Kā kalcijs ārstē luorīda izraisītus nieru bojājumus?
Mar 16, 2022
Kontaktpersona: Odrija Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pasts:audrey.hu@wecistanche.com
Atslēgvārdi: Kalcijs, Nieres, Apoptoze
KOPSAVILKUMS
Ilgstoša pārmērīga fluorīda (F) uzņemšana var izraisīt kaulu un nekaulu bojājumus. Thenieresir galvenais ķermeņa fluora izvadīšanas orgāns. Šī pētījuma mērķis bija noskaidrot, vai uzturakalcijspapildināšana var mazinātnieresfluorozes radītos bojājumus un turpmāku izmeklēšanu sekasKalcijspar seku mazināšanas mehānismunieresšūnaapoptozeaktivizēja F. Mēs novērtējām histopatoloģisko struktūru,nieresfunkciju indikatori un gēnu un proteīnu ekspresijas līmeņi nāves receptoru starpniecībāapoptozeceļi Sprague Dawley (SD) žurkām, kas ārstētas ar nātrija fluorīdu (NaF) un/vaikalcijskarbonātu (CaCO3) 120 dienas. Rezultāti parādīja, ka 100 mg/l NaF inducējaniereshistopatoloģisku bojājumu unapoptoze, paaugstināja kreatinīna (CRE), urīnskābes (UA), urīnvielas slāpekļa (BUN), kālija (K), fosfora (P) un F (p < {0}}.05)="" koncentrāciju="" ,="" un="" samazināt="" magnija="" (mg)="" līmeni="" serumā="" (p="">< 0,05).="" turklāt="" naf="" palielināja="" fas="" šūnu="" virsmas="" nāves="" receptoru="" (fas),="" audzēja="" nekrozes="" faktora="" (tnf),="" ar="" tnf="" saistīto="" mrns="" un="" olbaltumvielu="" ekspresijas="">apoptoze-inducējošais ligands (TRAIL), kaspāze 8, kaspāze 3 un poli-ADP-ribozes polimerāze (PARP) (p < 0,01),="" kas="" beidzot="" aktivizēja="" nāves="" receptoru="" ceļu.="">Kalcijspapildināšana mainīja F izraisīto CRE, BUN, UA, F un P līmeņa pazemināšanos, mazināja histopatoloģiskos bojājumus unapoptoze, un samazināja ar nāves receptoru ceļu saistīto marķieru gēnu un proteīnu ekspresijas līmeni. Noslēgumā jāsaka, ka 1 procentsKalcijsmazina F izraisītonieresapoptozecaur FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL signalizācijas ceļiem.
Ievads
Fluors ir plaši sastopams augsnē, ūdenī un pārtikā. Tomēr daži dabas faktori (minerālu un iežu laikapstākļi, veidošanāskalcijsun magnija sāļi, infiltrācija gruntsūdeņos u.c.) un cilvēka darbība (rūpnieciskie notekūdeņi, agroķīmiskās vielas, sadzīves preces u.c.) rada fluora piesārņojumu vidē (Daiwile et al., 2019). Pašlaik lielākais fluora (F) iedarbības faktors ir dzeramais ūdens, un Pasaules Veselības organizācijas ieteiktā F koncentrācija dzeramajā ūdenī ir mazāka par 1,5 mg/l (Dzeramā ūdens kvalitātes vadlīnijas, 2017). Epidemioloģiskie pierādījumi liecina, ka augstāka par šo koncentrāciju palielina zobu fluorozes risku, un pieaugošā koncentrācija palielinās skeleta fluorozes risku (Dzeramā ūdens kvalitātes vadlīnijas, 2017; Nacionālā pētniecības padome, 2006). Ilgstoša iedarbība uz augstu fluorīda koncentrāciju var palielināt fluora uzsūkšanos organismā caur elpceļiem.
un gremošanas trakti. Pārmērīga F uzņemšana var izraisīt ķermeņa kaulu un bezkaulu orgānu bojājumus. Mīksto audu bojājumus ārpus kaula parasti sauc par nekaulu bojājumiem. Šobrīd ir konstatēts, ka F izraisītais nekaulu audu bojājums skar gremošanas traktu, aknas,nieres, smadzenes utt. (Jha et al., 2011; Perumal et al., 2013).
