MsWAK{25}}ED.

2.5. MaCFEM85 mijiedarbība ar MsWAK16 aktivizē augu imūnreakciju

2.5.1. MaCFEM85 un MsWAK16 lomas novērtējums slimību rezistencē pret B. cinerea

Lai izpētītu iespējamo MaCFEM85 un MsWAK16 iesaistīšanos patogēnu aizsardzības reakcijās, mēs pārbaudījām, vai MaCFEM85, MsWAK16 vai MaCFEM85 un MsWAK16 pārmērīga ekspresija varētu palielināt rezistenci pret B. cinerea. Mēs īslaicīgi izteicām šos vektorus N. benthamiana lapās. Western blot tests parādīja, ka MaCFEM85 un MsWAK16 tika izteikti salīdzināmos līmeņos, kad tie tika izteikti atsevišķi vai kopā, kas parāda, ka MaCFEM85 un MsWAK16 tika veiksmīgi ekspresēti tabakā (4.a attēls). Slimību testi tika veikti arī, izmantojot N. benthamiana, kas infiltrēts ar MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 vai GFP kontroli. Bojājumi bija ievērojami mazāki (par ~ 30% 2 dienās pēc inokulācijas) lapām, kas bija infiltrētas ar MaCFEM85, MsWAK16 vai MaCFEM85+MsWAK16, salīdzinot ar kontroles augiem (4.b attēls). Šie dati parāda, ka pārejoša MaCFEM85 ekspresija N. benthamiana radīja paaugstinātu rezistenci pret B. cinerea un ka MaCFEM85 un MsWAK16 pozitīvi regulēja aizsardzības reakciju pret B. cinerea.

3. attēls. MaCFEM5 un MsWAK16 mijiedarbības vietas identifikācija.

4. attēls. Augu rezistences indukcija ar MaCFEM85 un MsWAK16 pārejošu ekspresiju.

2.5.2. MaCFEM85 un MsWAK16 lomas novērtējums laputu aizsardzībā N. benthamiana

Lai turpinātu pētīt MaCFEM85 un MsWAK16 lomu, N. benthamiana augi, kas īslaicīgi ekspresē MaCFEM85 un MsWAK16, tika inficēti ar M. persicae, un tika novērtētas populācijas. Šim eksperimentam liela katras N. benthamiana lapas platība tika agroinfiltrēta ar rekombinanto bināro vektoru pYBA1132, kas satur MaCFEM85 un MsWAK16. GFP tika izmantots kā kontrole. 12 stundas pēc infiltrācijas uz katras lapas tika ievietoti 20 M. persicae pieaugušie, pakļaujot infiltrēto zonu laputīm. Nākamajās trīs dienās tika reģistrēta pieaugušo laputu mirstība un nimfu skaits; nimfas pēc tam tika izņemtas. Mirstības riska ziņā nebija būtiskas atšķirības starp M. persicae populācijām, kas barojas ar augiem, kas ekspresē MaCFEM85, MsWAK16 vai MaCFEM{11}}MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081). ) (4.c attēls). Tomēr pēc 24, 48 un 72 stundām vidējais katra pieaugušā laputu radīto pēcnācēju skaits bija ievērojami lielāks uz N. benthamiana, kas izsaka GFP kontroli, salīdzinot ar tiem, kas ekspresē MaCFEM85, MsWAK16 vai MaCFEM{24}}MsWAK16 (attēls). 4d).

2.5.3. MaCFEM85 un MsWAK16 lomas novērtēšana hormonu uzkrāšanā un ar hormoniem saistīto gēnu ekspresijā

Lai analizētu atšķirības starp N. benthamiana augu aizsardzības reakcijām, kas ekspresē eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 un MaCFEM85+MsWAK16, mēs izmērījām JA, SA un kopējo flavonoīdu līmeni un saistīto gēnu ekspresiju. Rezultāti parādīja, ka JA un SA līmenis atšķiras augos, kas ekspresē eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 un MaCFEM{6}}MsWAK16 (5.a attēls). Salīdzinot ar tiem, kas ekspresē eGFP, JA līmenis bija ievērojami zemāks augos, kas ekspresē MaCFEM85; SA līmenis bija nedaudz paaugstināts, taču atšķirības nebija nozīmīgas. Turpretim augiem, kas ekspresē MsWAK16, nebija būtiskas atšķirības JA līmeņos, salīdzinot ar eGFP kontroli, turpretim SA līmenis bija ievērojami zemāks nekā kontrolē (5.a attēls). JA un SA līmenis augos, kas ekspresē MaCFEM85+MsWAK16, bija ievērojami paaugstināts un pazemināts, salīdzinot ar eGFP.

5. attēls. Hormonu līmenis un hormonu atbildes gēnu ekspresija

Kopējais flavonoīdu saturs bija ievērojami augstāks augos, kas ekspresē MaCFEM{0}}MsWAK16, salīdzinot ar visām pārējām apstrādes grupām (5.a attēls). Biosintētisko gēnu ekspresijas līmeņi bija līdzīgi augiem, kas ekspresē MsWAK16 un MaCFEM85+MsWAK16. Piemēram, gēni, kas saistīti ar JA reakciju, proti, COI1, MYC2 un PDF1.2, tika ievērojami paaugstināti, salīdzinot ar augiem, kas ekspresē GFP (5.b attēls). Līdzīgi, ar SA saistītie gēni NPR1, WRKY70 un PR1 bija ievērojami atšķirīgi ekspresēti augos, kas ekspresē MsWAK16 un MaCFEM{16}}MsWAK16; NPR1 tika regulēts augstāk, savukārt WRKY70 un PR1 tika pazemināti, salīdzinot ar kontroli (5.b attēls). Mēs arī pārbaudījām galveno gēnu ekspresiju šikimīnskābes un fenilpropanoīdu sintēzes ceļos, kas abi ir saistīti ar flavonoīdu sintēzi. Kopumā tikai MaCFEM85 ekspresija neizraisīja ievērojami augstāku šo gēnu ekspresiju tabakā. Tomēr šie gēni tika paaugstināti regulēti tabakā, kas ekspresē MsWAK16 vai MsWAK16+MaCFEM85, salīdzinot ar GFP kontroli (5.c attēls).

