RNA M6 A lasītājs YTHDF2 kontrolē NK šūnu pretaudzēju un pretvīrusu imunitāti, 3. daļa

YTHDF2 ir nepieciešams IL-15 mediētu NK šūnu izdzīvošanai, proliferācijai un efektora funkcijām

IL-15 ir viens no, ja ne vissvarīgākajiem citokīniem NK šūnu pleiotropiskajām funkcijām. Mēs un citi iepriekš atklājām, ka IL-15 spēlē galveno lomu NK šūnu homeostāzes, izdzīvošanas un efektora funkciju regulēšanā (Becknell un Caligiuri, 2005; Carsonet al., 1997; Carson et al., 1994; Wang et al., 2019b; Yu et al., 2013).

Šūnu pleiotropija attiecas uz to spēju veikt dažādas funkcijas dažādās vidēs. Šūnu pleiotropija ir cieši saistīta ar imunitāti, jo daudzām imūnsistēmas šūnām var būt dažādas lomas.

Imūnsistēmā T šūnas ir ļoti kritisks šūnu veids. Viņi atpazīst un uzbrūk patogēniem, vienlaikus regulējot arī citu imūno šūnu darbību. T šūnu pleiotropija ir ļoti svarīga, jo, kad imūnsistēma saskaras ar jaunu patogēnu, T šūnām īsā laika posmā ir jāspēlē dažādas lomas, lai efektīvi reaģētu. Piemēram, kad imūnsistēma saskaras ar bakteriālu infekciju, T šūnām ir jāpilda baktēriju nogalināšanas loma, un, kad imūnsistēma saskaras ar vīrusu infekciju, T šūnām ir jāregulē citas imūnās šūnas.

Turklāt imūnsistēmā šūnu klasei, ko sauc par makrofāgiem, ir arī pleiotropiska iedarbība. Tie var fagocitēt un noārdīt svešus patogēnus, kā arī var aktivizēt citas imūnās šūnas, lai uzbruktu patogēniem. Makrofāgu pleiotropija ir svarīga, jo tiem dažādās vidēs ir jāspēlē dažādas lomas. Piemēram, vīrusu infekciju gadījumā makrofāgiem ir jāizdala dažas vielas, lai cīnītos ar vīrusu, savukārt bakteriālu infekciju gadījumā makrofāgiem ir jāapņem un jāsagremo baktērijas, lai atbrīvotos no patogēna.

Rezumējot, pastāv cieša saikne starp šūnu pleiotropiju un imunitāti. Pleiotropās šūnas var spēlēt dažādas lomas vidē, ko inficē dažādi patogēni, tādējādi uzlabojot imūnsistēmas spēju reaģēt un uzlabojot organisma imunitāti pret dažādiem patogēniem. Tāpēc mums vajadzētu pievērst uzmanību šūnu pleiotropijai un arī stiprināt imunitātes kultivēšanu, lai saglabātu cilvēka veselību. Var redzēt, ka mums ir jāuzlabo atmiņa, un Cistanche deserticola var būtiski uzlabot atmiņu, jo Cistanche deserticola var regulēt arī neirotransmiteru līdzsvaru, piemēram, palielināt acetilholīna un augšanas faktoru līmeni. Šīs vielas ir ļoti svarīgas atmiņai un mācībām. Turklāt Cistanche deserticola var arī uzlabot asins plūsmu un veicināt skābekļa piegādi, kas var nodrošināt, ka smadzenes saņem pietiekami daudz barības vielu un enerģijas, tādējādi uzlabojot smadzeņu vitalitāti un izturību.

Noklikšķiniet uz Zināt veidus, kā uzlabot atmiņu

Pašreizējā pētījumā mēs parādām, ka IL-15 paaugstināja YTHDF2 mRNS un olbaltumvielu līmeni NK šūnās (6. att. A; un 1. att., D–F). Tāpēc mēs spekulējām, ka YTHDF2 ir nepieciešams IL-15 mediētai NK šūnu izdzīvošanai un efektora funkcijām.

