Herba Cistanches aizsargājošā iedarbība uz statīnu izraisītu miotoksicitāti in vitro
Mar 24, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Elīna Vata a,b,1, Čun Fai Ng a,b,1, Či Man Kūna a,b, Ēriks Čuns Vai Vongs a,b, Braiens Tomlinsons c, Klāra Bika San Lau a,b,n
Ķīniešu medicīnas institūts, Honkongas Ķīnas Universitāte, Šatina, Jaunās teritorijas, Honkonga
b Valsts galvenā fitoķīmijas un augu resursu laboratorija Rietumķīnā, Honkongas Ķīnas Universitāte, Šatina, Jaunās teritorijas, Honkonga
c Klīniskās farmakoloģijas nodaļa, Honkongas Ķīnas Universitātes Medicīnas un terapijas nodaļa, Šatina, Jaunās teritorijas, Honkonga
Abstract:
Etnofarmakoloģiskā nozīme: HerbaCistancas(HC,Cistanchedeserticola, vaiCistanchetubulosa) ir ķīniešu augs, ko tradicionāli izmanto muskuļu problēmu risināšanai. Iepriekšējie pētījumi parādīja, ka HC ekstrakts var samazināt muskuļu bojājumus un uzlabot ATP uzglabāšanu žurkām pēc treniņa. Tomēr tā ietekme uz statīnu izraisītu muskuļu toksicitāti nekad nav pētīta.
Mērķis:Šī pētījuma mērķis bija noteikt, vai HC (HCE) ūdens ekstrakts var novērst simvastatīna izraisītu toksicitāti L6 žurku skeleta muskuļu šūnās un vai verbaskozīds ir galvenā bioaktīvā sastāvdaļa, kas veicina ietekmi.
Materiāli un metodes:MTT tika veikta, lai noteiktu HCE ({0}}–2000 mg/ml) vai verbaskozīda (0–160 mM) ietekmi uz ar simvastatīnu (10 mM) apstrādātām L6 šūnām. Tika veikts aneksīna V-FITC / PI apoptozes tests un kaspāzes 3 tests, lai noteiktu HCE aizsargājošo lomu simvastatīna izraisītā šūnu nāvē un novērtētu, vai HCE iedarbināja savu aizsargājošo iedarbību caur kaspāzes ceļu. Tika mērīta ATP ražošana, lai noskaidrotu, vai HCE var novērst simvastatīna izraisītu ATP ražošanas samazināšanos in vitro.
Rezultāti:Simvastatīns ievērojami palielināja apoptotisko šūnu nāvi L6 šūnās. HCE ievērojami samazināja no devas atkarīgu simvastatīna izraisīto apoptotisko šūnu samazināšanos, iespējams, izmantojot kaspāzes -3 ceļu. Simvastatīns samazināja ATP veidošanos L6 šūnās, ko no devas atkarīgi novērsa HCE. Verbaskozīdam bija tikai tendence, bet ne nozīmīga ietekme (izņemot lielu devu) uz aizsardzību pret simvastatīna izraisītu muskuļu toksicitāti.
Secinājumi:Noslēgumā mēs pirmo reizi parādījām, ka HCE var radīt no devas atkarīgu aizsargājošu efektu uz simvastatīna izraisītu toksicitāti in vitro, kas bija maz ticams verbaskozīda klātbūtnes dēļ. Mūsu pētījums liecināja par iespējamu HC izmantošanu simvastatīna izraisītas muskuļu toksicitātes situācijā.
