Visa transkripta analīze, lai izpētītu pavājinātas imunoloģiskās pazīmes kritiski slimiem gados vecākiem pacientiem ar sepsi

Abstrakts

Fons

Sepsis ir bieža komplikācija kritiski slimiem pacientiem, tā ir ļoti neviendabīga un saistīta ar augstu saslimstības un mirstības līmeni, īpaši gados vecākiem cilvēkiem. RNS sekvencēšanas (RNA-Seq) izmantošana bioloģisko ceļu analīzei tiek plaši izmantota klīniskajos un molekulārajos ģenētiskajos pētījumos, taču joprojām trūkst pētījumu par gados vecākiem pacientiem ar sepsi. Tādējādi mēs pētījām ar mirstību saistītās bioloģiskās pazīmes un transkriptomiskās pazīmes gados vecākiem pacientiem, kuri tika uzņemti intensīvās terapijas nodaļā (ICU) sepses dēļ.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Metodes

Mēs reģistrējām 37 gados vecākus pacientus ar sepsi no Taidžunas veterānu vispārējās slimnīcas ICU. 1. un 8. dienā RNS-Seq analīzei tika savākti klīniskie un laboratoriskie dati, kā arī asins paraugi. Izmantojot DVID bagātināšanas analīzi un gēnu kopas bagātināšanas analīzi, mēs noteicām diferencēti izteiktu gēnu dinamiskos transkriptu un bagātinātos ceļus no 8. līdz 1. dienai. Pēc tam ar MiXCR tika analizēta T šūnu repertuāra daudzveidība.

Rezultāti

Kopumā 37 pacientiem bija sepse, un pacienti, kuri reaģēja, un pacienti, kas nereaģēja, tika sagrupēti, izmantojot galveno komponentu analīzi. Ievērojami augstāki SOFA rādītāji 7. dienā, garākas ventilācijas dienas, ICU uzturēšanās ilgums un slimnīcas mirstība tika konstatēta nereaģējošo grupā nekā respondentu grupā. 8. dienā gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi gēni, kas saistīti ar iedzimtu imunitāti un iekaisumu, piemēram, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 un PCSK9, tika regulēti. Atšķirīgi ekspresētie gēni (DEG) tika bagātināti ar transkripcijas, adaptīvās imūnās atbildes, imūnglobulīna ražošanas, negatīvas transkripcijas regulēšanas un imūnās atbildes regulēšanu. Turklāt T-šūnu receptoru daudzveidība dienā -8 respondentu grupā bija lielāka nekā dienā-1, kas liecina, ka viņiem bija labāk regulēta atveseļošanās no sepses, salīdzinot ar pacientiem, kuriem nebija atbildes reakcijas. .

Secinājums

Sepses mirstība un sastopamība gados vecākiem cilvēkiem bija augsta. Mēs identificējām ar mirstību saistītās bioloģiskās pazīmes un transkriptomiskās pazīmes, izmantojot funkcionālo ceļu un MiXCR analīzi, pamatojoties uz RNS-Seq datiem; un atklāja, ka reaģētāju grupai bija paaugstināta iedzimtā imunitāte un palielināta T-šūnu daudzveidība; salīdzinot ar nereaģējošo grupu. RNA-Seq var piedāvāt papildu papildu informāciju precīzai un agrīnai ārstēšanas rezultātu prognozēšanai.

cistanche augu paaugstinošā imūnsistēma

Atslēgvārdi

Sepse, RNA-Seq, vecāka gadagājuma ICU pacients, atšķirīgi ekspresēti gēni, T-šūnu receptori

Ievads

Sepsis ir klīnisks sindroms, kas ir potenciāli dzīvībai bīstams. To rada nesakārtota saimnieka reakcija uz infekciju, un tas ir ļoti neviendabīgs un nāvējošs globāls veselības apdraudējums, īpaši gados vecākiem cilvēkiem [1, 2]. Iepriekšējie pētījumi ir atklājuši, ka gados vecākiem pacientiem ir lielāks sepses risks un viņiem ir augstāka slimības smaguma pakāpe nekā vispārējā populācijā [3]. Vecāka gadagājuma pacientu skaits, kuri tiek ievietoti intensīvās terapijas nodaļā (ICU) sepses dēļ, pēdējo divu desmitgažu laikā ir nepārtraukti pieaudzis, jo pastāvīgi pieaug gados vecāku cilvēku skaits [4]. Jo īpaši, neskatoties uz augsto aprūpes intensitāti, mirstība joprojām ir augsta gados vecākiem pacientiem, kuri ievietoti ICU, taču joprojām trūkst pētījumu par bioloģiskajiem ceļiem, kas saistīti ar ārstēšanas reakciju gados vecākiem pacientiem ar sepsi [5]. Vecāka gadagājuma cilvēku imūnsistēma piedzīvo daudzas bioloģiskas izmaiņas, kad viņi noveco, kas ietekmē vecāka gadagājuma cilvēku imūnreakciju, kā rezultātā palielinās imūnsistēmas traucējumu iespējamība [6]. Kompromitēta adaptīvā imunitāte tiek uzskatīta par būtisku imūnnovecošanās pazīmi gados vecākiem cilvēkiem [7, 8], bet transkriptomiskās pazīmes sepses laikā gados vecākiem cilvēkiem joprojām nav izpētītas. Šīs izmaiņas nosaka ne tikai uzņēmību pret bakteriālām infekcijām, bet arī sepses progresēšanu un klīniskos rezultātus [6]. Tāpēc ir ļoti svarīgi izpētīt atšķirīgās imunoloģiskās reakcijas un ar mirstību saistītās bioloģiskās pazīmes gados vecākiem pacientiem, kuri ievietoti ICU [9, 10].

