Ceļš uz progresu ar vecumu saistītu neirodeģeneratīvo slimību preklīniskajos pētījumos: perspektīva uz grauzējiem un no HiPSC iegūtiem modeļiem 4. daļa

No hiPSC iegūtie PD in vitro modeļi ir arī bijuši ļoti informatīvi, lai noskaidrotu patofizioloģisko progresēšanu, kas saistīta ar ģimenes PD mutācijām pacientu atvasinātos hiPSC DA neironu modeļos.

PD ir neirodeģeneratīva slimība, kas parasti zināmā mērā ietekmē pacienta atmiņu un kognitīvās spējas. Tomēr, nepārtraukti attīstoties mūsdienu medicīnai, mēs varam izmantot dažādas metodes, lai palīdzētu pacientiem saglabāt labu atmiņu.

Pirmkārt, regulāras fiziskās aktivitātes var uzlabot PD pacientu kognitīvās spējas un atmiņu. Vingrojumi var veicināt smadzeņu nervu šūnu asinsriti un smadzeņu barošanu, kas palīdz uzturēt saikni un koordināciju starp dažādām smadzeņu daļām, tādējādi uzlabojot vispārējo kognitīvo līmeni.

Otrkārt, diēta ir arī atslēga PD pacientu atmiņas uzlabošanai. Diēta ar augstu šķiedrvielu, zemu tauku saturu un zemu holesterīna līmeni ir atslēga smadzeņu veselības uzturēšanai. Šī diēta var veicināt asinsriti smadzenēs un nodrošināt veselīgas barības vielas, kas var aizsargāt neironus un palēnināt PD progresēšanu.

Visbeidzot, pozitīva attieksme un pienācīga atpūta ir arī atslēga PD pacientu atmiņas uzlabošanai. Lai gan PD dos zināmu triecienu ķermenim un prātam, ja spējat saglabāt optimistisku attieksmi un nedaudz atpūsties, varat mazināt garīgo un psiholoģisko stresu un labāk saglabāt atmiņu.

Īsāk sakot, lai gan PD ietekmēs atmiņu, tas nenozīmē, ka mēs nevaram veikt izmaiņas. Izmantojot atbilstošus vingrinājumus, diētu un psiholoģisko pārvaldību, PD pacienti var uzturēt noteiktu kognitīvo spēju un atmiņas līmeni. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche var ievērojami uzlabot atmiņu, jo Cistanche ir tradicionāls ķīniešu ārstniecības materiāls ar daudziem unikāliem efektiem, no kuriem viens ir atmiņas uzlabošana. Cistanche iedarbība rodas no dažādām tajā esošajām aktīvajām sastāvdaļām, tostarp miecskābes, polisaharīdiem, flavonoīdu glikozīdiem utt. Šīs sastāvdaļas var dažādos veidos veicināt smadzeņu veselību.

Noklikšķiniet uz zināt 10 veidus, kā uzlabot atmiņu

Piemēram, no hiPSC iegūtajiem neironiem no pacienta ar LRRK2 GS2019S mutāciju bija ar slimību saistīti šūnu fenotipi, tostarp paaugstināta neaizsargātība pret oksidatīvo stresu170 un samazināts neirīta garums un skaits.171

Citi piemēri ir no hiPSC iegūti DA neironi, kas iegūti no pacientiem ar PARK2 mutāciju, kam bija mitohondriju disfunkcija un oksidatīvā stresa morfoloģija172, un no hiPSC iegūtie neironi ar A53T mutāciju un SNCA trīskāršību, kas uzrāda raksturīgo pazīmju paaugstināšanos un a-syna3 agregātu uzkrāšanos.

Turklāt vairāki pētījumi uzlaboja šos slimību fenotipus, veicot intervences, kuru mērķis bija koriģēt mutācijas gēnu, tostarp LRRK2,174PINK1,175 SNCA,140,176 un GBA1.177. Šādi modeļi parāda hiPSC tehnoloģijas lietderību jaunu zāļu mērķu identificēšanā un validācijā un sniedz pierādījumus gēnu terapijas pieejām.