Atslēgvārdi:HerbaCistancas, Statīns Holesterīns, Hiperlipidēmija, Muskuļu toksicitāte, Verbaskozīds, Kaspāze-3
1. Ievads
HMG-CoA reduktāzes inhibitori (statīni), kas ir pasaulē vislabāk pārdotā recepšu zāļu klase vēsturē, ir labi dokumentēti, jo tie ir noderīgi abu dzimumu pacientiem dažādos vecumos ar mērenu un augstu sirds un asinsvadu slimību (CVD) risku (Golomb un Evans, 2008). Pēc tam tika izstrādāti un klīniski apstiprināti dažādi statīni, tostarp pravastatīns, atorvastatīns, fluvastatīns, lovastatīns, pitavastatīns, rosuvastatīns un simvastatīns. Kopumā visi statīni darbojas, inhibējot HMG-CoA reducēšanos par mevalonskābi agrīnā mevalonāta ceļa posmā, lai samazinātu holesterīna veidošanos (Kromer un Moosmann, 2009; Thompson et al., 2003). Lai gan statīni parasti ir labi panesami, viena no svarīgākajām un labi zināmajām klīniskajām blakusparādībām ir skeleta muskuļu toksicitāte (rabdomiolīze) (Kobayashi et al., 2008). Skeleta muskuļu anomālijas var būt no labdabīgas mialģijas līdz smagai miopātijai. Lai gan ir ierosināts dažādu mehānismu kopums, kas varētu būt atbildīgs par statīna nelabvēlīgo ietekmi uz muskuļiem, tiek uzskatīts, ka mitohondriju mehānismiem ir svarīga loma (Golomb un Evans, 2008). Mevalonāts ir ne tikai holesterīna prekursors, bet arī citiem savienojumiem, tostarp selenoproteīniem, doliholam un ubihinonam (Kaufmann et al., 2006; Vaklavas et al., 2009). Statīnu spēja inhibēt mevalonātu tādējādi arī kavētu selenoproteīnu, piemēram, glutationa peroksidāzes (GPx), ražošanu, kas ir svarīgi enzīmi antioksidatīvās aizsardzības mehānisma uzturēšanā (Kromer un Moosmann, 2009). Statīni var izraisīt arī ubikinona samazināšanos, izraisot skābekļa patēriņa un ATP sintēzes samazināšanos (Beltowski et al., 2009). Turklāt pieaugošie in vitro un in vivo pētījumi parādīja, ka statīns var arī tieši iedarboties uz audu mitohondrijiem, lai inducētu no Ca2þ atkarīgu membrānas caurlaidības pāreju (MPT) no devas atkarīgā veidā (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006). ). Tas ir saistīts arī ar palielinātu reaktīvo skābekļa sugu (ROS) un mitohondriju oksidatīvo stresu, kas izraisa šūnu nāvi un tādējādi veicina aknu un muskuļu bojājumus (Beltowski et al., 2009; Velho et al., 2006).
HerbaCistancas, viss kaltētais Cistanche deserticola YC Ma jeb Cistanche tubulosa (Schrenk) Wight (Orobanchaceae dzimta) ir parazītaugi, kas pārsvarā aug Ķīnas ziemeļu un ziemeļaustrumu tuksnešainajos apgabalos (Siu un Ko, 2010).HerbaCistancasir Jangu uzmundrinošs ķīniešu tonizējošais augs, ko galvenokārt izmanto nieru mazspējas ārstēšanai ar tādiem simptomiem kā impotence, neauglība, priekšlaicīga ejakulācija. Smagais un saraustītais garšaugs arī mitrina zarnas un palīdz mazināt aizcietējumus. Tas ir arī ķīniešu augs, ko tradicionāli izraksta pacientiem pret sāpēm jostasvietā un ceļgalos, un tas ir augs, ko parasti izmanto ķīniešu preparātos muskuļu problēmu ārstēšanai (Siu un Ko, 2010; Xiong et al., 1998). Interesanti, ka tas atbilst arī mūsdienu zinātniskajiem pētījumiem, kas pierādīja ar polisaharīdiem un feniletanoīdiem bagāta ekstrakta pretnoguruma iedarbību.HerbaCistancasžurkām pēc treniņa, samazinot muskuļu bojājumus un uzlabojot ATP uzglabāšanu (Cai et al., 2010). Nesenais darbs parādīja, ka Herba Cistanches metanola ekstrakts var uzlabot mitohondriju ATP veidošanos (Leung un Ko, 2008). Siu un Ko (2010) to pierādījaHerbaCistancasvarētu arī uzlabot mitohondriju glutationa statusu, mediējot glutationa sintēzes un GPx līmeni, tādējādi aizsargājot audus no oksidatīvā stresa žurku sirdīs. To parādīja arī Siu un Ko (2010).HerbaCistancasvarētu samazināt mitohondriju Ca2 saturu, tādējādi samazinot no Ca2 atkarīgo MPT. TurklātHerbaCistancasTika arī pierādīts, ka tas ir spēcīgs antioksidants un brīvo radikāļu uztvērējs dažādos orgānos, samazinot oksidatīvo stresu un ROS aktivitātes in vivo pētījumos (Lu et al., 1995; Sui et al., 2011). Vēl interesantāk, mēģinot noteikt aktīvo frakciju, kas veicina pretnoguruma aktivitātiHerbaCistancas, tika konstatēts, ka verbaskozīds bija galvenā aktīvās frakcijas sastāvdaļa (Cai et al., 2010). Ir pierādīts, ka verbaskozīds mazina arī krupju muskuļu nogurumu, iespējams, pateicoties tā antioksidanta iedarbībai (Liao et al., 1999), kas liecina, ka verbaskozīds varētu būt bioaktīvā sastāvdaļa, kas veicina Herba Cistanches labvēlīgo ietekmi.
Šī pētījuma mērķis bija noteikt, vai augu Cistanches ūdens ekstrakta (HCE) izmantošana varētu samazināt simvastatīna izraisīto muskuļu toksicitāti in vitro. Tika izvirzīta hipotēze, ka HCE lietošana varētu koriģēt simvastatīna izraisītās muskuļu toksicitātes blakusparādības. Tika arī mēģināts noteikt, vai labvēlīgā ietekme irHerbaCistancastiek attiecināti uz verbaskosīda klātbūtni.