Sepse ir ļoti neviendabīga, un to raksturo sarežģītas un dinamiskas imunoloģiskas reakcijas, kas ietver sākotnējo pārmērīgu iekaisuma reakciju, kam seko disregulēta / izsmelta adaptīvā imunitāte [11]. Vairāki pētījumi ir parādījuši mainītu adaptīvo imunitāti pēc sepses; tā sauktā imūnparalīze, šķiet, ir viena no galvenajām imunoloģiskajām pazīmēm, kas izraisa pastāvīgu imunitātes pavājināšanos pacientiem ar sepsi [12]. RNA-Seq tika izmantots iepriekšējos pētījumos, lai atrastu transkriptisko parakstu vai "subendotips" pacientiem ar sepsi. Ar sepsi saistītie apakšgenotipi ir agrīna orgānu disfunkcijas uzlabošanās pēc sepses, pavājināta adaptīvā imunitāte pacientiem ar novājinātu imūnsistēmu un reakcija uz steroīdiem septiskā šoka pacientiem [13, 14]. Izmantojot RNA-Seq datus, nesen tika izstrādāti analītiskie rīki, piemēram, MiXCR, lai kvantitatīvi noteiktu T-šūnu receptoru (TCR) daudzveidību [15, 16]. Šajā pētījumā mēs pētījām septisku pacientu dinamisko transkriptu, pārbaudot pāru paraugus no 1. un 8. dienas, un atklājām, ka septiskiem pacientiem ar imūndeficītu ir samazinājusies T šūnu daudzveidība un traucēta T šūnu funkcija. Šī pētījuma mērķis bija izpētīt ar mirstību saistītās bioloģiskās pazīmes un transkriptomiskās pazīmes, lai labāk izprastu ar adaptīvo imunitāti saistīto signalizāciju gados vecākiem pacientiem, kuri tika uzņemti ICU sepses dēļ.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Noklikšķiniet šeit, lai skatītu Cistanche Enhance Immunity produktus

【Jautājiet vairāk】 E-pasts:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Materiāli un metodes Studiju plānošana un datu vākšana

Pētījumu apstiprināja TCVGH Institucionālā pārskata padome (IRB nr. CE20069B), un no visiem dalībniekiem tika iegūta informēta piekrišana. No 2018. gada decembra līdz 2022. gada janvārim no Taidžunas veterānu vispārējās slimnīcas (TCVGH) tika pieņemti darbā trīsdesmit septiņi gados vecāki ICU pacienti. Reģistrācijas laikā tika apkopota demogrāfiskā informācija, un 1. un 8. dienā tika ņemti sākotnējie asins paraugi. transkriptam, divas 4 ml asiņu alikvotas tika savāktas sterilos EDTA vakutaineros un nekavējoties pārnestas uz RNS nesaturošiem flakoniem, kas satur 10, 5 ml RNAlater® (TermoFisher, Waltham, MA, ASV).

RNS ekstrakcija un sekvencēšana

Šajā pētījumā mēs ekstrahējām RNS ar PAXgene Blood RNA Kit, un vidējais RNS integritātes numurs (RIN) bija 8,31±0.58. Veidojot bibliotēku, tika ievēroti ražotāja norādījumi, un turpmākajos eksperimentos tika izmantots 1,000 ng fragmentētas RNS. 150-bp paired-end nolasījumi tika izmantoti RNA-Seq platformā NovaSeq (Illumina, Inc., Sandjego, CA, Amerikas Savienotās Valstis), un katram paraugam bija vismaz 50–60 miljoni nolasījumu. RNA-seq datu kopa tika deponēta Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) gēnu ekspresijas omnibusā (GEO) ar pievienošanās numuru GSE216902. Datu kopa tika izmantota šūnu proporcijām un ceļa analīzei.

Secenciālā orgānu mazspējas novērtējuma (SOFA) rezultāts

Secīgā orgānu mazspējas novērtējuma (SOFA) rādītājs ir ar sepsi saistītas orgānu mazspējas skaitliska vērtība, ti, tas kvantitatīvi nosaka bojāto orgānu skaitu un smagumu. Katrs rezultāts svārstās no 0 līdz 4, un augstāks rādītājs norāda uz orgānu disfunkcijas pasliktināšanos [17]. Mēs izmantojām dinamiskās SOFA rezultātu izmaiņas, lai definētu reaģētājus (R) un nereaģējošos (NR), un dalībnieks tika klasificēts kā NR, ja SOFA rezultāta samazinājums no 1. līdz 7. dienai bija mazāks par 2 [13, 18, 19]. .