No hiPSC iegūtie modeļi dažādiem NDD kopš tā laika ir paplašināti līdz dažādām kopkultūras 2D un 3D konfigurācijām, paplašinot modularitāti un potenciālos pamatpētījumus un preklīniskos lietojumus.

Pašreizējās hiPSC atvasināto NDD modeļu 2D vienas un kopkultūras šūnu modeļu konfigurācijas

Pēdējā desmitgadē ir publicēts ievērojams daudzums darbu, izmantojot 2D kultūras, kas sastāv no hiPSC atvasinātiem atsevišķiem šūnu tipiem. Šie vienas šūnas tipa modeļi ir bijuši informatīvi, atklājot atsevišķu šūnu populāciju lomu NDD, piemēram, mugurkaula muskuļu atrofijā, 178 179 AD, PD un amiolaterālajā sklerozē (ALS)180 (1. attēls), un turklāt ir ļāvuši labāk. izpratne par to, kā ar slimībām saistīti gēni darbojas bioloģiskā līmenī, lai ietekmētu šūnu traucējumus.

hiPSC šūnu modeļi ir pieņemti darbā AD pētījumos, lai labāk izprastu ģenētisko polimorfismu un mutāciju lomu atsevišķās šūnu populācijās un to, kā tie var veicināt vai ietekmēt slimību. HiPSC balstītā ADmodelī Kondo et al.181

novēroja palielinātu Ab oligomēru uzkrāšanos, kas saistīta ar palielinātu endoplazmatiskā tīkla disfunkciju un oksidatīvo stresu hiPSC atvasinātajos neironos un astrocītos, kas iegūti no sAD un fAD pacientiem, kuri satur APP E693D mutāciju. HiPSC iegūtie 2D individuālie modeļi ir arī izrādījuši lielu vērtību, pētot APOEε4, kas ir lielākais un visvairāk replikējams AD ģenētiskais riska faktors, ģenētisko ieguldījumu dažādos nervu šūnu modeļos.182

Lins un kolēģi183 izmantoja 2D kultūras, lai atklātu, ka izogēnajiem hiPSC iegūtajiem APOEε4 astrocītiem ir liela mēroga izmaiņas gēnu ekspresijā saistībā ar holesterīna uzkrāšanos un Ab42 internalizāciju, kuras abas ir kritiskas astrocītu homeostatiskās funkcijas attiecībā pret izogēnajām APOEε3 šūnām. Turklāt izogēnajiem ε4 astrocītiem bija samazināta spēja ekspresēt un izdalīt APOE, kā rezultātā samazinājās lipidācija.

Pastiprināta neirīta augšana gan garuma, gan skaita neironos, papildus pastiprinātai Ab sekrēcijai, tika konstatēts, ka šajos modeļos patogēni ir arī inogēnie APOEε4 neironi.183

Veidojot astrocītu kultūras, kas iegūtas no neirotipiskiem indivīdiem, kuri ir izogēni pret APOEε3 un APOEε4 alēlēm, Zhao et al.161 atklāja, ka APOEε4 astrocītiem ir zemāks APOE lipidācijas statuss, salīdzinot ar veselām APOEε3 kontrolēm, vēl vairāk izceļot no šādiem modeļiem gūto ieskatu.

2D kopkultūru izmantošana ir arī ļāvusi izpētīt APOEε4 atsevišķu šūnu populāciju un šūnu un šūnu mijiedarbības kontekstā un to, kā tās var veicināt AD patoģenēzi.

Turpinot iepriekš minēto eksperimentu, no hiPSC atvasinātos APOEε4 astrocītus kultivējot kopā ar neironiem, tika apdraudēta neironu morfoloģiskā un funkcionālā integritāte un tika pierādīta nobriešanas kavēšana, salīdzinot ar to izogēnajām ε3 kontrolēm.161

Dažādu neironu un glia šūnu mijiedarbībai ir izšķiroša nozīme AD un PD attīstībā un progresēšanā, tādējādi izmantojot hiPSC tehnoloģiju, lai izveidotu in vitro modeļus, kas atdarina šūnu un šūnu mijiedarbību, un šūnu mikrovide ir izrādījusies ļoti informatīva.