2. Materiāli un metodes
2.1. Augu izcelsmes materiālu autentifikācija un sagatavošana
Augu izcelsmes izejvielas noHerbaCistancastika iegādāts no slavena piegādātāja Guandžou, Ķīnā.HerbaCistancastika ķīmiski autentificēts, izmantojot plānslāņa hromatogrāfiju (TLC) saskaņā ar Ķīnas farmakopeju (CP), 2010, ar verbaskozīdu un ehinakozīdu kā ķīmiskajiem marķieriem (dati nav parādīti). Pēc ķīmiskās autentifikācijas herbārija kupona paraugsHerbaCistancastika deponēts Ķīnas Medicīnas institūta muzejā Honkongas Ķīnas Universitātē (CUHK) ar kupona parauga numuru 2014–3434.
Īsumā, 1 kg neapstrādāta zālaugu mērcēja 1 stundu, kam sekoja divreiz ekstrakcija, karsējot 1 stundu ar atteci 100 grādu temperatūrā, katrai ekstrakcijai izmantojot 10 destilētu ūdeni. Ūdens ekstrakti (HCE) tika apvienoti un filtrēti. Filtrāts tika koncentrēts pazeminātā spiedienā pie 60 grādiem. Koncentrētais ekstrakts tika liofilizēts līdz sausumam. Ienesīgums bija 50,1 % w/w. Neliels daudzums tika izmantots, lai noteiktu verbaskozīda un ehinakozīda daudzumu, izmantojot ultra-efektivitātes šķidruma hromatogrāfiju (UPLC). Viss ekstrahētais pulveris tika iepakots vakuumā un uzglabāts līdz lietošanai.
2.2. Ūdens ekstrakta UPLC analīze
UPLC analīzes tika veiktas, izmantojot Waters Acquity Ultra Performance LC sistēmu (Waters, ASV). Visi UPLC analīzēm nepieciešamie šķīdinātāji tika iegādāti Honkongas Ķīnas universitātes Ķīmijas katedrā. Verbaskozīds un ehinakozīds tika iegādāti no Nacionālā farmaceitisko un bioloģisko produktu kontroles institūta Ķīnā. Parauga šķīdums tika ievadīts Waters Acquity UPLC BEH C18 kolonnā (10{{20}} 2,1 mm2 id, daļiņu izmērs 1,7 mm) ar Waters ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard priekškolonnu ( 5-2,1 mm2 id, daļiņu izmērs 1,7 mm). Visi šķīdinātāji tika iepriekš filtrēti ar 0,45 mm Millipore filtra disku (Millipore) un atgāzēti. Gradienta eluēšana tika veikta, izmantojot šādas šķīdinātāju sistēmas: kustīgā fāze A – acetonitrils; kustīgā fāze B – divreiz destilēts ūdens/skudrskābe (99,9/ 0.1; v/v). Eluēšana tika veikta ar gradienta procedūru šādi: 0–5 min, 88 procenti B; 5–10 min, no 88 procentiem B līdz 83 procentiem B. Izmantotais plūsmas ātrums bija 0,4 ml/min, un noteikšana tika veikta pie 331 nm saskaņā ar CP (2010). Katrs paraugs (5 ul) tika ievadīts kolonnā pēc filtrēšanas caur 0, 2 mm filtra disku. Ķīmisko marķieru identificēšana tika veikta, salīdzinot nezināmo pīķu aiztures laikus un UV absorbciju ar standartiem. Kvantitatīvai noteikšanai tika uzzīmēta kalibrēšanas līkne, izmantojot virkni verbaskozīda un ehinakozīda koncentrāciju (40, 20, 10, 5, 2,5 un 1,25 mg/ml). Verbaskozīda un ehinakozīda kvantitatīvā noteikšana augu ekstraktā tika veikta trīs eksemplāros. Sistēmu uzraudzīja dators, kas aprīkots ar Waters MassLynx programmatūru datu vākšanai, integrācijai un analīzei.
2.3. Šūnu kultūra
L6 žurku skeleta muskuļu šūnu līnija tika iegādāta no American Type Culture Collection (ATCC, Manassa, VA, ASV). Šūnas tika uzturētas subkonfluentā blīvumā Dulbecco's Modifified Eagle's Medium (DMEM, ATCC, Manasas, VA, ASV), kas papildināts ar 10% v/v liellopu augļa serumu (FBS) un 1% penicilīna-streptomicīna (P/S), un inkubēts 37 grādu temperatūrā mitrinātā atmosfērā, kas satur 5 procentus CO2 un 95 procentus gaisa.
