Nefrotoksīna ohratoksīna A ietekmi uz cilvēka nieru šūnām, kas pētīta ar jaunu kopkultūras modeli, ietekmē fibroblastu klātbūtne
Mar 01, 2022
Abstract:Thenieresto apdraud daudzas potenciāli toksiskas vielas. Lai izpētītu nefrotoksīna ohratoksīna A (OTA) ietekmi, mēs izveidojām šūnu kopkultūras modeli, kas sastāv no cilvēkanieru proksimālās kanāliņu šūnas un fibroblasti. Mēs pētījām OTA ietekmi uz šūnu izdzīvošanu, gēnu un / vai proteīnu ekspresiju, kas saistīti ar šūnu nāvi, ekstracelulāro matricu un enerģijas homeostāzi. OTA izraisītā nekroze tika pastiprināta abos šūnu tipos attiecīgā cita šūnu tipa klātbūtnē, turpretim OTA izraisītā apoptoze bija no tā neatkarīga. Fibroblastos, bet ne kanāliņu šūnās, bija redzams kopkultūras efekts attiecībā uz ar šūnu ciklu saistītā proteīna p21 ekspresiju. Epitēlija un mezenhimālās pārejas indikācijas proteīna vimentīna ekspresija nebija atkarīga no kultūras stāvokļa. OTA inducētās lncRNS WISP1-AS1 ekspresija tika uzlabota kopkultūrā. OTA iedarbība izraisīja izmaiņas gēnu ekspresijā, kas saistīti ar enerģijas metabolismu ar glikozes mobilizējošo efektu un samazinātu mitohondriju proteīnu ekspresiju. Kopā mēs demonstrējam, ka šūnu reakcija var būt atšķirīga tādu šūnu klātbūtnē, kuras dabiski atrodas blakus, tādējādi nodrošinot šūnu savstarpēju sarunu. Tāpēc, lai novērtētu vielas toksicitāti, būtu lietderīgi apsvērt iespēju izmantot kopkultūras, nevis monokultūras.
Atslēgvārdi:ohratoksīns A; šūnu kultūra; enerģijas metabolisms; apoptozes-nekrozes līdzsvars; mitohondriji; nieres; nieru
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru mazspēju
Ievads
Pateicoties izvadīšanas funkcijai,nieresto apdraud dažādas kaitīgas vielas, piemēram, zāles vai pārtikas piesārņotāji, piemēram, mikotoksīni, kas izraisa akūtu vai, vēl ļaunāk, hroniskunieru slimībasar izplatību aptuveni 10 procenti [1,2]. Lai izprastu nefrotoksiskās iedarbības mehānismus, ir lietderīgi atrast stratēģijas šo kaitīgo scenāriju mazināšanai, un ir veikti daudzi pētījumi, lai atrisinātu jautājumu par to, kāpēc un kā.nieresir apdraudētas [3–5]. Lai izpētītu vielas ietekmi uz organismu, bieži vien ir grūti izmantot veselus dzīvniekus ētisku apsvērumu un organizatorisku, dārgu un sarežģītu priekšnoteikumu dēļ. Turklāt zināšanu pārnese uz cilvēka situāciju ir saistīta ar nenoteiktību. Tāpēc ir izveidoti un plaši izmantoti šūnu kultūras modeļi, un tiem ir priekšrocība, ka kontrolētos apstākļos var pētīt noteiktu šūnu tipu un to reakciju uz vielu vai ārstēšanu. Lai gan, izmantojot šo pieeju, ir izdarīti daudzi un svarīgi atklājumi, daži trūkumi ir raksturīgi: šūnu līnijas šūnas bieži ir iemūžinātas ar mutaģenēzi vai citām, dažreiz drastiskām metodēm [6]. Tas nodrošina vieglu apstrādi un ilgstošu lietošanu, taču ar apdraudējumu, kas konstatēts konkrētā modeļa sistēmā, var nebūt attiecināms uz situāciju visā orgānā vai organismā. Lai novērstu šo trūkumu, iemūžinātu šūnu līniju vietā var izmantot primārās šūnas, taču primāro šūnu ģenerēšana bieži ir ļoti sarežģīta un prasa uzlabotas tehniskās prasmes. Turklāt primārās šūnas bieži neizdzīvo ilgu laiku, un tām ir nepieciešami īpaši individuāli kultivēšanas apstākļi. Bet primārās šūnas ir soli tuvāk dabiskajiem apstākļiem, un vismaz dažreiz izrādījās, ka tās ir jutīgākas, piemēram, pret toksiskiem stimuliem, kā šūnu līnijas [7], kas nozīmē, ka šūnu līnijas varētu būt noturīgākas. Vēl viens trūkums ir fakts, ka šūnas bieži tiek turētas monokultūrā, ti, bez citu šūnu tipu ietekmes, kas viņu mājas orgānā parasti atrodas blakus. Tāpēc tas varētu būt solis ceļā uz reālāku situāciju, lai izpētītu šūnu tipa reakciju uz vielu vai ārstēšanu to šūnu klātbūtnē, kuras atrodas dzimtajā orgānā tiešā tuvumā.
