lvValoda
Mājas / Zināšanas / Saturs

Zināšanas

Proteāze Calpain2a ierobežo iedzimto imunitāti, mērķējot uz TRAF6 Teleost Fish.

Dec 19, 2023

Ar TNF receptoriem saistītajam faktoram 6 (TRAF6) ir galvenā signāla pārraides loma gan antibakteriālajos, gan pretvīrusu signalizācijas ceļos. Tomēr mazāk ziņots par TRAF6 regulēšanas mehānismiem zemākiem mugurkaulniekiem. Šajā pētījumā mēs identificējam calpain2a kā no kalcija atkarīgo proteāžu saimes locekli ar unikālu hidrolītisko enzīmu aktivitāti un darbojas kā galvenais antibakteriālās un pretvīrusu imunitātes regulators teleostu zivīs. Pēc lipopolisaharīda (LPS) stimulācijas calpain2a notriekšana veicina iekaisuma citokīnu regulēšanu. Mehāniski calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6 un samazina TRAF6 proteīna līmeni, hidrolizējot. Pēc fermentatīvās aktivitātes zaudēšanas mutants calpain2a konkurētspējīgi kavē TRAF6 dimēra veidošanos un auto-ubikvitināciju. Calpain2a iznīcināšana veicina arī šūnu pretvīrusu reakciju. Mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, nomāc IFN regulējošā faktora (IRF) ubikvitināciju 3/7 no TRAF6. Kopumā šie atklājumi klasificē calpain2a kā iedzimtu imūnreakciju negatīvu regulatoru, mērķējot uz TRAF6 teleostu zivīs.

Desert ginseng-Improve immunity (2)

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Iedzimtajai imunitātei kā pirmajai aizsardzības līnijai pret iebrukušiem patogēniem ir svarīga loma ķermeņa aizsardzībā no baktēriju invāzijas un vīrusu infekcijām. Modeļa atpazīšanas receptori (PRR) uz membrānas nekavējoties atpazīst ar patogēniem saistītus molekulāros modeļus (PAMP) 1–3. Trīs visplašāk pētītie PRR iedzimtajā imunitātē ir Toll-like receptors (TLR), RIG-I līdzīgi receptori (RLR) un NOD līdzīgi receptori (NLR), kas atpazīst dažādus PAMP un izraisa signālu kaskādes, lai aktivizētu proinflammatoriskus citokīnus un pretvīrusu faktors 4-6. Ar TNF receptoriem saistītais faktors (TRAF) 6 ir neaizstājama sastāvdaļa cīņā pret baktēriju invāziju un vīrusu infekcijām. Kā svarīgs signāla ceļš, ko aktivizē lipopolisaharīds (LPS), kodola transkripcijas faktora-κB (NF-κB) ceļš ir detalizēti izplānots. Lielākā daļa olbaltumvielu funkciju NF-κB signalizācijas ceļā ir plaši pētītas 1, 7 . Mieloīdo diferenciācijas faktoru 88 (MyD88) vispirms aktivizē TLR, reaģējot uz LPS, un IRAK4 darbojas kā starpnieks, aktivizējot IRAK1 un IRAK2, kas saista MyD88 ar TRAF68–11. Ubc13 un Uev1A katalizē K63-saistīto TRAF6 ubikvitināciju, kas pārnes K63 ubikvitīna ķēdi uz TAB2 un TAB3, izraisot TAK112–16 aktivāciju. TRAF6-regulētais IKK aktivators 2 (TRIKA2), kas sastāv no TAK1, TAB1 un TAB2, aktivizē IκB kināzes (IKK)/fosforilācijas inhibitoru17–19. Transkripcijas faktors NF-κB iekļūst kodolā un veicina iekaisuma citokīnu veidošanos20. Kad TLR7/9 atpazīst vīrusu, MyD88- IRAKs-TRAF6 komplekss pārraida signālus uz IFN regulējošo faktoru (IRF) 7, veicina IRF7 ubikvitināciju un aktivizē tā fosforilēšanos kodolā21,22. RLR signalizācijas ceļā RIG I un ar melanomas diferenciāciju saistītais gēns 5 (MDA5) aktivizē mitohondriju pretvīrusu signalizācijas proteīnu (MAVS) 23, 24. MAVS agregācija ir svarīga RLR signāla pārraides sākuma iezīme23,25,26. TRAF2/3/6 ir pirmie faktori, ko aktivizē MAVS27,28. TRAF3 aktivizēs TBK1-IRF3 signalizāciju, un MAVS-TRAF6 komplekss aktivizēs NF-κB signalizāciju, kas veicina IFN-1 ekspresiju27,29.

Desert ginseng-Improve immunity (12)

cistanche priekšrocības vīriešiem - stiprina imūnsistēmu

TRAF6 aktivācijas molekulārais mehānisms jau ir pierādīts. TRAF6 dimēra formā tiek pakļauts autoubikvitinācijai Ubc13 un Uev1A katalīzes laikā, kas ir saistīts ar gredzenveida pirkstu domēnu un ZF pirkstu domēnu. TRAF6 / Ubc13 ~ UB modelis apstiprina TRAF6 dimēra svarīgo lomu K63 ubikvitīna ķēdes agregācijā un pārraidē30. Turklāt ir ziņots, ka gredzenveida pirkstu un ZF pirkstu domēns piesaista E2 ~ ub konjugātus zebrafish TRAF6 kristāla modelī, un tika atklāts, ka TRAF6 pirmo reizi var veidot heterodimēru ar TRAF5 no tās pašas TRAF saimes16. Deubikvitinācijas saimes proteīni: A20, CYLD, USP2a, USP4 un USP20 ir vērsti uz TRAF6, lai novērstu K63-saistīto ubikvitināciju un samazinātu pakārtoto signalizāciju31–35. Rauga divu hibrīdu sistēma pārbauda mijiedarbību starp UBE2O un TRAF6 un apstiprina, ka šī mijiedarbība tieši ietekmē TRAF6 aktivizēšanu, izmantojot MyD8836. TRAF6 pakārtotajā signāla pārraides procesā ECSIT kā starpprodukta proteīns mijiedarbojas attiecīgi ar TRAF6 un TAK1, un šī mijiedarbība pastiprina TRAF6 un TAK137 saistīšanos. LPS inducētā TLR4 signalizācijā PRDX neļauj TRAF6 pieņemt darbā ECSIT, lai piegādātu K63 ubikvitīna ķēdi, kā arī inhibē BECN1, ko autofagijas ceļā aktivizē TRAF638. MST4 aktivizē TRAF6 fosforilāciju pie Thr463 un Thr486 un kavē TRAF6 dimerizāciju un ubikvitināciju39. Zīdītājiem TRAF6 proteīnu regulēšanas mehānisms ir plaši pētīts antibakteriālajā un pretvīrusu imunitātē. Tomēr TRAF6 pētījumi zemākiem mugurkaulniekiem ir mazāk pētīti. Imūnās atbildes reakcija teleostu zivīs galvenokārt balstās uz TLR un RLR ceļiem, lai veiktu imūnreakciju pēc patogēna infekcijas. Tāpēc ir ļoti svarīgi izpētīt TRAF{47}}mediēto signalizācijas ceļu regulēšanas mehānismu. calpain2 (m-calpain) ir no kalcija atkarīgu proteāžu saime, kas sastāv no vairāk nekā 16 locekļiem zīdītājiem un daudziem citiem organismiem40. Agrākais pētījums par kalpaīna proteīnu saimi ir saistīts ar šūnu kustību41. kalpaīns veicina šūnu migrāciju un tika konstatēts, ka tas kavē neitrofilu migrāciju un p38 MAPK un ERK MAPK42 aktivāciju. Hidrolāzes aktivitāte ir viena no svarīgākajām kalpaīna funkcijām. Imunitātes regulēšanā kalpaīns{56}} veicina NF-κB izdalīšanos, hidrolizējot IkB, un aktivizē signalizācijas ceļu43. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6 un darbojas kā negatīvs regulators antibakteriālajās un pretvīrusu reakcijās teleostām zivīm, miiuy croaker (Miichthys miiuy). calpain2a veicina TRAF6 proteīna līmeņa degradāciju, izmantojot hidrolāzes aktivitāti. Tikmēr mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, kavē K63 ubikvitīna ķēdes veidošanos, inhibējot TRAF6 dimēru. Tiek atspoguļots, ka gan calpain2a, gan mutants calpain2a pārtrauc TRAF6 ubikvitināciju uz ECSIT / BENC1 / IRF3 / IRF7. calpain2a aptur NF-κB un IFN signalizācijas procesu, mērķējot uz TRAF6. Mūsu rezultāti nodrošina molekulu TRAF{75}}mediētās imūnregulācijas pētīšanai zemākiem mugurkaulniekiem.

Rezultāti

calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6 un negatīvi regulē NF-κB signālu pārraidi.

Lai gūtu ieskatu par TRAF{0}}saistītajiem proteīniem iedzimtajā imunitātes reakcijā teleostām zivīm, mēs raksturojām miiuy croaker TRAF6 mijiedarbību, izmantojot afinitātes attīrīšanu un masas spektrometriju. Sakārtoti pēc bez etiķetes kvantifikācijas (LFQ) intensitātes, mēs pārtvērām daļu datu un parādījām tos (1.a attēls). No TRAF6-saistītajiem proteīniem calpain2a, iespējams, regulēja TRAF6 aktivitāti un ietekmēja TRAF6-mediētos signalizācijas ceļus. Pirmkārt, ir jāizpēta saistība starp calpain2a un TRAF6 olbaltumvielu līmenī, mēs pārbaudījām calpain2a mijiedarbību ar TRAF6 Miiuy croaker nieru šūnu līnijās (MKC). Endogēni koimunoprecipitācijas eksperimenti liecināja, ka calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6 (1.b, c att.). Kā liecina pārejošas transfekcijas un koimunoprecipitācijas eksperimenti, pārmērīgi ekspresēts calpain2a un TRAF6 mijiedarbojās viens ar otru (1.d, e att.). Tas viss liecina, ka calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6, un ir nepieciešami turpmāki eksperimenti, lai izpētītu to darbības mehānismu. Cilvēka, peles, zebrafish un var calpain2a proteīnu vairāku secību izlīdzināšanas rezultātā calpain2a ir evolucionāri saglabājies starp zivīm un zīdītājiem (1. fig.). Lai noteiktu calpain2a funkciju iedzimtajā imunitātē, mēs pārbaudījām, vai calpain2a ir saistīts ar NF-κB aktivāciju, ko izraisa LPS stimulācija. Mēs transfektējām epithelioma papulosum cyprinid (EPC) šūnas ar NF-κB luciferāzes reportieri, iekšējās kontroles renilla luciferāzes reportieri un vektoru, kas kodē calpain2a vai tukšu vektoru. calpain2a būtiski samazināja NF-κB reportiera aktivitāti pēc LPS stimulācijas no devas atkarīgā veidā (1.g attēls). Turklāt proinflammatoriskie citokīni, piemēram, IL-1 un IL-8 promotors, kas reaģē uz LPS stimulāciju, tika ievērojami samazināti kalpain2a pārmērīgi ekspresētās EPC šūnās (1.h, i att.), kas liecina par iespējamu kalpain2a lomu iekaisuma signalizācijā. ceļi, ko izraisa LPS stimulācija.