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

3. Diskusija

3.1. Konservētais CFEM proteīna motīvs pilda vairākas funkcijas sēnīšu sugās

CFEM domēns ir unikāls sēnēm un parasti sastopams sēnīšu ekstracelulāro membrānu proteīnos. Domēna izcelsme ir jaunākajā Ascomycota un Basidiomycota priekštecī [33]. Jaunākie pētījumi liecina, ka CFEM proteīni sēnīšu patogēnos var darboties kā augu imūnregulatori, izraisot saimniekauga imūnsistēmas nomākšanu vai aktivāciju atkarībā no infekcijas veida [28,34,35]. Ir bijuši daži ziņojumi par CFEM domēnu saturošiem proteīniem M. anisopliae, tikai saistībā ar evolucionāru salīdzinājumu ar citām sēnēm [36]. Šajā pētījumā mēs salīdzinājām M. anisopliae CFEM proteīnus ar citiem zināmiem CFEM proteīniem gan patogēnās, gan nepatogēnās sēnēs. Mēs apstiprinājām, ka tuvākais MaCFEM85 homologs ir Cfem5, kas atrodams Beauveria bassiana, kas ir viens no 12 CFEM proteīniem šajā sugā (papildu attēls S1). BbCfem5 ir būtiska dzelzs iegūšanai [37]. Turklāt, pamatojoties uz prognozēto terciāro struktūru, CFEM domēns MaCFEM85 ir ļoti līdzīgs virsmas antigēna proteīnam 2 (CSA2), kas atrodams Candida albicans (CPRobin) Berkhout, kurā 65 atlikumi (96% no secības) ir modelēti ar 99,8. % ticamības [31]. Candida albicans ir dzīvnieku patogēns; CSA2 ir svarīga loma augšanā un patogenitātē, ekstrahējot hēmu no hemoglobīna un transportējot hēmu no šūnas sienas uz plazmu [38–40]. Mēs izvirzām hipotēzi, ka MaCFEM85 var būt iesaistīts kukaiņu saimnieku M. anisopliae virulences veidošanā. Šīs apvienotās MaCFEM85 funkcijas dzīvnieku patogēnās infekcijas gadījumā un augu imunitātes aktivizēšana padara proteīnu par aizraujošu nākotnes pētījumu fokusu.

3.2. Disulfīda saites ir svarīgas struktūras proteīna funkcijai

Proteīna struktūras konformācijas integritāte ir tieši saistīta ar tās spēju funkcionēt. Disulfīda saites, ko veido cisteīna pāri, veicina olbaltumvielu locīšanu un konformācijas stabilitāti, un tiek uzskatītas par galvenajām vietām specifisku receptoru vai ligandu atpazīšanai un saistīšanai [41]. Piemēram, izjaucot kādu no trim konservētajām disulfīda saitēm augu patogēnā Cladosporium fulvum efektora proteīnā AVR4, tiek panākta proteāzes jutība un samazināta hitīna saistīšanās spēja [42]. Trijos citos C. fulvum proteīnos (ECP1, ECP2 un ECP5) atsevišķa alanīnu aizstāšana ar cisteīniem mazina tomātu hipersensitivitātes reakciju, norādot, ka cisteīni ir ļoti svarīgi stabilitātes un paaugstinātas jutības reakciju izraisošās aktivitātes saglabāšanai [43]. Turklāt Magnaporthe oryzae nobriedušajā proteīnā MC69 divu konservētu cisteīna atlieku (Cys36 un Cys46) mutaģenēze var pasliktināt MC69 darbību, neietekmējot sekrēciju, kas liecina par disulfīda saites nozīmi MC69 patogenitātē [44]. Šķiet, ka CFEM domēns pēc izmēra un cisteīna atlieku modeļa ir līdzīgs EGF līdzīgiem domēniem, kas satur trīs vai četrus disulfīda saišu pārus. EGF proteīni var darboties kā šūnu virsmas receptori, signālu pārveidotāji vai adhēzijas molekulas saimnieka un patogēna mijiedarbībā [45]. Šajā pētījumā mēs ne tikai atklājām, ka MaCFEM85 CFEM domēns satur astoņus konservētus cisteīnus, kas veidoja četrus disulfīda saišu pārus (3.b attēls), bet arī apstiprinājām, ka CFEM bija kritiskais domēns mijiedarbībai starp MaCFEM85 un MsWAK16. Turklāt, veicot cisteīna atlieku mutāciju uz alanīnu, mēs atklājām, ka cisteīna atlikums 52. pozīcijā bija galvenā vieta, kas nepieciešama mijiedarbībai (3.c attēls). Šie rezultāti ir pamats turpmākiem pētījumiem par CFEM85 – WAK16 mijiedarbības fizioloģiskām funkcijām.