Iekšnieres, proksimālās kanāliņu šūnas ieskauj fifibroblasti, un var pieņemt, ka, iespējams, ir savstarpēja ietekme. Tā tas ir arī lietānieru bojājumiscenāriji, kas vairumā gadījumu izraisa tubulo-intersticiālu iekaisumu un fibrozi [8,9], un ir izšķiroši, lai samazinātunieresfunkciju. To transportēšanas un enzīmu spēju dēļ,nieruproksimālās kanāliņu šūnas apdraud dažādas potenciāli toksiskas vielas, piemēram, zāles vai to atliekas vai mikotoksīni. Viena no apkārtējo fibroblastu funkcijām ir nodrošināt ekstracelulāro matricu, atbrīvojot kolagēnus un citus matricas komponentus, un tādējādi piedalīties audu integritātē [10]. Bet tie ir arī - kopā ar epitēlija šūnām - ir iesaistīti iekaisuma procesos vai fibrozes procesosnieru slimības[11] ar attīstības riskunieru mazspēja.
Intensīvi pētīts mikotoksīns, kam ir nozīme cilvēka veselībai, ir ohratoksīns A (OTA) [12,13]. To var atrast dažādos pārtikas produktos [12,14], un gandrīz neiespējami izvairīties no tā iedarbības un uzņemšanas [9,15]. Tas noved pie novērojuma, ka OTA bieži tiek konstatēta cilvēka asinīs zemā nanomolārā koncentrācijā [16]. Atklātiem dzīvniekiem OTA noved pienieru mazspējaun fifibrotiskas izmaiņas [17,18]. Tiek pieņemts, ka OTA iedarbība ir saistīta ar cilvēkunieru slimības[19]. Cilvēka primārajās proksimālajās kanāliņu šūnās ir pierādīta OTA toksiskā iedarbība, kas ir novērojama arī cilvēka primārajos fifibroblastos, lai gan tā nav tik izteikta kā proksimālajās kanāliņu šūnās [7]. OTA toksiskās iedarbības mehānismi joprojām nav pilnībā izprasti, un tos veic daudzi pētījumi. Cik tālu blakus esošās šūnas ar dažādām funkcijām traucē un tādējādi modulē šūnu darbību, gandrīz nav zināms, bet tas ir sagaidāms. Iepriekšējā pētījumā, izmantojot kopkultūras modeli, kas sastāv no žurkasnieresproksimālo kanāliņu un fifibroblastu šūnās, izrādījās, ka notiek savdabīga šķērsruna starp abiem šūnu tipiem, kā rezultātā tika konstatēts, ka OTA kā epitēlija-mezenhimālās pārejas (EMT) ietekme notika tikai kopkultūras apstākļos [20]. Cits secinājums, ko var izdarīt no šī un citiem pētījumiem, bija tāds, ka žurku šūnas ir spēcīgākas attiecībā uz toleranci pret OTA, salīdzinot ar cilvēka proksimālajām kanāliņu šūnām [7, 20], un tāpēc ir nepieciešama modeļa sistēma, kuras pamatā ir cilvēka šūnas, lai tuvāk novērtētu cilvēka situāciju un OTA iedarbības risks.
Tāpēc šajā pētījumā mēs izveidojam progresīvu šūnu kopkultūras modeli, kas sastāv no cilvēka proksimālajām kanāliņu šūnām (HK2 šūnām) un cilvēka fifibroblastiem (CCD-1092SK šūnām), lai pētītu OTA ietekmi uz šūnu izdzīvošanu (apoptozi). , nekroze) un dažu parauga izvēlētu gēnu ekspresija, kas saistīti ar šūnu ciklu, šūnu nāvi, ekstracelulāro matricu un metabolismu. Līdzīgi kā iepriekšējos pētījumos ar žurku šūnām [20], cilvēka proksimālās kanāliņu šūnas tika novietotas uz filtra ierīcēm un filtri tika novietoti virs fibroblastu slāņa, kas iesēts Petri trauciņa apakšā tā, lai epitēlija šūnu bazolaterālā puse būtu vērsta pret. fibroblastus, nodrošinot sava veida sarunu starp abiem šūnu tipiem.
