Kopējie Cistanche Deserticola glikozīdi veicina neiroloģisko funkciju atjaunošanos, izraisot neirovaskulāru reģenerāciju
Mar 29, 2022
Kontaktpersona:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791
Fujiang Wang1, Ruiyan Li 2, Pengfei Tu1, Jianping Chen3, Kewu Zeng1* un Yong Jiang1*
Fons:Ir ziņots, ka tradicionālā ķīniešu medicīna Cistanche deserticola ir derīga sirds un smadzeņu asinsvadu slimībām. Tomēr tā aktīvās sastāvdaļas išēmiska insulta aizsardzībai nav skaidras. Mūsu mērķis bija izpētīt C. deserticola aktīvās sastāvdaļas pret išēmisku insultu, kā arī tās iespējamos mehānismus.
Metodes:Mēs pētījām C. deserticola ekstraktu, kopējo glikozīdu (TG), polisaharīdu (PS) un oligosaharīdu (OS) ekstraktu smadzenes aizsargājošo iedarbību vidējās smadzeņu artērijas oklūzijas-reperfūzijas (MCAO/R) žurku modelī. 2, 3, 5-Trifeniltetrazolija hlorīda (TTC) krāsošana tika izmantota, lai novērtētu smadzeņu infarkta apjomu, un Evansblue tests tika pieņemts, lai novērtētu asins-smadzeņu barjeras (BBB) caurlaidību. Pēc tam izteiksmes CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 un Nrf{{13 }} tika analizēti, izmantojot Western blot vai imunofluorescenci, un aktivitātes MDA, SOD, CAT un GSH-Px tika analizētas, izmantojot komplektus.
Rezultāti:TG ārstēšana ievērojami samazināja neiroloģiskā deficīta rādītājus un infarkta apjomu, veicināja angiogenēzi un nervu pārveidošanu un efektīvi uzturēja asins-smadzeņu barjeras integritāti, salīdzinot ar modeļa grupu. Turklāt TG ievērojami samazināja MDA līmeni un palielināja antioksidantu aktivitātes (SOD, CAT un GSH-Px) smadzenēs. Tikmēr TG ievērojami pazemināja Keep-1 izteiksmi un atviegloja Nrf-2 kodola translokāciju. Gluži pretēji, PS un OS grupām netika novērota aizsargājoša iedarbība.
Secinājums:TG ir galvenie C. deserticola aktīvie komponenti pret MCAO/R izraisītiem smadzeņu bojājumiem, un aizsardzība galvenokārt tiek nodrošināta caur Nrf-2/Keap-1 ceļu.
Atslēgvārdi:Cistanche deserticola,smadzeņu bojājumi, kopējie glikozīdi, polisaharīdi, oligosaharīdi, Nrf{0}}/Keap-1 ceļš
cistanche amazon deserticola
IEVADS
Insults tiek uzskatīts par galveno nāves un invaliditātes cēloni pasaulē (Donnan et al., 2008). Gandrīz 87 procentus no visiem insulta gadījumiem izraisa išēmisks insults (Ovbiagele un Nguyen-Huynh, 2011). Pašlaik visefektīvākais līdzeklis un vienīgais FDA apstiprinātais medikaments, ko lieto išēmiska insulta ārstēšanai, ir rekombinantais audu plazminogēna aktivators. Tomēr liela daļa insulta pacientu nespēj reaģēt uz šīm zālēm, jo viņiem ir šaurs terapeitiskais laiks un nopietns hemorāģisko komplikāciju risks (Lee et al., 2012; Schellinger andKohrmann, 2014). Galvenais trombolītiskās ārstēšanas izaicinājums ir išēmijas/reperfūzijas (I/R) bojājums, kas tiek uzskatīts par galveno smadzeņu traumu un funkciju iznīcināšanas cēloni. Reperfūzija pēc smadzeņu išēmijas palielina smadzeņu asiņošanas risku, vienlaikus izraisot neirovaskulārus bojājumus un radot pārmērīgi reaktīvas skābekļa sugas (ROS), kas bojā asins-smadzeņu barjeru (Alluri et al., 2015). Vairāki pētījumi ir apstiprinājuši, ka BBB traucējumi ir galvenais išēmiskā insulta patoģenēzes cēlonis (Cao et al., 2016b).
BBB sastāv galvenokārt no endotēlija šūnām, pericītiem, astrocītiem, neironiem un bazālajām membrānām. BBB galvenās sastāvdaļas ir smadzeņu mikrovaskulārās endotēlija šūnas, kuras savieno cieši savienojumi, tādējādi ierobežojot eksogēno molekulu iekļūšanu smadzenēs. Stingru savienojumu patoloģiskās izmaiņas — īpaši okludīns, klaudīns-5 un zonulaoklūns-1 (ZO-1) — būtiski ietekmē BBB darbību išēmiska insulta laikā, īpaši barjeras caurlaidību (Liuet al., 2014). Hu et al., 2018; Liu et al., 2019). I/R periodos pārmērīgs ROS ir viens no galvenajiem faktoriem, kas izraisa tiešus smadzeņu neironu bojājumus (Ding et al., 2014). ROS pārprodukcija izraisa noteiktu savienojumu degradāciju un BBB traucējumus, kā rezultātā smadzenēs caur BBB iekļūst eksogēnas molekulas, kas izraisa smadzeņu bojājumu saasināšanos (Cheon et al., 2016; Zhang QY et al., 2017). Tāpēc BBB aizsardzība ar antioksidantiem tika uzskatīta par iespējamu veidu, kā novērst reperfūzijas bojājumus.