Desert ginseng-Improve immunity (23)

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Negatīva LPS izraisītas NF-κB signalizācijas regulēšana ar kalpaīnu2a.

Lai izpētītu calpain2a iespējamo lomu NF-κB signalizācijā, mēs transfektējām calpain2a MKC ar LPS laika gradientu un novērtējām proinflammatoriskos citokīnus, kas reaģē uz LPS. Pārmērīga kalpain2a ekspresija izraisīja IL-1, IL-8 un IL-6 ekspresijas pazemināšanos (2.a attēls). Tālāk mēs izstrādājām divas calpain2a specifiskas mazas traucējošas RNS (siRNS), kas efektīvi pazemināja calpain2a (2.b, d att.). Kalpain2a iznīcināšana ievērojami uzlaboja LPS izraisītos proinflammatoriskos citokīnus, tostarp IL-1 un IL-8 MKC un Miiuy croaker zarnu šūnu līnijās (MIC) (2.c un e attēls). LPS stimulēto šūnu grupā calpain2a notriekšana uzlaboja šūnu proliferāciju. Tāpat, ja nebija stimulācijas, mēs atklājām, ka calpain2a notriekšana arī uzlaboja šūnu proliferāciju (2. att.). Lai noteiktu, vai calpain2a inhibēja proteīnus LPS inducētā NF-κB signalizācijā, calpain2a ievērojami inhibēja TRAF6 endogēno proteīnu līmeni, bet ne MyD88, IRAK4 vai TAK1 (2.g attēls). Rezumējot, calpain2a un proinflammatorisko citokīnu ekspresijas kinētika liecināja par calpain2a funkcionālu iesaistīšanos LPS izraisītā NF-κB signalizācijā.

Fig. 1 calpain2a interacts with TRAF6 and inhibits the NF-κB Signaling Pathway. a List of TRAF6 interactome based on Label-free quantification intensity (section). b, c MKC cells seeded in 6 cm2 dishes. After 24 h, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-TRAF6 or anti-calpain2a affinity gels. Then the immunoprecipitates and cell lysates were analyzed by IB with the anti-TRAF6 and anti-calpain2a Abs, respectively. d, e HEK 293 cells seeded in 6 cm2 dishes were transfected with the plasmids calpain2a-Flag and TRAF6-Myc (2 μg each). After 24 h, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Myc d or anti-Flag e affinity gels. Then the immunoprecipitates and cell lysates were analyzed by IB with the anti-Myc and anti-Flag Abs, respectively. f The same amino acids among human calpain2a (Hu-calpain2), mouse calpain2a (Mu-calpain2), zebrafish calpain2a (ZF-calpain2a) and miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) are highlighted with black background. g–I EPC cells were transfected with calpain2a-Flag or empty vector together with the NF-κB, IL-1β, and IL-8 luciferase reporters. At 24 h post-transfection, cells were untreated (Mock) or treated with LPS for 6 h. The luciferase activity value was achieved against the Renilla luciferase activity (n = 3 per group). Western blot analysis was used to measure the expression of the transiently transfected calpain2a Flag. The expression of Tubulin was used as a loading control. Data were analyzed by two-way ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. All experiments were performed in at least three independent experiments.


1. att. calpain2a mijiedarbojas ar TRAF6 un inhibē NF-κB signalizācijas ceļu. TRAF6 mijiedarbības saraksts, kura pamatā ir kvantitatīvas noteikšanas intensitāte bez etiķetes (sadaļa). b, c MKC šūnas, kas iesētas 6 cm2 trauciņos. Pēc 24 stundām šūnu lizāti tika imūnprecipitēti (IP) ar anti-TRAF6 vai anti-calpain2a afinitātes gēliem. Pēc tam imunoprecipitātus un šūnu lizātus analizēja ar IB attiecīgi ar anti-TRAF6 un anti-calpain2a Abs. d, e HEK 293 šūnas, kas iesētas 6 cm2 trauciņos, tika transficētas ar plazmīdām calpain2a-Flag un TRAF6-Myc (katra 2 ug). Pēc 24 stundām šūnu lizāti tika imūnprecipitēti (IP) ar anti-Myc d vai anti-Flag e afinitātes gēliem. Pēc tam imunoprecipitāti un šūnu lizāti tika analizēti ar IB ar attiecīgi anti-Myc un anti-Flag Abs. f Tās pašas aminoskābes cilvēka calpain2a (Hu-calpain2), peles calpain2a (Mu-calpain2), zebrafish calpain2a (ZF-calpain2a) un miiuy croaker calpain2a (M-calpain2a) ir izceltas ar melnu fonu. g-I EPC šūnas tika transficētas ar calpain2a-Flag vai tukšu vektoru kopā ar NF-κB, IL-1 un IL-8 luciferāzes reportieriem. 24 stundas pēc transfekcijas šūnas netika apstrādātas (Mock) vai apstrādātas ar LPS 6 stundas. Luciferāzes aktivitātes vērtība tika sasniegta pret Renilla luciferāzes aktivitāti (n=3 katrā grupā). Lai izmērītu īslaicīgi transfektētā calpain2a karoga ekspresiju, tika izmantota Western blot analīze. Tubulīna ekspresija tika izmantota kā iekraušanas kontrole. Dati tika analizēti ar divvirzienu ANOVA (g, h, i). **p < 0.01. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos.

Calpain2a mijiedarbība ar TRAF6.

Domēna analīze tika veikta, izmantojot Conserved Domain Database (CDD) NCBI. calpain2a ietver trīs domēnus: Calpain ģimenes cisteīna proteāzes (CysPc) domēnu (aa 46-339), centrālo Kalpaina lielās apakšvienības III domēnu (aa 360-499) un C-termināla Penta-EF rokas domēnu ( aa 500-697). Lai noteiktu, kurš(-i) calpain2a domēns(-i) ir nepieciešams(-i) mijiedarbībai ar TRAF6, mēs izveidojām trīs saīsināšanas mutantus: calpain2a (1-339), calpain2a (340-697) un calpain (500-697). (3.a att.). HEK293 šūnas tika transficētas ar calpain2a-Flag savvaļas tipa (WT), calpain2a-Flag truncation mutantiem vai TRAF6-HA vektoru. Mēs atklājām, ka gan pilna garuma calpain2a, gan trīs saīsinātie mutanti var mijiedarboties ar TRAF6 (3.c att.). TRAF6 sastāv no C-termināla TRAF domēna, satītas spoles domēna, cinka pirkstu domēna un gredzena pirksta domēna38. Lai pārbaudītu, kurš(-i) TRAF6 domēns(-i) bija nepieciešami tā mijiedarbībai ar calpain2a, mēs izveidojām virkni TRAF6 saīsinātu mutantu, tostarp TRAF6 (1-139), TRAF6 (140-574), TRAF6 ({{36). }}), un TRAF6 (400-574). Tikmēr mēs izveidojām domēna mutantus: TRAF6ΔRing (kurā ir dzēsts gredzena pirksta domēns), TRAF6ΔZF (kurā ir dzēsts cinka pirkstu domēns), TRAF6ΔCC (kurā tiek dzēsts spoles domēns) un TRAF6ΔTRAF-C ( kurā C-termināla TRAF domēns ir dzēsts) (3.b att.). calpain2a mijiedarbojās ar pilna garuma TRAF6, kā arī TRAF6 saīsinājumiem, kas saturēja C-termināla TRAF domēnu, spirālveida domēnu, cinka pirkstu domēnu (3.d, f att.), bet ne ar gredzenveida pirkstu domēnu (3.e attēls). . Luciferāzes testi parādīja, ka pārmērīga calpain2a un šo saīsināto mutantu ekspresija būtiski inhibēja NF-κB un IL-1 reportiera aktivitāti EPC šūnās (3.h att.). Turklāt tika pētītas calpain2a subcelulārās kolokalizācijas ar TRAF6. Mēs transfektējām EPC šūnas ar TRAF{60}}GFP un tukšu vektoru vai calpain2a-mCherry. Konfokālās mikroskopijas analīze parādīja, ka TRAF6 zaļie signāli pārklājās ar calpain2a sarkanajiem signāliem, kas liecināja, ka calpain2a vienlaikus lokalizējas ar TRAF6 EPC šūnās (3.i, j att.). Šie dati liecina, ka vairāku TRAF6 domēnu (C-termināla TRAF domēns, spoles spoles domēns, cinka pirkstu domēns), bet ne gredzenveida pirksta domēna strukturālais pamats ir noteicošais tā saistībai ar calpain2a (3.g attēls).