3.3. MaCFEM85 mijiedarbība ar MsWAK16 aktivizētajām augu aizsardzības ierīcēm

Mikrobu un augu mijiedarbībā augu aizsardzības reakcijas parasti aktivizē mikrobu efektorolbaltumvielas. Inducētā aizsardzība kļūst par svarīgu līdzekli bioloģiskajā kaitēkļu apkarošanā, lai veicinātu rezistenci. CFEM proteīni ir identificēti kā efektori, kas iesaistīti augu imūnās aktivācijas vai inhibīcijas regulēšanā [28, 46]. Tomēr ir maz publicētu pētījumu, kas saista šo imūno faktoru regulēšanu ar to īpašo lomu augu slimībās un kukaiņu rezistencē. Šajā pētījumā mēs izmantojām entomopatogēnu un endofītisku sēnīti M. anisopliae, lai identificētu mijiedarbību starp MaCFEM85 un ar šūnu sieniņu saistītu kināzi MsWAK16 M. sativa. Rezultāti parādīja, ka šī mijiedarbība samazināja bojājumu attiecību pēc inokulācijas ar B. cinerea (4.b attēls) un samazināja M. persicae populācijas augšanas ātrumu (4.d attēls), norādot, ka mijiedarbība starp MaCFEM85 un MsWAK16 palielināja M. sativa izturību pret laputīm. JA, SA un etilēna (ET) līmeņa izmaiņas var izmantot kā marķierus, lai novērtētu augu rezistences indukciju [47,48]. Šeit mēs parādījām, ka MaCFEM85 mijiedarbojas ar MsWAK16, lai ar hormonālo regulējumu ietekmētu augu rezistenci un kavētu M. persicae reproduktīvo ātrumu (4.d attēls). Par līdzīgiem pētījumiem ziņots iepriekš. Piemēram, tika pierādīts, ka Brevibacillus laterosporus efektora proteīns PeBL1 izraisa JA un SA uzkrāšanos tomātos un samazina otrās un trešās paaudzes M. persicae populāciju augšanas ātrumu, kas barojās ar šiem augiem. Turklāt ar efektoriem apsmidzinātiem tomātu augiem ir atbaidoša iedarbība uz M. persicae [49]. Elicitorproteīna PeBC1 lietošana parastajām pupiņām (Phaseolus vulgaris L.) izraisa izteiktu un nozīmīgu subletālu ietekmi uz zaļo persiku laputīm. Ar PeBC1 apstrādātajiem augiem ir ievērojama ar JA un SA saistīto gēnu regulēšana [50]. Beauveria bassiana izsaucējs PeBb1 samazina M. persicae auglību uz tabakas un inducē JA un ET saistīto gēnu ekspresiju [51]. Šajā pētījumā pārejoša MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresija tabakā ievērojami pārregulēja ar JA reakciju saistītos gēnus COI1, MYC2 un PDF1.2 (5.b attēls) un palielināja JA un kopējo flavonoīdu saturu (5.a attēls), kas bija salīdzināms ar rezultātiem. literatūrā, kā aprakstīts iepriekš. Tomēr mēs nekonstatējām augstu SA līmeni tabakā 12 stundas pēc infiltrācijas, un augi, kas īslaicīgi ekspresēja MsWAK16 vai MaCFEM{35}}MsWAK16, uzrādīja ievērojami samazinātu SA līmeni un SA atbildē iesaistīto gēnu pazemināšanos (5.a, b attēls). . Tas parādīja, ka dažādu augu hormonu stimulēšana var izraisīt ne tikai sinerģiskas aktivitātes, bet arī šķērsrunas un atgriezenisko saiti, ļaujot augiem atbilstoši reaģēt uz dažādiem stimuliem. Augos iepriekš ziņots par paaugstinātu JA līmeni, bet zemu SA līmeni. Piemēram, A. thaliana, kam nebija SA uzkrāšanās, JA līmenis bija 25-reizes augstāks nekā savvaļas tipa A. thaliana, un tika aktivizēti uz JA reaģējoši gēni [52]. Ir arī ziņots, ka dažas baktērijas var palielināt JA līmeni augos, lai kavētu SA uzkrāšanos, izvairoties no SA nodarītā kaitējuma. Piemēram, Pseudomonas syringae ir vērsta uz COI1 receptoru caur toksīnu, koronatīnu, kas negatīvi regulē JA ceļu [53]. Tas veicina MYC2-inducētu transkripcijas faktoru ANAC019, ANAC055 un ANAC072 [54] regulēšanu, kavējot ICS1 (galvenais SA sintēzes gēns) transkripciju un tādējādi samazinot SA ražošanu un signālu pārraidi. Šajā pētījumā mijiedarbība starp MaCFEM85 un MsWAK16 izraisīja palielinātu JA uzkrāšanos un JA reaģējošo gēnu regulēšanu, bet SA uzkrāšanās un ar SA saistīto gēnu transkripcijas kavēšanu. Tas norādīja, ka mijiedarbība starp MaCFEM85 un MsWAK16 izraisīja JA, tādējādi uzlabojot augu izturību pret laputīm.

N. benthamiana, kas īslaicīgi ekspresē MaCFEM85 un MsWAK16, tika paaugstināts JA līmenis un samazināts B. cinerea bojājumu lielums (4.b attēls), kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem. JA ir iesaistīts augu rezistencē pret kukaiņiem un nekrotrofiskiem patogēniem [52,55]. B. cinerea kā nekrotrofisku patogēnu inhibēja JA un ET uzkrāšanās [56]. A. thaliana ET deficīta mutanta ein2-1 un JA-atbildes mutanta coi1-1 pakārtotā aizsardzības gēna PDF1.2 līmenis bija ievērojami samazināts un jutība pret B. cinerea tika palielināta [ 57]. Šeit mēs atklājām, ka JA uzkrāšanās un JA saistīto gēnu transkripcija tika ievērojami palielināta N. benthamiana, kas īslaicīgi ekspresē MaCFEM85 un MsWAK16, savukārt SA uzkrāšanās un ar SA saistīto gēnu transkripcija tika kavēta. MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresija arī uzrādīja inhibējošu iedarbību uz B. cinerea. Tas norādīja, ka JA aktivizēja MaCFEM85 un MsWAK16, un tam bija vadošā loma augu rezistencē pret B. cinerea.

4. Materiāli un metodes

4.1. Sēnīšu celmi, augu materiāli un kultivēšanas metodes

Metarhizium anisopliae izolāta celmi Ma 9 tika kultivēti uz kartupeļu-cukura-agara (PSA) barotnes (200 g mizotu kartupeļu ekstrakta, kas vārīts ūdenī, 20 g saharozes un 15 g agara/l). Svaigs sporangija pulveris tika savākts pēc 10 dienām. Nicotiana benthamiana augi tika audzēti mākslīgā klimata kamerā ar 14/10 h gaismas/tumsas ciklu (27/25 ◦C). Pārejošai gēnu ekspresijai, izmantojot Agrobacterium mediētu transformāciju, Agrobacterium tumefaciens celms GV3101 tika kultivēts Luria Broth (LB) barotnē (10 g triptona, 5 g rauga ekstrakta un 10 g NaCl/L). Rauga celms Gold (OE Biotech Co., Ltd., Šanhaja, Ķīna) tika kultivēts uz rauga ekstrakta peptona dekstrozes (YPDA) barotnes (10 g rauga ekstrakta, 20 g peptona, 20 g glikozes un 0,03 g adenīna hemisulfāta/l). Katram vektoram un celmam tika izmantotas atbilstošas ​​antibiotikas, proti, rifampīns, kanamicīns vai ampicilīns (attiecīgi 25, 50 vai 50 µg/ml). Šajā pētījumā izmantotie celmi un plazmīdas ir uzskaitīti S1 papildu tabulā. Medicago sativa sēklas 1 minūti sterilizēja ar 75% etanolu, kam sekoja 50% NaClO (5, 5%) 15 minūtes. Sēklas rūpīgi samaisa un pēc tam trīs reizes 5 minūtes nomazgāja sterilā ūdenī. Sēklas inkubēja 4 ◦ C tumsā vairāk nekā 24 stundas, pēc tam uz nakti istabas temperatūrā diedzēja uz 1% ūdens agara plāksnēm. Trīs dienas pēc dīgšanas attīstošie stādi tika pārvietoti uz filtrpapīru uz 9-cm steriliem Petri trauciņiem ar 20 stādiem katrā traukā. Apstrāde un kontrole tika piešķirta attiecīgi 15 ēdieniem. Pēc tam stādus apūdeņoja ar 10 ml M. anisopliae sporu suspensijas, kas satur 107/ml, un kontroli apūdeņoja ar 10 ml sterila ūdens. 0, 12, 24, 48 un 60 stundās katram laika intervālam tika ņemta nejauša stādu atlase no trim Petri trauciņiem. Paraugi tika sasaldēti šķidrā slāpeklī un uzglabāti –80 ◦C.