RNA-Seq datu bioinformātikas analīze 

Sekvencēšana bija augstas kvalitātes, tika izmantoti Phred rādītāji 30, un HISAT2 kartēja secības nolasījumus ar atsauces genomu (GRCh38/hg38) [20]. R pakotne DEseq2 [21] tika izmantota, lai identificētu diferencēti izteiktos gēnus (DEG), un nolasījumu skaits tika aprēķināts, izmantojot funkciju Counts [22]. Vidējais kartēšanas ātrums un nolasījumu skaits bija attiecīgi 87,6 ± 4, 8% un 65, 5 ± 17, 6 miljoni nolasījumu. Profilera [23] R pakotne tika izmantota, lai veiktu funkcionālo bagātināšanu un ceļu analīzi, pamatojoties uz genomiem (KEGG, https://www.genome.jp/kegg/) un gēnu ontoloģiju (GO, http://geneontology.org). /) datu bāzes. Tika uzskatīts, ka koriģētā p vērtība, kas mazāka par 0, 05, ir ievērojami bagātināta. Visi diferencēti izteiktie gēni tika funkcionāli anotēti, izmantojot gēnu kopas bagātināšanas analīzi (GSEA) [24], un tika izveidota Cytoscape 3.9.0 [25] vizualizēta bagātināšanas karte. Mēs vizualizējām GSEA rezultātus, izmantojot bagātināšanas karti, kas organizē gēnu kopas līdzības tīklā. Mezgls, saite un mezgla krāsa attēlo attiecīgi gēnu kopu, dalībnieku gēnu pārklāšanos un bagātināšanas punktu skaitu [24].

TCR analīžu daudzveidība

RNA-Seq dati tika izmantoti MiXCR v3.0.13 [15, 16], lai kvantitatīvi noteiktu sepses pacientu klonotipus, pamatojoties uz iepriekš ziņoto protokolu [14]. VDJTools v 1.2.1 [26] programmatūra tika izmantota, lai aprēķinātu komplementaritāti noteicošā reģiona -3 (CDR3) skaitu un paraugu daudzveidību pēc kvantitatīvo klonotipu iegūšanas.

Statistiskās analīzes

Mēs izmantojām Kolmogorova – Smirnova testu, lai pārbaudītu normālu, un atklājām, ka vairāku mainīgo lielumu, tostarp ventilatora dienas, ICU uzturēšanās ilguma un slimnīcas uzturēšanās ilguma, sadalījums bija pa kreisi. Lai sniegtu datus vienotā formātā, mēs uzrādījām kategorisko mainīgo biežumu (procentos) kategoriskiem mainīgajiem un nepārtrauktajiem mainīgajiem kā mediānu (interkvartiļu diapazons, IQR). Atšķirības starp abām grupām tika analizētas, izmantojot Mann-Whitney U testu nepārtrauktiem mainīgajiem un Fišera precīzu testu kategoriskiem mainīgajiem. Nozīmīguma līmenis tika iestatīts uz 0.05, un statistiskā analīze bija divpusēja. Lai veiktu visu datu analīzi, tika izmantota R versija 4.1.0.

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Rezultāti Pacientu raksturojums un SOFA rādītāji

Šajā pētījumā mēs iesaistījām 37 gados vecākus pacientus ar sepsi [vidējais vecums 83 gadi (IQR: 79–87 gadi)] (1. tabula). Veicot galveno komponentu analīzi, mēs novērojām, ka atšķirība starp dienu -1 un dienu-8 bija labāka reaģējošiem pacientiem (reaģējošo grupa, R) nekā pacientiem, kas nereaģē (nereaģējošo grupa, NR), kas norāda uz regulētu atveseļošanos no sepses imūnkompetentu grupā (1. papildu fails: S1 att.). Kopumā starp 37 pacientiem bija 23 reaģējoši pacienti (reaģējošo grupa, R) ar vidējo vecumu 82 gadi (IQR: 79,5–86,5 gadi) un 14 nereaģējoši pacienti (nereaģējošo grupa, NR). vidējais vecums 84 gadi (IQR: 79–88 gadi). 1. tabulā parādītas pētāmās grupas pamatīpašības. Ārstēšanas laikā tika novērots augstāks albumīna līmenis (vidēji 3,3 mg/dl, IQR: 3–3,7 mg/dl) un zemāks C-reaktīvā proteīna līmenis (vidēji 9,16 mg/dl, IQR: 3,9–17,5 mg/dl) nekā to kolēģiem. Salīdzinot ar reaģētāju grupu, nereaģējošo grupai bija ievērojami augstāki SOFA rādītāji 7. dienā, garākas ventilācijas dienas, ilgāks uzturēšanās ilgums ICU un augstāka mirstība slimnīcā.

Atšķirīgs dinamisks transkripts gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi

Kā parādīts 1.A attēlā, izmantojot galveno komponentu analīzi par 500 populārākajiem gēniem no visiem paraugiem, mēs atklājām, ka gados vecākiem pacientiem ar sepsi intensīvās terapijas nodaļā 1. un 8. dienā bija ievērojami atšķirīgi transkripti. DEG) tika identificēti, salīdzinot gēnu ekspresijas profilus starp 8. un 1. dienu gados vecākiem ICU pacientiem, izmantojot p kritērijus.<0.01 and log fold change>0.25 vai<− 0.25. Tree DEGs (two upregulated and one downregulated gene) were found in the R group, while the NR group only had 11 DEGs (five upregulated and six downregulated genes). We found that in elderly sepsis patients in the ICU, the top upregulated genes were innate immunity- and inflammation-relevant genes, namely, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33, and PCSK9, which bind to low-density lipoprotein receptors (LDLRs), leading to LDLR degradation and increasing LDL cholesterol levels (Fig. 1B). 