Fig. 2 calpain2a negative regulates LPS-induced NF-κB Signaling Pathway. an IL-1β, IL-8, and IL-6 mRNA in MKC transduced with calpain2a-Flag or empty vector and treated with saline (0) or challenged with LPS for various times (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n = 3 per group). b, d MKC cells and MIC cells were transfected with si-calpain2a #1 and si-calpain2a #2 (100 nM) or si-ctrl (100 nM). At 48 h post-transfection, calpain2a expression was measured by qRT PCR (n = 3 per group). The level of calpain2a protein was determined by Western blotting. c, e IL-1β, IL-8 mRNA in MKC and MIC stably transduced with si-calpain2a #1 or si-ctrl (control vector) and treated with saline (0) or challenged with LPS for various times (4 h, 8 h) (n = 3 per group). f MKC cells were transfected with either si-ctrl or si-calpain2a #1. At 36 h post-transfection, the cells were stimulated with LPS for 12 h, then cell proliferation assay was measured (n = 3 per group). Scale bar, 100 μm. g calpain2a-Flag was transfected into MKC cells which were challenged with LPS at various times (3 h, 6 h, 9 h). Immunoblot analysis of cell lysates with indicated Abs. Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by two-way ANOVA (a, c, e, f) or one-way ANOVA (b, d). *p < 0.05, **p < 0.01.

2. att. calpain2a negatīvs regulē LPS izraisītu NF-κB signalizācijas ceļu. IL-1, IL-8 un IL-6 mRNS MKC, kas transducēts ar calpain2a-Flag vai tukšu vektoru un apstrādāts ar fizioloģisko šķīdumu (0) vai pakļauts LPS dažādām slimībām. reizes (2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h) (n=3 vienai grupai). b, d MKC šūnas un MIC šūnas tika transficētas ar si-calpain2a #1 un si-calpain2a #2 (100 nM) vai si-ctrl (100 nM). 48 stundas pēc transfekcijas calpain2a ekspresija tika noteikta ar qRT PCR (n=3 katrā grupā). Kalpain2a proteīna līmenis tika noteikts ar Western blotēšanu. c, e IL-1, IL-8 mRNS MKC un MIC, kas ir stabili transducēta ar si-calpain2a #1 vai si-ctrl (kontroles vektors) un apstrādāta ar fizioloģisko šķīdumu (0) vai pakļauta LPS dažādu iemeslu dēļ. reizes (4 h, 8 h) (n=3 vienai grupai). f MKC šūnas tika transficētas ar si-ctrl vai si-calpain2a # 1. 36 stundas pēc transfekcijas šūnas tika stimulētas ar LPS 12 stundas, pēc tam tika mērīts šūnu proliferācijas tests (n=3 katrā grupā). Mēroga josla, 100 μm. g calpain2a-Flag tika transficēts MKC šūnās, kuras dažādos laikos (3 h, 6 h, 9 h) tika inficētas ar LPS. Šūnu lizātu imūnblota analīze ar norādītajiem Abs. Relatīvais mRNS līmenis tika normalizēts līdz gēna, kas kodē -aktīnu, ekspresijai katrā paraugā. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos. Dati tika analizēti ar divvirzienu ANOVA (a, c, e, f) vai vienvirziena ANOVA (b, d). *p < 0,05, **p < 0,01.

Fig. 3 The interaction of calpain2a with TRAF6. a, b Schematic diagrams of domain organization in miiuy croaker calpain2a, TRAF6, and mutants were used in this study.


3. att. Calpain2a mijiedarbība ar TRAF6. a, b Šajā pētījumā tika izmantotas miiuy croaker calpain2a, TRAF6 un mutantu domēna organizācijas shematiskās diagrammas. "+" apzīmē mijiedarbību ar TRAF6 vai calpain2a, "-" nozīmē, ka nav mijiedarbības. c HEK293 šūnas tika transficētas ar viltotiem, calpain2a-Flag savvaļas tipa (WT) un calpain2a-Flag saīsinātiem mutantiem vai TRAF6-HA, kā norādīts. 24 stundas pēc transfekcijas transfektētās šūnas tika ekstrahētas un šūnu lizāti tika pakļauti imunoprecipitācijai ar anti-HA antivielu, kam sekoja IB, izmantojot anti-HA vai anti-Flag antivielu. d–f HEK293 šūnas tika transficētas ar viltus, TRAF6-HA savvaļas tipa (WT) un TRAF6-HA saīsinātiem mutantiem vai calpain2a-Flag, kā norādīts. 24 stundas pēc transfekcijas transfektētās šūnas tika ekstrahētas un šūnu lizāti tika pakļauti imunoprecipitācijai ar anti-HA antivielu d, f vai anti-Flag antivielu e, kam sekoja IB, izmantojot anti-HA vai anti-Flag antivielu. g TRAF6 un calpain2a mijiedarbības vieta. h EPC šūnas tika transficētas ar TRAF6-HA, calpain2a-Flag vai calpain2a-Flag atdalītiem mutantiem kopā ar NF-κB un IL-1 luciferāzes reportieriem. Pēc 36 h pēc transfekcijas tika sasniegta luciferāzes aktivitātes vērtība pret reniļas luciferāzes aktivitāti (n=3 katrā grupā). I j EPC šūnas tika transficētas ar mock, calpain2a-mCherry un TRAF6-GFP. DAPI iekrāsotie kodoli ir parādīti zilā krāsā. calpain2a tika atklāts ar sarkanu fluorescenci, un TRAF6 tika atklāts ar zaļu fluorescenci. Mēroga josla, 10 μm. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos. Dati tika analizēti ar vienvirziena ANOVA (h). **p < 0,01.

calpain2a inhibē TRAF6 proteīna ekspresijas līmeni ar proteolītisko aktivitāti.

Lai izpētītu calpain2a regulēšanas mehānismu uz TRAF6, mēs vispirms pārbaudījām, vai calpain2a ietekmēja TRAF6 olbaltumvielu līmenī. calpain2a-Myc un TRAF6-Flag tika kopīgi transfekēti EPC šūnās, TRAF6 proteīna līmenis tika daļēji degradēts pēc 30 stundām (4.a attēls). Kā parādīts 4.b attēlā, calpain2a veicināja TRAF6 degradāciju atkarībā no devas. Kalpain2a klātbūtnē tas neietekmēja TRAF6 mRNS līmeni, norādot, ka calpain2a ietekmē tikai TRAF6 proteīna līmeni. Tikmēr inhibitora cikloheksimīda (CHX) tests parādīja, ka calpain2a var paātrināt TRAF6 proteīna pussabrukšanas periodu (4.c attēls). Kalpain2a pārmērīga ekspresija MKC šūnās izraisīja endogēnā TRAF6 destabilizāciju (4.d attēls). Lai noskaidrotu, vai kalpain2a mediētā TRAF6 noārdīšanās bija atkarīga no ubikvitīna-proteasomas, autofagosomām, lizosomu ceļiem vai citiem, EPC šūnas tika apstrādātas ar reaģentiem, kas inhibēja šos ceļus: MG132, 3-MA un NH4Cl. Tomēr proteasomu inhibitors MG132, autofagiskais inhibitors 3-MA vai lizosomu inhibitors NH4Cl neatcēla kalpaīna2a izraisīto TRAF6 destabilizāciju (4.e attēls). Pēc tam EPC šūnas tika apstrādātas ar reaģentiem: E-64 (kalpaīna inhibitors, kas inaktivē kalpaīna hidrolāzes aktivitāti) un PMSF (nespecifisks serīna proteāzes inhibitors). Mēs atklājām, ka kalpaīna inhibitors E-64 novērsa degradāciju TRAF6 proteīna līmenī (4.f attēls). Kā parādīts 4.g attēlā, E-64 arī apvērsa endogēno TRAF6 proteīna līmeņu degradāciju, ko izraisa kalpain2a.

Fig. 4 calpain2a inhibits TRAF6 protein expression. a The time gradient experiment of empty vectors or calpain2a-Myc plasmids together with TRAF6- Flag was conducted in EPC cells. The cell lysates were subjected to IB with anti-Myc, anti-Flag, and anti–Tubulin Abs. RNA was extracted from cells and reverse transcribed, and then TRAF6 and actin were amplified by PCR primers. b EPC cells were seeded in 12-well plates overnight and co-transfected with TRAF6-Flag and calpain2a-Myc (0.3, 0.6, or 0.9 μg) for 48 h. The expression of TRAF6-Flag and calpain2a-Myc proteins was detected by Western blotting. RNA was extracted from cells and reverse transcribed, then TRAF6 and actin were amplified by PCR primers. c calpain2a-Myc or empty vectors were co-transfected with TRAF6-Flag into EPC cells. At 36 h post-transfection, the transfected cells were treated with cycloheximide (CHX) for 2 or 4 h. d MKC cells were transfected with calpain2a-Flag or empty vectors. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with anti-TRAF6, anti-Flag, and anti-Tubulin Abs. e, f EPC cells were transfected with the indicated plasmids in the presence or absence of MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 or 75 μM), or PMSF for 6 h before immunoblot analysis was performed. g MKC cells were transfected with calpain2a-Flag in the presence or absence of E-64 (50 or 75 μM) for 6 h before immunoblot analysis was performed. h calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag were co-transfected with TRAF6-HA into EPC cells. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with indicated Abs. I calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag were cotransfected into MKC cells. At 48 h post-transfection, the cell lysates were subjected to IB with anti-TRAF6, anti-Flag, and anti-Tubulin Abs. j IL-1β, IL-8 mRNA in MKC stably transduced with calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag and treated with saline (0) or challenged with LPS for 4 h (n = 3 per group). Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by two-way ANOVA (j). **p < 0.01.