4.2. qRT-PCR un plazmīdu konstrukcija

Kopējā RNS tika ekstrahēta no M. anisopliae (hyphae) un M. sativa (saknēm) ar TRIzol reaģentu (Invitrogen, CA, ASV), ievērojot ražotāja norādījumus. Iegūtās RNS kvalitāte un pārpilnība tika mērīta ar NanoPhotometer® (Implen, Minhene, Vācija). Pirmās virknes cDNS sintēze (līdz 2 ug RNS) tika veikta, izmantojot 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vankūvera, BC, Kanāda), ievērojot ražotāja norādījumus. qRT-PCR tika veikta, izmantojot 2×SYBR Green qPCR Master Mix no US EVER BRIGHT ® INC. un sistēmu ABI QuantStudio 5, ievērojot ražotāja norādījumus. Katram gēnam izmantotie praimeri ir uzskaitīti S2 papildu tabulā. Maury [58], Msactin [59] un Nbactin [60] tika izmantoti kā iekšējie atsauces gēni ekspresijas datu normalizēšanai. Reakcija tika veikta šādos apstākļos: 5 minūtes 95 ◦ C temperatūrā, kam sekoja 40 cikli 95 ◦ C temperatūrā 15 sekundes un 60 ◦ C 40 sekundes. Katram paraugam bija trīs tehniski atkārtojumi. Relatīvā izteiksme tika aprēķināta, izmantojot 2−∆∆Ct metodi [61]. Statistisko nozīmīgumu noteica, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA) un Dankana vairāku diapazonu testu SPSS v20.0 (SPSS).

4.3. Pārejoša proteīnu ekspresija N. benthamiana

MaCFEM85 kodējošā secība (CDS) tika pastiprināta ar īpaši precīzu DNS polimerāzi, izmantojot cDNS kā veidni. Subcelulārās lokalizācijas testos PCR produkti, kas satur CDS MaCFEM85, tika klonēti attiecīgi pYBA1132-eGFP (sagremots ar EcoRI un SalI) un pcambia1300- ķiršiem (EcoRI un SacI). Visas konstrukcijas tika apstiprinātas ar sekvencēšanu (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Pekina, Ķīna). Šajā pētījumā izmantotie primeri ir uzskaitīti S2 papildu tabulā. Pārejošai MaCFEM85-eGFP un MaCFEM85-mCherry ekspresijai N. benthamiana, A. tumefaciens celms GV3101 tika transformēts ar katru plazmīdu un pārbaudīts ar PCR. Agrobacterium kultivēja nakti 28 ◦ C temperatūrā, kratot. Šūnas tika savāktas, centrifugējot 5 min 5000 apgr./min istabas temperatūrā, trīs reizes nomazgātas ar sterilu divreiz destilētu ūdeni un atkārtoti suspendētas 10 mM MgCl2 buferšķīdumā (kas satur 10 mM MES un 10 mM acetosiringonu, pH 5, 7). Šūnu suspensija tika noregulēta uz OD600 0,5, pēc tam ar 1-mL šļirci iefiltrējās 4- līdz 5-nedēļu veco N. benthamiana lapu apakšpusē. Katra lapa tika infiltrēta ar 50 µL A. tumefaciens; Katram augam tika apstrādātas trīs lapas, un katrā apstrādes grupā bija trīs augi. Apstrādātās lapas tika savāktas pēc 30 stundām un vizualizētas ar Zeiss LSM980 konfokālo mikroskopu (Carl Zeiss, Vācija), lai noteiktu sub-šūnu lokalizāciju.

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

4.4. Filoģenētiskā analīze

Filoģenētiskais koks tika izveidots, izmantojot kaimiņu savienošanas metodi MEGA X. 1000 bootstrap replikātos tika izmantots P attāluma modelis. Koka ģenerēšanai izmantotās aminoskābju sekvences tika iegūtas, izmantojot BLASTP meklēšanu NCBI radniecīgo sēņu datubāzē (piemēram, Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumiodiplomatus the Lasocriodiplodiaum, Gliocrola, , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana un Paecilomyces lilacinus), izmantojot kā vaicājumu MaCFEM85.

4.5. Rauga divu hibrīdu testi

Lai pārbaudītu mijiedarbību starp MaCFEM85 un MsWAK16, tika izmantota Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc.; tagad Takara Bio USA, Inc.). MaCFEM85 bez signālpeptīda tika ievadīts pGBKT7 kā ēsma, un MsWAK16 ekstracelulārais domēns (MsWAK16-ED) tika ievietots pGADT7 kā laupījums. Raugs kompetento šūnu sagatavošana un transformācijas tika veiktas, izmantojot Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, ASV), ievērojot ražotāja norādījumus. Ēsmas un laupījuma plazmīdas tika kopīgi pārveidotas rauga celmā Gold. Olbaltumvielu un olbaltumvielu mijiedarbība tika analizēta, pamatojoties uz augšanu uz SD dubultās pamešanas barotnes (DDO, SD / -Trp-Leu) un SD četrkāršās pamešanas barotnes (QDO, SD / -Trp-Leu-His-Ade) plāksnēm.