Rezultāti
Olbaltumvielu, laktātdehidrogenāzes atbrīvošanās un kaspāzes-3 aktivitāteLai iegūtu pirmo priekšstatu par pašu kultivēšanas apstākļu iespējamo ietekmi, kā arī par ietekmi uz OTA izraisītām izmaiņām, mēs salīdzinājām kaspāzes -3 aktivitāti kā monokultūrā audzētu šūnu apoptozes mērījumu ar to šūnu aktivitāti, kas audzētas kopā. - kultūra, kas inkubēta ar vai bez 100 nM OTA divus laika punktus, 24 un 48 stundas. Turklāt tika noteikta laktāta dehidrogenāzes (LDH) izdalīšanās kā nekrozes mērs, kā arī olbaltumvielu saturs, lai radītu vispārēju iespaidu par šūnu stāvokli. Tāpēc vienādi šūnu daudzumi tika ievietoti vai nu iedobes dibenā (fifibroblasti), vai uz fifiltra (proksimālās kanāliņu šūnas). Pēc saplūšanas sasniegšanas iedobēs, kurās atradās fifibroblasti, tika ievietoti fifiltri (skatīt grafisko kopsavilkumu). Kā parādīts 1.A attēlā, abos šūnu tipos pēc 24 vai 48 stundām gandrīz nevarēja novērot no kultūras apstākļiem atkarīgu ietekmi uz olbaltumvielu saturu (skatīt arī papildu failu S1). Fifibroblastos OTA iedarbība izraisīja nelielu olbaltumvielu satura palielināšanos, savukārt kanāliņu šūnās OTA izraisīja nelielu olbaltumvielu satura samazināšanos, kas liecina, ka OTA varētu negatīvi ietekmēt kanāliņu šūnas. Šie efekti bija gandrīz neatkarīgi no kultūras stāvokļa abos šūnu tipos
1. attēls. Ohratoksīna A (OTA) un/vai kultivēšanas apstākļu ietekme uz olbaltumvielu saturu (A), kaspāzes -3 aktivitāti (B) un laktātdehidrogenāzes (LDH) izdalīšanos (C). Šūnas tika kultivētas vai nu monokultūrā, vai kopkultūrā un pakļautas 100 nM OTA iedarbībai 24 vai 48 stundas. N=3–6, n=14–18 (olbaltumvielas, LDH) vai 8–9 (kaspāze-3). * norāda ap < 0,05="" šūnām,="" kas="" nav="" pakļautas="" ota="" iedarbībai="" (salīdzinot="" ota="" efektus,="" resp.="" kreiso="" pusi)="" vai="" šūnām="" monokultūrā="" (salīdzinot="" kultūras="" efektus,="" attiecīgi="" labajā="" pusē).="" lai="" sīkāk="" izskaidrotu="" ietekmi="" uz="" olbaltumvielu="" saturu,="" mēs="" pētījām="" apoptozi="" un="" nekrozi.="" salīdzinot="" ar="" fifibroblastiem,="" ota="" skaidri="" ietekmēja="" apoptozi="" kanāliņu="" šūnās="" pēc="" 24 stundu="" iedarbības="" ar="" aptuveni="" 2{21}}aktivitātes="" pieaugumu="" (1.b="" attēls).="" pēc="" 48="" stundu="" iedarbības="" pieaugums="" joprojām="" bija="" novērojams,="" bet="" ne="" tik="" izteikts="" kā="" pēc="" 24="" stundām.="" tomēr="" šie="" palielinājumi="" bija="" gandrīz="" neatkarīgi="" no="" audzēšanas="" apstākļiem,="" izņemot="" to,="" ka="" pēc="" 48="" stundām="" fifibroblastu="" klātbūtnē="" kaspāzes="" aktivitāte="" kanāliņu="" šūnās="" bija="" nedaudz="" samazināta,="" norādot="" uz="" nelielu="" kopkultūras="" aizsargājošo="" efektu.="" tomēr="" fifibroblastiem="" bija="" novērojama="" kopkultūras="" aizsargājoša="" iedarbība,="" īpaši="" ota="" klātbūtnē.="" kopkultūrā="" ldh="" izdalīšanās="" bija="" skaidri="" uzlabota="" fifibroblastos="" un="" kanāliņu="" šūnās,="" salīdzinot="" ar="" monokultūras="" apstākļiem="" neatkarīgi="" no="" ota="" klātbūtnes="" (1. c="" attēls).="" kanāliņu="" šūnās="" ota="" izraisīja="" barotnē="" izdalītā="" ldh="" palielināšanos,="" īpaši="" pēc="" 48="" stundu="" iedarbības,="" kas="" fibroblastos="" nebija="" tik="" izteikta.="" kopumā="" attiecīgā="" cita="" veida="" šūnu="" klātbūtne="" izraisīja="" pastiprinātu="" nekrozi,="" bet="" mazāku="" apoptozi,="" tāpēc="" kopējais="" olbaltumvielu="" saturs="" netika="" ievērojami="" mainīts.="" ota="" ietekme="" uz="" apoptozi="" un="" nekrozi="" arī="" lielākoties="" bija="" neatkarīga="" no="" cita="" šūnu="" veida="" klātbūtnes="" vai="">
Western Blot un mRNS ekspresija
CDKN1A/p21Tika pierādīts, ka OTA ietekmē šūnu ciklu, un varēja pierādīt, ka p21 proteīns, kas ir iesaistīts šūnu ciklā, tika pārregulēts ar OTA kanāliņu šūnās [21]. Lai izpētītu, cik tālu proteīnu, kā arī p21 kodējošo mRNS ekspresiju ietekmē fibroblastu klātbūtne, mēs veicām Western blot un RT-PCR. Kā parādīts 2.A, B un 3. attēlā, 48 stundu iedarbība uz 100 nM OTA izraisīja p21 proteīna daudzuma palielināšanos mono, bet arī kopkultūras apstākļos kanāliņu šūnās. Fibsoblastos kopkultūras apstākļos OTA neietekmēja p21-proteīna ekspresiju, lai gan mRNS ekspresiju palielināja OTA neatkarīgi no cita veida šūnu klātbūtnes. Interesanti, ka kopkultūras apstākļos OTA iedarbība vēl vairāk nepalielināja p21 proteīna ekspresiju. Kanāliņu šūnās to RNS ekspresiju neizmainīja fibroblastu klātbūtne, bet fibroblastos kopkultūrā pZlmRNS ekspresija tika uzlabota ne tikai OTA pakļautajās, bet arī jau šūnās, kas nav pakļautas OTA (skatīt arī Papildu failu S1). Tas parāda, ka cita šūnu tipa p rezēns ietekmē p21 proteīna ekspresiju, īpaši fibroblastos.