4. attēls calpain2a inhibē TRAF6 proteīna ekspresiju. a Tukšu vektoru vai calpain2a-Myc plazmīdu laika gradienta eksperiments kopā ar TRAF6- karogu tika veikts EPC šūnās. Šūnu lizāti tika pakļauti IB ar anti-Myc, anti-Flag un anti-Tubulin Abs. RNS tika ekstrahēta no šūnām un reversi transkribēta, un pēc tam TRAF6 un aktīns tika pastiprināti ar PCR primeriem. b EPC šūnas tika iesētas 12-iedobju plāksnēs uz nakti un kotransfektētas ar TRAF6-Flag un calpain2a-Myc (0.3, 0.6 vai {{). 18}},9 ug) 48 stundas. TRAF6-Flag un calpain2a-Myc proteīnu ekspresija tika noteikta ar Western blot metodi. RNS tika ekstrahēta no šūnām un reversi transkribēta, pēc tam TRAF6 un aktīns tika pastiprināti ar PCR primeriem. c calpain2a-Myc vai tukšie vektori tika kopīgi transfekēti ar TRAF6-Flag EPC šūnās. 36 stundas pēc transfekcijas transfektētās šūnas 2 vai 4 stundas apstrādāja ar cikloheksimīdu (CHX). d MKC šūnas tika transficētas ar calpain2a-Flag vai tukšiem vektoriem. 48 stundas pēc transfekcijas šūnu lizāti tika pakļauti IB ar anti-TRAF6, anti-Flag un anti-Tubulin Abs. e, f EPC šūnas tika transficētas ar norādītajām plazmīdām MG132, 3-MA, NH4CL, E-64 (50 vai 75 μM) vai PMSF klātbūtnē vai bez tās 6 h pirms imunoblota analīzes veikšanas. g MKC šūnas tika transficētas ar calpain2a-Flag E{{50}} (50 vai 75 μM) klātbūtnē vai bez tās 6 stundas pirms imunoblota analīzes. h calpain2a-Flag un calpain2a-ΔCysPc-Flag tika kopīgi transfekēti ar TRAF6-HA EPC šūnās. 48 stundas pēc transfekcijas šūnu lizāti tika pakļauti IB ar norādītajiem Abs. I calpain2a-Flag un calpain2a-ΔCysPc-Flag tika kotransfekēti MKC šūnās. 48 stundas pēc transfekcijas šūnu lizāti tika pakļauti IB ar anti-TRAF6, anti-Flag un anti-Tubulin Abs. j IL-1, IL-8 mRNS MKC, kas stabili transducēts ar calpain2a-Flag un calpain2a-ΔCysPc-Flag un apstrādāts ar fizioloģisko šķīdumu (0) vai 4 stundas pakļauts LPS iedarbībai (n=3 katrai grupai). Relatīvais mRNS līmenis tika normalizēts līdz gēna, kas kodē -aktīnu, ekspresijai katrā paraugā. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos. Dati tika analizēti ar divvirzienu ANOVA (j). **p < 0,01.

Lai noteiktu, vai TRAF6 noārdīšanās bija atkarīga no calpain2a hidrolāzes aktivitātes. Izmantojot iepriekšējos kalpain2a strukturālos un bioķīmiskos pētījumus zīdītājiem, mēs mutējām calpain2a cisteīna, histidīna un asparagīna atlikumus par alanīnu (calpain2a C105A, H262A, N286A un 3 A), kas zaudēja katalītisko-44-triādi6. Mēs novērojām, ka šī mutācija neietekmēja TRAF6 degradāciju (papildu 1.a attēls). Tātad, mēs mutējām proteāzes domēnu, kas ir calpain2a (apzīmēts kā calpain2a-ΔCysPc) Calpain ģimenes cisteīna proteāzes (CysPc) domēns. Kalpain2a-ΔCysPc neietekmē ne pārmērīgi ekspresētu TRAF6, ne endogēno TRAF6 (4.h, i att.). Tomēr proinflammatoriskos citokīnus IL-1 un IL-8 pēc LPS stimulācijas vienlaikus ietekmē savvaļas tipa vai mutācijas kalpaīns2a (4.j attēls). Mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, neietekmē TRAF6 proteīna līmeni, bet mutants calpain2a, kuram trūkst hidrolāzes aktivitātes, joprojām ietekmēja pakārtoto iekaisuma citokīnu ekspresiju. Tas izraisīja mūsu izmeklēšanu par iespējamiem mehānismiem, ar kuriem calpain2a regulē TRAF6. Kopumā šie rezultāti atklāj, ka calpain2a regulē NF-κB signālu pārraidi, nomācot TRAF6 proteīna līmeņa ekspresiju, izmantojot kalpaīna hidrolāzes aktivitāti.

calpain2a inhibē TRAF6 ubikvitīna-ligāzes aktivitāti.

Pēc tam mēs izpētījām molekulāros mehānismus, ar kuriem calpain2a negatīvi regulē TRAF6-aktivēto NF-κB signālu pārraidi un vai calpain2a mijiedarbība ar TRAF6 pēc fermentatīvās aktivitātes zuduma modulē tā ubikvitīna ligāzes aktivitāti. Mēs apstrādājām MKC šūnas ar LPS un pēc tam imunoprecipitējām TRAF6. Ubikvitinācijas tests ar attīrītiem rekombinantiem proteīniem apstiprināja, ka calpain2a un calpain2a-ΔCysPc samazināja TRAF6 ubikvitināciju (5.a attēls). Kā parādīts 5.b un c attēlā, gan calpain2a, gan calpain2a-ΔCysPc ievērojami samazināja TRAF6 WT un K63 ubikvitinēto proteīnu daudzumu. Kalpain2a un calpain2a-ΔCysPc koncentrācijas gradienti no devas atkarīgā veidā samazināja TRAF6 WT un K63 ubikvitinētos proteīnus. calpain2a-ΔCysPc joprojām novērsa TRAF6 K63 ubikvitīna ķēdes agregāciju, neietekmējot TRAF6 proteīna līmeni (5.d, e att.). Pēc tam mēs transfektējām MKC šūnas, lai ekspresētu ar Myc marķētu TRAF6 ar karogu iezīmētā calpain2a-ΔCysPc klātbūtnē vai bez tās, pēc tam veicām imunoprecipitācijas eksperimentus ar anti-Myc antivielu un analizējām ar imūnblotu ar anti-UB. Šādu TRAF6 ubikvitināciju būtiski mazināja calpain2a-ΔCysPc (5.f att.). LPS stimulēts, TRAF6 nodrošina K63-saistītu ubikvitīna ķēdi TAK1, kas stimulē TAK1 autofosforilāciju un aktivizē NF-κB18. TAK1 WT un K63 ubikvitīna proteīni tika ievērojami pastiprināti TRAF6 klātbūtnē, savukārt ar TAK1- saistītā ubikvitinācija tika inhibēta kalpain2a-ΔCysPc klātbūtnē (5.g, h att.). Šie dati apstiprina, ka mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, līdzīgi inhibē TRAF6 ubikvitīna ligāzes aktivitāti, neietekmējot TRAF6 proteīna līmeni.

Cistanche deserticola-improve immunity (7)

Cistanche tubulosa priekšrocības- stiprināt imūnsistēmu

calpain2a inhibē TRAF6 homo-oligomerizāciju.

Lys63 ubikvitīna ķēde, ko sintezē TRAF6, spēlē galveno lomu signālu pārraidē. Ir ziņots, ka TRAF6 dimerizācija ir būtiska tās ubikvitīna ķēdes sintēzei16. Dimerizācijas modelis ir cieši saistīts ar Ubc13 kombināciju, lai iegūtu K63 ubikvitināciju 16, 30. Lai pārbaudītu, vai zivis TRAF6 var veidot dimērus, mēs izmantojām TRAF6 plazmīdas ar dažādiem tagiem: ar Myc marķētu TRAF6 un HA marķētu TRAF6 kopīgu IP eksperimentiem. IP tests tika veikts, izmantojot anti-HA antivielu, HATRAF6 mijiedarbojās ar Myc-TRAF6 (6.a attēls). Lai izpētītu calpain2a inhibējošo iedarbību TRAF6-dimēru mijiedarbībā, ar karogu iezīmētais calpain2a, HA marķēts TRAF6 un ar Myc marķēts TRAF6 tika īslaicīgi ekspresēts HEK293 šūnās. Kā gaidīts, TRAF6-dimēru mijiedarbība tika samazināta kalpain2a klātbūtnē (6.b attēls). Tajā pašā laikā, lai izvairītos no TRAF6 degradācijas ar calpain2a. Mēs transfektējām ar karogu atzīmēto calpain2a-ΔCysPc un atklājām, ka TRAF6-dimēra mijiedarbība pakāpeniski samazinājās calpain2a-ΔCysPc klātbūtnē (6.c attēls). Kā parādīts 6.d un e attēlā, mēs atklājām HA-TRAF6 uzlabotu Myc-TRAF6 WT un K63 ubikvitināciju. Kamēr HEK293 šūnas tika kopīgi transfekētas ar calpain2a un calpain2a-ΔCysPc, pastiprinātā ubikvitinācija tiktu nomākta. Šie rezultāti liecina, ka gan savvaļas tipa calpain2a, gan mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, kavē TRAF6 homooligomerizāciju un auto-ubikvitināciju.

calpain2a kavē TRAF6 ubikvitinācijas piegādi ECSIT un BECN1.

Kā parādīts 5.d attēlā, mēs atklājām, ka calpain2a traucēja visuresamības procesu no TRAF6 līdz TAK1. Ir ziņots, ka ECSIT darbojās kā TAK1 un TRAF6 adaptera proteīns, lai veicinātu NF-κB signālu pārraidi ar LPS stimulāciju37. Lai pārbaudītu, vai ECSIT ir minētās funkcijas teleostzivīs, mēs veicām vairākas ECSIT proteīnu secību izlīdzināšanas cilvēka, peles un vareno ķircinātājā (papildu 1.b attēls). Mēs transficējām EPC šūnas ar NF-κB luciferāzes reportieri, ECSIT ievērojami uzlaboja NF-κB reportiera aktivitāti pēc LPS stimulācijas (papildu attēls 1c). Pārmērīga ECSIT ekspresija MKC šūnās izraisīja TNF- mRNS līmeņa regulēšanu (papildu 1.d attēls). Pēc transficētajām zivīm ECSIT un TRAF6 HEK293 šūnās mēs atklājām, ka TRAF6 mijiedarbojas ar ECIST (7.a attēls). Tāpat ECSIT un TAK1 tika kopīgi transfekēti, un arī abi proteīni saglabāja mijiedarbību (7.b att.). Pēc tam, lai pārbaudītu, vai calpain2a-ΔCysPc kavē TRAF6-ECSIT kompleksa veidošanos, mēs transfekējām trīs plazmīdas HEK293 šūnās un atklājām, ka calpain2a-ΔCysPc novērsa TRAF6-ECSIT kompleksu (7. att.). ). Lai pārbaudītu ubikvitīna ķēdes pārraides procesu NF-κB signalizācijā. Kā parādīts 7.d attēlā, TRAF6 varētu veicināt ECSIT ubikvitināciju; kā gaidīts, calpain2a-ΔCysPc kavēja procesu, kurā TRAF6 nosūtīja ubikvitīna ķēdi uz ECSIT. BECN1 ir svarīgs proteīns LPS izraisītā autofagijā. Ir apstiprināts, ka K63 ubikvitinācija var modificēt un aktivizēt BECN1. Deubikvitinējošais enzīms A20 noņem BECN1 ubikvitināciju un inhibē LPS izraisīto autofagiju, un TRAF6 ir E3 ligāze, kas atbild par BECN1 ubikvitināciju šajā signālā47. Kā parādīts 7.e attēlā, TRAF6 mijiedarbojās ar BECN1 un veicināja BECN1 ubikvitināciju. Pēc tam mēs transfektējām BECN1, TRAF6, calpain2a un calpain2a-ΔCysPc HEK293 šūnās, TRAF6 veicināja BECN1 ubikvitināciju. calpain2a-ΔCysPc kavēja procesu, kurā TRAF6 nodeva ubikvitīna ķēdi uz BECN1 (7.f attēls). Šie rezultāti liecina, ka savvaļas tipa calpain2a un mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, kavē TRAF6 ubikvitinācijas spēju LPS inducētā autofagijā un NF-κB signalizācijā.