Lai noteiktu HCE ietekmi uz statīnu izraisītu muskuļu toksicitāti, L6 šūnas tika apstrādātas ar simvastatīnu 10 μM 48 stundas, lai izraisītu toksicitāti. HCE (koncentrācijās 0, 250, 500, 1000 un 2000 ug/ml) vai verbaskozīdu (koncentrācijās 0, 20, 40, 80 un 160 μM) pievienoja kā vienlaicīgu ārstēšanu ar statīnu, lai noteiktu, vai augu ekstrakts varētu novērst statīnu izraisīto toksicitāti skeleta muskuļu šūnās un, ja verbaskozīdam varētu būt līdzīga aizsargājoša iedarbība kā augu ūdens ekstraktam.
Herba Cistanche ekstrakta aizsargājoša iedarbība uz simvastatīna izraisītu toksicitāti in vitro
2.4. In vitro citotoksicitāte
L6 šūnas (1x105/iedobē) tika iesētas {{0}}iedobēs plakandibena kultivēšanas plāksnēs (Iwaki, Japāna) uz nakti, kam sekoja apstrāde ar 10 μM simvastatīna kopā ar vai bez dažādām HCE devām ( 0–2000 ug/ml) vai verbaskozīdu (0–160 μM), 48 stundas. Kontroles iedobēm tika pievienota vienkārša barotne (DMEM). Augu ekstrakts un savienojums tika izšķīdināti DMEM.
Pēc 48 stundu ilgas apstrādes barotne no visām šūnām tika izmesta un 30 ul 5 mg/ml 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,{{ Katrā iedobē tika pievienots 8}}difeniltetrazolija bromīds (MTT; Sigma, ASV) fosfātu buferšķīdumā (PBS) un plāksnes tālāk inkubēja 3 stundas 37 grādu temperatūrā. Pēc tam supernatants tika noņemts un katrā iedobē tika pievienots 100 ul DMSO, lai izšķīdinātu purpursarkanos formazāna kristālus (Sigma-Aldrich, Sentluisa, MO. ASV). Katra parauga absorbcija tika nolasīta pie 540 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Biotek μ-Quant, ASV). Rezultāti tika izteikti kā MTT absorbcijas procents attiecībā pret kontroles šūnām.
2.5. Anneksīna-V FITC/PI krāsošanas tests
L6 šūnas (3 x 105/ labi) tika ārstēti ar simvastatīnu kopā ar vai bez dažādām HCE vai verbaskozīda devām. Pēc tam šūnas tika savāktas, mazgātas un iekrāsotas ar aneksīna-V FITC komplektu saskaņā ar ražotāja protokolu (Trevigen, MD, ASV). Īsumā, šūnas divas reizes nomazgāja ar 1x saistīšanas buferšķīdumu un 15 minūtes istabas temperatūrā tumsā 100 ul marķēšanas šķīdumā, kas satur 1 ul aneksīna-V FITC konjugātu un 10 ul PI, tumsā. Paraugu fluorescence tika noteikta ar plūsmas citometriju (Becton Dickinson FACSCanto II, ASV).
2.6. Kaspāzes 3 aktivitātes tests
Kaspāzes 3 aktivitāte tika noteikta, izmantojot fluorometrisko imūnsorbcijas enzīmu testu (Sigma) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, L6 šūnas (3 105 iedobē), kas tika apstrādātas ar simvastatīnu kopā ar vai bez dažādām HCE verbaskozīda devām, tika lizētas, izmantojot līzes buferi. Brīvais 7-amino-4-metilkumarīns (AMC), kas rodas substrāta proteolītiskā šķelšanā ar kaspāzes 3 palīdzību, tika izmērīts un kvantificēts fluorometriski ar ierosmes viļņa garumu pie 360 nm un emisijas viļņa garumu pie 460 nm ar BMG cropmiliostar Optima FLUOstar. lasītājs (BMG LABTECH GmbH, Vācija).
2.7. Šūnu ATP tests
L6 šūnas (3x105/ labi) tika ārstēti ar simvastatīnu kopā ar vai bez dažādām HCE vai verbaskozīda devām. Pēc apstrādes šūnas tika savāktas un ATP saturs tika mērīts, izmantojot komerciāli pieejamo kolorimetrisko komplektu (Abcam, UK), mērot glicerīna fosfāta saturu lizētās šūnās un nolasot pie 570 nm, izmantojot mikroplašu lasītāju (Biotek μ-Quant, ASV). ). ATP ražošanas mērījums tika izteikts procentos attiecībā pret kontroles grupu.
2.8. Statistiskā analīze
Dati tika parādīti kā mean7SD, statistikas analīzei tika izmantota Prism 5 for Window (versija 5.{3}}c, GraphPad Software, Inc., ASV). Būtiskas atšķirības starp visām grupām tika novērtētas ar vienvirziena ANOVA, kam sekoja Bonferroni vairāku salīdzināšanas tests. Po0.05 varbūtība tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu.