Ciklooksigenāze 2 (COX2)Ir pierādīts, ka ciklooksigenāzes 2 (COX2) proteīna, kā arī mRNS līmenis palielināsnieru mazspēja[22]. Kā parādīts 2.C, D un 3. attēlā, tikai fifibroblastos proteīna ekspresiju palielināja OTA iedarbība. Turklāt kanāliņu šūnu klātbūtnē COX2 proteīna ekspresija tika uzlabota neapstrādātajās, kā arī OTA pakļautajās šūnās, parādot skaidru kanāliņu šūnu ietekmi. Tomēr OTA neietekmēja mRNS ekspresiju, un OTA iedarbība radīja ļoti nelielu kopkultūras ietekmi. Turpretī kanāliņu šūnās COX2 mRNS un olbaltumvielu ekspresija bija pilnīgi neatkarīga no OTA vai fifibroblastu klātbūtnes. Tas parāda, ka attiecībā uz COX2 kanāliņu šūnas var ietekmēt fifibroblastus, bet fifibroblastiem nav ietekmes uz kanāliņu šūnām.
FibronektīnsNieru mazspējato bieži pavada fibroze. Fifibrozes laikā notiek ekstracelulārās matricas uzkrāšanās un viens novērojums bez otra ir fifibronektīna proteīna daudzuma palielināšanās [23]. Tāpēc no OTA atkarīgās fibronektinkodējošās mRNS un olbaltumvielu ekspresijas izmaiņas tika noteiktas mono- vai kopkultūras apstākļos. Kā parādīts 3. un 4.A, B attēlā, kanāliņu šūnu 48 stundu iedarbība uz 100 nM OTA izraisīja intracelulārā fifibronektīna samazināšanos gan mono-, gan kopkultūrā. OTA efekts bija mazāks kopkultūrā. Turklāt mRNS daudzums, kas kodē fifibronektīnu, tika samazināts ar OTA iedarbību neatkarīgi no audzēšanas apstākļiem, un fifibroblastu klātbūtne izraisīja zemāku mRNS ekspresiju kontroles un OTA pakļautajās šūnās. Turpretim fifibroblastos fifibronektīna ekspresiju gandrīz nemainīja ne OTA, ne kultūras apstākļi, jo ir liela atšķirība, īpaši Western blotos. Tendence uz OTA izraisītu ekspresiju var būt redzama monokultūrā.
VimentinVimentīns ir proteīns, kura daudzums palielinās, kad notiek pāreja no epitēlija uz mezenhimālu (EMT) un EMT attīstība var izraisītnieru mazspēja[23]. Tāpēc no OTA atkarīgās vimentīna mRNS un olbaltumvielu ekspresijas izmaiņas tika noteiktas mono- un kopkultūras apstākļos. Kā parādīts 3. un 4C, D attēlā, kanāliņu šūnu 48 stundu iedarbība uz 100 nM OTA izraisīja mazāku vimentīna proteīna daudzumu gan mono-, gan kopkultūras apstākļos. Tomēr fifibroblastu klātbūtnē vimentīna proteīna ekspresija nebija atkarīga no audzēšanas apstākļiem. Vimentīnu kodējošo mRNS ekspresiju gandrīz nemainīja ne OTA, ne kultivēšanas apstākļi, izņemot to, ka OTA iedarbība kopkultūrā uzrādīja nelielu pieaugumu. Fifibroblastos vimentīna proteīna ekspresija bija pilnīgi neatkarīga no OTA iedarbības, kā arī no kanāliņu šūnu klātbūtnes. Turklāt vimentīnu kodējošā mRNS ekspresija gandrīz netika mainīta
Dažu atlasīto gēnu izpausmeLai tālāk pārbaudītu, cik lielā mērā kultūras apstākļi var ietekmēt arī citu RNS ekspresiju, mēs izvēlējāmies dažus gēnus, kuriem ir nozīme apoptozes nekrozē, vēža attīstībā vai enerģijas metabolismā (skatīt arī Papildu failu S1).
WISP1-AS1ir gara nekodējoša RNS (lncRNS), ko inducē OTA, kas ietekmē transkripcijas regulējumu un spēlē lomu apoptozes un nekrozes līdzsvarā un, iespējams, vēža attīstībā [24]. Kā redzams 5.A attēlā, 48 stundu ilga 100 nM OTA iedarbība abos šūnu tipos izraisīja ievērojamu šīs lncRNS ekspresijas palielināšanos. Bez OTA attiecīgā cita šūnu tipa klātbūtne gandrīz neietekmēja ekspresiju. Tomēr OTA klātbūtnē tā ekspresija bija augstāka kopkultūrā, salīdzinot ar monokultūru.