Dinamiskā transkripta DAVID bagātināšanas analīze

Lai parādītu bioloģisko ceļu izmaiņas gados vecākiem ICU pacientiem no 8. līdz 1. dienai, mēs parādījām bagātināto ceļu, izmantojot tiešsaistes DAVID v6.8 serveri. Kā parādīts 2. attēlā, gēnu ontoloģijas (GO) burbuļu diagrammas tika izveidotas bioloģiskajiem procesiem 20 DEG no datu kopas. Mēs noskaidrojām, ka gados vecāku ICU pacientu ar sepsi DEG tika bagātinātas ar transkripcijas regulēšanu, adaptīvo imūnreakciju, imūnglobulīnu veidošanos, negatīvu transkripcijas regulēšanu un imūnreakciju. DAVID funkcionālā GO analīze ir parādīta 3. attēlā. Salīdzinot ar kontrolēm, Gēnu kodēto proteīnu funkcionālās anotācijas DEG uzrādīja nozīmīgi (P<0.05) increased or decreased enrichment. These annotations were categorized according to biological processes, cellular components, and molecular functions. There were significant differences between DEG-encoded proteins involved in the regulation of transcription, the immune response, protein phosphorylation, and Ras protein signal transduction at the level of biological processes (Fig. 3), whereas cellular component analysis revealed significant differences between the T-cell receptor complex, cytosol nucleoplasm, and nucleus (Fig. 3). Significant differences were found in the enrichment of encoded proteins associated with protein binding, metal ion binding, translation factor activity, or transcriptional activator activity according to molecular function analysis (Fig. 3). Ten, we used the Cytoscape ClueGO plugin to investigate the functional enrichment of the DEGs in the dataset to further refine the biological process from the analysis of DAVID-GO terms [27]. Additionally, the REACTOME pathway analysis from ClueGO revealed that cytokine signaling in the immune system, adaptive immune system, sensory perception, innate immune system, and immunoregulatory interactions between lymphoid and non-lymphoid cells were significantly enriched in many DEGs.

1. tabula Vecāku ICU pacientu ar sepsi raksturojums

1. att. Transkripta galveno komponentu analīze A un vulkāna diagramma B starp dienu-1 un dienu-8

2. att. Diferenciāli ekspresētu gēnu funkcionālās un ceļu bagātināšanas analīzes ar DAVID, izmantojot burbuļu diagrammu

3. att. DAVID funkcionālās gēnu ontoloģijas (GO) analīze par bioloģisko procesu (BP), šūnu komponentu (CC) un molekulāro funkciju (MF)

TCR analīzes ar MiXCR gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi

Ņemot vērā, ka R un NR grupas atguvās no sepses, izmantojot īpašu T-šūnu receptoru signalizācijas ceļu, izmantojot unikālo CDR3, D50 un apgriezto Simpsona indeksu, mēs izmantojām MiXCR, lai noteiktu T-šūnu receptoru (TCR) daudzveidību. ) (5A–C att.). 8. dienā R grupas CDR3, D50 un apgrieztais Simpsona indekss bija ievērojami augstāks nekā 1. dienā. Turklāt D50 indekss bija ievērojami augstāks R grupā nekā NR grupā 8. dienā (5. B att.). Visbeidzot, mēs novērtējām unikālā CDR3 daudzveidību, izmantojot apgriezto Simpsona indeksu, kas atspoguļo bagātīgus klonotipus. Mēs novērojām līdzīgu modeli ar ievērojami palielinātu TCR daudzveidību R grupā, īpaši 8. dienā (5. C att.).