3. Rezultāti
3.1. Herba Cistanches ūdens ekstrakta UPLC analīze
S1A attēlā parādīts UPLC profils standarta maisījumam, kas satur ehinakozīdu un verbaskozīdu. Katra šī marķiera aiztures laika punkti tika salīdzināti ar UPLC profiluHerbaCistancasūdens ekstrakts (S1B att.). Ehinakozīda un verbaskozīda daudzums iekšāHerbaCistancastika konstatēts, ka ūdens ekstrakts ir attiecīgi {{0}},45 % w/w un 0,085 % w/w.
3.2. HCE un verbaskozīda ietekme uz simvastatīna citotoksicitāti in vitro L6 skeleta muskuļu šūnās
Kā parādīts 1.A attēlā, simvastatīns izraisīja ievērojamu citotoksicitāti L6 šūnām, par ko liecina ievērojams L6 šūnu dzīvotspējas samazinājums pie 10 mM simvastatīna. Ārstēšana ar HCE atkarībā no devas un būtiski novērsa simvastatīna izraisīto citotoksicitāti pie 500, 1000 un 2000 mg/ml. Verbaskosīdam bija tendence uzlabot ar simvastatīnu vienlaikus apstrādāto L6 šūnu dzīvotspēju. Tomēr neviena no koncentrācijām nebija sasniegusi statistisku nozīmīgumu (1.B att.).
1. attēls. (a) HCE aizsargājošā iedarbība; un (b) verbaskozīds uz simvastatīna izraisītu citotoksicitāti L6 šūnās. Vērtības apzīmē vidējos 7SD (n¼3). Būtiska atšķirība starp ārstēšanu tikai ar simvastatīnu un kontroles grupu, izmantojot Stjudenta t-testu: ### po0.{{10}}01. Būtiska atšķirība starp visām simvastatīnu ārstētajām grupām ar vai bez HCE verbaskozīda vienlaicīgas terapijas, izmantojot vienvirziena ANOVA: ** po0,01,*** po0,001.
3.3. HCE un verbaskozīda ietekme uz simvastatīna izraisītu šūnu nāvi L6 skeleta muskuļu šūnās
Lai pārbaudītu simvastatīna izraisīto šūnu nāves veidu un noteiktu HCE vai verbaskozīda aizsargājošo lomu simvastatīna izraisītajā šūnu nāvē, apoptotisko šūnu īpatsvars tika noteikts ar propīdija jodīda (PI) krāsošanu. Rezultāti parādīja, ka simvastatīns izraisīja ievērojamu agrīnu apoptotisko šūnu (Aneksīna V-FITC pozitīvas un PI negatīvas, Q4–2) un vēlu apoptotisko/mirušo šūnu (Aneksīna V-FITC pozitīvas un PI pozitīvas, Q2– 2) salīdzinot ar kontroles grupu. Vienlaicīga ārstēšana ar HCE samazināja agrīnu apoptotisko un vēlu apoptotisko/mirušo šūnu īpatsvaru atkarībā no devas līdz 1000 mg/ml (2.A att.). Šis aizsargājošais efekts tika novērots arī verbaskozīda kopterapijas grupās. Tomēr neviena no pārbaudītajām koncentrācijām nebija sasniegusi statistisku nozīmīgumu (2.B att.).
2. attēls. Simvastatīna ar vai bez HCE vai verbaskozīda kopterapijas ietekme uz fosfatidilserīna eksternalizāciju L6 šūnās. Šūnas tika iekrāsotas ar aneksīna-V FITC un I un noteiktas ar plūsmas citometriju
3.4. HCE un verbaskozīda ietekme uz kaspāzes 3 aktivitāti L6 skeleta muskuļu šūnās, kas apstrādātas ar simvastatīnu
Kā parādīts 3.A attēlā, 10 mM simvastatīns būtiski inducēja kaspāzes 3 aktivitāti L6 šūnās, kas liecina par simvastatīna izraisītu L6 šūnu apoptozi caur kaspāzes kaskādi. Tomēr L6 šūnās, kas vienlaikus apstrādātas ar simvastatīnu un HCE, HCE atkarībā no devas un ievērojami samazināja kaspāzes 3 aktivitāti, kas liecina par HCE spēju novērst simvastatīna izraisītu apoptozi caur kaspāzes kaskādi. No otras puses, lai gan verbaskozīdam bija arī tendence samazināt simvastatīna izraisīto kaspāzes 3 enzīma aktivitātes palielināšanos, statistisku nozīmīgumu sasniedza tikai koncentrācija pie 160 mM (3.B attēls).