GDF15Augšanas diferenciācijas faktors 15 (GDF15) ir transformējošās augšanas faktoru virsģimenes loceklis, kas reaģē uz stresu. Tas tiek apspriests arī kā biomarķierisnieru slimībasvai kā izdzīvošanas prognozētājsnierestransplantācijas pacienti [25,26]. MRNS, kas kodē GDF15, ekspresija tika uzlabota abos šūnu tipos pēc OTA iedarbības, kā parādīts 5.B attēlā. Šis OTA izraisītais efekts bija labvēlīgs fifibroblastiem, kad tuvumā atradās kanāliņu šūnas. Tomēr kanāliņu šūnās ekspresija nebija atkarīga no fifibroblastu klātbūtnes (5.B attēls).CDK2No ciklīna atkarīgā kināze 2 (CDK2) tika identificēta ar svērtās korelācijas tīkla analīzi kā galvenais OTA izraisītas šūnu cikla disregulācijas regulators [21]. Fifibroblastos monokultūrā OTA nemainīja CDK2 kodējošo mRNS ekspresiju. Turklāt kanāliņu šūnu klātbūtne neietekmēja mRNS ekspresiju. Tomēr kanāliņu šūnās OTA izraisīja nedaudz uzlabotu ekspresiju tikai fifibroblastu klātbūtnē (5.C attēls).
Glikogēns un ar glikozi saistītie proteīni: PYGM, GYS1 un GLUT1 (SLC2A1)Thenieresir iesaistīts arī glikozes homeostāzē un var nodrošināt organismu ar glikozi vai nu ar glikoneoģenēzi, vai mobilizējot glikogēna krājumus [27]. Glikogēna fosforilāzei (PYGM) ir nozīme glikogēna krājumu sadalīšanā, tādējādi mobilizējot glikozi [28]. Kā redzams 6.A attēlā, 48 stundu iedarbība uz 100 nM OTA izraisīja ievērojamu glikogēna fosforilāzi kodējošās mRNS ekspresijas palielināšanos, īpaši kanāliņu šūnās. Tomēr kanāliņu šūnās šis pieaugums nebija atkarīgs no kultivēšanas stāvokļa, turpretim fifibroblastos OTA izraisītā ekspresija bija augstāka kanāliņu šūnu klātbūtnē, salīdzinot ar stāvokli bez kanāliņu šūnām, glikogēna sintāze 1 (G^YSl) katalizē pretēju reakciju. un, tā kā fosforilāzes ekspresija tika regulēta, sintāzes ekspresiju regulēja OTA kanāliņu šūnās un fibroblastos kokultūrā (6.B attēls). Tas norāda uz OTA glikozi mobilizējošo efektu. Interesanti, ka arī OTA regulēja glikozes transportētāja GLUTl (SLC2A1) mRNS ekspresiju (6.C attēls), uzsverot ideju par palielinātu glikozes pieprasījumu OTA iedarbības dēļ, iespējams,
Ar mitohondrijiem saistītie proteīni: NDUFB10 un MRPS16
Ir pazīmes, ka OTA iedarbība var izraisīt mitohondriju potenciāla samazināšanosnieresšūnas [24], kas parāda, ka mitohondriju funkciju var ietekmēt OTA iedarbība, ko papildus var ietekmēt fibroblastu klātbūtne. Tāpēc, pārstāvot citas RNS, kas kodē mitohondriju proteīnus, mēs šeit parādām mRNS, kas kodē NDUFB10 un MRPS16, ekspresiju. NDUFBt0 kodē mitohondriju NADH: ubiquinone oksidoreduktāzes apakšvienību B10, kas ir daļa no mitohondriju elpošanas kompleksa I un ļoti izteikta sirdī unnieres(NCBI gēns. Pieejams tiešsaistē: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (aplūkots 2021. gada 17. martā)). MRPS16 gēns kodē mitohondriju ribosomu proteīnu S16, kam ir nozīme mitohondriju proteīnu sintēzē. Kā parādīts 7. attēlā, 24 stundu OTA iedarbība abos šūnu tipos izraisīja abu mRNS ekspresijas samazināšanos. Kanāliņu šūnās NDUFB10 gēna samazināto ekspresiju neietekmēja fibroblastu klātbūtne, savukārt fibroblastos OTA izraisītā NDUFB10 ekspresijas samazināšanās tika nedaudz izglābta kanāliņu šūnu klātbūtnē (7.A attēls). Kanāliņu šūnās jau pazeminātā gēna ekspresija, kas kodē mitohondriju ribosomu apakšvienību ar OTA, bija papildus zemāka fibroblastu klātbūtnē, turpretim fibroblastos kanāliņu šūnu klātbūtne izraisīja nedaudz augstāku MRPS16 mRNS ekspresiju (7.B attēls). Tas parāda, ka OTA var ietekmēt mitohondriju funkciju, bet OTA efektu var papildus modificēt, ja abi šūnu veidi atrodas tuvu viens otram.