Diskusija

Šis pētījums parāda, ka ar mirstību saistītās bioloģiskās pazīmes un adaptīvā imunitāte saistītā signalizācija, izmantojot transkriptomiku, salīdzinot atšķirības starp 1. un 8. dienu (1. papildu fails: S1 att.), var droši identificēt gados vecākus ICU pacientus ar sepsi un atšķirt nereaģējošos pacientus no reaģējošiem pacientiem. . Iepriekšējie pētījumi, kuros tika pētīti sepses biomarķieri, bija atkarīgi no zināmo bioloģisko funkciju un ceļu atlases, izmantojot uz zināšanām balstītas metodes [28], un tikai neliels skaits pētījumu ir tieši vērsti uz gēniem, kuru funkcijas nav pilnībā aprakstītas [29]. Šajā pētījumā mēs izmantojām RNA-Seq, lai identificētu bioloģiskās un imunoloģiskās pazīmes gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi, izmantojot galveno komponentu analīzi, diferenciālo gēnu ekspresijas analīzi un MiXCR. Iedzimta imunitāte un iekaisumi, piemēram, ZDHCC19, ALOX15, FCER1A, HDC, PRSS33 un PCSK9, tika regulēti gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi. ZDHHC19 ir palmitoiltransferāze un mediē RRAS palmitoilāciju, kā rezultātā palielinās šūnu dzīvotspēja [30]. Genoma mēroga gēnu ekspresijas analīze ir saistīta ar palielinātu ekspresiju ICU pacientiem ar sepsi, ko izraisa fekāliju peritonīts [31]. HDC (histidīna dekarboksilāze, HDC) ir II grupas dekarboksilāzes saimes loceklis un veido homodimēru, kas izmanto piridoksāla fosfātu, lai pārvērstu L-histidīnu histamīnā. Pētījums ar dzīvniekiem, ko veica Hattori et al. [32] izmantoja HDC gēnu knockout (HDC−/−) peles. Pēc sepses izraisīšanas ar cecal ligation un punkciju (CLP), ar HDC nokautu pelēm bija samazināts histamīna līmenis plazmā, un TNF, IL-1b, IL-6 un MCP1 līmeņa paaugstināšanās sepses gadījumā tika vājināta, ja plazmas nebija. histamīns [32]. Sepses izraisīta patoloģiska citokīnu ražošana un vairāku orgānu (plaušu, aknu un nieru) bojājumi tika ievērojami samazināti pelēm ar HDC nokautu, salīdzinot ar WT C57BL/6 J pelēm. HDC ekspresijas kavēšana novērsa iekaisuma audu bojājumus un uzlaboja izdzīvošanu pelēm ar CLP izraisītu sepsi [32]. Turklāt histamīns var veicināt proinflammatorisku citokīnu veidošanos, ko regulē transkripcijas faktors NF‐κB. CLP izraisītas sepses laikā pelēm ar HDC nokautu NF‐κB aktivitāte kodolā bija ievērojami samazināta, salīdzinot ar WT pelēm [32]. Šis rezultāts norāda, ka histamīns inducē proinflammatorisku citokīnu un kemokīnu sintēzi, palielinot NF-KB aktivitāti.

Nesenie pētījumi ir parādījuši, ka ALOX15 un FCER1A ir izšķiroši svarīgi bakteriālās sepses patoģenēzē [33, 34]. ALOX15, lipīdu peroksidējošais enzīms, ir funkcionāls lipoksigenāzes (LOX) gēns [35], kas oksidē polinepiesātinātās taukskābes un ir saistīts ar dažādiem fizioloģiskiem procesiem, kā arī neirodeģeneratīvu, iekaisuma un hiperproliferatīvu slimību patoģenēzi [35, 36]. ALOX15 un tā metabolīti ir iesaistīti vairāku iekaisuma slimību, piemēram, sepses, artrīta, astmas, cistiskās fibrozes un aterosklerozes, patofizioloģijā [36]. FCER1A (IgE receptora Ia Fc fragments, FCER1A), ar imūnsistēmu saistīts proteīns, ir alerģisku reakciju ierosinošais faktors, un tam ir nozīme alerģiskā iekaisumā [37, 38]. Iepriekšējos pētījumos FCER1A ir bijis iesaistīts vielmaiņas procesu un imūnsistēmas regulēšanā. [38, 39]. Turklāt astmas iespējamība ir lielāka, ja mijiedarbojas FCER1B un citi ar imūnglobulīnu saistīti iekaisuma gēni [39]. Turklāt PCSK9 (proteīna konvertāzes subtilizīna/keksīna tips- 9, PCSK9) ir identificēts kā centrālais plazmas ZBL-C līmeņa regulators, jo tas spēj saistīties ar ZBL receptoriem (ZBL) un izraisīt to lizosomu degradāciju šūnās. , kas izraisa ZBL degradāciju un palielina ZBL holesterīna līmeni [40].

cistanche tubulosa-uzlabo imūnsistēmu

Šajā pētījumā mēs izmantojām KEGG bagātināšanu un GO, lai noteiktu šo gēnu funkcionālo anotāciju, lai izpētītu izteiktu DEG iesaistīšanos gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi BP, MF un FH molekulārajos ceļos. Šie DEG galvenokārt tika bagātināti ar transkripcijas, adaptīvās imūnās atbildes, imūnglobulīna ražošanas, transkripcijas negatīvās regulēšanas un imūnās atbildes regulēšanu (2. attēls). Mēs izveidojām funkcionāli sakārtotu GO/ceļa terminu tīklu, izmantojot Cytoscape spraudni ClueGO/CluePedia, kas ir uzlabota bioloģisko terminu interpretācija. Šis spraudnis arī palīdzēja mums vizualizēt tīklus, kas ir funkcionāli sagrupēti no lielākām gēnu kopām [41]. Mēs izmantojām ClueGO spraudni, lai identificētu atšķirīgi regulētos molekulāros ceļus un to nozīmīgo gēnu mijiedarbību, pamatojoties uz p-vērtībām un kappa statistiku, lai iegūtu visaptverošu priekšstatu par sepsē iesaistītajiem DEG. Turklāt, analizējot MF no GO, DEG tika ievērojami bagātināti ar transkripcijas aktivitāti un saistīšanos ar olbaltumvielām (3. att.). Šie rezultāti liecina, ka funkcionālās bagātināšanas analīzes jo īpaši attiecas uz imunitātes šūnu signalizācijas ceļiem, kas saistīti ar šūnu reakciju uz patogēniem motīviem vai citokīniem. Tie, visticamāk, ir sagaidāmi rezultāti septiskiem pacientiem, un tiem ir nepieciešama turpmāka izmeklēšana, lai noskaidrotu sepses ceļus. Pamatojoties uz kappa statistiku un p vērtībām, mēs noskaidrojām, ka starp bagātinātajiem bioloģiskajiem procesiem un molekulārajiem ceļiem citokīnu signalizācija imūnsistēmā, adaptīvā imūnsistēma, sensorā uztvere, iedzimtā imūnsistēma un imūnregulācijas mijiedarbība starp limfoīdo un ne-limfoīdu. šūnas bija disregulētas un bija nozīmīgi saistītas ar sepses progresēšanu gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi (4. att.).