3. attēls. (a) HCE aizsargājošā iedarbība; un (b) verbaskozīds uz simvastatīna inducētu kaspāzes 3 enzīmu aktivitāti L6 šūnās. Vērtības apzīmē vidējos 7SD (n¼3–5). Būtiska atšķirība starp ārstēšanu tikai ar simvastatīnu un kontroles grupām, izmantojot Stjudenta t-testu: ###po0.001. Būtiska atšķirība starp visām simvastatīnu ārstētajām grupām ar vai bez HCE vai verbaskozīda vienlaicīgas terapijas, izmantojot vienvirziena ANOVA: *po0.05, **p o0.01, ***po0.001.
3.5. HCE ietekme uz simvastatīna izraisītu ATP ražošanas samazināšanos L6 skeleta muskuļu šūnās
Simvastatīns (10 mM) ievērojami samazināja ATP veidošanos L6 šūnās par aptuveni 60 procentiem salīdzinājumā ar kontroles grupu (4.A attēls). HCE vienlaicīga terapija no devas atkarīgi mazināja ATP ražošanas samazināšanos ar simvastatīnu ārstētās šūnās, no kurām tikai koncentrācija pie 500, 1000 un 2000 mg/ml bija sasniegusi statistisku nozīmīgumu. No otras puses, lai gan verbaskozīdam bija tendence atjaunot ATP veidošanos pie 50 mg/ml, tas nesasniedza statistisku nozīmīgumu (4.B att.).
4. attēls. (a) HCE un (b) verbaskozīda aizsargājošā iedarbība uz simvastatīna izraisītu ATP ražošanas samazināšanos L6 šūnās. Vērtības apzīmē vidējos 7SD (n¼3–5). Būtiska atšķirība starp ārstēšanu tikai ar simvastatīnu un kontroles grupām, izmantojot Stjudenta t-testu: ###po0.001. Būtiska atšķirība starp visām simvastatīnu ārstētajām grupām ar vai bez HCE vai verbaskozīda vienlaicīgas terapijas, izmantojot vienvirziena ANOVA: *po0,05, **po0,01.
4. Diskusija
Pasaulē pieaugot sirds un asinsvadu slimību (CVD) izplatībai un pacientiem, kuriem diagnosticēta hiperholesterinēmija, statīnu lietošana ir kļuvusi izplatītāka. Lai gan statīni kopumā ir ļoti labi panesami, muskuļu traumas ir bieži ziņots ar statīnu lietošanu saistīta blakusparādība, kas var rasties akūti nedēļas vai mēnešus pēc zāļu lietošanas uzsākšanas (Fine, 2003). Muskuļu simptomi var atšķirties no vieglām problēmām, piemēram, sāpēm, jutīguma vai vājuma ar kreatīnkināzes (CK) līmeņa paaugstināšanos vai bez tā, līdz vissmagākajam rabdomiolīzes stāvoklim (Armitage, 2007; Hu et al., 2012). Sakarā ar šo blakusparādību rašanos un to, ka nav efektīvas ārstēšanas pret statīnu izraisītu muskuļu toksicitāti, statīni joprojām netiek izmantoti. Plašā aptaujā par 10 409 franču subjektiem, kas tika veikti telefona intervijā, 10 procenti pacientu, kuri saņēma ārstēšanu ar statīniem, ziņoja par muskuļu simptomiem, no kuriem 30 procenti no šiem simptomātiskajiem pacientiem izraisīja ārstēšanas pārtraukšanu (Rosenbaum et al., 2013).
Mēs pirmo reizi esam pierādījuši, ka ūdens ekstrakts noHerbaCistancas, plaši izmantots tradicionāls ķīniešu augs, kas var radīt aizsargājošu efektu pret simvastatīna izraisītu toksicitāti in vitro L6 skeleta muskuļu šūnās, kas liecina par potenciāluHerbaCistancasūdens ekstrakts (HCE) ar savu aizsargājošo lomu statīnu izraisīto muskuļu toksicitāti, kas ir atzīta bieža blakusparādība pacientiem, kuri lieto statīnus. Tāpēc HCE spēcīgajai spējai aizsargāt pret statīnu izraisītu muskuļu toksicitāti būtu liels potenciāls.