Thenieres, galvenais organisma ekskrēcijas orgāns, atbild par toksisko vielu un eksogēno toksīnu metabolismu organismā. Pētījumi liecina, ka aptuveni 50–80 procenti no organismā uzņemtā fluora tiek filtrēti un atkārtoti uzsūcas organismā.nieres, un atlikušais fluors tiek uzkrāts citos audos un orgānos (Chen et al., 2013; Dharmaratne, 2019). Daudzu veidu literatūra ir pierādījusi, ka 50 un 100 mg/LF iedarbība var izraisīt nieres kapsulas dobuma paplašināšanos, nieru atrofiju.niereskanāliņi, neregulārs papilāru šūnu izvietojums, lūmena sašaurināšanās, kā rezultātāapoptozenonieresšūnu un bioķīmisko funkciju, piemēram, kreatinīna (CRE), urīnskābes (UA), pasliktināšanās,kalcijs(Ca) un fosfors (P) (Song et al., 2014; HW Wang et al., 2020; Wei et al., 2018a).
Apoptoze, sava veida šūnu nāve, ko kontrolē gēni, kas ir sadalīta endogēnāapoptozeun eksogēniapoptoze. Jaunākie ziņojumi par to liecinaapoptozeaugsta F izraisītie ceļi galvenokārt ietver mitohondriju starpniecību, endoplazmatiskais tīkls ir stresa izraisīts un nāves receptoru mediēti ceļi (Wei et al., 2018a). Iepriekšējie mūsu grupas eksperimenti norādīja, ka NaF inducē kaulus un aknasapoptozecaur intracelulāro endoplazmatiskā tīkla (ER) ceļu un mitohondriju ceļu (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Turklāt pētījumi ir arī parādījuši, ka mitohondriju ceļš ir iesaistīts NaF izraisītā procesāapoptozeno pelesnieres(Wei et al., 2018b). Tomēr nav sistemātisku pētījumu par nāves receptoru izraisīto ceļu F izraisītajā gadījumānieresapoptoze. Nāves receptoru ceļš dominē katrā eksogēnā stadijāapoptoze, ieskaitot Fas šūnu virsmas nāves receptoru (FAS) ceļu, audzēja nekrozes faktora (TNF) ceļu un ar TNF saistītoapoptoze-inducējošā liganda (TRAIL) ceļš (Grunert et al., 2012; Lu et al., 2017; Wang and Su, 2018). FAS ceļš ir primitīva signālu pārraides sistēma, kas ir starpnieksapoptoze. FAS piemīt membrānas receptoru īpašības un pēc saistīšanās ar FAS ligandu (FAS-L) veido trimeru. Tad specifiskais trimera domēns saistās ar atbilstošās konneksīna molekulas FAS saistītā nāves domēna proteīna (FADD) nāves domēnu (DD), veidojot nāves izraisītu signālu kompleksu (DISC) (Wang un Su, 2018). Nākamajā bioloģiskā signāla pārraides procesā FADD var vienlaikus aktivizēt Caspase 8 un Caspase saimi un galu galā izraisītapoptozepiedaloties kaspāzes 3 un poli ADP-ribozes polimerāzes (PARP) efektam (Kischkel et al., 2000; Meynier un Rieux-Laucat, 2019). Nesenie pētījumi liecina, ka FAS ceļš ir starpnieksapoptozeT šūnās un laikānierescisplatīna izraisīta neveiksme (Djiadeu et al., 2017; Linkermann et al., 2011). Turklāt pētījumā arī ziņots, ka NaF inducēapoptozepelēm caur FAS ceļu (Sun et al., 2017). TRAIL ir atzīts citokīns TNF virsģimenē. Tas saistās ar saviem homologajiem agonistu receptoriem, proti, nāves receptoriem (DR4 un DR5). Tā šūnu apgabalā ir DD. DD ir nepieciešams adaptīvā proteīna FADD pieņemšanai darbā. FADD savukārt inducē kaspāžu izdalīšanos citoplazmā, aktivētā Caspase 3 šķeļ PARP un inhibē tā DNS labošanas potenciālu, kā rezultātāapoptoze(Bodmer et al., 2000; Micheau, 2018). Ir norādīts, ka TRAIL / DR5 ceļš ir iesaistīts NaF izraisītāapoptozepelēm (Song et al., 2021). Osteoprotegerīns (OPG) ir brīvi šķīstošs receptors, kam trūkst transmembrānas domēna. Tas var ierobežot TRAIL starpniecībuapoptozeinhibējot TRAIL un citu nāves receptoru saistīšanos (Duiker et al., 2006; Kiraz et al., 2016; Micheau, 2018). TNF un TNF receptoru (TNF-R1) saistīšanās var aktivizēt ar TNFR saistītā nāves domēna (TRADD) proteīna piesaisti, izmantojot tā DD. Pēc tam TRADD mijiedarbojas ar FADD, izraisot pro-kaspāzes 8 piesaistīšanu, ko proteolītiskie enzīmi sadala aktīvajā kaspāzē 8. Pēc tam kaspaze 8 aktivizē Caspase 3, kas ir atbildīga par šūnuapoptoze(Kiraz et al., 2016; Sedger un McDermott, 2014). Tiek ziņots, ka NaF inducē hepatocītusapoptozepelēm caur TNF-R1 signāla ceļu (Lu et al., 2017)