Vispirms mēs mēģinājām identificēt iespējamos transkripcijas faktorus, kas ir pakārtoti IL-15 signalizācijai, kas tieši regulē YTHDF2 ekspresiju. Mēs analizējām DNS elementu enciklopēdiju, izmantojot Kalifornijas Universitāti Santakrusā, Genome BrowserDatabase (https://genome.ucsc.edu), kas nodrošina saistīšanās vietu prognozes visā genomā kopā ar JASPAR (http://jaspar.genereg). .tīkls).

Mēs noskaidrojām, ka STAT5, kas ir galvenais IL-15 pakārtotais faktors NK šūnās, ir četras saistīšanās vietas 2 kb robežās augšpus Ythdf2 transkripcijas sākuma vietas (TSS), kas norāda, ka IL-15 var pozitīvi ietekmēt. regulē Ythdf2 transkripciju peles NK šūnās, izmantojot STAT5.

Izmantojot STAT5 inhibitoru STAT5-IN-1 (Müller et al., 2008), mēs parādījām, ka STAT5 inhibīcija izraisīja Ythdf2 samazināšanos gan mRNS, gan proteīna līmeņos peles NK šūnās (S4, A att. un B). Lai vēl vairāk apstiprinātu, ka YTHDF2 ir pakārtots faktors, ko regulē STAT5, mēs izmantojām Stat5fl/fl Ncr1-iCre peles (turpmāk tekstā Stat5ΔNK peles), kur STAT5 ir īpaši dzēstas peles NK šūnas (Wiedemann et al. al., 2020).

Mēs apstrādājām splenicNK šūnas no Stat5WT un Stat5ΔNK pelēm ar IL-15. Mēs atklājām, ka YTHDF2 būtiski samazinājās NK šūnās no Stat5ANKpelēm, salīdzinot ar NK šūnām no Stat5WT pelēm gan RNS, gan olbaltumvielu līmenī (6. att., B un C; un S4, C un D att.).

Luciferāzes reportiera tests parādīja, ka gan STAT5a, gan STAT5b tieši aktivizēja Ythdf2 gēna transkripciju (6. attēls, D un E). Hromatīna imūnprecipitācijas (ChIP) – qPCR rezultāti parādīja, ka STAT5 ir ievērojami bagātināts četrās vietās, salīdzinot ar normālu IgG kontroli, norādot uz tiešu saistīšanos peles NKšūnās (6. att. F). Kopā mūsu rezultāti parāda, ka YTHDF2 ekspresiju regulē STAT5 lejpus IL-15 signalizācijas NK šūnās.

Pēc tam mēs prātojām, vai Ythdf2-deficītu NK šūnu reakcija uz IL-15 ir bojāta. Mēs izolējām liesas NK šūnas no Ythdf2ΔNK pelēm un Ythdf2WT pelēm un kultivējām themin vitro IL-15 klātbūtnē. Mēs noskaidrojām, ka Ythdf2ΔNK pelēm NK šūnu augšana bija ievērojami samazināta, salīdzinot ar Ythdf2WT pelēm (6. att. G). CellTrace Violet (CTV) marķējuma testi parādīja, ka Ythdf2 deficīts traucēja NK šūnu proliferāciju (6. att. H).

 Šūnu cikla sadalījuma analīze atklāja ievērojami palielinātu NK šūnu daļu no Ythdf2ΔNK pelēm G0/G1 fāzē, bet ievērojami samazinātu NK šūnu daļu no Ythdf2ΔNK pelēm S fāzē (6. att. I), kas liecina par Ythdf2 deficīta rezultātiem. G0/G1 fāzes apstādināšanā NK šūnās.