Diskusija
Thenieresir apdraudētas ar dažādām nefrotoksiskām vielām ar akūtu vai hronisku riskunieru mazspēja[1]. Lai pētītu nefrotoksisko vielu ietekmi uz dažādiem šūnu tipiem un samazinātu apiešanos ar dzīvniekiem, šūnu kultūras ir plaši izmantotas. Šīm šūnu kultūrām ir papildu priekšrocība, ka var kontrolēt eksperimentālos apstākļus un izpētīt vielas specifisko iedarbību, izmantojot noteiktu šūnu tipu. Papildus šīm neapstrīdamajām priekšrocībām joprojām ir jāņem vērā daži apsvērumi: piemēram, "mājas orgānā" ir viens šūnu veids (piemēram, proksimālās kanāliņu šūnasnieres) ieskauj citi šūnu veidi (piemēram, fibroblasti) ar daudzveidīgu savstarpēju atkarību. Tāpēc reakcija uz vielu, kas novērota, izmantojot tikai vienu šūnu tipu, var nebūt tāda pati kā šūnu klātbūtnē oriģinālajos audos. Modelī, kas sastāv no diviem dažādiem žurku nieru šūnu tipiem, ir pierādīts, ka starp kanāliņu un fibroblastu šūnām pastāv savstarpēja saruna, kā rezultātā reakcijas parādās tikai tad, kad abi šūnu tipi bija tuvu kopā [20]. Tomēr, salīdzinot šī pētījuma rezultātus ar atklājumiem, kas novēroti, izmantojot cilvēka nieru kanāliņu šūnas, atklājas, ka žurku šūnas acīmredzami ir noturīgākas, nekā stāsta cilvēks, ņemot vērā to reakciju uz ārstēšanu ar visuresošu nefrotoksīnu ohrafoksīnu A (OTA) [7]. Tāpēc ir nepieciešams kopkultūras modelis, kas sastāv no cilvēka šūnām. Mēs izveidojām šādu modeli, izmantojot cilvēka proksimālo kanāliņu šūnu līniju HK2 un cilvēka fibroblastus. HK2 šūnas, kas izaudzētas uz filtra ieliktņiem un apvienotas ar fibroblastiem, audzētas 6-iedobes plāksnes apakšā. Pēc pamatparametru, piemēram, apoptozes un nekrozes, reģistrēšanas mēs izmantojām šo modeli, lai iegūtu sākotnējos datus par ohratoksīna A ietekmi uz dažu proteīnu un RNS, kas saistīti ar šūnu ciklu, EMT un šūnu metabolismu, darbību.
Šūnu izdzīvošana Pamatojoties uz olbaltumvielu saturu, šķita, ka ne OTA, ne kultūras stāvoklim nebija ievērojamas ietekmes. Tomēr attiecības starp apoptozi un nekrozi tika novirzītas uz nekrozi abos šūnu tipos, kad šūnas tika kultivētas kopā. Ir zināms, ka OTA izraisa apoptozi kanāliņu šūnās [29] un mazākā mērā arī fibroblastos [7]. Tas atspoguļojas arī pašreizējos rezultātos. Interesanti, ka attiecīgā cita veida šūnu klātbūtne izraisīja apoptozes ātruma samazināšanos abos šūnu veidos, bet palielināja LDH izdalīšanos. Šis ir pirmais mājiens, ka jau cita veida šūnu klātbūtne var ietekmēt šūnu darbību un ka šūnu reakcija uz toksisku vielu var atšķirties kopkultūrā, salīdzinot ar monokultūru.
Olbaltumvielu un RNS ekspresija Mēs paplašinājām savus pētījumus, nosakot proteīnu un RNS ekspresiju dažiem paraugam izvēlētiem proteīniem un RNS, kas tos kodē. Tā kā tika pierādīts, ka OTA ietekmē šūnu ciklu [21, 30], tika pētīta CDKN1A/p21 ekspresija. Saskaņā ar Dubourg et.al [21] atklājumiem OTA izraisīja ne tikai CDKN1A mRNS, bet arī CDKN1A/p21 proteīna ekspresiju kanāliņu šūnās. Šajās šūnās fibroblastu klātbūtne neietekmēja CDKN1A mRNS ekspresiju, savukārt fibroblastos bija redzams skaidrs kopkultūras efekts ar pastiprinātu mRNS pārpilnību, kas bija redzama tikai kopkultūrā. Tomēr šo mRNS pārpilnības pieaugumu pilnībā neatspoguļoja olbaltumvielu ekspresija, kas liecina par turpmākiem regulēšanas mehānismiem. Var pievienot šūnu cikla pētījumus, lai iegūtu papildu ieskatu par ietekmi uz šūnu ciklu. Tika konstatēts, ka no ciklīna atkarīgajai kināzei 2 (CDK2) ir nozīme OTA izraisītā šūnu cikla disregulācijā [21]. Kanāliņu šūnās tās mRNS ekspresiju pastiprināja OTA kopkultūrā, savukārt fibroblastus neietekmēja kanāliņu šūnas. Kopā rezultāti liecina, ka šūnu ciklu kanāliņu šūnās ietekmē fibroblastu klātbūtne.