4.6. BiFC tests

Lai ģenerētu BiFC konstrukcijas, pUC-SPYNE un pUC-SPYCE vektori tika linearizēti, sadalot ar BamHI. MaCFEM85 un MsWAK16 pilna garuma CDS tika klonēti un ievietoti linearizētajās plazmīdās, izmantojot rekombinanto enzīmu, lai iegūtu MaCFEM85-YFPN un MsWAK16-YFPC konstrukcijas. Plazmīdas, kas satur MaCFEM85 un MsWAK16, tika līdztransformētas ar tukšiem vektoriem kā negatīvām kontrolēm (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE un pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Visi vektori tika ievadīti N. benthamiana, izmantojot Agrobacterium mediētu transformāciju, kā aprakstīts iepriekš. Fluorescences signāli tika novēroti lapu epidermas šūnās, izmantojot Zeiss LSM980 konfokālo mikroskopu (Carl Zeiss, Vācija). Vektoru konstruēšanai izmantotie primeri ir uzskaitīti S2 papildu tabulā.

4.7. GST nolaižamā pārbaude

GST nolaižamajiem testiem MsWAK16-ED tika ievietots pGEX-6P-2 vektorā un MaCFEM85 tika ievietots pET-21b. Attīrītie saplūšanas proteīni (GST-MsWAK16- ED) un pGEX-6P-2 bezslodzes proteīns (GST) tika izmantoti kā ēsmas proteīns un attīrīts pET-21 Kā laupījums tika izmantots b-MaCFEM85 saplūšanas proteīns (His-MaCFEM85). GST nolaižamās pārbaudes tika veiktas ar Mag-Beads GST Fusion proteīna attīrīšanas sistēmu (Sangon Biotech, Šanhaja, Ķīna), ievērojot ražotāja norādījumus. Īsumā, Mag-Beads tika mazgātas piecas reizes ar 1x fosfātu buferšķīdumu (PBS, pH 7,4), lai atbrīvotu spirta aizsargu, un pēc tam pievienoja 10 ml GST vai GST-MsWAK16-ED. Pērlītes sajauca, apgriežot istabas temperatūrā 30 minūtes. Pēc supernatanta noņemšanas Mag-Beads piecas reizes mazgāja ar 1 × PBS. His-MaCFEM85 tika pievienots Mag-Beads, kas jau bija saistīts ar GST, un maisījumu inkubēja nakti 4 ◦ C temperatūrā ar rotāciju. Pēc tam lodītes piecas reizes mazgāja ar 1 × PBS, lai noņemtu nesaistītos proteīnus. Pēc tam uz lodītēm imobilizētie proteīni tika atdalīti ar SDS-PAGE, pārnesti uz nitrocelulozes membrānu (100 V, 1 h) un analizēti, izmantojot Western blot. Membrānas trīs reizes 10 minūtes mazgāja ar PBS + Tween (PBST). Membrānas tika bloķētas 2 stundas istabas temperatūrā ar 5% vājpienu, pēc tam inkubētas ar ProteinFind anti-His peles monoklonālo antivielu (TransGen Biotech, Pekina, Ķīna) (atšķaidīta 1:3000) vai ProteinFind anti-GST peles monoklonālo antivielu 2 reizes. h pie 4 ◦C. Pēc tam membrānas tika iegremdētas ProteinFind kazas anti-trušu IgG (H + L) (HRP) antivielā (TransGen Biotech, Pekina, Ķīna) (atšķaidīta 1:5000) 1 stundu istabas temperatūrā. Membrānas tika vizualizētas ar EasySee® Western Blot komplektu (TransGen Biotech, Pekina, Ķīna), ievērojot ražotāja norādījumus.

4.8. Galvenās vietas identifikācija programmā MaCFEM85

Lai noteiktu izmēru, kas nepieciešams MaCFEM85 mijiedarbībai ar MsWAK16, tika veikta PCR amplifikācija, lai radītu vairākas saīsinātas MaCFEM85 formas. CFEM domēns (MaCFEM85-CFEM; aa atlikumi 19–86) un C terminālis bez CFEM domēna (MaCFEM85-C, aa atlikumi 87–170) tika ievietoti vektorā. pGBKT7 kā ēsmas proteīnu (papildu tabula S1). Vēl pieci varianti tika konstruēti, izmantojot polipeptīdu sintēzi, lai cisteīnu mutētu par alanīnu pozīcijās 26, 30, 43, 52 un 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8530, ∆CFEM8, ∆543). attiecīgi CFEM8552 un ∆CFEM858). Šie varianti tika izmantoti, lai veiktu Y2H eksperimentus ar MsWAK16-ED. Transformēto rauga šūnu augšana tika pārbaudīta uz sintētiskām SD/-Trp-Leu plāksnēm un SD/-Trp-Leu-His-Ade plāksnēm, kas satur X- -galaktozidāzi (X- -Gal).

4.9. Augu rezistences testi

Myzus persicae tika iegūti no Henan Quanying Biological Co., Ltd. Nedēļu pirms bioloģisko testu sākuma 150 pieaugušas laputis tika novietotas uz trim N. benthamiana augiem (50 laputis uz vienu augu). Pēc 72 stundām visi pieaugušie tika noņemti ar mīkstu mākslinieka suku, un nimfām tika atļauts baroties vēl četras dienas, pirms tās tika pārvietotas uz N. benthamiana laputu veiktspējas pārbaudēm.

4.10. Laputu veiktspējas testi

Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) tika izmantots, lai novērtētu M. persicae veiktspēju, augu slimību rezistenci pret B. cinerea un ar hormoniem saistīto gēnu ekspresiju. Agrobaktērijas ar pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 vai pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16 tika audzētas LB, kas papildināts ar atbilstošām antibiotikām, 36 stundas 28 ◦C temperatūrā. Šūnas trīs reizes mazgāja, pēc tam atkārtoti suspendēja infiltrācijas buferšķīdumā (10 mM MgCl2, 10 mM MES un 100 µM acetosiringons, pH 5,6) līdz OD600 0,6. Vienlaicīgai infekcijai baktērijas, kas pārnēsā MaCFEM85 un MsWAK16, tika pielāgotas līdz OD600 1, 2 un pēc tam sajauktas vienādos tilpumos. Pilnībā paplašinātās lapas tika infiltrētas ar baktērijām, izmantojot 1-ml bezadatas šļirces. Katram augam tika infiltrētas trīs lapas, un katra apstrāde tika veikta trīs augiem, kopā 12 augiem vienā eksperimentā.