Negatīva pretvīrusu reakcijas regulēšana ar calpain2a.

RLR ceļā TRAF6 darbojas kā E3 ligāze, ko MAVS pieņem darbā, lai aktivizētu NF-κB, IFN un citokīnu veidošanos. Pēc tam mēs pārbaudījām, vai calpain2a bija nozīme TRAF6 novēršanā IFN mediētajā pretvīrusu procesā. EPC šūnās tika ekspresēti IFN-1, ISRE un IRF3 promotoru vadīti luciferāzes reportieri. Mēs atklājām, ka calpain2a būtiski samazināja šīs promotora virzītās luciferāzes aktivitātes atkarībā no devas pēc Ploy (I: C) stimulācijas un Siniperca apkrāpj rabdovīrusa (SCRV) infekciju (8.a, b att.). Calpain2a iznīcināšana ievērojami uzlaboja Ploy (I: C) un SCRV izraisīto gēnu ekspresiju, tostarp Viperin, Mx1 un ISG15 (8.c, d attēls). Kalpain2a notriekšana izraisīja augstāku šūnu dzīvotspējas ekspresiju pēc SCRV infekcijas MKC šūnās (8.e attēls). Kā parādīts 8.f attēlā, šūnu proliferācijas testi atklāja, ka calpain2a notriekšana pastiprināja šūnu proliferāciju pēc SCRV infekcijas. Pārmērīga calpain2a ekspresija strauji veicināja vīrusa pavairošanu, par ko liecina vīrusa replikācija pēc SCRV infekcijas (8.g attēls). calpain2a un calpain2a-ΔCysPc būtiski samazināja IFN-1, ISRE un IRF3 promotoru vadītos luciferāzes reportierus pēc Ploy(I:C) stimulācijas un SCRV infekcijas (papildu attēls 2a, b). Šie rezultāti liecina, ka calpain2a var negatīvi regulēt RLR signalizācijas ceļu, inhibējot TRAF6, tādējādi kavējot IFN aktivāciju.

Fig. 5 calpain2a inhibits TRAF6 ubiquitin-ligase activity. a Ubiquitination of endogenous TRAF6 in MKC cells transduced with calpain2a-Flag and calpain2a-ΔCysPc-Flag and unchallenged (−) or challenged with LPS (+), assessed by immunoblot analysis with anti-ubiquitin after immunoprecipitation with anti-TRAF6 and input immunoblot analysis with indicated Abs. b, c HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-HA and WT-ubiquitin-His or K63O ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. d, e HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-HA and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag (0.5 μg, 1 μg), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0.5 μg, 1 μg) or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. f Ubiquitination of overexpressed TRAF6 in MKC cells transduced with calpain2a-ΔCysPc-Flag, assessed by immunoblot analysis with anti-ubiquitin after immunoprecipitation with anti-Myc and input immunoblot analysis with indicated Abs. g, h HEK293 cells were cotransfected with TAK1-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. All the immunoprecipitates and input immunoblot analysis with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.


5. att. calpain2a inhibē TRAF6 ubikvitīna-ligāzes aktivitāti. endogēnā TRAF6 ubikvitinācija MKC šūnās, kas transducētas ar calpain2a-Flag un calpain2a-ΔCysPc-Flag un neapstrīdētas (-) vai pakļautas LPS (+), kas novērtētas ar imūnblota analīzi ar anti-ubikvitīnu pēc imunoprecipitācijas ar anti-TRAF6 analīzi un ievadīšanu. ar norādīto Abs. b, c HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar TRAF6-HA un WT-ubikvitīnu-His vai K63O ubikvitīnu-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. d, e HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar TRAF{{30}}HA un WT-ubikvitīnu-His vai K63O-ubikvitīnu-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag ({{45) }}.5 ug, 1 ug), calpain2a-ΔCysPc-Flag (0,5 ug, 1 ug) vai tukšs vektors. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. f Pārmērīgi ekspresētas TRAF6 ubikvitinācija MKC šūnās, kas transducētas ar calpain2a-ΔCysPc-Flag, novērtēta ar imūnblota analīzi ar anti-ubikvitīnu pēc imunoprecipitācijas ar anti-Myc un ievades imūnblota analīzi ar norādīto Abs. g, h HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar TAK1-Myc, TRAF6-HA un WT-ubikvitīnu-His vai K63O-ubikvitīnu-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag. , calpain2a-ΔCysPc-karogs vai tukšs vektors. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. Visi imunoprecipitāti un ievades imūnblotu analīze ar anti-Myc, anti-Flag, anti-HA un anti-Tubulin Abs. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos.

calpain2a nomāc IRF3 un IRF7 ubikvitināciju no TRAF6.

Tiek ziņots, ka MAVS-TRAF3/6 kompleksa iedarbinātajā pretvīrusu signālā TRAF6 aktivitāte ir nepieciešama IRF3 un NF-κB48 aktivizēšanai. Kā parādīts 9.a un b attēlā, TRAF6 veicina IRF3 ar WT un K{9}} saistītu ubikvitināciju, un šo uzlabošanos kavē kalpain2a-ΔCysPc ekspresija. Tikmēr, kad vīruss iedarbina no TLR atkarīgu signalizācijas signālu, TRAF6 ir cieši saistīts ar IRF7 un veicina IRF7 ubikvitināciju kopā ar aktivizētiem pretvīrusu faktoriem22,49,50. TRAF6 veicina ar WT un K63-saistītu IRF7 ubikvitināciju, un šo uzlabošanos kavē kalpain2a-ΔCysPc ekspresija (9.c un d. att.). Šie dati liecina, ka savvaļas tipa calpain2a un mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, kavē IRF3 un IRF7 TRAF{29}}mediētu ubikvitināciju.

Diskusija

TRAF6 ir viens no septiņiem ar audzēja nekrozes faktora (TNF) receptoriem saistīto faktoru (TRAF) saimes locekļiem, kas ir identificēts kā signāla adapteris un veic signālu pārraidi51, 52. TRAF saime satur gredzenveida pirkstu domēnu, kam pieder E3 ligāzes aktivitāte. E3 ligāzes ar HECT domēnu veicina substrāta poliubikvitināciju, un E3 ar gredzena domēnu prasa E2 ~ ub, lai pārraidītu poliubikvitināciju53,54. Ir apstiprināts, ka dimēru Ub saistošais enzīms Ubc13 / Uev1A ir iesaistīts TRAF6 poliubikvitinācijas agregācijā16. Kamēr peles TRAF6 K124 ir izsists, TRAF6 zaudēs K63 auto-ubikvitinācijas aktivitāti, un mutācija šajā vietā novērš TRAF6-mediētā NEMO ubikvitināciju un TAK1, IKK un NF-κB55 aktivāciju. . Tas ir precīzi, jo PRDX1 saistās ar TRAF6 gredzenveida pirkstu domēnu, kas atrodas K124, un novērš TRAF638 ubikvitināciju. Ir ziņots, ka TRAF6 ubikvitinācija ir cieši saistīta ar tā N-gala domēna dimerizāciju (Gredzena pirkstu un ZF pirkstu domēns). Vairākas N-termināla mijiedarbības vietas ar Ubc13 tika mutētas, un Ubc13 nevarēja pārsūtīt poli ~ ub uz TRAF616. Mijiedarbība starp calpain2a un TRAF6 mutantiem parādīja, ka lielākā daļa TRAF6 domēnu mijiedarbojās ar calpain2a, izņemot gredzena pirksta domēnu. Sakarā ar mijiedarbību starp calpain2a un TRAF6 ZF pirkstu domēnu, mēs spekulējām, ka calpain2a varētu kavēt auto-ubikvitināciju, bloķējot TRAF6 dimerizāciju. Pēc tam mēs pārbaudījām dažādu TRAF6 tagu mijiedarbību. Palielinoties mutanta calpain2a ekspresijai, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, dažādu TRAF6 tagu mijiedarbība vājinājās. Ar HA marķētais TRAF6 veicina Myc marķētā TRAF6 ubikvitināciju, un mutants calpain2a inhibē ubikvitināciju, ko pastiprina HA marķētais TRAF6. Kā starpprodukts TRAF6-TAK1 signāla pārraides procesā ECSIT saistās ar TRAF6 C-termināla domēnu (CC domēns un TRAF-C domēns) un ir apstiprināts, ka tas ir iesaistīts NF-κB signalizācijā37. ECSITKD THP-1 šūnās samazinājās pro-iekaisuma citokīnu ekspresija. Tomēr pēc pārmērīgas ECSIT ekspresijas ECSITKD THP-1 šūnās ievērojami palielinājās tādi gēni kā IRF7, IL-1 un CD4437. PRDX1 saistās ar TRAF6 gredzenveida pirkstu domēnu un kavē ECSIT un BECN1 ubikvitināciju NF-κB un autofagijas signālos, kavējot TRAF6 poliubikvitinācijas veidošanos38. Teleost zivīs mēs apstiprinājām ECSIT aktivizēto NF-κB signalizācijas ceļu, mijiedarbojāmies attiecīgi ar TRAF6 un TAK1 un pārsūtījām TRAF6 ražoto poliubikvitīna ķēdi. calpain2a saistījās ar TRAF6 domēnu ZF, CC domēnu un TRAF-C domēnu, kas kavēja TRAF6-ECSIT mijiedarbību. Mēs apstiprinājām, ka mutants calpain2a, kam nebija hidrolāzes aktivitātes, neļāva poliubikvitīna ķēdei no TRAF6 uz ECSIT un BECN1.