Papildus BBB sabrukumam I/R var izraisīt neirovaskulārus bojājumus un neironu nāvi (Jung et al., 2010). Insulta laikā palielinātu neironu šūnu nāvi var izraisīt oksidatīvs stress (Chi et al., 2018) un daudzi pētījumi. ir parādījuši, ka ROS pasliktina insulta smagumu un neiroloģiskos bojājumus (Kondo et al., 1997; Crack et al., 2001; Crack et al., 2006). Lai gan klīniskajos pētījumos nav gūti apmierinoši rezultāti, neiroaizsardzība joprojām ir daudzsološa stratēģija akūta išēmiska insulta ārstēšanai (Moretti et al., 2015). Tādējādi efektīvu neiroprotekcijas līdzekļu atrašana insultu ārstēšanai ir ieguvums pacientiem ar insultu.
Tradicionālā ķīniešu medicīna (TCM) veic pasākumus, lai iejauktos pret ķermeņa iekšējo nelīdzsvarotību (Gaire, 2018). Sakarā ar išēmisku insultu sarežģīto patoģenēzi, TCM un tā aktīvo sastāvdaļu daudzfaktoru iedarbībai ir izšķiroša nozīme insultu ārstēšanā. Cistanche deserticola YC Ma, kas ir plaši izplatīts sausos vai daļēji sausos apgabalos visā Mongolijā un Ķīnas ziemeļrietumos, ir bijis plaši izmantots TCM herb dažādu slimību, piemēram, aizmāršības un depresijas, ārstēšanai vairāk nekā 1,000 gadus Ķīnā. Mūsdienu farmakoloģiskie pētījumi liecina, ka neapstrādāti ekstrakti no C. deserticola parādīja vairākas farmakoloģiskas aktivitātes, piemēram, uzlabojot mācīšanās un atmiņas funkcijas, neiroaizsardzību, uzlabojot imunitāti, antioksidantus, pretnovecošanos un pretnoguruma efektus (Ko un Leung, 2007; Wang et al., 2012; Li et al., 2015). Ķīmiskā analīze of C. deserticola parādīja, ka tās galvenās sastāvdaļas ir feniletanoīdu glikozīdi, iridoidglikozīdi, polisaharīdi un oligosaharīdi (Jiang and Tu, 2009). Tomēr C. deserticola aktīvie komponenti smadzeņu aizsardzībai nav īsti skaidri.
C. deserticola neiroprotektīvā īpašība nozīmē tās terapeitisko potenciālu ar kognitīviem traucējumiem, piemēram, insultu un depresiju, kā arī Alcheimera slimību (Wang et al., 2017). Tomēr pētījumi par C. deserticola ietekmi uz insultiem, tostarp tās aktīvajiem komponentiem un darbības mehānismiem, ir ļoti ierobežoti. Pašreizējā darbā mēs pētījām trīs C. deserticola ekstraktu, kopējo glikozīdu (TG, feniletanoīdu glikozīdu un citu glikozīdu), polisaharīdu (PS) un oligosaharīdu (OS) aizsargājošo iedarbību uz smadzeņu I/R traumām. Mūsu atklājumi var veicināt precīzu C. deserticola klīnisko pielietojumu un nodrošināt kandidāta līdzekli forišēmiska insulta terapijai.
Cistanche ir tterapeitiskais potenciālsar kognitīvām slimībām, piemēram, insultu un depresiju,kā arī Alcheimera slimību.
MATERIĀLI UN METODES
Ķīmiskās vielas un reaģenti
Cistanche deserticola stublāji tika iegādāti no Alashanas, Iekšējās Mongolijas štatā, un tos identificēja viens no autoriem (P.-F. Tu). TG, PS un OS tika sagatavoti saskaņā ar mūsu iepriekš ziņoto metodi (Gao et al., 2015). . TG kvantitatīvā analīze tika veikta ar augstas izšķirtspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC), kā aprakstīts iepriekš (Li et al, 2019), un tās hromatogramma ir parādīta 1. attēlā. Galvenās TG sastāvdaļas ir ehinakozīds, tubulozīds A, akteozīds, izoakteozīds un2'- acetilakteozīds; to saturs ir attiecīgi 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g un 12,045 mg/g. PS un OS saturs ir attiecīgi 69,42 procenti un 65,24 procenti, kas noteikts attiecīgi ar HPLC un fenola-sērskābes analīzi (Zhang A. et al., 2018; Shi et al., 2019).