Saskaņā ar tradicionālo teoriju TCM, Yang ir saistīts ar mitohondriju enerģijas metabolismu organismā, un tika konstatēts, ka Yang uzmundrinošu garšaugu recepte uzlabo mitohondriju ATP veidošanos (Ko un Leung, 2007). Interesanti, ka mēs novērojām ATP ražošanas samazināšanos ar simvastatīnu ārstētās L6 skeleta muskuļu šūnās, un šis ATP ražošanas samazinājums tika ievērojami uzlabots, vienlaikus ārstējot ar HCE. Mūsu pētījumā, izmantojot L6 žurku skeleta muskuļu šūnas, mēs parādījām simvastatīna izraisītu šūnu dzīvotspējas samazināšanos. Šis šūnu dzīvotspējas samazinājums tika ievērojami uzlabots, vienlaikus ārstējotHerbaCistancasno devas atkarīgā veidā. Lai gan precīzs statīnu izraisītas muskuļu toksicitātes mehānisms nav pilnībā noskaidrots, tika ierosināts, ka statīnu izraisīta veselu skeleta miocītu apoptoze ir faktors, kas izraisa miopātiju, kas ir visizplatītākā blakusparādība, ar kuru saskaras statīnu lietotāji (Dirks un Jones, 2006). . Mūsu pētījumā mēs novērojām ievērojamu simvastatīna izraisīto apoptotisko šūnu pieaugumu, kas bija saistīts ar ievērojami paaugstinātu kaspāzes 3 aktivitāti. Šie dati atbilst arī iepriekšējiem pētījumiem, kas parādīja, ka dažādi statīni var izraisīt apoptozi skeleta mioblastos, miotubos un diferencētās primārās cilvēka skeleta muskuļu šūnās, aktivizējot kaspāzes-9 un kaspāzes-3 aktivitātes (Dirks). un Džounss, 2006). Mūsu HCE spēja novērst šo simvastatīna izraisīto kaspāzes -3 aktivētās apoptozes palielināšanos atkarībā no devas.
HerbaCistancas
Turklāt iepriekšējā literatūrā ir norādīts, ka verbaskozīds ir viena no galvenajām aktīvajām sastāvdaļāmHerbaCistancas. Verbaskozīds, pazīstams arī kā akteozīds, pieder pie feniletanoīdu glikozīdu grupas, kas ir dabiski sastopama polifenolu savienojumu grupa, kas šķīst ūdenī (Liao et al., 1999). Iepriekš tika pierādīts, ka verbaskozīds ir spēcīgs antioksidants, kam var būt spēcīga ROS attīrīšanas un antioksidanta iedarbība (Liao et al., 1999). Mūsu pētījumā, lai noteiktu, vai verbaskozīds ir mūsu HCE galvenā sastāvdaļa, kas veicina novēroto labvēlīgo ietekmi, mēs pārbaudījām verbaskozīda ietekmi pie koncentrācijām 0–160 mM. Tā kā mēs esam pierādījuši, ka mūsu HCE ir aktīvs koncentrāciju diapazonā no 250–2000 mg/ml, pamatojoties uz mūsu HPLC rezultātiem, kas liecināja, ka mūsu HCE satur verbaskozīdu koncentrācijā 0,085 % masas. /wt, verbaskozīda aktīvajai koncentrācijai jābūt diapazonā no 0,2125–1,7 mg/ml (ti, 0,34–2,72 mM), vai verbaskozīdam ir jābūt aktīvajai sastāvdaļai? Tomēr mums neizdevās novērot būtisku verbaskozīda labvēlīgo ietekmi ar pārbaudīto koncentrācijas diapazonu, lai gan mēs novērojām no devas atkarīgu tendenci verbaskozīda labvēlīgai ietekmei uz L6 skeleta muskuļu šūnām. Šie dati liecināja, ka mūsu HCE labvēlīgā ietekme, kas novērota L6 skeleta šūnās, visticamāk, nav saistīta tikai ar verbaskozīda iedarbību, liekot domāt, ka par novēroto labvēlīgo ietekmi varētu būt citi komponenti, nevis verbaskozīds. Ir arī iespējams, ka verbaskozīds var mijiedarboties ar citiem bioloģiski aktīviem savienojumiem ekstraktā, lai veicinātu labvēlīgo ietekmi. Papildu eksperimenti, izmantojot biotestu vadītu frakcionēšanu, būs noderīgi, lai sniegtu papildu ieskatu bioaktīvo komponentu atklāšanā, kas ir atbildīgi par novēroto HCE aizsargājošo iedarbību uz simvastatīna izraisītu muskuļu toksicitāti.
Noslēgumā jāsaka, ka šis pētījums norāda, ka HCE var radīt spēcīgu aizsargājošu iedarbību uz simvastatīna izraisītu muskuļu šūnu dzīvotspējas samazināšanos in vitro. Šie rezultāti sniedz provizoriskus pierādījumus, kas liecina, ka mūsu HC ūdens ekstraktam varētu būt terapeitiska vērtība kā funkcionālam pārtikai vai uztura bagātinātājam hiperlipidēmijas pacientiem, kuriem statīnu izraisītas miotoksicitātes dēļ ir jāpārtrauc ārstēšana ar statīniem.
Pateicība Šo pētījumu finansiāli atbalstīja Pārtikas un veselības birojs HKSAR, Veselības un medicīnas pētījumu fonds Nr. 11120831.
Atsauces
Armitage, J., 2007. Statīnu drošība klīniskajā praksē. Lancet 370, 1781–1790.
Beltowski, J., Wojcicka, G., Jamroz-Wisniewska, A., 2009. Statīnu nelabvēlīgā ietekme – mehānismi un sekas. Curr. Narkotiku Saf. 4, 209–228.