Fig. 6 calpain2a attenuates autoubiquitination of TRAF6. a HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. b HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, empty vector, or calpain2a-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. c HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, empty vector, or different concentrations of calpain2a-ΔCysPc-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with HA antibody. d, e HEK293 cells were cotransfected with TRAF6-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. The immunoprecipitates and input immunoblot analysis with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.

6. att. calpain2a vājina TRAF6 autoubikvitināciju. HEK293 šūnas tika transficētas ar TRAF6-Myc, TRAF6-HA vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar HA antivielu. b HEK293 šūnas tika transficētas ar TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tukšu vektoru vai calpain2a-Flag. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar HA antivielu. c HEK293 šūnas tika transficētas ar TRAF6-Myc, TRAF6-HA, tukšu vektoru vai dažādu koncentrāciju calpain2a-ΔCysPc-Flag. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar HA antivielu. d, e HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar TRAF6-Myc, TRAF6-HA un WT-ubikvitīnu-His vai K63O-ubikvitīnu-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag. , calpain2a-ΔCysPc-karogs vai tukšs vektors. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. Imunoprecipitē un ievada imūnblotu analīzi ar anti-Myc, anti-Flag, anti-HA un anti-Tubulin Abs. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos.

Fig. 7 calpain2a inhibits TRAF6-mediated ubiquitination of ECSIT and BECN1. a HEK293 cells were transfected with ECSIT-Myc, TRAF6-Flag, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Flag antibody. b HEK293 cells were transfected with TAK1-Flag, ECSIT-Myc, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. c HEK293 cells were transfected with TRAF6-Myc, ECSIT-HA, empty vector, or different concentrations of calpain2a-ΔCysPc-Flag. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. d HEK293 cells were cotransfected with ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubiquitin-His together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. e HEK293 cells were transfected with BECN1-Flag, TRAF6-Myc, or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and IP analyzed with Myc antibody. f HEK293 cells were cotransfected with BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post-transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. The immunoprecipitates and inputs with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti-Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments.


7. attēls calpain2a inhibē TRAF6-mediētu ECSIT un BECN1 ubikvitināciju. HEK293 šūnas tika transficētas ar ECSIT-Myc, TRAF6-Flag vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar Flag antivielu. b HEK293 šūnas tika transficētas ar TAK{10}}Flag, ECSIT-Myc vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar Myc antivielu. c HEK293 šūnas tika transficētas ar TRAF6-Myc, ECSIT-HA, tukšu vektoru vai dažādu koncentrāciju calpain2a-ΔCysPc-Flag. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar Myc antivielu. d HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar ECSIT-Myc, TRAF6-HA, WT-ubikvitīnu-His kopā ar calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. e HEK293 šūnas tika transficētas ar BECN1-Flag, TRAF6-Myc vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un IP analizētas ar Myc antivielu. f HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar BECN1-HA, TRAF6-Myc, WT-ubiquitin-His kopā ar calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag vai tukšu vektoru. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. Imunoprecipitē un ievada ar anti-Myc, anti-Flag, anti-HA un anti-Tubulin Abs. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos.

Mēs novērojam, ka calpain2a ir hidrolāzes aktivitāte kā viena no kalcija atkarīgo proteāžu saimes. m-kalpaīnam (kalpaīnam-2) ir pozitīva regulējoša loma HepG2 aknu šūnu NF-κB signālu ceļā. Neatkarīgi no 26 sekunžu proteasomu pieejas calpain2a hidrolizē IkB, lai atbrīvotu transkripcijas faktoru NF-κB. Specifiskais kalpaīna proteīna inhibitors novērš IkB 56 noārdīšanos. Tomēr attiecībā uz kalpaīnu ir maz pētījumu par zivju iedzimto imūnreakciju. MKC šūnās calpain2a pārmērīga ekspresija inhibēja NF-κB pakārtotos proinflammatoriskos citokīnus, ko izraisīja LPS. Šī parādība bija pretrunā rezultātiem HepG2 aknu šūnās. Iespējams, ka kalpaīna proteīnu saimes sugas specifika izraisīja dažādus efektus. Tāpat mēs izmantojām specifisko kalpaīna proteīna E-64 inhibitoru, lai novērstu kalpaīna 2a hidrolizāciju TRAF6. Mutants calpain2a, kam trūkst hidrolāzes aktivitātes, inhibē TRAF6 ubikvitīna ligāzes aktivitāti, neietekmējot tā olbaltumvielu līmeni. Mēs neatradām enzīmu aktīvās vietas calpain2a. Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem ar zīdītājiem, trīs vietas ir cisteīns (C105A), histidīns (H262A) un asparagīna atliekas (N286A). Tomēr mūsu eksperimenti apstiprina, ka trīs miiuy croaker calpain2a aktīvās vietas neietekmē TRAF6 proteīna līmeņa ekspresiju, bet mutants calpain2a, kuram trūkst hidrolāzes domēna, to ietekmē. Tāpēc mēs izvēlējāmies mutēt visu fermentu aktivējošo strukturālo domēnu. Lai gan proteīns calpain2a ir salīdzinoši konservēts zīdītājiem un zemākiem mugurkaulniekiem, specifiskās fermentatīvās aktivitātes vietas ir pelnījušas turpmāku izpēti.

Desert ginseng-Improve immunity (15)

cistanche augu paaugstinošā imūnsistēma

Rezumējot, mēs identificējām calpain2a kā negatīvu LPS izraisītas NF-κB signālu un vīrusu izraisītas IFN aktivācijas regulatoru (9.e attēls). Masu spektrometrijā calpain2a var mijiedarboties ar TRAF6, un mēs parādījām šo parādību ar endogēnu koimunoprecipitācijas eksperimentu. Mēs noskaidrojām, ka calpain2a ir iesaistīts LPS izraisītā NF-κB signalizācijas ceļa regulēšanā. Turklāt TRAF6 ir arī svarīga loma pretvīrusu signalizācijas ceļos. Mēs izmantojām SCRV un Ploy (I: C), lai stimulētu IFN signalizācijas ceļu, un atklājām, ka calpain2a var arī kavēt IFN signālu pārraidi, regulējot proteīna līmeni un TRAF6 autoubikvitināciju. Tā kā TLR3 var atpazīt divpavedienu RNS (dsRNS) struktūru, ko rada vīrusu infekcijas. Mūs vairāk interesē TRAF6-mediētā IFN signalizācijas ceļa calpain2a regulējuma noskaidrošana, taču neizslēdzam iespējamo saistību starp calpain2a un TLR3 signalizācijas ceļu. calpain2a veicināja TRAF6 noārdīšanos hidrolītiskā veidā un mijiedarbojās ar TRAF6, lai kavētu dimēru veidošanos un auto-ubikvitināciju. Šī inhibīcija novērsa TRAF6 un ECSIT mijiedarbību un ubikvitinācijas pārsūtīšanas procesu no TRAF6 uz ECSIT, BECN1, IRF3 un IRF7. Mūsu pašreizējie rezultāti veicinās izpratni par negatīvajiem regulēšanas mehānismiem, mērķējot uz TRAF6 iedzimtajās imūnās atbildēs. Turklāt šis pētījums norāda uz TRAF6 homooligomerizācijas un auto-ubikvitinācijas galveno lomu zivju iedzimtās imūnās atbildes procesā. Vienlaikus calpain2a tiek ierosināts kā regulēšanas mehānisma proteīns, lai kavētu TRAF6 imūnreakciju un novērstu normālus un sakārtotus signālu ceļus. Ieskats ir noderīgs, lai izprastu mugurkaulnieku imunoloģiju un mugurkaulnieku imūnsistēmas attīstību.

Fig. 8 calpain2a inhibits SCRV- or Poly(I: C)-induced IFN activation. a b EPC cells were transfected with different concentrations of calpain2a-Flag or empty vector together with the IFN-1, ISRE, and IRF3-pro luciferase reporters. At 24 h post-transfection, cells were mock-infected or infected with SCRV or Poly(I: C) for 12 h (n = 3 per group). Western blot analysis was used to measure the expression of transiently transfected calpain2a-Flag. The expression of Tubulin was used as a loading control. c, d Viperin, Mx1, ISG15 mRNA in MKC stably transduced with si-calpain2a #1 or si-ctrl (control vector) and treated with saline (0) or challenged with SCRV or Poly(I: C) for 24 h. Relative mRNA level was normalized to the expression of the gene encoding β-actin in each sample (n = 3 per group). e, f MKC cells were transfected with either si-ctrl or si-calpain2a #1. At 24 h post-transfection, the cells were stimulated with SCRV for 24 h, then cell viability assay and cell proliferation assay were measured (n = 3 per group). Scale bar, 100 μm. g MKC cells were transfected with calpain2a-Flag or pcDNA3.1, then infected with SCRV for 24 h (n = 3 per group). The qRT-PCR analysis was conducted for intracellular and supernatant SCRV RNA expression. All experiments were performed in at least three independent experiments. Data were analyzed by one-way ANOVA (a, b), two-way ANOVA (c, d, e, f), or two-tailed Student's t-test (g). *p < 0.05, **p < 0.01.