Turklāt Ythdf2ΔNK pelēm tika konstatēts apoptotisko (anneksīns V+Sytox-Blue+/−) NK šūnu skaita pieaugums divas līdz trīs reizes, salīdzinot ar Ythdf2WT pelēm (6. att. J), kas norāda uz NK šūnu izdzīvošanas defektu pēc tam, kad tika zaudētas Ythdf2. Šie rezultāti liecina, ka YTHDF2 regulē NKšūnu reakciju uz IL-15 in vitro. Tā kā IL-15 tiek vāji translēts un izdalīts in vivo līdzsvara stāvoklī (Corbel et al., 1996; Fehniger et al., 2001), lai noskaidrotu, vai Ythdf2-deficītu NK šūnu reakcija ir bojāta. uz IL-15 in vivo, mēs ārstējām peles ar IL-15.

Mēs atklājām, ka Ythdf2-deficīts salīdzinājumā ar WT NK šūnām uzrādīja ievērojami samazinātu šūnu proliferāciju un palielinātu šūnu apoptozi, kad peles tika ārstētas ar IL-15 (6. att. K; un att. S4, E–J). Šie dati liecina, ka YTHDF2 regulē NK šūnu reakciju uz IL-15, īpaši dažos apstākļos ar augstu IL-15 līmeni. Mēs arī atklājām, ka IFN-, granzīma B un perforīna mRNS un olbaltumvielu līmenis Ythdf2ΔNK NK šūnās, salīdzinot ar Ythdf2WT NK šūnām, bija ievērojami samazināts, reaģējot uz IL-15 (6. att., L–N), norādot, ka YTHDF2. arī veicina IL-15-mediētu NK šūnu efektoru funkcijas in vitro.

Kopumā mūsu dati parāda, ka YTHDF2 ir nepieciešams IL-15 mediētu NK šūnu izdzīvošanai, proliferācijai un efektorfunkcijām. Tālāk mēs pētījām pakārtotos mehānismus, ar kuriem YTHDF2 regulē IL-15 mediētu NK izdzīvošanu, proliferāciju un efektora funkciju. Mēs noskaidrojām, ka NK šūnām no Ythdf2ΔNKpelēm un Ythdf2WT pelēm bija līdzīgs IL-15 receptoru CD122 (IL-15R) un CD132 (IL-15R c; S4K att.) līmenis. IL-15 signalizāciju mediē vismaz trīs pakārtotie signalizācijas ceļi NK šūnās: Ras–Raf–MEK–ERK, PI3K–AKT–mTOR un JAK1/3–STAT3/5 (Mishra et al., 2014).

Lai noskaidrotu, kuru signalizācijas ceļu NK šūnās regulē YTHDF2, mēs pārbaudījām ERK, AKT, S6, STAT3 un STAT5 inNK šūnu fosforilācijas līmeni no Ythdf2ΔNK pelēm vai Ythdf2WT pelēm pēc stimulācijas ar IL-15.

Rezultāti parādīja, ka Ythdf2 deficīts neietekmēja ERK, AKT, S6 un STAT3 fosforilēšanos pēc IL-15 stimulācijas (S4, L un M att.), bet ievērojami kavēja STAT5 aktivāciju, par ko liecina samazināts STAT5 fosforilācijas līmenis Ythdf{{ 7}}deficītu NK šūnu nekā NK šūnās no Ythdf2WT pelēm (6. att. O), kas norāda, ka YTHDF2 ir nepieciešama optimālai IL-15/STAT5 signalizācijai aktivētās NK šūnās.

Tā kā mēs parādījām, ka fosforilētais STAT5 lejpus IL-15 saistās ar Ythdf2 promotoru (6. attēls, D–F), un šeit mēs parādījām, ka YTHDF2 ir nepieciešams optimālai STAT5 fosforilēšanai, mūsu dati liecina par STAT5–YTHDF2 pozitīvas atgriezeniskās saites cilpu lejup pa straumi. IL-15, kas var kontrolēt NK šūnu izdzīvošanu, proliferāciju un efektoru funkcijas.