Lai veiktu laputu veiktspējas testus, katras lapas infiltrētajā zonā 12 stundas pēc Agrobacterium uzklāšanas tika uzklātas 20 pieaugušas laputis. Laputis tika ierobežotas, izmantojot 5 mm diametra sprostus. Katru apstrādi atkārtoja piecas reizes. Pieaugušo laputu mirstība un tikko dētu nimfu skaits tika reģistrēts katru dienu trīs dienas. B. cinerea tika kultivēta piecas dienas PDAY. 12 stundas pēc Agrobacterium infiltrācijas jaunkultivētais B. cinerea tika iespiests 5- mm sēņu kūkā, un micēlija augšanas virsma tika piestiprināta pie infiltrācijas zonas lapas virsmā. Lai veicinātu slimības attīstību, augi tika turēti mitri, pārklājot tos ar plastmasas plēvi paplātēs 22 ◦C temperatūrā, lai veicinātu slimības progresēšanu. Pēc 48 stundām slimības progresu novērtēja inokulētajās lapās, mērot bojājumu izmērus. Lai kvantitatīvi noteiktu attiecīgo gēnu relatīvo ekspresiju, trīs infiltrētās lapas tika savāktas no katra auga 12 stundas pēc infiltrācijas, pēc tam sasaldētas šķidrā slāpeklī un uzglabātas -80 grādu temperatūrā. Kopējā RNS ekstrakcija, cDNS sintēze un qRT-PCR tika veikta, kā aprakstīts 3.2. sadaļā. Salicilskābes (SA), jasmonskābes (JA) un flavonoīdu līmenis tika mērīts 15 infiltrētās N. benthamiana lapās vienā apstrādē. Lapas tika savāktas, sasaldētas šķidrā slāpeklī, pēc tam uzglabātas -80 grādu temperatūrā. Augu hormoni tika kvantificēti, izmantojot augu salicikliskās skābes un augu jasmonskābes ELISA komplektus (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), un flavonoīdus noteica, izmantojot Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.). ražotāja norādījumus.

4.11. Statistiskā analīze

Dati tika analizēti SPSS v20.0. Būtiskas atšķirības MaCFEM85 un MsWAK16 ekspresijas līmeņos tika noteiktas, izmantojot Studenta t-testu. Būtiskas SA, JA un flavonoīdu līmeņu atšķirības tika noteiktas, izmantojot vienvirziena ANOVA un Dankana vairāku diapazonu testu ar slieksni p < 0,05.

5. Secinājumi

Šajā pētījumā mēs identificējām un raksturojām jaunu M. anisopliae izdalīto proteīnu MaCFEM85. Tika konstatēts, ka tas ir konservēts efektors, kas var mijiedarboties ar MsWAK16 un aktivizēt N. benthamiana aizsardzības reakciju. Mēs parādījām, ka CFEM domēns un cisteīna atlikums MaCFEM85 52. pozīcijā bija kritiski svarīgi mijiedarbībai. Šī mijiedarbība var aktivizēt ar JA saistītās imūnās atbildes un pret slimībām izturīgus un pret kukaiņiem izturīgus mehānismus augā.

Atsauces

1. Paulucci, NS; Anta, GG; Galarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurejs, C.; Bueno, MA; Garsija, MB; Dardanelli, MS Augu un mikrobu partnerības: ietekme uz augšanu un augu veselību. Augu mikrobu simbiozē: pamati un sasniegumi; Springer: Berlīne/Heidelberga, Vācija, 2013; 105.–117.lpp. [CrossRef]

2. Šenks, PM; Carvalhais, LC; Kazaņa, K. Augu un mikrobu mijiedarbības atšķetināšana: vai var palīdzēt vairāku sugu transkriptomika? Trends Biotechnol. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]

3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Pabarojiet savus draugus: vai augu eksudāti veido sakņu mikrobiomu? Trends Plant Sci. 2018, 23., 25.–41. [CrossRef]

4. Lugtenbergs, B.; Kamilova, F. Augu augšanu veicinošas rizobaktērijas. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]

5. Šorešs, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Inducēta sistēmiskā rezistence un augu reakcijas uz sēnīšu biokontroles līdzekļiem. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]

6. van de Mortels, JE; de Vos, RC; Dekers, E.; Pineda, A.; Gilods, L.; Bouwmeester, KJ; van Lūns, Dž.; Diks, M.; Raaijmakers, JM. Metaboliskās un transkriptomiskās izmaiņas, ko Arabidopsis inducē rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Augu fiziol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]

7. Larēna, A.; Bērtons, F.; Schafer, P. Augu sakņu un mikrobu komunikācija sakņu mikrobiomu veidošanā. Augu Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]

8. Sasans, RK; Bidochka, MJ Kukaiņu patogēnā sēne Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) ir arī endofīts, kas stimulē augu sakņu attīstību. Am. Dž. Bots. 2012, 99., 101.–107. [CrossRef]

9. Sasans, RK; Bidochka, MJ Endofītiskās kukaiņu patogēnās sēnes Metarhizium robertsii antagonisms pret pupiņu augu patogēnu Fusarium solanif. sp. phaseoli. Var. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]

10. Ahmads, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Lute, DS; Šekīls, SN; Barbercheck, ME Endophytic Metarhizium robertsii veicina kukurūzas augšanu, nomāc kukaiņu augšanu un maina augu aizsardzības gēnu ekspresiju. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]

11. Chairin, T.; Petcharat, V. Aizsardzības reakciju ierosināšana Honkongas augļos (Aglaia dookkoo Griff.) pret augļu puves sēnēm, ko veic Metarhizium guizhouense. Biol. Kontrole 2017, 111, 40.–44. [CrossRef]

12. Hao, K.; Van, F.; Nongs, X.; Maknīls, MR; Liu, S.; Van, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Zemesriekstu Arachis hypogaea sakņu reakcija uz labvēlīgo un patogēno sēņu klātbūtni ar transkripta analīzi. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]

13. Pātels, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM 11. nodaļa — Sēnīšu izsaucēju loma augu aizsardzības mehānismā. Augu labvēlīgo mikrobu molekulārajos aspektos lauksaimniecībā; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., Eds.; Akadēmiskā prese: Kembridža, MA, ASV, 2020; 143.–158.lpp. [CrossRef]