8. att. calpain2a inhibē SCRV vai Poli(I:C) izraisītu IFN aktivāciju. ab EPC šūnas tika transficētas ar dažādu koncentrāciju calpain2a-Flag vai tukšu vektoru kopā ar IFN-1, ISRE un IRF3-pro luciferāzes reportieriem. 24 stundas pēc transfekcijas šūnas tika izspēlētas vai inficētas ar SCRV vai Poly (I: C) 12 stundas (n=3 katrā grupā). Lai izmērītu īslaicīgi transfektētā calpain2a-Flag ekspresiju, tika izmantota Western blot analīze. Tubulīna ekspresija tika izmantota kā iekraušanas kontrole. c, d Viperīna, Mx1, ISG15 mRNS MKC, kas stabili transducēts ar si-calpain2a #1 vai si-ctrl (kontroles vektors) un apstrādāts ar fizioloģisko šķīdumu (0) vai pakļauts SCRV vai Poly(I:C) 24 h. Relatīvais mRNS līmenis tika normalizēts līdz gēna, kas kodē -aktīnu, ekspresijai katrā paraugā (n=3 katrā grupā). e, f MKC šūnas tika transficētas ar si-ctrl vai si-calpain2a # 1. 24 stundas pēc transfekcijas šūnas tika stimulētas ar SCRV 24 stundas, pēc tam tika mērīts šūnu dzīvotspējas tests un šūnu proliferācijas tests (n=3 katrā grupā). Mēroga josla, 100 μm. g MKC šūnas tika transficētas ar calpain2a-Flag vai pcDNA3.1, pēc tam inficētas ar SCRV 24 stundas (n=3 katrā grupā). qRT-PCR analīze tika veikta intracelulārai un supernatanta SCRV RNS ekspresijai. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos. Dati tika analizēti ar vienvirziena ANOVA (a, b), divvirzienu ANOVA (c, d, e, f) vai divvirzienu Stjudenta t-testu (g). *p < 0,05, **p < 0,01.

Metodes

Šūnu kultūra.

Cilvēka embrija nieru (HEK) 293 šūnu līnijas un Epithelioma papulosum cyprini (EPC) šūnu līnijas tika iegādātas no Amerikas tipa kultūras kolekcijas un glabātas mūsu laboratorijā. Miiuy croaker (M. miiuy) nieru šūnu līnijas (MKC) un Miiuy croaker zarnu šūnu līnijas (MIC) tika kultivētas no miiuy croaker57,58 nieru un zarnu audiem. Miiuy croaker nieru šūnu līnijas un Miiuy croaker zarnu šūnu līnijas tika kultivētas 26 grādu temperatūrā mitrinātā inkubatorā, kas satur 0,5% CO2 L-15 barotnē (HyClone, ASV), kas papildināta ar 15% FBS (Gibco). , ASV), 100 U/ml penicilīna (Gibco, ASV), 100 ug/ml streptomicīna (Gibco, ASV) un 20 V/ml heparīna (Solarbio, Ķīna). Epithelioma papulosum cyprini šūnas tika audzētas 26 grādos mitrinātā inkubatorā, kas satur 5% CO2 barotnē 199 (Hyclone), kas papildināts ar 10% FBS, 2 mM L-glutamīnu, 100 U/ml penicilīnu un 100 mg/ml streptomicīnu. Cilvēka embrija nieres 293 šūnas tika audzētas 37 grādu temperatūrā mitrinātā inkubatorā, kas satur 5% CO2 Dulbecco modificētajā ērgļa barotnē (DMEM) (Invitrogen), kas papildināta ar 10% FBS, 2 mM L-glutamīnu, 100 U/ml penicilīnu un 100 mg. /ml streptomicīna.

Fig. 9 calpain2a inhibits TRAF6-mediated ubiquitination of IRF7 and IRF3. b HEK293 cells were cotransfected with IRF3-Myc, TRAF6-HA, and WTubiquitin-His or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h posttransfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. c, d HEK293 cells were cotransfected with IRF7-Myc, TRAF6-HA, and WT-ubiquitinHis or K63O-ubiquitin-His (in which only lysine 63 is kept) together with calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc-Flag or empty vector. After 24 h post transfection, the cells were lysed and purified with Ni-NTA agarose. All the immunoprecipitates and input with anti-Myc, anti-Flag, anti-HA, and anti Tubulin Abs. All experiments were performed in at least three independent experiments. e Model detailing the roles of calpain2a in TRAF6-mediated signaling pathways. Upon LPS and virus, TRAF6 could be activated, homo-oligomerization and auto-ubiquitination. BECN1, ECSIT, IRF7, and IRF3 are ubiquitinated by TRAF6 and trigger the activation of downstream signals. calpain2a as a negative regulator targets TRAF6 to inhibit TRAF6-mediated signaling pathways.


9. attēls calpain2a inhibē TRAF6-mediētu IRF7 un IRF3 ubikvitināciju. b HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar IRF3-Myc, TRAF6-HA un WTubiquitin-His vai K63O-ubiquitin-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag, calpain2a-ΔCysPc. - Karogs vai tukšs vektors. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. c, d HEK293 šūnas tika kotransfekētas ar IRF7-Myc, TRAF6-HA un WT-ubiquitinHis vai K63O-ubiquitin-His (kurā tiek glabāts tikai lizīns 63) kopā ar calpain2a-Flag, calpain2a -ΔCysPc-karogs vai tukšs vektors. Pēc 24 stundām pēc transfekcijas šūnas tika lizētas un attīrītas ar Ni-NTA agarozi. Visi imunoprecipitāti un ievade ar anti-Myc, anti-Flag, anti-HA un anti-Tubulin Abs. Visi eksperimenti tika veikti vismaz trīs neatkarīgos eksperimentos. e Modelis, kurā detalizēti aprakstīta calpain2a loma TRAF{39}}mediētajos signalizācijas ceļos. Pēc LPS un vīrusa TRAF6 var tikt aktivizēts, homo-oligomerizācija un auto-ubikvitinācija. BECN1, ECSIT, IRF7 un IRF3 ir visuresoši TRAF6 un izraisa pakārtoto signālu aktivizēšanu. calpain2a kā negatīvs regulators ir vērsts uz TRAF6, lai kavētu TRAF{49}}mediētos signalizācijas ceļus.

Atsauces

1. Akira, S., Uematsu, S. & Takeuchi, O. Patogēnu atpazīšana un iedzimta imunitāte. Cell 124, 783–801 (2006).

2. Takeuchi, O. & Akira, S. Pattern atpazīšanas receptori un iekaisums. Cell 140, 805–820 (2010).

3. Wu, J. & Chen, ZJ Citosola nukleīnskābju iedzimta imūnā uztvere un signalizācija. Annu. Immunol. 32, 461–488 (2014).

4. Moresco, EM, LaVine, D. & Beutler, B. Toll-like receptors. Curr. Biol. 21, R488–R493 (2011).

5. Schlee, M. Master sensors of pathogenic RNS - RIG-I like receptors. Immunobiology 218, 1322–1335 (2013).

6. Wilmanski, JM, Petnicki-Ocwieja, T. & Kobayashi, KS NLR proteīni: iedzimtas imunitātes neatņemami locekļi un iekaisuma slimību mediatori. J. Leukoc. Biol. 83, 13–30 (2008).

7. Akira, S. & Hemmi, H. Ar patogēnu saistīto molekulāro modeļu atpazīšana pēc TLR ģimenes. Immunol. Lett. 85, 85–95 (2003).

8. Kawai, T. & Akira, S. The role of pattern-recognition receptors in innate imunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 11, 373–384 (2010).

9. Kawagoe, T. et al. Toll līdzīgu receptoru atkarīgo reakciju secīga kontrole ar IRAK1 un IRAK2. Nat. Immunol. 9, 684–691 (2008).

10. Suzuki, N. & Saito, T. IRAK-4- kopīgs NF-kappaB aktivators iedzimtajā un iegūtajā imunitātē. Trends Immunol. 27, 566–572 (2006).

11. Kawai, T. & Akira, S. TLR signalizācija. Šūnu nāves atšķirība. 13, 816–825 (2006).

12. Deng, L. et al. IkappaB kināzes kompleksa aktivizēšanai ar TRAF6 ir nepieciešams dimērisks ubikvitīna konjugācijas enzīmu komplekss un unikāla poliubikvitīna ķēde. Cell 103, 351–361 (2000).

13. Ninomiya-Tsuji, J. et al. Kināze TAK1 var aktivizēt NIK-I kappaB, kā arī MAP kināzes kaskādi IL-1 signalizācijas ceļā. Nature 398, 252–256 (1999).

14. Takaesu, G. et al. TAB2, jauns adaptera proteīns, veicina TAK1 MAPKKK aktivāciju, saistot TAK1 ar TRAF6 IL-1 signāla transdukcijas ceļā. Mol. Šūna. 5, 649–658 (2000).

15. Qian, Y., Commane, M., Ninomiya-Tsuji, J., Matsumoto, K. & Li, X. IRAKm mediētā TRAF6 un TAB2 translokācija interleikīna -1-inducētā NF-kappa BJ aktivācijā Biol. Chem. 276, 41661–41667 (2001).

16. Yin, Q. et al. E2 mijiedarbība un dimerizācija TRAF6 kristāla struktūrā. Nat. Struktūra. Mol. Biol. 16, 658–666 (2009).

17. Wang, C. et al. TAK1 ir no ubikvitīna atkarīga MKK un IKK kināze. Nature 412, 346–351 (2001).

18. Ajibade, AA, Wang, HY & Wang, RF TAK1 šūnu tipam specifiskā funkcija iedzimtajā imūnsignalizēšanā. Trends Immunol. 34, 307–316 (2013).

19. Zhang, J., Clark, K., Lawrence, T., Peggie, MW & Cohen, P. Negaidīts pavērsiens IKKbeta aktivizēšanai: TAK1 aktivizē IKKbeta, lai aktivizētu ar autofosforilāciju. Biochem. J. 461, 531–537 (2014).

20. Emmerich, CH et al. Kanoniskā IKK kompleksa aktivizēšana ar K63/M1- saistītām hibrīda ubikvitīna ķēdēm. Proc. Natl Acad. Sci.110, 15247–15252 (2013).

21. Kawai, T. et al. Interferona-alfa indukcija caur Toll līdzīgiem receptoriem ietver tiešu IRF7 mijiedarbību ar MyD88 un TRAF6. Nat. Immunol. 5, 1061–1068 (2004).

22. Kitagawa, Y. et al. Cilvēka paragripas vīrusa 2. tipa V proteīns inhibē TRAF6-mediētu IRF7 ubikvitināciju, lai novērstu TLR7- un TLR9- atkarīgo interferona indukciju. J. Virols. 87, 7966–7976 (2013).

23. Kawai, T. et al. IPS-1, adapteris, kas iedarbina RIG-I- un Mda5-mediētu I tipa interferona indukciju. Nat. Immunol. 6, 981–988 (2005).