Standarta atsauces uz ehinakozīdu (A0282), tubulosīduA (A0942), akteozīdu (A0280), izoakteozīdu (A0281) un 2'-acetilakteozīdu (A0943) iegādājās no Chengdu MustBiotechnology (Sichuan, Ķīna). Visu standartu tīrības pakāpe ir lielāka par 98 procentiem. Nissl traipu H&E komplekti tika nopirkti no Boster (Uhaņa, Ķīna). Edaravone (T0407-1) tika nopirkta no TargetMol (Šanhaja, Ķīna). Trušu pretžurkām MAP-2 (ab32454), Nrf-2(ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) un mouseanti-rat CD31 (ab24590) tika iegādātas no Abcam Inc (Kembridža, MA, ASV). Trušu anti-žurka Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) un Occludin (BS72035) tika iegādāti no Bioworld Technology (Nanjing, Ķīna). Cell SignalingTechnology Inc. (Bostona, MA, ASV) bija trušu žurku Synapsin-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-SmoothMuscle Actin (a-SMA,19245T) avots. GAPDH (HRP-60004) tika iegādāts no Proteintech Group, Inc. (Čikāga, ASV). Sekundārās antivielas piegādāja Zhongshan GoldenBridge Biotechnology (Pekina, Ķīna). Hoechst 33258 tika iegūts no Beyotime (Jiangsu, Ķīna).
1. ATTĒLS|TG HPLC hromatogrammas (A) un standarta atsauces (B).
Dzīvnieki
Sprague-Dawley žurkas (vīrieši, sver 250–300 g) tika iegūtas no Vital River Laboratory Animal Technology (Pekina, Ķīna) un tika izmitinātas telpā ar gaisa kondicionētāju, kas tika turēta 12 stundu gaismas/tumsas ciklā. Visi eksperimenti ar dzīvniekiem tika veikti saskaņā ar dzīvnieku pētījumu ARRIVE vadlīnijām (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010), un tos apstiprinājusi Pekinas Universitātes Veselības zinātnes centra Institucionālā dzīvnieku kopšanas un lietošanas komiteja (LA2019123).
Dzīvnieku eksperimentu protokoli
Žurkas tika pakļautas MCAO/R, kā aprakstīts iepriekš (Wang et al., 2018). Īsumā, tika atklāta kreisā kopējā miega artērija (CCA), ārējā miega artērija (ECA) un iekšējā miega artērija (ICA), un no ECA tika ievietota 3-0 neilona monopavedienu šuve ICA, līdz tā sasniedza vidējo smadzeņu artēriju ( MCA). Pēc 1,5 h MCA oklūzijas reperfūzija tika simulēta, noņemot pavedienu. Ķirurģiskās procedūras laikā visu žurku ķermeņa temperatūra tika uzturēta 37,0 grādu līmenī.
Zāļu pārvalde
Žurkas nejauši tika sadalītas sešās grupās, izmantojot SPSS programmatūras versiju 22.0 kā aprakstīts (Jiang et al., 2014): normāla grupa (NOR); modeļu grupa (MOD); edaeavona grupa (pozitīvs medikaments, 6 ml/kg, EDI); TG grupa (280 mg/kg, TG); PS grupa (280 mg/kg, PS) un OS grupa (280 mg/kg, OS). TG, PS un OS tika ievadīti vienu reizi dienā pēc MCAO/R 14 dienas. NOR un MOD grupas tika ārstētas ar normālu fizioloģisko šķīdumu. Dzīvnieku skaits ir parādīts 1. tabulā.
1. TABULA|Dzīvnieku skaits dažādām eksperimentālajām grupām un dažādi parametri 14 dienas pēc ievadīšanas.
Svara un modificēto neiroloģiskā deficīta rādītāju (mNSS) mērīšana
Ķermeņa svars tika uzraudzīts 14. dienā, izmantojot ADVENTURE™ digitālo svaru (OHAUS, Ņūdžersija, ASV). NSS tika novērtēts saskaņā ar FJ Wang aprakstīto metodi (Wang et al., 2018), veicot nelielas izmaiņas.
2, 3, 5-trifeniltetrazolija hlorīda (TTC) krāsošana
Infarkta apjoms tika mērīts, kā aprakstīts iepriekš (Wanget al., 2015). Īsāk sakot, smadzenes tika sadalītas septiņos vienādi izvietotos koronālos blokos (2 mm). Šīs sekcijas tika iekrāsotas ar 2% TTC (Coolaber, Pekina, Ķīna) 37 grādu temperatūrā 15 minūtes. Infarkta tilpums ( procenti )=(ipsilateral išēmiskās puslodes tilpums–kontralaterālās išēmiskās puslodes tilpums)/kontralaterālās išēmiskās puslodes tilpums × 100.
Nissl un H&E krāsošana
Žurkas tika dziļi anestēzētas, un visas smadzenes tika ātri izņemtas no galvaskausa un fiksētas, izmantojot 4% paraformaldehīdu, un iestrādātas parafīna vaskā un sadalītas 7 µm biezās šķēlēs. Sekcijas tika iekrāsotas ar Nissl un H&E. Šajā pētījumā ar gaismas mikroskopu katrā audu paraugā tika fiksēti seši nejauši 200 × 200 µm lauki. Nissl ķermeņu skaits tika skaitīts ar IPP programmatūras versiju 6.0 (Media Cybernetics, Bethesda, ASV).
Evansa Blue Assay
Žurkām tika injicēts 2% EB (Coolaber Science & TechnologyCo., LTD) pēc MCAO/R. Pēc divām stundām žurkas tika anestēzētas, un pēc tam visas smadzenes tika ātri izņemtas un homogenizētas acetonā. Supernatanti tika analizēti pie 620 nm ar 800 TS absorbcijas lasītāju (BioTek, ASV).