COX2 ekspresijai fibroblastos tika novērots vēl viens kopkultūras efekts. Fibroblastiem kanāliņu šūnu klātbūtne izraisīja skaidri pastiprinātu olbaltumvielu ekspresiju (līdzīgi rezultātiem, kas novēroti žurku šūnās [20]), kas nebija redzama kanāliņu šūnām, kurām nebija nekādas kultūras atkarības. Tas norāda, ka fibroblastu loma iekaisumanieru slimībasvar būt nepietiekami novērtēts pētījumos, izmantojot fifibroblastus monokultūrā. Starpposma pavedienu proteīns vimentīns tiek konstitutīvi ekspresēts fibroblastos un arvien vairāk tiek ekspresēts epitēlija-mezenhimālās pārejas (EMT) laikā epitēlija šūnās [10]. Lai gan ir pierādīts, ka ilgstoša OTA iedarbība var izraisīt pastiprinātu kolagēna III vai fibronektīna ekspresiju kanāliņu šūnās [7], šajā pētījumā EMT indikējošā proteīna vimentīna ekspresija kanāliņu šūnās bija vēl zemāka pēc OTA iedarbības, neatkarīgi. kultūras apstākļiem. Turklāt fibronektīna mRNS un proteīna ekspresija bija diezgan zemāka un nepastiprinājās. Turklāt fibroblastos netika pierādīta izmainīta ekspresija, tāpēc šie atklājumi neatbalsta OTA izraisītu EMT, kā liecina citi [31].
CISTANČE UZLABOS NIeru/NIeru FUNKCIJU
Lai vēl vairāk pārbaudītu, vai kopkultūra var ietekmēt šūnu reakciju uz OTA izraisīto stresu, mēs noteicām dažu paraugā izvēlētu RNS ekspresiju, kas saistītas ar apoptozi-nekrozi, vēža attīstību un enerģijas metabolismu. Garām nekodējošām RNS ir nozīmīga loma daudzos šūnu regulēšanas procesos un to izkrišanā no sliedēm, kā arī nieru fibrozes vai vēža gadījumā [32]. WISP1-AS1 ir gara nekodējoša RNS, ko inducē OTA un ekspresē nieru audzēja šūnās [24]. Mēs atklājām, ka tā regulēšana ar OTA gan šūnu tipos, gan kopkultūrā uzlaboja augšupregulāciju. Tas ļauj pastiprināt WISP1-AS1 ietekmi uz apoptozes-nekrozes līdzsvaru un, iespējams, audzēja veidošanos. Līdz ar to pastiprināto LDH izdalīšanos, kas novērota kopkultūrā, vismaz daļēji var izskaidrot ar paaugstinātu WISP1-AS1 saturu, kas tika pierādīts kā nepieciešams OTA izraisītas nekrozes gadījumā [24].
WISP1-AS1bija arī aizdomas, ka tam ir nozīme metabolismā, tostarp mitohondria [24]. Kuņģa epitēlija šūnās tika pierādīts, ka OTA izraisa mitohondriju disfunkciju [33]. Priekšnieresšūnas, ir pretrunīgi rezultāti par to, vai OTA iedarbība ietekmē mitohondriju potenciālu vai nē [21, 24]. Samazināts mitohondriju potenciāls var būt mitohondriju darbības traucējumu rezultāts vai izraisīt mitohondriju bojājumus. Samazināta mitohondriju proteīnu ekspresija var izraisīt funkciju traucējumus, kas atspoguļojas vai kam seko mainīts mitohondriju potenciāls. Traucēta mitohondriju funkcija liek šūnai izmantot alternatīvus ceļus, lai nodrošinātu enerģijas piegādi. Enerģijas piegādi ar neatbilstošu mitohondriju ieguldījumu var uzturēt, pastiprināti izmantojot glikolīzi, kas palielina laktāta veidošanos. Tomēr HEK293 šūnās, cilvēka embrijanieresšūnu līniju, tika konstatēts, ka OTA drīzāk izraisīja glikolīzes samazināšanos un palielinātais laktāta daudzums, ko izraisa laktāta ražošana no glutamīna, bija atkarīgs no lncRNS WISP1-AS1 ekspresijas [24]. Turpretim kuņģa epitēlija šūnās varēja pierādīt, ka OTA iedarbība izraisa glikozes metabolisma pārprogrammēšanu uz glikolīzi un mazāku trikarbonskābes cikla aktivitāti [34]. Šeit mēs varam parādīt, ka (1) OTA samazina mRNS ekspresiju diviem reprezentatīvi izvēlētiem mitohondriju proteīniem, kuriem ir nozīme mitohondriju proteīnu sintēzē (MRPS16) un enerģijas ražošanā (NDUFB10), un (2) ka glikogēna apstrādes enzīmi tika regulēti. tādā veidā, ka var mobilizēt pastiprinātu glikozi (GYS1 uz leju un PYGM uz augšu). Turklāt šķiet, ka tiek izraisīta lielāka GLUT1 transportēšanas jauda. Tomēr šīs OTA izraisītās izmaiņas bija gandrīz neatkarīgas no audzēšanas apstākļiem.