24. Zust, R. et al. Ribozes 2'-O-metilēšana nodrošina molekulāru parakstu pašmRNS un ne-pašmRNS atšķiršanai atkarībā no RNS sensora Mda5. Nat. Immunol. 12, 137–143 (2011).

25. Seth, RB, Sun, L., Ea, CK & Chen, ZJ MAVS, mitohondriju pretvīrusu signālu proteīna, kas aktivizē NF kappaB un IRF 3, identifikācija un raksturojums. 3. Cell 122, 669–682 (2005).

26. Xu, LG et al. VISA ir adaptera proteīns, kas nepieciešams vīrusa izraisītai IFN beta signalizācijai. Mol. Šūna. 19, 727–740 (2005).

27. Yoshida, R. et al. TRAF6 un MEKK1 spēlē galveno lomu RIG-I līdzīgajā helikāzes pretvīrusu ceļā. J. Biol. Chem. 283, 36211–36220 (2008).

28. Liu, S. et al. MAVS pieņem darbā vairākas ubikvitīna E3 ligazes, lai aktivizētu pretvīrusu signālu kaskādes. Elife 2, e00785 (2013).

29. Ivaškiv, LB & Donlin, LT I tipa interferona reakciju regulēšana. Nat. Immunol. 14, 36–49 (2014).

30. Fu, TM, Shen, C., Li, Q., Zhang, P. & Wu, H. TRAF6 veicinātais ubikvitīna pārneses mehānisms. Proc. Natl Acad. Sci. 115, 1783–1788 (2018).

31. Boone, DL et al. Ubikvitīnu modificējošais enzīms A20 ir nepieciešams Toll līdzīgu receptoru reakciju pārtraukšanai. Nat. Immunol. 5, 1052–1060 (2004).

32. Kovaļenko, A. et al. Audzēja nomācējs CYLD negatīvi regulē NF kappaB signālu pārraidi, izmantojot deubikvitināciju. Nature 424, 801–805 (2003).

33. Viņš, X. et al. USP2a negatīvi regulē IL-1beta un vīrusu izraisītu NF kappaB aktivāciju, deubikvitinējot TRAF6. J. Mol. Cell Biol. 5, 39–47 (2013).

34. Xiao, N. et al. Ubikvitīnam specifiskā proteāze 4 (USP4) ir vērsta uz TRAF2 un TRAF6 deubikvitinācijai un inhibē TNFalfa izraisītu vēža šūnu migrāciju. Biochem. J. 441, 979–986 (2012).

35. Yasunaga, J., Lin, FC, Lu, X. & Jeang, KT Ubiquitin-specific peptidase 20 mērķis ir TRAF6 un cilvēka T šūnu leikēmijas vīrusa 1. tipa nodoklis, lai negatīvi regulētu NF-kappaB signālu pārraidi. J. Virols. 85, 6212–6219 (2011).

36. Zhang, X., Zhang, J., Zhang, L., van Dam, H. & ten Dijke, P. UBE2O negatīvi regulē TRAF6-mediēto NF-kappaB aktivāciju, inhibējot TRAF6 poliubikvitināciju. Cell Res. 23, 366–377 (2013).

37. Wi, SM et al. TAK1-ECSIT-TRAF6 kompleksam ir galvenā loma TLR4 signālā, lai aktivizētu NF-kappaB. J. Biol. Chem. 289, 35205–35214 (2014).

38. Min, Y., Kim, MJ, Lee, S., Chun, E. & Lee, KY. TRAF6 ubikvitīna-ligāzes aktivitātes inhibīcija ar PRDX1 izraisa NFKB aktivācijas un autofagijas aktivācijas inhibīciju. Autofagija, 14, 1347–1358 (2018).

39. Jiao, S. et al. Kināze MST4 ierobežo iekaisuma reakcijas, izmantojot tiešu adaptera TRAF6 fosforilāciju. Nat. Immunol. 16, 246–257 (2015).

40. Baudry, M. & Bi, X. Calpain-1 and Calpain-2: The Yin and Yang of Synaptic Plasticity and Neurodegeneration. Trends Neurosci. 39, 235–245 (2016).

41. Franco, SJ & Huttenlocher, A. Šūnu migrācijas regulēšana: kalpains padara griezumu. J. Cell Sci. 118, 3829–3838 (2005).

42. Katsube, M. et al. Kalpaīna mediēta atšķirīgo signalizācijas ceļu un šūnu migrācijas regulēšana cilvēka neitrofilos. J. Leukoc. Biol. 84, 255–263 (2008).

43. Schaecher, K., Goust, JM & Banik, NL Kalpaīna inhibīcijas ietekme uz IkB alfa degradāciju pēc PBMC aktivizēšanas: kalpaīna šķelšanās vietu noteikšana. Neurochem. Res. 29, 1443–1451 (2004).

44. Tompa, P. et al. Par kalpaīna šķelšanās secīgiem faktoriem. J. Biol. Chem. 279, 20775–20785 (2004).

45. Cuerrier, D., Moldoveanu, T. & Davies, PL Peptīdu substrāta specifiskuma noteikšana mu-kalpaīnam ar peptīdu bibliotēku balstītu pieeju: gruntētas sānu mijiedarbības nozīme. J. Biol. Chem. 280, 40632–40641 (2005).

46. ​​DuVerle, DA, Ono, Y., Sorimachi, H. & Mamitsuka, H. Calpain šķelšanās prognozēšana, izmantojot vairāku kodolu apguvi. PLoS One. 6, e19035 (2011).

47. Shi, CS & Kehrl, JH TRAF6 un A20 regulē ar lizīnu 63-saistīto Beklina ubikvitināciju-1, lai kontrolētu TLR4-inducēto autofagiju. Sci. Signāls. 3, ra42 (2010).

48. Loo, YM & Gale, M. Imūnsignalizācija ar RIG-I līdzīgiem receptoriem. Immunity 34, 680–692 (2011).

49. Ling, T. et al. TARBP2 inhibē IRF7 aktivāciju, nomācot ar TRAF6-mediētu K63- IRF7 ubikvitināciju. Mol. Immunol. 109, 116–125 (2019).

50. Zhou, Z. et al. Zebrafish otud6b negatīvi regulē pretvīrusu atbildes reakcijas, nomācot ar K63- saistītu irf3 un irf7 ubikvitināciju. J. Immunol. 207, 244–256 (2021).

51. Kobayashi, T., Walsh, MC & Choi, Y. TRAF6 loma signālu pārraidē un imūnreakcijā. Mikrobi inficē. 6, 1333–1338 (2004).

52. Wu, H. & Arron, JR TRAF6, molekulārais tilts, kas aptver adaptīvo imunitāti, iedzimto imunitāti un osteoimunoloģiju. Bioessays 25, 1096–1105 (2003).

53. Pickart, CM & Eddins, MJ Ubiquitin: struktūras, funkcijas, mehānismi. Biochim. Biophys. Acta. 1695, 55–72 (2004).

54. Pickart, CM & Fushman, D. Polyubikvitīna ķēdes: polimēru olbaltumvielu signāli. Curr. Atzinums. Chem. Biol. 8, 610–616 (2004).

55. Lamothe, B. et al. Vietnei specifiskā Lys-63-saistītā ar audzēja nekrozes faktora receptoriem saistītā 6. faktora auto-ubikvitinācija ir būtisks I kappa B kināzes aktivācijas noteicošais faktors. J. Biol. Chem. 282, 4102–4112 (2007).

56. Han, Y., Weinman, S., Boldogh, I., Walker, RK & Brasier, AR Audzēja nekrozes faktora alfa-inducējamā IkappaBalpha proteolīze, ko veic citosoliskais m-kalpaīns. Mehānisms, kas ir paralēls ubikvitīna-proteasomas ceļam kodolfaktora-kappa B aktivācijai. J. Biol. Chem. 274, 787–794 (1999).

57. Chu, Q. et al. Ļoti konservēta cirkulāra RNS circRasGEF1B uzlabo pretvīrusu imunitāti, regulējot miR-21-3p/MITA ceļu zemākajiem mugurkaulniekiem. J. Virols. 95, e02145–20 (2021).

58. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W. & Xu, T. ACKR4a inducē autofagiju, lai bloķētu NF-kappaB signālu pārraidi un apoptozi, lai atvieglotu Vibrio harveyi infekciju. iScience 26, 106105 (2023).

59. Sepulcre, MP et al. Lipopolisaharīdu (LPS) atpazīšanas un signālu evolūcija: zivs TLR4 neatpazīst LPS un negatīvi regulē NF kappaB aktivāciju. J. Immunol. 182, 1836–1845 (2009).

60. Zheng, W., Chu, Q. & Xu, T. Long noncoding RNA NARL regulē imūnās atbildes, izmantojot microRNA-mediētu NOD1 downregulation in teleost zivis. J. Biol. Chem. 296, 100414 (2021).

61. Zheng, W., Su, H., Lv, X., Xin, S. & Xu, T. Exon-Intron Circular RNS circRNF217 veicina iedzimtu imunitāti un antibakteriālo aktivitāti Teleost zivīs, samazinot miR-130-3p Funkcija. J. Immunol. 208, 1099–1114 (2022).

62. Xu, T., Chu, Q. & Cui, J. Ar rabdovīrusu inducējama mikroRNS-210 modulē pretvīrusu iedzimtu imūnreakciju, mērķējot uz STING/MITA zivīs. J. Immunol. 201, 982–994 (2018).

63. Bi, D. et al. Lipopolisaharīda atpazīšana un NF-kappaB aktivizēšana ar citosola sensoru NOD1 Teleost zivīs. Priekšpuse. Immunol. 9, 1413 (2018).

64. Yan, X., Zhao, X., Huo, R. & Xu, T. IRF3 and IRF8 Regulate NF-kappaB Signaling by Targeting MyD88 in Teleost Fish. Priekšpuse. Immunol. 11, 606 (2020).

65. Chen, Y., Cao, B., Zheng, W., Sun, Y. & Xu, T. eIF3k inhibē NF-kappaB signālu pārraidi, mērķējot uz MyD88 ATG5-mediētās autofagiskās degradācijas dēļ teleost zivīs. J. Biol. Chem. 298, 101730 (2022).

Jums varētu patikt arī