Kalcijsspēlē dažādas lomas kaulu un zobu sastāvā, kā arī var kontrolēt nervu transmisiju un materiāla izdalīšanos (Cao et al., 2016), piedalīties sistēmiskākalcijshomeostāze (Carmeliet et al., 2003; Yang et al., 2016), maina membrānas caurlaidību (Lappe et al., 2017), aktivizē dažādu enzīmu un hormonu sekrēciju (Kim et al., 2012) utt. Daudzos iepriekšējos pētījumos ir atklāts, ka F un Ca bioloģijā ir antagonistiska iedarbība (Dure-Smith et al., 1996; Nobrega et al., 2019). Kad F tiek absorbēts organismā, tas nonāks asinīs, veidojot nešķīstošas CaF2 nogulsnes. Ja Ca apgāde ar uzturu ir nepietiekama un Ca līmenis asinīs nesasniedz noteikto līmeni, notiks patoloģiskas izmaiņas, piemēram, hipokalciēmija un osteolīze, tāpēc uztura bagātinātājam ar Ca ir svarīga loma fluorozes profilaksē un uzlabošanā (Dure-Smith et al. al., 1996; Li et al., 2021; Yang et al., 2021). Mūsu grupa ir apstiprinājusi, ka uzturakalcijsvar atvieglotapoptozekaulu un aknu, izmantojot PI3K-AKT signālu ceļu, ER ceļu un mitohondriju ceļu (Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019; Yang et al., 2021). Lai vēl vairāk pierādītu, vaiKalcijsmazina F nefrotoksicitāti ar nāves receptoru starpniecībuapoptozeceļā, mēs izveidojām augsta fluora diētas žurku modelikalcijsun novērtējanierestraumu indekss, pakāpeapoptoze, un marķiera gēna un olbaltumvielu ekspresijas izmaiņas nāves receptoru starpniecībāapoptozeceļš.
materiāli un metodes
Ķimikālijas un instrumenti
Destilēto ūdeni sagatavoja Heal Force ūdens attīrīšanas sistēma (Šanhaja, Ķīna). Radio imunoprecipitācijas testu (RIPA) līzes buferi un nātrija fluorīdu (NaF) nodrošināja Sigma-Aldrich (Šanhaja, Ķīna). 10% formalīns, glicīns, nātrija dodecilsulfāts (SDS), TRIS, fenilmetilsulfonilfluorīds (PMSF), CaCO3, nitrocelulozes (NC) membrāna, bicinhonīnskābes (BCA) komplekts un hematoksilīna-eozīna (H&E) krāsošanas komplekts tika iegūti no Solarbio Technology Co. ., Ltd. (Pekina, Ķīna). Trizola reaģents tika iegūts no Takara Biological Engineering Company (Dalian, Ķīna). CRE, UA, asins urīnvielas slāpekļa (BUN), magnija (Mg), P un kālija (K) komplekti tika iegādāti no Nanjing Jiancheng Bioinženierijas institūta (Nanjing, Ķīna). Uz vietasapoptozenoteikšanas komplekts, FAS Rabbit Polyclonal antiviela (BA0484) un FAS-L Rabbit Polyclonal antiviela (PB0042) tika iegādāta no Boster Biotechnology (Uhaņa, Ķīna). -aktīna truša poliklonālā antiviela (20536-1-AP), FADD truša poliklonālā antiviela (14906-1-AP), kaspāzes 8 truša poliklonālā antiviela (13423-1-AP), kaspāzes 3 truša poliklonālā antiviela ({{9) }}AP), un HRP-konjugēts Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG(H plus L) (SA00001–2) tika iegūts no Proteintech Group (Uhaņa, Ķīna). TRAL Rabbit Polyclonal Antibody (bs-1214R), TNF alfa Rabbit Policlonal Antibody (bs2081R), PARP Rabbit Polyclonal Antibody (bs-55164R) tika iegādātas no Bioss (Pekina, Ķīna). Elektroķīmiskā luminiscence (ECL) un 3,3′-diaminobenzidīns (DAB) tika iegādāti no KeyGen Biotech (Jiangsu, Ķīna). PrimeScript® RT Master Mix un SYBR® Premix Ex Taq™ II komplektu nodrošināja Promega Biotechnology (Pekina, Ķīna).