14. Dongs, X.; Sa, JA Etilēns un augu izturība pret slimībām. Curr. Atzinums. Augu Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]

15. Tomma, BP; Egermonts, K.; Peninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsangs, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF Atsevišķi no jasmonāta atkarīgi un no salicilātiem atkarīgi aizsardzības-reakcijas ceļi Arabidopsis ir būtiski rezistencei pret atšķirīgiem mikrobu patogēniem. Proc. Natl. Akad. Sci. ASV 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]

16. Panta, SR; Irigojens, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Kristensens, SA; Šmelcs, EA; Sedbruks, JC; Scholthof, K.‑BG; Mandadi, KK Brachypodium Fenilalanīna amonjaka liāze (PAL) Veicina pretvīrusu aizsardzību pret Panicum mozaīkas vīrusu un tā pavadoņiem. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]

17. Liu, R.; Sju, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Astragalus membranaceus var. PAL gēna ekspresijas profils. Mongholicus un tā izšķirošā loma flavonoīdu biosintēzes plūsmā. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]

18. De Geiters, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripcijas mehānismi jasmonāta izraisītā augu sekundārajā metabolismā. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]

19. Mirjalili, N.; Linden, JC Gāzes fāzes sastāva ietekme uz Taxus cuspidata suspensijas kultūrām. Biotehnoloģija. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]

20. Li, ST; Džans, P.; Džans, M.; Fu, CH; Džao, CF; Dongs, YS; Guo, AY; Yu, LJ Taksus chinensis šūnu transkripcijas profils, reaģējot uz metiljasmonātu. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]

21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Stīnkampa, PA; Dubery, IA Metabolomikas atvasināts ieskats terpenoīdu sintēzes manipulācijās Centella asiatica šūnās, izmantojot metiljasmonātu. Augu biotehnoloģija. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]

22. Lu, M.; Vongs, H.; Teng, W. Ietekme uz izraidīšanu uz ražošanu saponīna šūnu kultūrā Panax ginseng. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]

23. Mandals, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor izraisītas aizsardzības reakcijas Solanum lycopersicum pret Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]

24. Li, L.; Vangs, S.; Jans, X.; Francisks, F.; Qiu, D. Proteīna izsaucējs PeaT1 uzlaboja rezistenci pret laputīm (Sitobion avenae) kviešos. Pest Manag. Sci. 2020, 76., 236.–243. [CrossRef] [PubMed]

25. Bujalowski, W. Heksameriskās DnaB helikāzes fizioloģiskās lomas paplašināšana. Tendences Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]

26. Vaknins, Y.; Šadčans, Y.; Levdaņskis, E.; Morozovs, M.; Romano, Dž.; Ošerovs, N. Trīs Aspergillus fumigatus CFEM domēna GPI noenkurotie proteīni (CfmA-C) ietekmē šūnu sienas stabilitāti, bet tiem nav nozīmes sēnīšu virulentē. Sēnīšu. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]

27. Džao, S.; Šans, X.; Bi, V.; Yu, X.; Liu, D.; Kangs, Z.; Vangs, X.; Wang, X. Genoma mēroga identifikācija efektoru kandidātiem ar konservētiem motīviem no kviešu lapu rūsas sēnītes Puccinia triticina. Priekšpuse. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]

28. Gongs, A.; Jings, Z.; Džans, K.; Tan, Q.; Van, G.; Liu, W. CFEM proteīnu bioinformātiskā analīze un funkcionālais raksturojums kukurūzas antracnozes sēnē Colletotrichum graminicola. J. Integr. Lauksaimniecības. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]

29. Mārtiņš, F.; Aerts, A.; Ārens, D.; Brūns, A.; Dančins, EG; Duchaussoy, F.; Gibons, J.; Kolers, A.; Lindkvists, E.; Pereda, V.; un citi. Laccaria bicolor genoms sniedz ieskatu mikorizas simbiozē. Daba 2008, 452, 88–92. [CrossRef]

30. Stefans, V.; Lara, RJ Entomopatogēnās sēnes kā endofīti: augu, endofītu un zālēdāju mijiedarbība un izmantošanas iespējas bioloģiskajā kontrolē. Curr. Sci. 2015, 109., 46.–54.

31. Cai, N.; Liu, R.; Jans, D.; Džans, N.; Žu, K.; Džans, D.; Nongs, X.; Tu, X.; Džans, Z.; Wang, G. Metarhizium anisopliae CFEM proteīnu bioinformātikas analīze un funkcionālais raksturojums. J. Sēnes. 2022, 8, 661. [CrossRef]

32. Stīvenss, C.; Hamonda-Kosaka, KE; un Kanyuka, K. WAKsing augu imunitāte, slimības pavājināšanās. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]

33. Džans, ZN; Wu, QY; Džans, GZ; Zhu, YY; Mērfijs, RW; Liu, Z.; Zou, CG Sistemātiskās analīzes atklāj CFEM domēna unikalitāti un izcelsmi sēnēs. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]

34. Fangs, A.; Gao, H.; Džans, N.; Džens, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Džou, S.; Cui, F.; Sun, W. Jauns efektorgēns SCRE2 veicina pilnīgu Ustilaginoidea virens virulenci rīsiem. Priekšpuse. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]

35. Žu, V.; Vejs, V.; Vu, Y.; Džou, Y.; Pengs, F.; Džans, S.; Čens, P.; Xu, X. BcCFEM1, CFEM domēnu saturošs proteīns ar iespējamu GPI noenkurotu vietu, ir iesaistīts Botrytis cinerea patogenitātē, konidiju ražošanā un stresa tolerancē. Priekšpuse. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]

36. Sju, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Genoma mēroga salīdzinošā analīze par iespējamiem Pth11-saistītiem G proteīniem saistītiem receptoriem sēnēs, kas pieder pie Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]

37. Pens, JJ; Hou, J.; Džans, H.; Lei, JH; Lin, HY; Dings, JL; Feng, MG; Ying, SH CFEM domēna, kas satur proteīnus, sistemātisks ieguldījums dzelzs ieguvē ir būtisks pavedienveida patogēnās sēnes Beauveria bassiana starpsugu mijiedarbībai. Vide. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]