2D atsevišķo un kopkultūras modeļu priekšrocības ir līdzīgi realizētas, pētot vairāku PD izraisošu mutāciju ieguldījumu ar slimībām saistītos šūnu fenotipos, piemēram, samazinātā šūnu dzīvotspējā un mitohondriju disfunkcijā.

To pirmo reizi gudri pierādīja Nguyen et al.,170 kuri parādīja, ka PD pacientu radītie hiPSCneironu modeļi ar LRRK2 G2019S mutāciju uzrāda paaugstinātu sintēzes līmeni, oksidatīvā stresa reakcijā iesaistīto gēnu regulēšanu, kā arī paaugstinātu jutību pret H2O{{ 6}}izraisīts oksidatīvais stress un šūnu nāve.

Līdzīgi Sánchez-Danés et al.171 novērtēja autofagijas izmaiņas DA neironos, kas iegūti no PD pacienta hiPSC, kam bija LRRK2 G2019S mutācija, un novēroja paaugstinātu a-sinandas autofagisko disfunkciju.

Labāka izpratne par to, kā šūnu mijiedarbība ir patofizioloģijas pamatā, ir panākta ar hiPSC atvasinātām kopkultūras modeļu sistēmām. Piemēram, tika pierādīts, ka hiPSC iegūtie astrocīti nodrošina aizsargājošu labumu kokultivētās nervu cilmes šūnās (NPC), kas iegūtas no PD pacientiem pēc mitohondriju toksīnu, rotenona un kālija cianīda iedarbības, ko pierādīja diferenciācijas deficīta un mitohondriju disfunkcijas glābšana.184

Citā pētījumā tika izmantotas neironu un astrocītu kopkultūras, lai izpētītu PD izraisošās LRRK2G2019S mutācijas ietekmi uz neironu un astrocītu šķērsrunu. Autori ziņoja, ka kontroles hiPSC iegūto DA neironu kopkultūra ar pacienta atvasinātiem astrocītiem, kas satur G2019S mutāciju, izraisīja neirodeģenerāciju un a-syn uzkrāšanos DA neironos.185

Šis pētījums parādīja kopkultūru lietderību, pārbaudot dažādas gēnu varianta / mutācijas kombinācijas pēc šūnu veidiem, lai atklātu šūnu-šūnu mijiedarbību un šūnu tipus, kas rada ar slimību saistīto variantu patogēno efektu.

Tomēr 2D kopkultūras veido mikrovidi mijiedarbībai starp dažādiem smadzeņu šūnu tipiem, un to spēja modelēt smadzeņu kā trīsdimensiju audu sarežģītību joprojām ir ierobežota, un tādēļ tām ir raksturīgi šķēršļi tulkošanas nozīmei.

3D hiPSC atvasināti modeļi

Jaunās tehnoloģijas ir ļāvušas pētniekiem sākt ģenerēt un novērtēt 3D hiPSC atvasinātus NDD modeļus, tostarp kopkultūras un organoīdus, kas ir gan bioķīmiski, gan fizioloģiski izturīgi. Organoīdu modeļi. Cilvēka smadzeņu 3D organoīdu modeļu mērķis ir pēc iespējas precīzāk uztvert cilvēka smadzeņu sarežģīto telpisko organizāciju in vitro modelī.

Šie smadzeņu organoīdi, kas iegūti no hiPSC, ir pašorganizēti un pašizveido 3D. Papildus vispārējiem epigenomiskiem un transkripcijas raksturlielumiem186187 3D organoīdu modeļu fizioloģiskās īpašības, piemēram, neironu reakcija uz glutamātu, instinktīva Ca2+ signalizācija un šūnu nobriešanas fenotipu attīstība, arī precīzi atspoguļo cilvēka smadzeņu audus. .188–190

Jaunākie pētījumi ir radījuši un raksturojuši no AD un PD 3D hiPSC atvasinātus modeļus, kuriem ir pierādīts, ka tiem ir ļoti reproducējami patoloģiskas pazīmes.