Katalāzes (CAT), superoksīda dismutāzes (SOD), malondialdehīda (MDA) un glutationa peroksidāzes (GSH-Px) aktivitāšu mērīšana
Visi seruma paraugi tika centrifugēti ar ātrumu 4, 000 × apgr./min 15 minūtes 4 grādu temperatūrā un pēc tam analizēti, lai noteiktu MDA, CAT, SOD un GSH-Px aktivitātes, ievērojot ražotāja norādījumus (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. , Ķīna).
Western blotēšanas analīze
Smadzeņu audi (100 mg), kas savākti no katras žurkas, tika homogenizēti un lizēti RIPA līzes buferšķīdumā, un pēc tam analizēti, lai noteiktu proteīna koncentrāciju, izmantojot BCA komplektu (Beijing TransGenBiotech Co., Ltd.). Audu kopējie proteīni tika ievietoti 10% SDS-PAGE gēlos un pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Membrāna tika bloķēta, izmantojot 5% vājpiena, pēc tam inkubēja nakti ar primārajām antivielām 4 grādu temperatūrā. Pēc tam membrānu inkubēja ar sekundāro antivielu. Western blot analīze tika analizēta, izmantojot Kodak Digital Imaging System (5200 Multi, Tanon, Ķīna).
Imunofluorescējošā analīze
Tika veikta CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludīna, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 un Keap-1 imūnfluorescences krāsošana. Primārās antivielas pret Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 un Keap{15}} tika atšķaidītas līdz 1:200 un 1:100, attiecīgi. Alexa Flur 488 peles anti-trušu IgG un rodamīna (TRITC) kazas anti-trušu IgG sekundārās antivielas tika atšķaidītas līdz 1:200. Kodolus iekrāsoja ar Hoechst 33258. Attēli tika uzņemti, izmantojot Vectra® Polaris™ automatizēto kvantitatīvās patoloģijas attēlveidošanas sistēmu (PerkinElmer, ASV). Olbaltumvielu ekspresija tika analizēta, izmantojot IPP programmatūras versiju 6.0.
Statistiskā analīze
Visi dati tika aprakstīti kā vidējie ± SD. SPSS programmatūras versija 22.{1}}tika veikta statistiskai analīzei. Salīdzinot dažādas grupas, tika izmantota vienvirziena ANOVA. P < 0,05="" tika="" uzskatīts="" par="" statistisko="">
cistanche kultūrisms neiroaizsardzība
REZULTĀTI
TG palielina ķermeņa svaru un samazina smadzeņu bojājumus MCAO/R žurkām
Pēc 14 dienu ilgas ārstēšanas ar TG, PS, Oss un EDI tika novērtēts I/R žurku ķermeņa svars, neiroloģiskie deficīti un infarkta apjomi. Rezultāti parādīja, ka ķermeņa svars MOD grupā bija ievērojami samazināts, savukārt samazinātais svars TG, PS un EDI grupās acīmredzami palielinājās (2.A attēls). Neiroloģiskā deficīta rādītājus būtiski samazināja EDI un TG (2.B attēls). Smadzeņu šķēles NOR grupas žurkām bija dziļi sarkanas un nebija infarktu, savukārt MOD grupas žurkām bija liels ipsilaterāls smadzeņu infarkts. Pēc TG terapijas infarkta apjomi tika ievērojami samazināti (attēls 2C, D). PS un OS apstrāde neuzrādīja acīmredzamu ietekmi uz iepriekš minētajiem indeksiem. Iepriekš minētie dati parādīja, ka TG varētu ievērojami atvieglot I/R izraisīto smadzeņu bojājumu, bet PS un OS nevarēja.
2. ATTĒLS|TG samazina smadzeņu bojājumus, ko izraisa pārejoša fokusa smadzeņu išēmija.
TG uzlabo MCAO/R žurku histopatoloģiskos bojājumus
Lai noteiktu dažus TG, PS un OS ārstēšanas ietekmi uz histopatoloģiskajiem bojājumiem, tika veikta H&E krāsošana, lai atklātu patoloģiskos bojājumus. Smadzeņu histomorfoloģiskās struktūras NOR grupā tika sakārtotas regulāri. Morfoloģijas izmaiņas TG grupās bija mazākas nekā MOD grupā. Tomēr PS un OS ārstēšanas grupas neuzrādīja būtisku morfoloģisko izmaiņu uzlabošanos (3. attēls).
TG mazina neironu bojājumus pēc I/R izraisītām žurkām
Nissl krāsošana parādīja neironu histopatoloģiskās izmaiņas išēmiskās zonas pusumbrā. Kā parādīts 4. attēlā, normālajiem neironiem bija skaidrs kodols un neskarta struktūra. MOD grupā neironiem bija palielinātas starpšūnu telpas. Nislķermeņi bija pazuduši, sarukuši un dziļi notraipīti. Tomēr šīs izmaiņas reti tika novērotas EDI, TG un PS grupās. Šie rezultāti parādīja, ka TG un PS var ievērojami vājināt išēmijas/reperfūzijas izraisītus neironu bojājumus.
TG mazina BBB traucējumus pēc I/R apstrādātām žurkām
Evansa zilais tests ir klasiska metode BBB caurlaidības izmaiņu izpētei. Eksperimenta rezultāti parādīja, ka palielināts Evansa zilais tika novērots MOD grupā, bet ievērojami samazināts Evansa zilais daudzums TG un ar EDI apstrādātajām žurkām. Turklāt nebija būtiskas atšķirības starp PS un OS terapijas grupām (5. attēls). Šie rezultāti liecināja, ka TG var ievērojami mazināt BBB traucējumus.