Dzīvnieki un ārstēšana
Četrdesmit veseli {0}}nedēļu veci Sprague-Dawley (SD) žurku tēviņi (120 ± 20 g) tika iegūti no Šaņsji Medicīnas universitātes Eksperimentālo dzīvnieku centra (Šansi, Ķīna). Žurkas tika aklimatizētas vienu nedēļu, nejauši sadalītas četrās grupās (10 žurkas katrā grupā): kontroles grupa (C), NaF grupa (F), NaF plus 0,5 procenti CaCO3 grupa (F plus 0,5 procenti Ca), NaF plus 1 procents. CaCO3 grupa (F plus 1 procentsKalcijs) un apstrādātas kā 1. tabula. Visas žurkas tika ievietotas plastmasas būros 22–25 ◦C (mitrums 55 ± 5 procenti, 12 h gaismas/tumsas cikls), uzturs un dzeramais ūdens ir brīvi pieejami.
Pēc 17 nedēļu audzēšanas žurkas badojās 24 stundas, un ūdeni varēja dzert bez maksas. Pēc tam žurkas tika anestēzijas ar nātrija pentobarbitālu un tika nogalinātas ar dzemdes kakla dislokāciju pēc tam, kad asinis tika savāktas no acs āboliem. Dažas asinis tika savāktas ar mēģenēm, kas satur antikoagulantu heparīna nātriju, lai veiktu BUN testu. Daļa asiņu tika ievietota kopējās mēģenēs, novietota istabas temperatūrā 2 stundas un pēc tam centrifugēta ar ātrumu 3000 apgr./min 10 minūtes, lai atdalītu serumu. Serums tika atdalīts CRE, UA, Mg, P, K un F testiem. Astoņi paraugi nonieresno katras grupas tika nejauši atlasīti un ātri sasaldēti šķidrā slāpeklī, un pēc tam uzglabāti -80 ◦ C temperatūrā qRT-PCR un Western blot eksperimentiem. Pārējie paraugi nonierestika fiksēti 10 procentu formalīnā histopatoloģiskai izmeklēšanai un termināla deoksinukleotidiltransferāzes mediētās dUTP nick end marķēšanas (TUNEL) eksperimentiem. Visas ar dzīvniekiem saistītās eksperimentālās darbības tika stingri īstenotas saskaņā ar Dzīvnieku aprūpes iestādes un Šansji Lauksaimniecības universitātes Šansi, Ķīnas lietošanas komitejas noteikumiem.
Niereskoeficients
Vispirms nosvēra žurkas; tadnieresaudi tika izņemti un nosvērti. Theniereskoeficients tika iegūts pēc šādas formulas.
Niereskoeficients=[nieresmitrā masa (g) / ķermeņa masa (g)] × 100 procenti .
Histopatoloģiskā izmeklēšana
Nieresparaugi tika iestrādāti parafīnā. Sadaļa (5 μm biezums) nonierestika iekrāsots ar H&E. Pēc tam priekšmetstikliņus novēroja, izmantojot gaismas mikroskopu (Olympus, Tokija, Japāna). Smaguma pakāpenieresievainojums tika novērtēts pēc histopatoloģiskā rezultāta.Nierescauruļveida ievainojums ir definēts kānieresasinsķermenīši ir atrofēti un deformēti,niereskapsulas dobums paplašināts,niereskanāliņi, kas veido ģipsi, un epitēlija šūnas nokrīt. Pie 200 reizes palielinājuma tika izmantoti šādi kritēriji, lai novērtētu aknu bojājuma pakāpi. 1: 0–25 procenti bojājumu; 2: 25–50 procentu bojājumi; 3: 50–75 procentu bojājumi; 4: 75–100 procentu bojājumi (Baranova et al., 2016).
Noteikšananieres- saistītie rādītāji
F līmenis tika mērīts ar F jonu specifisku elektrodu (Quadri et al., 2018). CRE, UA, BUN, Mg, P un K līmeņi tika mērīti, izmantojot komerciāli pieejamus komplektus. Visas saistītās procedūras tika veiktas saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
Atklāšanaapoptozelīmenī ar TUNEL
Lai kvantitatīvi noteiktuapoptozeiekšānieresšūnas, eksperimentālā analīze tika veikta, izmantojot situapoptozenoteikšanas komplekts. Thenieressekcijas tika deparafinētas un pēc tam pakļautas šķelšanai, izmantojot proteināzi K. Termināla dezoksinukleotidiltransferāze var iezīmēt ar digoksīnu iezīmētu dUTP (DIG-dUTP) 3′-OH galā, un DIG-dUTP saistās ar DNS pārtraukuma punktu pēc reakcijas ar biomarķiera anti. -dig-Biotīns. Apvienojumā ar DAB tika pievienots displejam. Vizualizācijai
visus kodolus, sekcijas tika iekrāsotas ar hematoksilīnu. Tumši brūni signāli norāda uz pozitīvām šūnām, bet zils norāda uz nereaģējošām šūnām. Theapoptozeindekss tika aprēķināts pēc šādas formulas.