Cai, RL, Yang, MH, Shi, Y., Chen, J., Li, YC, Qi, Y., 2010. Cistanche deserticola ar feniletanoīdu bagātā ekstrakta pretnoguruma aktivitāte. Fitotēra. Res. 24, 313–315.
Dirks, AJ, Jones, KM, 2006. Statīnu izraisīta apoptoze un skeleta miopātija. Am. J. Physiol. Šūnu fiziol. 291, C1208–C1212.
Fine, DM, 2003. Ar statīnu saistīta muskuļu toksicitāte. Clin. Pharmacol. 3, 554.
Golomb, BA, Evans, MA, 2008. Statīnu nelabvēlīgā ietekme: literatūras apskats un pierādījumi par mitohondriju mehānismu. Am. J. Cardiovasc. Drugs 8, 373–418.
Hu, M., Cheung, BM, Tomlinson, B., 2012. Statīnu drošība: atjauninājums. Tur. Adv. Narkotiku Saf. 3, 133–144.
Kaufmann, P., Torok, M., Zahno, A., Waldhauser, KM, Brecht, K., Krahenbuhl, S., 2006. Statīnu toksicitāte žurku skeleta muskuļu mitohondrijās. Šūna. Mol. Life Sci. 63, 2415–2425.
Ko, KM, Leung, HY, 2007. ATP ģenerēšanas spējas, antioksidantu aktivitātes un imūnmodulējošo aktivitāšu uzlabošana, izmantojot ķīniešu jaņ un iņ tonizējošos augus. Zods. Med. 2, 3.
Kobayashi, M., Kagawa, T., Narumi, K., Itagaki, S., Hirano, T., Iseki, K., 2008. Bikarbonāta papildināšana kā preventīvs veids statīnu izraisītu muskuļu bojājumu gadījumā. J. Pharm. Pharm. Sci. 11, -8.
Kromer, A., Moosmann, B., 2009. Statīnu izraisīts aknu bojājums ietver holesterīna un selenoproteīna biosintēzes ceļu savstarpēju sarunu. Mol. Pharm. 75, 1421–1429.
Leung, HY, Ko, KM, 2008. Herba Cistanche ekstrakts uzlabo mitohondriju ATP veidošanos žurku sirdīs un H9C2 šūnās. Pharm. Biol. 46, 418.
Liao, F., Zheng, RL, Gao, JJ, Jia, ZJ, 1999. Skeleta muskuļu noguruma kavēšana ar diviem fenilpropanoīda glikozīdiem: verbaskozīdu un martensītu no Pedicularis plicata Maxim. Fitotēra. Res. 13, 621–623.
Lu, KG, Liu, HB, Gu, QQ, 1995. Pētījums par Cistanche deserticola Ma ķīmiskajām sastāvdaļām. un Cistanche salsa (CA Mey) G. Beck. Zods. Tradīcija. Garšaugs. Narkotikas 26, 143.
Farmakopejas komisija, 2010. Ķīnas Tautas Republikas farmakopeja. Ķīmiskās rūpniecības prese, Pekina.
Rosenbaum, D., Dallongeville, J., Sabouret, P., Bruckert, E., 2013. Statīnu terapijas pārtraukšana muskuļu blakusparādību dēļ: aptauja reālajā dzīvē. Nutr. Metab. Sirds un asinsvadu sistēmas. Dis. 23, 871-875.
Siu, AH, Ko, KM, 2010. Herba Cistanche ekstrakts uzlabo mitohondriju glutationa stāvokli un elpošanu žurku sirdīs, iespējams, indukējot atdalošos proteīnus. Pharm. Biol. 48, 512–517.
Sui, ZF, Gua, TM, Liu, B., Peng, SW, Zhao, ZL, Li, L., Shi, DF, Yang, RY, 2011. Ūdenī šķīstošs ogļhidrātu savienojums noHerbaCistancas: izolācija un tās attīrošā iedarbība uz brīvajiem radikāļiem ādā. Ogļhidrāti. Polim. 85, 75.
Thompson, PD, Clarkson, P., Karas, RH, 2003. Ar statīnu saistīta miopātija. JAMA 289, 1681–1690.
Vaklavas, C., Chatzizisis, YS, Ziakas, A., Zamboulis, C., Giannoglou, GD, 2009. Molecular basic of statin-associated myopathy. Ateroskleroze 202, 18-28.
Velho, JA, Okanobo, H., Degasperi, GR, Matsumoto, MY, Alberici, LC, Cosso, RG, Oliveira, HC, Vercesi, AE, 2006. Statīni inducē kalcija atkarīgu mitohondriju caurlaidības pāreju. Toksikoloģija 219, 124–132.
Xiong, Q., Hase, K., Tezuka, Y., Tani, T., Namba, T., Kadota, S., 1998. Hepatoprotective activity of phenylethanoids from Cistanche deserticola. Planta Med. 64, 120–125.