3. ATTĒLS|TG uzlabo histopatoloģiskos bojājumus MCAO / R žurkām.
TG veicina angiogenēzi I/R ievainotām žurkām
Jaunākie pētījumi liecina, ka angioģenēzei ir izšķiroša nozīme neiroloģiskās funkcionālās atveseļošanās un prognostiskā iznākumā pēc akūta išēmiska insulta (Yuen et al., 2015). Lai novērtētu TG, PS un OS ietekmi uz angiogenēzi, CD31 un a-SMA tika izmantoti, lai noteiktu kapilāru skaitu. Imunofluorescences krāsošana parādīja, ka MOD grupa izraisīja ievērojamu CD31 (attēls 6A, B) un a-SMA (attēls 6C, D) ekspresijas samazināšanos I / Rrats išēmisko zonu pusē, salīdzinot ar normālām žurkām. Šis rezultāts ilustrēja, ka I/R var izraisīt asinsvadu bojājumus garozas puslodē un išēmiskajās puslodēs. Tomēr TG un EDI ārstēšana ievērojami palielināja kapilāru blīvumu, angiogenēzi un arterioģenēzi, par ko liecina palielināta CD31 un a-SMA ekspresija. Šie rezultāti liecina, ka TG varētu veicināt angiogenēzi I / R žurku išēmiskajā pusumbrā, bet PS un OS nevarēja.
TG palielina saspringto savienojumu proteīnu ekspresiju I/R ievainotām žurkām
BBB traucējumi var paaugstināt smadzeņu ūdens saturu un audu pietūkumu, izraisot smadzeņu traumu. Stingras savienojuma olbaltumvielas ir svarīgas BBB strukturālās sastāvdaļas (Tenreiro et al., 2016; Jiang et al., 2018). Lai pārbaudītu, vai TG, PS un OS ārstēšana pēc insulta var ietekmēt BBB integritāti, ZO-1, claudin-5 un okludīna ekspresijas tika veiktas ar imunofluorescences analīzi. Rezultāti liecināja, ka Klaudīna -5, okludīna un ZO-1 ekspresija MOD grupā bija acīmredzami samazināta. Tomēr tie ievērojami palielinājās pēc 14 dienu ilgas TG ievadīšanas. PS un OSs grupas neuzrādīja būtiskas izmaiņas šajās olbaltumvielu ekspresijās (7. attēls). Šie dati norādīja, ka TG var regulēt saspringtas savienojuma olbaltumvielu ekspresijas un, iespējams, saglabāt BBB integritāti pēc I / R traumas.
TG palielina pericītu pārklājumu uz kapilāriem I/R ievainotām žurkām
Pericītu pārklājumam uz kapilāriem ir izšķiroša nozīme BBB integritātes saglabāšanā (Armulik et al., 2010; Daneman et al., 2010). Tādējādi mēs pārbaudījām, vai pericītu pārklājumu var palielināt ar TG, PS un OS ārstēšanu. Imunofluorescences intensitātes analīzes rezultāti parādīja, ka gan PDGFRb, gan CD31 ekspresijas tika ievērojami samazinātas MOD grupā. TGsto ievadīšana I/R žurkām ievērojami atjaunoja vai pat palielināja PDGFRb un CD31 ekspresijas intensitāti, bet PS un OS ārstēšanas grupās tika novērotas atšķirības (8. attēls). Tādējādi TG ārstēšana varētu ievērojami palielināt pericītu pārklājumu. Šie atklājumi vēl vairāk apstiprināja, ka TG var saglabāt BBB integritāti pēc I/R.
TG veicina nervu pārveidošanu I/RIvainotām žurkām
Saskaņā ar daudziem pētījumiem neiroģenēze pēc insulta var ievērojami uzlabot funkcionālo atveseļošanos (Grefkes un Ward, 2014; Zhang et al., 2019). Sinaptofizīns (SYN), postsinaptiskā blīvuma 95 (PSD-95) proteīni un ar mikrotubuliem saistītais proteīns 2 (MAP-2) tika izmantoti kā marķieri, lai pārbaudītu neironu plastiskumu garozas išēmiskajā pusumbrā. Lai novērtētu TG, PS un OS ārstēšanas ietekmi uz neiroģenēzi I/R ievainotām žurkām, tika veikta imunofluorescence un Western blot SYN, PSD95 un MAP-2 izpausmēm. Kā parādīts 9. un 10. attēlā, SYN, PSD95 un MAP{12}} ekspresijas līmeņi I/Ržurkām pēc 14 reperfūzijas dienām samazinājās, salīdzinot ar NOR žurkām, savukārt TG un PS izārstēšana varēja ievērojami paaugstināt to ekspresijas līmeni. . OS grupai nebija būtisku izmaiņu salīdzinājumā ar MOD grupu. Dati liecināja, ka TG un PS ārstēšana spēja dramatiski veicināt nervu remodelāciju pēc I/R traumas.