Turklāt mēs parādījām T šūnu daudzveidību gados vecākiem pacientiem ar sepsi un izmantojām MiXCR, lai analizētu RNS-Seq neapstrādāto secību, lai noteiktu TCR klonotipus, kas ļāva mums vienlaikus pārbaudīt TCR daudzveidību un visu transkriptu [ 15]. Šajā pētījumā tika izmantoti RNA-Seq un MiXCR, lai identificētu T šūnu signālu pārraidi, un rezultāti atklāja, ka R grupas TCR daudzveidība dienā -8 bija lielāka nekā dienā-1 (5. att.). . Salīdzinot ar NR grupu, R grupai bija ievērojami augstākas CDR3, D50 un apgrieztās Simpsona indeksa vērtības -8. dienā nekā -1. Šie pierādījumi liecina arī par TCR izraisītās daudzveidības nozīmi gados vecākiem ICU pacientiem ar sepsi, kas parāda RNA-Seq un MiXCR datu izmantošanas dzīvotspēju, lai risinātu TCR daudzveidību pacientiem ar sepsi. Mūsu pētījumam ir daži ierobežojumi, kas jāņem vērā. Pirmkārt, šajā pētījumā pētīto pacientu grupa bija neliela. Tādējādi dažādu populāciju ar lielāku izlases lielumu izpēte palīdzētu apstiprināt mūsu datus. Otrkārt, šajā pētījumā mēs izmantojām lielāko daļu RNS-Seq, un turpmākie sc-RNA-Seq un funkcionālie eksperimenti ir pamatoti apstiprināšanai šūnu līmenī. Turklāt, lai izpētītu T-šūnu repertuāru, var izmantot 5' ātrās cDNS galu amplifikācijas (5'-RACE) pieeju, kas var vēl vairāk apstiprināt mūsu atklājumus. Treškārt, mēs novērtējām iekaisuma reakciju bioloģiskās un molekulārās funkcijas pacientiem ar sepsi, izmantojot RNS-Seq datus. Ir nepieciešami turpmāki funkcionālie pētījumi, lai noskaidrotu sepses lomu.

4. att. Gēnu ontoloģijas (GO) terminu bagātināšana tika vizualizēta, izmantojot spraudni ClueGO/CluePedia no Cytoscape

5. attēls T-šūnu receptoru daudzveidība dienā-1 un dienā-8. Apgrieztā Simpsona indeksa skaits (A), unikālais CDR3 (B), D50 un (C). *<0.05, **<0.005

Secinājumi

Sepses sastopamība un mirstība gados vecākiem cilvēkiem ir augsta. Mūsu pētījumā tika iekļauti kritiski slimi vecāka gadagājuma cilvēki ar sepsi un identificētas ar mirstību saistītas bioloģiskās pazīmes un transkriptomiskās pazīmes, izmantojot funkcionālo ceļu un MiXCR analīzi, pamatojoties uz RNS-Seq datiem. Salīdzinot ar 1. dienu, mēs atklājām paaugstinātu iedzimto imunitāti un palielinātu T šūnu daudzveidību reaģējošo pacientu vidū 8. dienā, norādot, ka reaģējošiem pacientiem bija labāk regulēta atveseļošanās no sepses, salīdzinot ar pacientiem, kas nereaģē. Lai īstenotu precīzu un agrīnu prognozēšanu, RNA-Seq testa izmantošana varētu piedāvāt papildu papildu informāciju ārstēšanas rezultātu agrīnai prognozēšanai.

Atsauces

1. Seymour CW, Kennedy JN, Wang S, Chang CH, Elliott CF, Xu Z u.c. Sepses jaunu klīnisko fenotipu atvasinājums, validācija un iespējamā ārstēšanas ietekme. JAMA. 2019;321(20):2003–17.

2. Sweeney TE, Azad TD, Donato M, Haynes WA, Perumal TM, Henao R u.c. Neuzraudzīta baktēriju sepses transkriptomikas analīze vairākās datu kopās atklāj trīs spēcīgas kopas. Crit Care Med. 2018;46(6):915–25.

3. de Lange DW, Brinkman S, Flaatten H, Boumendil A, Morandi A, Andersen FH u.c. Kumulatīvais prognostiskais rādītājs, kas paredz mirstību pacientiem, kas vecāki par 80 gadiem, kuri uzņemti ICU. J Am Geriatr Soc. 2019;67(6):1263–7.

4. Flaatten H, de Lange DW, Artigas A, Bin D, Moreno R, Christensen S u.c. Intensīvās terapijas medicīnas pētījumu statuss un nākotnes darba kārtība ļoti veciem pacientiem ICU. Intensīvās terapijas med. 2017;43(9):1319–28.