Noslēgumā mēs esam parādījuši, ka kopkultūras apstākļos šūnu reakcija var atšķirties no reakcijām, kas novērotas monokultūrā, lai gan ne visi šeit pētītie parametri bija atkarīgi no kultūras. Tomēr, pamatojoties uz šeit sniegtajiem atklājumiem, ja iespējams, priekšroka jādod kopkultūras izmantošanai, tādējādi izvairoties no iespējas pārraudzīt ietekmi, kas nenotiek, ja tiek pētīts tikai viens šūnu tips. Paliek jautājums par to, kā šūnas sazinās savā starpā. Pētījumi ar žurku kopkultūras modeli atklāja COX2-atkarīgu mehānismu [20], un pelēm šķiet, ka retīnskābe piedalās šūnu savstarpējās sarunās.nieresšūnas [35]. Turklāt paliek jautājums, vai, kāpēc un kā OTA traucē šūnu enerģijas metabolismu un mitohondriju lomu tajā.
LDH un kaspāzes{0}} aktivitāšu un olbaltumvielu satura noteikšanaLīzei šūnas divas reizes nomazgāja ledusaukstā PBS buferšķīdumā, savāca un lizēja MOPSTriton buferšķīdumā (20 mM 3-(N-morfolino)propānsulfonskābe, pH 7,4, 0. 1 procents Triton X100). Olbaltumvielu saturs šūnu lizātos tika noteikts, izmantojot bicinhonīnskābi [36,37]. LDH aktivitāte barotnēs vai šūnu lizātos kā nekrozes mērs tika noteikta saskaņā ar Bergmeyer [38], kā detalizēti aprakstīts [20]. Kaspāzes -3 aktivitāte kā apoptozes mēraukla tika noteikta, izmantojot florigēno kaspāzes-3 substrātu (DEVD-AFC), kā aprakstīts [39]. Īsumā, 60 µL šūnu lizāta tika inkubēti ar 65 µL reakcijas buferšķīduma (20 mmol/L piperazīns-1, 4-bis(2etānsulfonskābe (PIPES), 4 mmol/L EDTA, 0,2 procenti {{26}). }[(3-holaminopropil)dimetilamonija]-1-propānsulfāts (CHAPS), 10 mmol/L ditiotreitola (DTT), pH 7,4), kas satur 42 µmol/L DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{) 36}}amino-4-trifluormetilkumarīns, gala koncentrācija) pie 37 ◦C. Sašķeltā produkta (AFC) fluorescence tika mērīta pie 400 nm ierosmes un 505 nm emisijas. Sašķeltā AFC kvantitatīvi noteica, izmantojot zināmu AFC kalibrēšanas līkni. koncentrācijas.
RT-PCR Kopējās ribonukleīnskābes (RNS) izolēšana tika veikta, izmantojot Trizol reaģentu (Life Technologies, Darmštate, Vācija). Šūnas tika mazgātas un pēc tam lizētas ar Trizol reaģentu un pārnestas reakcijas mēģenē. Pēc hloroforma pievienošanas un centrifugēšanas (12,000 × g) augšējā fāze tika savākta un sajaukta ar ledus aukstu izopropanolu. Pēc centrifugēšanas (12,000 × g) supernatants tika noņemts, granulas divas reizes nomazgātas ar 75% etanolu un visbeidzot izšķīdinātas ūdenī. Reversā transkripcija tika veikta, izmantojot komerciālu komplektu no Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV) saskaņā ar viņu norādījumiem. Reāllaika PCR tika veikta, izmantojot SYBR Green reaģentu (Invitrogen). Primerus sintezēja Microsynth AG, Balgach, Šveice. Praimeru sekvences ir parādītas 1. tabulā. Gēnu ekspresijas maiņa tika aprēķināta ar 2∆∆Ct metodi, izmantojot EEF2 un RPS17 ekspresiju kā atsauces. Šo divu gēnu ekspresija izrādījās mazāk izmainīta (ja vispār) RNS sekvencēšanas datos, salīdzinot OTA, kas apstrādāta ar neapstrādātām HK2 šūnām (nepublicēti rezultāti).
Western Blots Pēc olbaltumvielu atdalīšanas ar nātrija dodecilsulfāta-poliakrilamīda gēla elektroforēzi (SDS-PAGE) proteīni tika pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Pēc tam membrānas brīvās saistīšanās vietas tika bloķētas ar 5% beztauku sausa piena šķīdumu TRIS buferšķīdumā (3 mM TRIS bāzes, 140 mM NaCl, 0,17 mM Tris). -HCl, pH 7,4), kas satur 0,1 procentus Tween20. Tika pievienotas pirmās antivielas, kas atšķaidītas ar TRIS fizioloģisko šķīdumu un 5 procentiem liellopu seruma albumīna (TRIS-BSA, atšķaidījumus skatīt 2. tabulā), un membrānas inkubēja nakti. Pēc mazgāšanas 90 minūtes pievienoja ar fluorescenci saistītās sekundārās antivielas TRIS-BSA. Otro antivielu fluorescence tika reģistrēta, izmantojot LICOR noteikšanas sistēmu.
CISTANČE UZLABOS NIERU/NIeru SĀPES