TGs Alter Nrf{0}} un Keap-1 izteiksmes I/R ievainotās žurkās
Oksidatīvais stress ir galvenais I/R traumu patogēns mehānisms (Ya et al., 2018; Yu et al., 2018). Pētījumos tika apstiprināts, ka Nrf-2 ir galvenais antioksidatīvo reakciju regulators (Thompson et al., 2015). Lai izpētītu Nrf-2 un Keap-1 izraisītās oksidatīvās atbildes reakcijas pēc I/R traumas, mēs novērtējām Keap-1 citoplazmas ekspresiju, kā arī kodola translokāciju. Tikmēr Nrf{{7 ekspresija }} tika pārbaudīts arī I/R ievainoto žurku smadzeņu audos (10. un 11. attēls). Saskaņā ar imunofluorescences analīzi tika konstatēts, ka Nrf{10}} galvenokārt atrodas citoplazmā NOR grupā. TG grupā Nrf-2 ekspresija citoplazmas lokalizācijā tika samazināta, bet kodolā tika regulēta augstāk, un tika novērota arī Keap-1 ekspresijas samazināšanās. Dati parādīja, ka TG smadzeņu aizsardzība varētu būt saistīta ar Nrf-2 un Keap-1 modulāciju.
4. ATTĒLS|TG mazina neironu bojājumus pēc I / R apstrādātām žurkām.
TG mazina smadzeņu audu oksidatīvo stresu I/R ievainotām žurkām
Lai apstiprinātu TG antioksidatīvo iedarbību, I/R ievainotajām žurkām tika novērtētas SOD, CAT, GSH-Px un MDA aktivitātes. 12. attēlā MDA saturs bija ievērojami palielināts MOD grupā, un tajā pašā laikā SOD, CAT un GSH-Px aktivitātes bija samazinātas, salīdzinot ar normālām žurkām. Savukārt ārstēšana ar TG izraisīja ievērojamu samazinājumu. MDA saturā un SOD, CAT un GSH-Px aktivitāšu palielināšanās. Šie rezultāti vēl vairāk apstiprināja TG antioksidācijas aktivitāti.
DISKUSIJA
Daudzi pētījumi liecina, ka TCM C. deserticola piemīt plašas bioloģiskas aktivitātes, piemēram, tas uzlabo spēju mācīties, atmiņu un imunitāti (Dong et al., 2007; Jiang and Tu, 2009; Wanget al., 2017; Xia et al., 2018). ). Tomēr C aktīvās sastāvdaļas. deserticola neiroaizsardzībai joprojām nav skaidrs. Pašreizējā darba mērķis ir pārbaudīt C. deserticola aktīvos komponentus pret išēmisku insultu MCAO/R modelī. Trīs ekstrakti no C. deserticola (TG, PS un OS) tika izmantoti, lai novērtētu to ietekmi uz MCAO/R žurkām, kā arī iespējamos mehānismus.
Insults ir izplatīta akūta cerebrovaskulāra slimība. Epidemioloģiskie pētījumi liecina, ka insults ir biežāk sastopams vīriešiem nekā sievietēm (Sealy-Jefferson et al., 2012; Guzik and Bushnell, 2017). Tādējādi mūsu eksperimentā testiem tika pieņemti žurku tēviņi. Mūsu rezultāti pierādīja, ka I/R indukcija paātrināja oksidatīvo stresu un infarkta apjomu, pārtraucot BBB un izraisot nervu un cerebrovaskulārus bojājumus. Pēc skrīninga tika konstatēts, ka TG samazina infarkta apjomu un veicina neironu remodelāciju un angiogenēzi. Turklāt tika novērots, ka TG saglabā BBB integritāti pēc I / R traumas. Gluži pretēji, PS un OS būtiski nemazina I/R bojājumus. Tādējādi TG tiek uzskatīti par galveno C. deserticola aktīvo frakciju neiroaizsardzībai, iespējams, veicinot neirālu remodelēšanu, angiogenēzi un BBB integritāti, aktivizējot Nrf-2/Keap-1 ceļu.
5. ATTĒLS|TG mazina BBB traucējumus pēc I/R traumas.
Pieaugošie pierādījumi liecina, ka efektīvas nodrošinājuma cirkulācijas izveide ir ļoti svarīga, lai izvairītos no infarkta un išēmiska pustumsas veidošanās, un tā ir kritiska ārstēšana išēmiska insulta agrīnā stadijā (ElAli, 2016; Iwasawa et al., 2016). Asinsvadu endotēlija šūnu un gludo muskuļu šūnu proliferācija pēc išēmiska infarkta nosaka nodrošinājuma cirkulācijas izveidi. Tomēr išēmijas modeļiem ir izplatīta parādība, tas ir, oksidatīvais stress plaši pastāv smadzeņu mikrovaskulārā. Pētījuma dati liecina, ka liels skaits antioksidantu var traucēt BBB darbību un angioģenēzes īpašības (Mentor and Fisher, 2017). CD31 un a-SMA ir attiecīgi asinsvadu endotēlija šūnu, kā arī gludo muskuļu šūnu marķieri (Saboor et al., 2016). Lai izpētītu C. deserticola ekstraktu ietekmi uz iepriekš minēto šūnu proliferāciju, mēs pārbaudījām CD31 un a-SMA ekspresiju smadzeņu išēmiskā pusumbras homogenātā. Mūsu dati parādīja, ka TG pārsteidzoši uzlaboja CD31 un a-SMA izpausmes. Tomēr PS un OS grupām nebija būtisku atšķirību. Tāpēc mēs secinājām, ka TG var samazināt smadzeņu bojājumus, veicinot angiogenēzi, palielinot CD31 un a-SMA izpausmes, savukārt PS un OS nenodrošināja šādu aizsardzību pret smadzeņu bojājumiem. Šie rezultāti vēl vairāk apstiprināja, ka tikai TG varētu novērst smadzeņu I / R bojājumus.