Apoptotisko šūnu īpatsvars=(apoptotisko šūnu skaits mezglā / kopējais šūnu skaits mezglā) × 100 procenti.
Kvantitatīvā reāllaika PCR (qRT-PCR)
Kopējā RNS nonierestika ekstrahēts, izmantojot Trizol reaģentu. Lai pārbaudītu RNS kvalitāti un daudzumu, mēs izmantojām ND{0}} spektrofotometru (nanopiliens, ASV) un agarozes gēla elektroforēzi. Reversā transkripcija (RT) tika veikta 500 ng kopējās RNS, izmantojot PrimeScript® RT Master Mix. Specifiskus primerus -aktīnam un FAS, TRAIL, TNF un citiem gēniem izstrādāja Primer Premier 7.0 programmatūra (2. tabula) un sintezēja Sangon Biotech (Šanhaja, Ķīna). RT-PCR tika izmantota Quantstudio 7 flex reāllaika PCR sistēma (thermo-fisher, ASV) un SYBR® Premix Ex Taq™ II komplekts. PCR reakcijas tilpums bija 20 μL, un RT-PCR apstākļi bija: 95 ◦ C 10
min, 40 cikli 95 ◦C 15 s, 55 ◦C 30 s, 72 ◦C 30 s un visbeidzot viens cikls 95 ◦C 15 s, 60 ◦C 15 s, 95 ◦C 15 s. Visas reakcijas tika atkārtotas trīs reizes. Relatīvā 2-ΔΔCt metode tika izmantota, lai aprēķinātu relatīvos mRNS ekspresijas līmeņus, un -aktīns tika izmantots kā kalibrators. Šajā procesā efektivitātes atšķirība ir mazāka par 5 procentiem.
Kopējā olbaltumvielu ekstrakcija un Western blot analīze
Thenieresaudi tika mazgāti ar PBS, žāvēti ar filtrpapīru un sadalīti RIPA līzē (satur PMSF) pie 12, 000 apgr./min, 4◦C 10 min. Olbaltumvielu koncentrācija tika noteikta, izmantojot Bicinchoninic Acid (BCA) komplektu (Solarbio Science & Technology, Pekina, Ķīna). 35 ng proteīna paraugs tika veiksmīgi ekstrahēts un atdalīts uz 8% SDS-poliakrilamīda gēla ar elektroforēzi. Mērķa proteīns tika pārnests uz NC membrānu, un NC membrāna tika bloķēta ar 5 procentiem beztauku pienu istabas temperatūrā 2 stundas. Pēc tam NC membrāna tika inkubēta ar primārajām antivielām -aktīns (1:1000), TRAIL (1:500), FAS (1:500), FAS-L (1:100), TNF (1:500), FADD (1:500), Caspase 8 (1:500), Caspase 3 (1:500) un PARP (1:1000) 4 grādos naktī. Pēc 3 reizes mazgāšanas ar PBST, NC membrāna tika inkubēta ar HRP konjugētām sekundārajām kazas anti-trušu IgG antivielām (1:2000) istabas temperatūrā 2 stundas. ECL tika izmantots, lai vizualizētu mērķa proteīna joslas. Optisko blīvumu aprēķināja ar AlphaView programmatūru (versija: 3.2.2.0) FluorChem Q sistēmā (Alpha Innotech, CA, ASV).