Piemēram, Gonzalez et al.191 izstrādāja ADbrain organoīdu modeli, kas uzrādīja pakāpenisku Ab peptīda uzkrāšanos ar plāksnēm līdzīgām struktūrām un amiloidogēnām īpašībām, kā arī fosforilētu tau un NFT parādīšanos.

Linet al.183 paplašināja šos atklājumus, ieviešot izogēnās APOEε3- vai APOEε4-mikroglijām līdzīgas šūnas iepriekš izveidotos smadzeņu organoīdos, kas kultivēti no hiPSC, kas satur ar AD saistītu APP dublēšanās mutāciju, un novēroja ievērojami ilgu procesa veidošanos. APOEε4 mikroglijām līdzīgās šūnās, salīdzinot ar APOEε3 kontrolēm, kas liecina par ierobežotām maņu un reaģēšanas spējām uz ārpusšūnu Ab.

Pavisam nesen Zhao et al.192 ģenerēja smadzeņu organoīdu modeļus, izmantojot hiPSC, kas iegūti no AD pacientiem un veselām kontrolēm ar dažādiem APOE genotipiem. APOEε4 organoīda modelis uzrādīja ar slimību saistītus fenotipus, salīdzinot ar APOEε3 organoīdu, kas iegūts no cita donora, un izogēno APOEε3 organoīda modeli, kas izveidots, rediģējot APOEε4 līnijas genomu.

APOEε4 genotipa nelabvēlīgā ietekme organoīdu modelī apkopoja galvenās AD patoloģiskās pazīmes, tostarp sinaptiskās integritātes zudumu, apoptotisko šūnu nāvi, Ab un fosforilētā tau uzkrāšanos un paaugstinātu šķīstošo APOE līmeni, tādējādi parādot sistēmas piemērotību ne-fAD modelēšanai.

Turklāt šie rezultāti sniedz papildu atbalstu APOEε4 patogēnajai lomai AD un tā potenciālam kā ārstnieciskam mērķim AD.192 Tāpat Smitset al.193 izveidoja funkcionālu vidussmadzeņu DA organoīdu PD modeli, kas iegūts no PD pacienta audiem, kas satur LRRK GS2019 mutāciju.

Šis organoīda modelis ražoja un izdalīja DA un veiksmīgi demonstrēja saistītās organoīdos raksturīgas patoloģijas, piemēram, samazinātu vidējo smadzeņu DA neironu daudzumu un sarežģītību193. Tomēr GT pieeja, kas koriģēja LRRK mutāciju, nebija pietiekama, lai šajā modelī uzlabotu slimības fenotipus.

Bologninet al.194 arī izveidoja 3D DA neironu modeli, kas iegūts no PD pacienta ar LRRK2 G2019S mutāciju, kam bija mitohondriju disfunkcijas pazīmes un mainīta morfoloģija, samazināta DA diferenciācija un sazarojuma sarežģītība, kā arī paaugstināta priekšlaicīga šūnu nāve, salīdzinot ar jauno neironu kontroles līnijām; daži no šiem traucējumiem tika izglābti, ievadot LRRK2 inhibitoru 2 (Inh2).

Tomēr ir svarīgi atzīmēt dažādus ierobežojumus, par kuriem ziņots, izmantojot 3D organoīdu modeļus, jo īpaši attiecībā uz spontānu un nekontrolētu šūnu augšanas un diferenciācijas veidu, kas veicina starpeksperimentālo mainīgumu.

Spontānas pašsavienošanās paļaušanās uz organoīdiem modeļiem var izraisīt dažādu modeļu variācijas, tostarp neviendabīgas šūnu proporcijas, telpisko orientāciju un slimības fenotipu, padarot reproducējamību par svarīgu problēmu 3D-kokultūras un organoīdu modeļos.195

Tomēr nesenie sasniegumi liecina par 3D organoīdu modeļu reproducējamības uzlabošanos, 196 terminālo šūnu identitātes mainīgums joprojām ir 195 un ir paredzams nepārtraukts progress.