5. Guidet B, de Lange DW, Boumendil A, Leaver S, Watson X, Boulanger C u.c. Vājības, izziņas, ikdienas dzīves aktivitātes un blakusslimību ietekme uz iznākumu akūti uzņemtiem pacientiem, kas vecāki par 80 gadiem Eiropas intensīvās terapijas nodaļās: VIP2 pētījums. Intensīvās terapijas med. 2020;46(1):57–69.

6. Štāls EC, Brauns BN. Šūnu terapijas stratēģijas imunogēnu zinātnes apkarošanai. Organoģenēze. 2015;11(4):159–72.

7. Martin S, Perez A, Aldecoa C. Sepsis un imūnsenescence gados vecākiem pacientiem: pārskats. Front Med (Lozanna). 2017. https://doi.org/10. 3389/fmed.2017.00020.

8. Rydyznski Moderbacher C, Ramirez SI, Dan JM, Grifoni A, Hastie KM, Weiskopf D u.c. Antigēniem specifiska adaptīvā imunitāte pret SARS-CoV-2 akūtā COVID-19 gadījumā un saistība ar vecumu un slimības smagumu. Šūna. 2020;183(4):996-1012 e1019.

9. Leblanc G, Boumendil A, Guidet B. Desmit lietas, kas jāzina par kritiski slimiem gados vecākiem pacientiem. Intensīvās terapijas med. 2017;43(2):217–9.

10. Guidet B, Vallet H, Boddaert J, de Lange DW, Morandi A, Leblanc G u.c. Rūpes par kritiski slimiem pacientiem, kas vecāki par 80 gadiem: stāstījuma pārskats. Annas intensīvā aprūpe. 2018;8(1):114.

11. Breidijs J, Horijs S, Leifijs Dž. Adaptīvās imūnās atbildes loma sepsē. Intensive Care Med Exp. 2020;8(1):20.

12. Mārtins MD, Badovinaka VP, Grifta TS. CD4 T šūnu reakcijas un sepses izraisīts imūnparalīzes stāvoklis. Front Immunol. 2020. gads. https://doi.org/10. 3389/fmmu.2020.01364.

13. Barcella M, Bollen Pinto B, Braga D, D'Avila F, Tagliaferri F, Cazalis MA u.c. Transkripta profila identificēšana, kas saistīta ar orgānu funkcijas uzlabošanos septiskā šoka pacientiem pēc agrīnas atbalstošas ​​terapijas. Kritu aprūpe. 2018;22(1):312.

14. Cheng PL, Chen HH, Jiang YH, Hsiao TH, Wang CY, Wu CL u.c. RNA-Seq izmantošana, lai izpētītu imūnsistēmas vielmaiņas pazīmes pacientiem ar imūndeficītu un sepsi. Front Med (Lozanna). 2021. https://doi. org/10.3389/fmed.2021.747263.

15. Bolotin DA, Poslavsky S, Mitrophanov I, Shugay M, Mamedov IZ, Putintseva EV, et al. MiXCR: programmatūra visaptverošai adaptīvai imunitātes profilēšanai. Nat metodes. 2015;12(5):380–1.

16. Bolotins DA, Poslavsky S, Davydov AN, Frenkel FE, Fanchi L, Zolotareva OI u.c. Antigēnu receptoru repertuāra profilēšana no RNS-seq datiem. Nat Biotechnol. 2017;35(10):908–11.

17. Vincent JL, de Mendonca A, Cantraine F, Moreno R, Takala J, Suter PM u.c. SOFA rezultāta izmantošana, lai novērtētu orgānu disfunkcijas/nespējas biežumu intensīvās terapijas nodaļās: daudzcentru perspektīva pētījuma rezultāti Eiropas Intensīvās terapijas medicīnas biedrības "ar sepsi saistīto problēmu" darba grupa. Crit Care Med. 1998;26(11):1793–800.

18. Garsija-Gigorro R, Saez-de la Fuente I, Marin Mateos H, Andres-Esteban EM, Sanchez-Izquierdo JA, Montejo-Gonzalez JC. SOFA un Delta-SOFA rādītāju lietderība, lai prognozētu rezultātus kritiski slimiem pacientiem no neatliekamās palīdzības nodaļas. Eur J Emerg Med. 2018;25(6):387–93.

19. Jones AE, Trzeciak S, Kline JA. Secīgā orgānu mazspējas novērtējuma rezultāts, lai prognozētu rezultātus pacientiem ar smagu sepsi un hipoperfūzijas pierādījumiem neatliekamās palīdzības nodaļas prezentācijas laikā. Crit Care Med. 2009;37(5):1649–54.

20. Kim D, Langmead B, Salzberg SL. HISAT: ātri savienojams izlīdzinātājs ar zemām atmiņas prasībām. Nat metodes. 2015;12(4):357–60.

21. Anders S, Huber W. Diferenciālās izteiksmes analīze secību skaitīšanas datiem. Genoms Biol. 2010;11(10):R106.

22. Liao Y, Smyth GK, Shi W. FeatureCounts: efektīva vispārējas nozīmes programma secību nolasījumu piešķiršanai genoma pazīmēm. Bioinformātika. 2014;30(7):923–30.

23. Raudvere U, Kolberg L, Kuzmin I, Arak T, Adler P, Peterson H, et al. g: Profiler: tīmekļa serveris funkcionālās bagātināšanas analīzei un gēnu sarakstu konvertēšanai (2019. gada atjauninājums). Nucleic Acids Res. 2019;47(W1):W191–8.