38. Rojs, U.; Kornitzer, D. Heme-dzelzs iegūšana sēnēs. Curr. Atzinums. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]

39. Okamoto-Šibajama, K.; Kikuči, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, Rbt5 proteīnu saimes loceklis, ir iesaistīts dzelzs izmantošanā no cilvēka hemoglobīna Candida albicans hifu augšanas laikā. FEMS Yeast Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]

40. Peress, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Kazanova, M.; Lopess-Ribots, JL; Martinez, JP Bioplēves veidošanās ar Candida albicans mutantiem gēniem, kas kodē sēnīšu proteīnus, kuriem ir astoņu cisteīnu saturošs CFEM domēns. FEMS Yeast Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]

41. Hogg, PJ Disulfīda saites kā proteīna funkcijas slēdži. Tendences Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]

42. van den Burg, HA; Vesterinks, N.; Frankoijs, KJ; Rots, R.; Vūstenenks, E.; Bērens, S.; de Wit, PJ; Joostens, MH; Vervoort, J. Tomātu patogēna Cladosporium fulvum AVR4 dabiskie disulfīda saites mutanti ir jutīgi pret proteolīzi, apiet Cf-4-mediēto rezistenci, bet saglabā savu hitīna saistīšanās spēju. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Džans, Dž.; Sja, F.; Ke, Y.; Džans, H.; Xie, V.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; un citi. Vairāku agronomisko īpašību uzlabošana ar slimību rezistences gēnu, pastiprinot šūnu sienu. Nat. Plants 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]

44. Saitoh, H.; Fudžisava, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuči, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Jošino, K.; Jošida, K.; Matsumura, H.; un citi. Liela mēroga gēnu traucējumi Magnaporthe oryzae identificē MC69, izdalīto proteīnu, kas nepieciešams, lai inficētos ar viendīgļdīgļu un divdīgļdīgļu sēnīšu patogēniem. PLoS Patogs. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]

45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Astoņu cisteīnu saturošs CFEM domēns, kas ir unikāls sēnīšu membrānu proteīnu grupai. Tendences Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Pengs, Dž.; Vu, L.; Džans, V.; Džans, K.; Xing, Q.; Vangs, X.; Li, X.; Yan, J. Sistēmiskā identifikācija un funkcionālais raksturojums parastajiem sēnīšu ārpusšūnu membrānas proteīniem Lasiodiplodia theobromae. Priekšpuse. Augu Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]

47. Bari, R.; Džounss, JD. Augu hormonu loma augu aizsardzības reakcijās. Augu Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]

48. Vērma, V.; Ravindrāns, P.; Kumar, PP Augu hormonu izraisīta stresa reakciju regulēšana. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]

49. Džaveds, K.; Qiu, D. Brevibacillus laterosporus proteīna izsaucējs PeBL1 pastiprina tomātu rezistenci pret Myzus persicae. Patogens 2020, 9, 57. [CrossRef]

50. Basits, A.; Hanans, A.; Nazirs, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. No Botrytis cinerea ekstrahēta PeBC1 molekulārais un funkcionālais raksturojums, kas iesaistīts rezistences izraisīšanā pret zaļo persiku laputu (Myzus persicae) parastajās pupiņās (Phaseolus vulgaris L.). Kukaiņi 2019, 10, 35. [CrossRef]

51. Nazirs, T.; Hanans, A.; Basīts, A.; Majeed, MZ; Anvars, T.; Navazs, I.; Qiu, D. Vēl neraksturīga proteīna izsaucēja PeBb1 iespējamā loma, kas iegūta no Beauveria bassiana ARSEF 2860 celma pret Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogens 2020, 9, 111. [CrossRef]

52. Spoel, SH; Kūrnefs, A.; Klassens, SM; Korzēliuss, JP; Van Pelts, JA; Mullers, MJ; Bušala, AJ; Metraux, JP; Brauns, R.; Kazaņa, K.; un citi. NPR1 modulē savstarpējo sarunu starp salicilāta un jasmonāta atkarīgiem aizsardzības ceļiem, izmantojot jaunu funkciju citozolā. Plant Cell 2003, 15, 760–770. [CrossRef]

53. Xin, XF; Viņš, SY Pseudomonas syringae pv. tomāts DC3000: parauga patogēns, lai pārbaudītu uzņēmību pret slimībām un hormonu signalizāciju augos. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]

54. Džans, X.; Vangs, C.; Džans, Y.; Saule, Y.; Mou, Z. Arabidopsis mediatora kompleksa apakšvienība16 pozitīvi regulē salicilātu mediētu sistēmisku iegūto rezistenci un jasmonāta/etilēna izraisītos aizsardzības ceļus. Plant Cell 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]

55. Doares, SH; Narvaezs-Vaskess, J.; Konkoni, A.; Ryan, CA Salicilskābe inhibē proteināzes inhibitoru sintēzi tomātu lapās, ko izraisa sistēmīns un jasmonskābe. Augu fiziol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]

57. Pieterse, CM; Leons-Rejs, A.; Van der Ents, S.; Van Wees, SC Mazu molekulu hormonu tīklu veidošana augu imunitātē. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]

57. Peninckx, IA; Tomma, BP; Bušala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Augu defensīna gēna indukcijai Arabidopsis ir nepieciešama vienlaicīga jasmonāta un etilēna reakcijas ceļu aktivizēšana. Plant Cell 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]

58. Fangs, V.; Bidochka, MJ Gēnu ekspresija, kas iesaistīti Metarhizium anisopliae dīgšanā, konidioģenēzē un patoģenēzē, izmantojot kvantitatīvu reāllaika RT-PCR. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]

59. Guerriero, G.; Legejs, S.; Hausman, JF Lucerna Celulozes sintāzes gēna ekspresija abiotiskā stresa apstākļos: Stopnieka rokasgrāmata RT-qPCR normalizēšanai. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]

60. Yang, Y.; Džans, Y.; Li, B.; Jans, X.; Dongs, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliae pektāta liāze izraisa augu imūnās atbildes reakcijas un veicina virulenci. Priekšpuse. Augu Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]

62. Līvāks, KJ; Schmittgen, TD Relatīvo gēnu ekspresijas datu analīze, izmantojot reālā laika kvantitatīvo PCR un 2(-Delta Delta C(T)) metodi. Metodes 2001, 25, 402–408. [CrossRef]