Išēmisku insultu var uzskatīt par cerebralisēmijas rezultātu, ko izraisa neironu plastiskuma traucējumi vai smadzeņu zonu pārveidošana. Lielākajai daļai insulta pacientu ir neiroloģiski traucējumi. Neiroģenēzes aktivizēšana ir daudzsološa stratēģija insulta pacientiem, lai uzlabotu viņu neiroloģiskās funkcijas (Cramer un Chopp, 2000). Neiroģenēze tieši piedalās neiroloģiskās funkcijas atjaunošanā pēc smadzeņu I / traumas (Zhang et al., 2019). Iepriekšējie pētījumi liecina, ka TG var uzlabot hipokampu piramīdas šūnu izdzīvošanas līmeni un izraisīt neiroģenēzi (Lian et al., 2017). Oksidatīvais stress izraisa neironu zudumu daudzu slimību, piemēram, Parkinsona, insulta un tā tālāk, laikā (Duan un Si, 2019; Singh et al., 2019). Nrf-2transkribē daudz gēnu, kas saistīti ar neiroaizsardzību to promotora reģionā, galvenokārt ietverot SOD, MDA, CAT un g glutamilcisteīna ligazes utt. (Satoh et al., 2006). SYN, PSD-95 un MAP-2 proteīnus, kas ir cieši saistīti ar sinaptisko veidošanos un neirotransmisiju, var uzskatīt par pētāmās neironu plastiskuma marķieriem išēmiskā pusumbras reģionā. Pēc izpētes mēs atklājām, ka ārstēšana ar TG var ievērojami palielināt PSD95, SYN un MAP izteiksmes{11}}, norādot, ka TG smadzeņu aizsardzība bija saistīta ar pastiprinātu neironu plastiskumu I/R laikā. Tomēr žēl, ka nav acīmredzamas atšķirības attiecībā uz PSs. kā OS grupas. Šie rezultāti liecināja, ka TG var uzlabot neiroplastiskumu pēc smadzeņu I / R traumas.
Insulta pacientu attēlveidošanas pētījumi parādīja, ka BBB disfunkciju var uzskatīt par pārsteidzošu periišēmisko smadzeņu atribūtu (Bang et al., 2007). TJ, kas sastāv no citoplazmas olbaltumvielām, transmembrānu proteīniem un savienojošām adhēzijas molekulām starp kapilāru endotēlija šūnām, ir ļoti svarīgi BBB integritātes saglabāšanā (Ye et al., 2019). Tostarp ZO-1, claudin-5 un okludīns ir vissvarīgākie TJ proteīni. Pieaugošie pierādījumi liecina, ka išēmijas izraisītā palielinātā BBB caurlaidība parasti korelē ar ZO-1, klaudīna-5 un okludīna izmaiņām (Cao et al., 2016a; Page et al., 2016; Yu et al. ., 2017; Liu et al., 2018). Šajā darbā iegūtie rezultāti parādīja, ka, lai gan TG var ievērojami palielināt ZO-1, claudin-5 un okludīna proteīnu ekspresiju MCAO inducētos smadzeņu audos, to nedarīja ne PSs, ne OS. BBB sastāv no smadzeņu endotēlija šūnām un ir cieši saistīta ar pericītiem (Nyul-Toth et al., 2016). Pericīti ir vitāli svarīgi BBB integritātei (Bell et al., 2010). Išēmisks insults izraisa pericītu nāvi un atdalīšanos no smadzeņu endotēlija šūnām akūtā fāzē, tādējādi destabilizējot to mikrovaskulāro sistēmu un mainot BBB īpašības (Zechariahet al., 2013). Mūsu dati parādīja, ka TG var palielināt pericītu pārklājumu uz kapilāriem un palielināt ZO-1, claudin-5 un okludīna ekspresijas līmeni. Šīs parādības pierādīja, ka TG var efektīvi aizsargāt BBB integritāti pēc smadzeņu I / R traumas. Rezumējot, TG var mazināt smadzeņu bojājumus vairākos veidos, piemēram, veicinot angiogenēzi, uzlabojot neironu plastiskumu un saglabājot BBB integritāti.