Statistiskā analīze
Programmatūra GraphPadPrism{{0}} tika izmantota, lai organizētu un analizētu eksperimentālos datus, un katrs dati tika attēloti kā vidējais ± SEM. Vidējo atšķirību nozīmīgums tika noteikts, izmantojot dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey tests ar P < 0,05,="" ko="" uzskatīja="" par="">
Rezultāti
Izmaiņas iekšāniereskoeficients un bioķīmiskās funkcijas rādītāji
Theniereskoeficients un F, CRE, BUN, UA, Mg, P, K līmeņi ir parādīti 1. attēlā. Salīdzinot ar C grupu,niereskoeficients bija ievērojami samazināts F grupā (p < 0,05).="" tomēr="" nieru="" koeficients="" f="" plus="" 1="">Kalcijsgrupa uzrādīja ievērojamu pieaugumu, salīdzinot ar F grupu (p < {{0}}.05).="" f="" līmenis="" f="" grupā="" bija="" ievērojami="" augstāks="" nekā="" c="" grupā="" (p="">< 0,001).="" interesanti,="" ka,="" salīdzinot="" ar="" f="" grupu,="" f="" līmenis="" f="" plus="" 1="" procents="" ca="" grupā="" bija="" ievērojami="" pazemināts="" (p=""><>
CRE, BUN un UA tika novērtēti, lai atspoguļotu pakāpinieresbojājumi un funkcionālās izmaiņas. CRE, BUN un UA līmenis bija izteikti paaugstināts F grupā, salīdzinot ar C grupas līmeni (p < 0,05),="" tomēr="" attiecībā="" pret="" f="" grupu="" iepriekš="" minētie="" trīs="" rādītāji="" bija="" ievērojami="" augstāki.="" samazinājās="" f="" plus="" 1="">Kalcijsgrupa (p < 0.05).="" mg,="" p="" un="" k="" bija="" elektrolītu="" rādītāji,="" kas="" ir="" cieši="" saistīti="">nieresfunkciju. Salīdzinot ar C grupu, Mg līmenis serumā bija ievērojami pazemināts, P un K līmenis krasi palielinājās F grupā (p < 0.05).="" neskatoties="" uz="" to,="" pievienojot="" 1="">kalcijsdiēta ievērojami palielināja Mg līmeni serumā par 15,3 procentiem (p < 0.05)="" un="" ievērojami="" samazināja="" p="" līmeni="" serumā="" par="" 16,9="" procentiem="" (p="">< 0,05).="" k="" saturs="" serumā="" ir="" uzrādījis="" lejupejošu="" tendenci="" bez="" nozīmes="" pēc="" papildu="" 1%="" ca="">
Izmaiņas iekšānieresmorfoloģija
Morfoloģiskās izmaiņasnieresaudus pārbaudīja H&E (att. 2I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ). C grupā,nierescauruļveida šūnas bija kompakti sakārtotas, morfoloģija bija regulāra un glomerulu morfoloģija bija neskarta. Tomēr robežas starp šūnām bija neskaidrasnieresasinsķermenīši bija atrofēti un deformētiniereskapsulas dobums paplašināts,niereskanāliņi veidoja ģipsi, un epitēlija šūnas atdalījās F grupā. Salīdzinot ar F grupu, pieaugot parKalcijskoncentrācija, izkārtojumsnieresšūnas pakāpeniski kļuva sakārtotākas, morfoloģijanieresasinsķermenīši pakāpeniski atjaunojās, un traumas pakāpe pakāpeniski tika atvieglota. Turklāt mēs novērtējām bojājumus, izmantojotnierespunktu (2Ⅴ att.). F grupas rezultāts bija ievērojami augstāks nekā C grupā (p < 0,01);="" tomēr="" rezultāts="" f="" plus="" 1="">Kalcijsgrupa ievērojami samazinājās, salīdzinot ar F grupu (p < 0,05).
TUNEL nosakanieresšūnaapoptoze
Mēs veicām TUNEL testu, lai noteiktu un analizētu, vainieresšūnas ir izturējušasapoptozešajā pētījumā (3I-Ⅳ, ⅰ-ⅳ att.).NieresC grupas audi bija kārtīgi sakārtoti, ar mazāk apoptotisko šūnu (4,67 ± 1,15 procenti). F grupa uzrādīja lielu skaitu TUNEL pozitīvunierescauruļveida epitēlija šūnas (48,17 ± 3,94 procenti). Turpretim F plus 1 procentsKalcijsgrupa uzrādīja dramatisku TUNEL pozitīvo šūnu skaita samazināšanos (28,83 ± 4,81 procenti) (3Ⅴ att.).
Ietekme noKalcijspar F izraisītām izmaiņām ar nāves receptoru ceļu saistītajos gēnos
Augšupējo faktoru relatīvie mRNS ekspresijas līmeņi, kas saistīti ar nāves receptoru starpniecībuapoptozeceļi (TRAIL, DR5, TNF, TNFR1, TNF-R2, FAS, FAS-L, OPG) tika atklāti 4.a attēlā. Salīdzinot ar C grupu, TRAIL, DR5, TNF, TNF-R1, TNFR2, FAS un FAS-L mRNS ekspresijas līmeņi bija ievērojami paaugstināti ar F ārstētām žurkām (p < 0,01).="" turpretim="" trail,="" tnf,="" tnf-r2,="" fas="" un="" fas-l="" relatīvās="" mrns="" ekspresijas="" tika="" ievērojami="" samazinātas="" f="" plus="" 1="">Kalcijsgrupa, salīdzinot ar F grupu (p < {0}}.05).="" salīdzinot="" ar="" c="" grupu,="" tika="" novērota="" acīmredzama="" opg="" mrns="" ekspresijas="" līmeņa="" pazemināšanās="" f="" grupā="" (p="">< 0,01).="" tomēr="" attiecībā="" pret="" f="" grupu="" opg="" ir="" f="">Kalcijsgrupas tika palielinātas. Pakārtotie faktori FADD, TRADD, Kaspāzes 8, Kaspāzes 3 un PARP relatīvie mRNS ekspresijas līmeņi ir parādīti 4.b attēlā. FADD, TRADD, kaspāzes 8, kaspāzes 3 un PARP proteīnu ekspresijas acīmredzami bija uzlabotas F grupā, salīdzinot ar C grupu (p < 0.01),="" bet="" acīmredzami="" samazinājās="" f="" plus="">Kalcijsgrupām, salīdzinot ar F grupu (p < 0.05).