24. Merico D, Isserlin R, Stueker O, Emili A, Bader GD. Bagātināšanas karte: uz tīklu balstīta metode gēnu kopas bagātināšanas vizualizācijai un interpredācijai. PLoS ONE. 2010;5(11):e13984.

25. Shannon P, Markiel A, Ozier O, Baliga NS, Wang JT, Ramage D u.c. Cytoscape: programmatūras vide integrētiem biomolekulāro mijiedarbības tīklu modeļiem. Genome Res. 2003;13(11):2498–504.

26. Andersens ES. DNS un RNS struktūru prognozēšana un projektēšana. N Biotehnoloģijas. 2010;27(3):184–93.

27. Le Gall JR, Lemeshow S, Saulnier F. Jauns vienkāršots akūtas fizioloģijas rādītājs (SAPS II), pamatojoties uz Eiropas/Ziemeļamerikas daudzcentru pētījumu. JAMA. 1993;270(24):2957–63.

28. Sazerlends A, Tomass M, Brendons RA, Brendons RB, Lipmens J, Tans B u.c. Jauna molekulārā biomarķiera diagnostikas testa izstrāde un apstiprināšana sepses agrīnai noteikšanai. Kritu aprūpe. 2011;15(3):R149.

29. Lukaszewski RA, Jones HE, Gersuk VH, Russell P, Simpson A, Brealey D u.c. Pēcoperācijas infekcijas un sepses presimptomātiska diagnostika, izmantojot gēnu ekspresijas parakstus. Intensīvās terapijas med. 2022. https://doi. org/10.1007/s00134-022-06769-z.

30. Niu J, Sun Y, Chen B, Zheng B, Jarugumili GK, Walker SR u.c. Taukskābes un vēža pastiprināts ZDHHC19 veicina STAT3 aktivāciju, izmantojot S-palmitoilāciju. Daba. 2019;573(7772):139–43.

31. Burnham KL, Davenport EE, Radhakrishnan J, Humburg P, Gordon AC, Hutton P u.c. Kopīgi un atšķirīgi sepses transkriptomiskās reakcijas aspekti uz fekālo peritonītu un pneimoniju. Am J Respir Crit Care Med. 2017;196(3):328–39.

32. Hattori M, Yamazaki M, Ohashi W, Tanaka S, Hattori K, Todoroki K u.c. Endogēnā histamīna kritiskā loma gala orgānu audu bojājumu veicināšanā sepses gadījumā. Intensive Care Med Exp. 2016; 4(1):36.

33. Reyes M, Filbin MR, Bhattacharyya RP, Billman K, Eisenhaure T, Hung DT u.c. Baktēriju sepses imūnšūnu signāls. Nat Med. 2020;26(3):333–40.

34. Tang-Huau TL, Gueguen P, Goudot C, Durand M, Bohec M, Baulande S u.c. Cilvēka in vivo radītas no monocītiem iegūtas dendritiskās šūnas un makrofāgi krusteniski prezentē antigēnus caur vakuolāru ceļu. Nat Commun. 2018;9(1):2570.

35. Ivanovs I, Kuhn H, Heydeck D. Arahidonskābes 15-lipoksigenāzes-1 (ALOX15) strukturālā un funkcionālā bioloģija. Gene. 2015;573(1):1–32.

36. Singh NK, Rao GN. 12/15-lipoksigenāzes (ALOX15) jaunā loma cilvēka patoloģijās. Prog Lipid Res. 2019;73:28–45.

37. Baioumy SA, Esawy MM, Shabana MA. Cirkulējošās FCepsilonRIa novērtējums hroniskas spontānas nātrenes pacientiem un tā saistība ar klīniskajiem un imunoloģiskajiem mainīgajiem. Imunobioloģija. 2018;223(12):807–11.

38. Liao EC, Chang CY, Hsieh CW, Yu SJ, Yin SC, Tsai JJ. Izpētes izmēģinājuma pētījums par ģenētisko marķieru IgE izraisītām alerģiskām slimībām ar FcepsilonR1alpha un Cepsilon izpausmēm. Int J Mol Sci. 2015;16(5):9504–19.

39. Hua L, Zuo XB, Bao YX, Liu QH, Li JY, Lv J u.c. Četru lokusu gēnu mijiedarbība starp IL13, IL4, FCER1B un ADRB2 astmas gadījumā ķīniešu Han bērniem. Pediatr Pulmonol. 2016;51(4):364–71.

40. Kosenko T, Golders M, Leblond G, Vengs W, Lagace TA. Zema blīvuma lipoproteīns cilvēka plazmā saistās ar proproteīna konvertāzes subtilizīna/keksīna tipa -9 (PCSK9) un inhibē PCSK9-mediētu zema blīvuma lipoproteīnu receptoru degradāciju. J Biol Chem. 2013;288(12):8279–88.

41. Bindea G, Mlecnik B, Hackl H, Charoentong P, Tosolini M, Kirilovsky A u.c. ClueGO: Cytoscape spraudnis, lai atšifrētu funkcionāli grupētu gēnu ontoloģiju un ceļu anotācijas tīklus. Bioinformātika. 2009;25(8):1091–3.