Pēc tam mēs pētījām signalizācijas ceļu, lai izpētītu TG smadzeņu aizsardzības pamatā esošo mehānismu. I/R traumas process ir daudzfaktorāls, un tādējādi patoģenēzē ir iesaistīti daudzi mehānismi. Oksidatīvais stress ir būtisks riska faktors, kas veicina I/R izraisītu smadzeņu traumu (Suda et al., 2013), piemēram, BBB struktūras bojājumus, asinsvadu endotēlija disfunkciju un išēmisku neironu bojājumu saasināšanos (Xiong et al., 2015; Caglayan et al., 2015); al., 2019; Priestley et al., 2019). Tādējādi oksidatīvais stress ir kļuvis par pievilcīgu terapeitisku mērķi I/R izraisītu smadzeņu traumu gadījumā. 2. fāzes enzīmi, kurus mediē kodolfaktors E2-saistītais faktors-2 (Nrf{9}}), ir tika uzskatīts par svarīgu līdzekli, ar kuru neironi aizsargā sevi pret oksidatīvo stresu (Suzukiand Yamamoto, 2015; Ya et al., 2018). Pieaugošie pierādījumi liecina, ka Nrf-2 aktivizēšana I/R laikā ir potenciāls terapeitiskais mērķis neiroaizsardzībai (Ding et al., 2015; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, kas ir svarīgs endogēnās antioksidantu aizsardzības regulators, veicina hēma oksigenāzes 1 (HO-1) un citu antioksidantu enzīmu, piemēram, NAD(P)H hinona oksidoreduktāzes 1 (NQO1), SOD, līmeni. CAT, GSH un MDA (Siow et al., 2007; Dinget al., 2014). Turklāt Nrf-2 spēlē svarīgu regulatora lomu inangioģenēzē. Šis pētījums parāda, ka Nrf-2 var ievērojami uzlaboties un aktivizēties asinsvadu attīstības procesā (Wei et al., 2013).
Kā aprakstīts iepriekš (Jiang and Tu, 2009), TG satur daudz bioaktīvu savienojumu, piemēram, ehinakozīdu, tubulozīdu A, akteozīdu, izoakteozīdu un 2'-acetilakteozīdu, un daži no tiem parādīja neiroprotektīvas funkcijas pēc smadzeņu I/R traumas (Penget al. ., 2016). Ehinakozīdam ir daudz farmakoloģisku efektu, piemēram, antioksidācija, pretnovecošanās, neiroaizsardzība, pretiekaisuma iedarbība, cicatrization, hepatoprotection, kaulu veidošanās veicināšana un pretaudzēju aktivitātes (Yu et al., 2016; Li et al., 2018; Zhang Y. et al., 2018; Ji et al., 2019; Xu et al., 2019). Nesen ehinakozīds tika identificēts kā spēcīgs antioksidants centrālajā nervu sistēmā (Lu et al., 2016). Ehinakozīds var samazināt MDA saturu un uzlabot SOD un GSH Px aktivitātes smadzeņu traumu išēmijas gadījumā, un molekulārā dokstacijas analīze parādīja, ka ehinakozīds var saistīties ar Keap-1, izraisot Nrf-2 kodola translokāciju (Li et al. , 2018). Xia pētījums parādīja, ka akteozīds var samazināt infarkta apjomu un smadzeņu ūdens saturu, lai uzlabotu neiroloģiskos deficītus MCAO/R žurkām, mazinot oksidatīvo stresu (Xia et al., 2018). Citi pētījumi ir parādījuši, ka izoakteozīds var palielināt šūnu antioksidantu enzīmu, SOD un CAT aktivitāti H2O2-apstrādātajās V79-4 šūnās (Chae et al., 2005). Pamatojoties uz iepriekš minētajiem ziņojumiem par TG esošajiem aktīvajiem savienojumiem, ir iespējams secināt, ka TG var aizsargāt pret išēmisku insultu, izmantojot antioksidācijas ceļus.
Li ziņoja par feniletanoīdu glikozīdu (PhG) neiroprotektīvo ietekmi uz H2O2-inducēto apoptozi uz PC12 šūnām, izmantojot Nrf2/ARE ceļu (Li et al., 2018). Šie PhG tika ievērojami nomākti, izraisot Nrf2 kodola translokāciju un palielinot HO-1, NQO1, glutamāta-cisteīna ligāzes katalītiskās apakšvienības (GCLC) un glutamāta-cisteīna ligāzes modifikācijas apakšvienības (GCLM) ekspresijas (Li et al., Gong et al., 2018; al., 2019). Tāpēc šie atklājumi liecina, ka Nrf-2/ARE ceļam ir izšķiroša nozīme PhG mediētajā aizsargājošā iedarbībā uz neironu šūnām. Tāpat šajā pētījumā mēs atklājām, ka TG var samazināt MDA līmeni un paaugstināt SOD, CAT un GSH-Px līmeni I/R žurkām. Tikmēr TG var paaugstināt Nrf2 ekspresiju kodolā, pazemināt atbilstošo ekspresiju citoplazmā un ievērojami samazina Keap-1 ekspresiju. Tāpēc ceļš Nrf-2/Keap-1 var būt iesaistīts TG mediētā neiroprotektīvajā iedarbībā. Turpmāka šī ceļa validācija tiks veikta in vitro šūnu kultūrā ar skābekļa-glikozes atņemšanas / reoksigenācijas traumu modeļiem nākotnē. Turklāt C. deserticola ekstrakti tika ievadīti mūsu pētījumā 14 dienas nepārtraukti. Tā kā pieaugušo neiroģenēze varētu ietekmēt neiroprotektīvo efektu interpretāciju 14 reperfūzijas dienu laikā, mūsu pašreizējā eksperimenta plānā, pētot CT neiroprotektīvo efektu, nevar izslēgt neiroģenēzi. Tas ir mūsu pētījuma ierobežojums.
Visbeidzot, tieši C. deserticola TG var uzlabot angioģenēzi un neiroģenēzi, kā arī saglabāt BBB integritāti I/R traumu žurkām, bet ne PS un OS. Ietekmi varētu būt saistīti ar ceļa Nrf-2/Keap-1 aktivizēšanu.