Kopkultūras sistēmas. Jaunākie biotehnoloģijas sasniegumi ir ļāvuši radīt sarežģītas trīsdimensiju sastatnes, kas ļauj no hiPSC atvasinātām šūnām augt kopkultūras modeļos, kas atvieglo kontrolētāku pieeju salīdzinājumā ar iepriekš apspriestajiem organoīdiem, jo ​​īpaši attiecībā uz šūnu tipu, nobriešanu, sastāvu un viendabīga šūnu ekspozīcija.197

Esošie uz kopkultūru balstīti modeļi ietver motorneironu un neiromuskulārā savienojuma modeļus, kas iegūti no ALS pacientiem; 180 DA neironi no PD pacientiem ar zināmām mutācijām (piemēram, LRRK2194); neironu, astrocītu un mikrogliju trīsšūnu modeļi, kas modelē neiroiekaisuma AD vidi;198 un skeleta muskuļu audi.199

Šie modeļi nodrošina pētniekiem uzlabotus rīkus, lai izpētītu telpisko audu organizācijas-šūnu-šūnu un šūnu-matricas savienojumu lomu, kam ir galvenā loma NDD patoģenēzē. Nesenā pētījumā, ko veica Blanchard et al.200, tika izveidots no hiPSC atvasināts BBB 3D kopkultūras modelis, kas sastāv no smadzeņu endotēlija šūnām, astrocītiem un pericītiem, lai ar augstu precizitāti modelētu AD asinsvadu patoloģijas.

Šis 3D modelis atklāja pericītu galveno lomu APOEε4-atvasinātajās šūnās, kas uzrādīja paaugstinātu Ab peptīdu un fibrilu amiloīda BBB uzkrāšanos palielinātas NFAT-kalcineirīna pericītu signalizācijas rezultātā.

200 Park et al.198 arī izstrādāja hiPSC 3D tri-cultureAD modeli, kas sastāv no neironiem, astrocītiem un mikroglijām mikrofluidiskā platformā, kas veiksmīgi apkopo raksturīgās AD īpašības, tostarp Ab agregātu fosforilētā tau uzkrāšanos, kā arī neiroiekaisuma pazīmes, piemēram, mikrogliju veidošanās, slāpekļa oksīda izdalīšanās un sekojošais oksidatīvais stress.

Lai gan 3D kopkultūras sistēmu mērķis ir pārvarēt iepriekš minētos ierobežojumus, kas novēroti organoīdu modeļos, tām ir arī neveiksmes. Pašreizējie hiPSC atvasinātie modeļi rada neironu tīklus, kuriem trūkst kritisko smadzeņu audu īpašību, ko tie cenšas attēlot, tostarp vaskularizācijas un nepieciešamās barības vielu cirkulācijas un vielmaiņas atkritumu izvadīšanas trūkumu201, kā arī mainīgumu neironu un glia šūnu bioloģiski reprezentatīvu proporciju radīšanā. populācijas, iezīmes, kas ir apšaubāmas stiprās puses 3D organoīdu kultūru izmantošanā.

Turklāt 3D kopkultūras modeļiem ir nepieciešamas mākslīgas sastatnes un secīga šūnu iesēšana, savukārt organoīdu modeļi ir izstrādāti vairāk "dabiski". Neskatoties uz to, no hiPSC atvasināto kopkultūru izmantošana ļauj pētniekiem ne tikai izpētīt katra šūnu tipa aktīvo lomu AD un PD slimību īpašību veidošanā, bet arī no dažādiem genotipiem iegūto šūnu mijiedarbību, izceļot revolucionāro rīku komplektu, ko pārstāv hiPSC. NDD molekulārā izpēte.

Uz hiPSC balstītu in vitro modeļu priekšrocības un ierobežojumi ir sīkāk izpētīti nākamajā sadaļā.

For more information:1950477648nn@gmail.com