Ietekme noKalcijspar F izraisītām izmaiņām inapoptozear tiem saistītie proteīni
TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, kaspāzes 8, kaspāzes 3 un PARP proteīnu ekspresija tika noteikta ar Western blotēšanu (5.a, b att.). Salīdzinot ar C grupu, TRAIL, FAS, FAS-L, TNF, FADD, Caspase 8, Caspase 3 un PARP proteīnu ekspresijas F grupā bija ievērojami paaugstinātas (p < 0.01).="" visu="" iepriekšminēto="" faktoru="" proteīnu="" ekspresija="" tika="" ievērojami="" samazināta="" f="" plus="" 1="">Kalcijsgrupa, salīdzinot ar F grupu (p < 0.05).
Diskusija
Jaunākie pierādījumi pierādīja, ka F var izraisīt mīksto audu bojājumus, un F bojājuma pakāpe ir atkarīga no F koncentrācijas, ekspozīcijas laika un orgānu veida (Wei et al., 2019). Šajā pētījumā 100 mg/l NaF tika izmantots 17 nedēļas, lai izveidotu dzeramā ūdens subakūtas NaF iedarbības dzīvnieku modeli. NaF deva tiek izvēlēta atkarībā no F piesārņojuma pakāpes vidē un dažādu sugu nenoteiktajiem faktoriem. Ņemot vērā, ka vietējā gruntsūdeņos izmērītā dabiskā F-koncentrācija ir aptuveni 4,5 mg/L, šajā pētījumā izmantotais destilētais ūdens ar 100 mg/L NaF (F-koncentrācija ir aptuveni 45 mg/L) tika aprēķināts pēc nenoteikta faktora. Ekstrapolācija no dzīvnieka uz cilvēku pie 10 (Dzeramā ūdens kvalitātes vadlīnijas, 2017; Mukherjee un Singh, 2021; Wen et al., 2013; Zhang et al., 2020). Agrīnie pētījumi atklāja, ka uzturakalcijsvar ietekmēt fluora uzsūkšanos, veicināt fluora izdalīšanos organismā, samazināt fluora uzsūkšanās ātrumu un tādējādi samazināt F toksicitāti (Harrison et al., 1984; Larsen et al., 1981). Mūsu nesenie eksperimentālie pētījumi ir parādījuši, ka Ca mazina F izraisītus kaulu un aknu bojājumus, kavējot iekšējo ceļuapoptoze(Li et al., 2021; J. Wang et al., 2020; Wang et al., 2019). Tomēr līdz šim pētījumi par Ca aizsargājošo iedarbību uz F izraisītu nefrotoksicitāti un ar to saistīto mehānismu ir bezprecedenta. Šeit mēs ziņojam, ka Ca mazina F izraisītonieresbojājumu. Turklāt mēs arī atklājām, ka Ca apvērš F izraisītonieresšūnaapoptozecaur nāves receptoru starpniecībuapoptozeceļš (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL ceļi). Ilgtermiņa F uzkrāšanāsnieresvar izraisīt audu struktūras un funkcionālus bojājumus. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka NaF iedarbība izraisījanieresšūnaapoptozežurkām, ko pavada glomerulārā atrofija un deformācija,niereskapsulas dobuma paplašināšanās,niereskanāliņi, kas veido ģipsi, un epitēlija šūnas nokrīt. tomērnieresbojājumi tika ievērojami atviegloti pēc 1 procenta Ca pievienošanas. Šie rezultāti bija līdzīgi iepriekšējos ziņojumos iegūtajiem rezultātiem (Cao et al., 2015; HW Wang et al., 2020).