Transkripta mēroga analīze identificē Tardbp kā YTHDF2 mērķi NK šūnās

Lai risinātu molekulāro mehānismu, ar kuru YTHDF2 regulē NK šūnas, mēs vispirms veicām RNS sekvencēšanu (seq) IL-2 paplašinātajās Ythdf2WT un Ythdf2ΔNK NK šūnās. Ythdf2 dzēšana NK šūnās radīja 617 atšķirīgi izteiktus gēnus, tostarp 252 regulētus gēnus un 365 pazeminātus gēnus (S5 att. A).

Gēnu ontoloģijas (GO) analīze parādīja, ka atšķirīgi ekspresētie gēni ir ievērojami bagātināti ar šūnu ciklu, šūnu dalīšanos un ar šūnu dalīšanos saistītos procesos, tostarp mitoticcitokinēzē, hromosomu segregācijā, vārpstā, nukleosomā, ķermeņa vidusdaļā un hromosomā (7. attēls). A).

Gēnu kopas bagātināšanas analīze (GSEA) parādīja ievērojamu E2F mērķu, G2/Mcheckpoint un mitotiskās vārpstas pazīme gēnu kopu bagātināšanu Ythdf2ΔNKNK šūnās (S5 B att.). Ar šūnu ciklu un šūnu dalīšanos saistītie gēni, tostarp Aurka, Aurkb, Cdc20, Cdc25b, Cdc25c, Cdk1, E2f2 un Plk1 (Bertoli et al., 2013), tika ievērojami samazināti Ythdf2ΔNK pelēm iegūtajās NK šūnās (att. ).

Vārpstas un hromosomu segregācijas gēni, piemēram, Anln, Aspm, Birc5, Bublb, Cenpe, Esco2, Ska1, Ska3 un Tpx2 (Gorbsky, 2015), arī tika ievērojami samazināti Ythdf2ΔNK peļu NK šūnās, salīdzinot ar NK šūnām no Ythdf2ΔNK pelēm, salīdzinot ar NK šūnām no Ythdf2.

Turklāt Ythdf2ΔNK peļu NK šūnās ievērojami samazinājās šūnu izdzīvošanas gēni, tostarp Birc5 (Niu et al., 2010), Septin4 (Larisch et al., 2000) un Rffl (Yanget al., 2007). 7 D). NK šūnu efektorfunkciju gēni, tostarp Klrk1, Ncr1, CD226 un Gzma (Bezman et al., 2012), arī tika ievērojami samazināti Ythdf2ΔNK peļu NK šūnās (7. att. D).

Šie dati apstiprina mūsu raksturīgo YTHDF2 lomu NK šūnu proliferācijas, izdzīvošanas un efektoru funkciju regulēšanā. Pēc tam mēs veicām m6A-seq IL-2-paplašinātajās NK šūnās no Ythdf2WT un Ythdf2ΔNK pelēm. Galvenās komponentes analīzes parādīja, ka trīs katra genotipa bioloģiskie atkārtojumi sagrupējās kopā (dati nav parādīti), kas liecina par labu m6A-seq paraugu atkārtojamību.

Motīvu bagātināšanas (HOMER) analīzes hiperģeometriskā optimizācija identificēja m6A konsensa motīvu (GGAC), kas norāda uz veiksmīgu m6A modificēto transkriptu bagātināšanu (7. att. E). m6A modifikācijas pārsvarā tika izvietotas proteīnu kodējošos transkriptos, un pīķi tika bagātināti 59 netulkotajos reģionos (UTR) un 39UTR, it īpaši ap sākuma un beigu kodoniem (7. att. F un S5 C).

Gēnu bagātināšanas analīze ar m6A virsotnēm atklāja, ka lielākā daļa m6A marķētu transkriptu NK šūnās tika bagātināti šūnu ciklā un šūnu proliferācijā iesaistītajos ceļos (att. S5 D).

For more information:1950477648nn@gmail.com