CRE ir muskuļu metabolīts, UA ir purīnu metabolisma galaprodukts, un BUN ir galvenais ķermeņa olbaltumvielu metabolisma galaprodukts, kas tiek izvadīts glomerulārās filtrācijas ceļā un parasti tiek izmantots, lai noteiktu.nieresfunkcija (Myers et al., 2006; HW Wang et al., 2020). Augsta F reģiona bioķīmiskā aptauja parādīja, ka glomerulārās filtrācijas ātrums ir ievērojami samazināts un F, UA un BUN būtiski mainījās (Malin et al., 2019). Pārbaudes ar dzīvniekiem parādīja, ka seruma CRE,Kalcijs, un P koncentrācija tika ievērojami samazināta pelēm, kas pakļautas 100 mg/l NaF, kas liecina, ka F ir traucētsnieresfunkcija, kā arī Ca un P metabolisms (HW Wang et al., 2020). F izraisīta nefrotoksicitāte ir saistīta arnieresdisfunkcija. Kadnieresfunkcija pasliktinās, samazinās F izdalīšanās organismā, izraisot pārmērīgu fluora uzkrāšanosnieresun pastiprinoša F toksicitāte (Kido et al., 2017). Kadnieresir smagi traucēti,
F izdalīšanās ar urīnu samazinās, un F koncentrācija serumā vēl vairāk palielinās (Dharmaratne, 2019). Šajā pētījumā mēs novērojām, ka BUN un seruma CRE, UA, P, K līmenis žurkām, kas tika ārstētas ar 100 mg/l NaF, ievērojami palielinājās, kas liecina, ka augsta F iedarbība izraisīja izmaiņasnieresbioķīmiskos rādītājus žurkām un noveda pienieresnepietiekamība. Turklāt mēs arī norādījām, ka dažādie rādītājinieresmēdz būt normāli pēcKalcijspapildināšana. Tas parāda, ka Ca (īpaši 1 procentsKalcijs) ir ievērojama atvieglojoša iedarbība uz F izraisītonieresbojājumi žurkām.
Cistanchevar palīdzēt arnieresbojājumu.
Apoptozeir autonoma un sakārtota šūnu nāve, ko kontrolē gēni, kam raksturīga DNS degradācija bez acīmredzamas šūnu līzes. Šajā pētījumā tika konstatēts, ka fluoroze izraisījanieresšūnaapoptozežurkām. FAS ir liela loma rašanās gadījumāapoptozeun dažādas slimības. Jaunākā literatūra atklāja, ka FAS ir starpnieksapoptozeiekšnieresko izraisa išēmija-reperfūzija un cilvēka leikocītiapoptozeko izraisa N-nitrozodimetilamīns (Iwaniuk et al., 2019; Xu
et al., 2019). Kad FAS un FAS-L apvienojas, veidojot trimeru, tiek aktivizēts proapoptotiskais signāls. Nesenais pētījums parādīja, ka F inducē šūnuapoptozecaur FAS/FAS-L ceļu (Xu et al., 2011). Šajā pētījumā F ievērojami palielināja FAS un FAS-L mRNS un olbaltumvielu ekspresijunieres. FAS un FAS-L līmeņa regulēšana liecina, ka ar FAS / FAS-L saistīti apoptotiskie ceļi var būt saistīti ar F izraisītuapoptoze. FAS/FAS-L trimera piesaiste FADD noved pie Pro-Caspase 8 šķelšanās, lai iegūtu aktīvo Caspase 8, kas savukārt aktivizē Caspase 3 un pēc tam noved pieapoptoze(Li et al., 2011; Xu et al., 2011). Šis pētījums apstiprināja, ka 100 mg/l NaF izraisījaapoptozežurkānierescaur FAS/FAS-L ceļu. Vissvarīgākais rezultāts ir tas, ka uztura Ca piedevas mazinaapoptoze- F inducējošā iedarbība, kas ir saistīta ar FAS / FAS-L aktivācijas pazemināšanos un kaspāžu sekundāro aktivāciju.
TNF ir pleiotrops citokīns, kas piedalās plašā šūnu reakciju diapazonā, tostarp diferenciācijā, proliferācijā, iekaisumos un šūnu nāvē. TNF signāls iedarbina abusapoptozeun anti-apoptotiskie ceļi. Daudzu veidu literatūrā ir ziņots, ka TNF dominē lipopolisaharīdu izraisītajānieresbojājumus un cisplatīna izraisītu akūtunierestraumas (Lee et al., 2016; Li et al., 2018). TNF saistās ar TNF-R1, tā DD piesaista TRADD, un pēc tam TRADD mijiedarbojas ar FADD, izraisot DISC veidošanos (Kiraz et al., 2016; Sun et al., 2003). Pētījumi atklāja, ka F var inducēt aknas, neironus unnieresleikocītuapoptozecaur TNF signalizācijas ceļu (Lu et al., 2017; Singh et al., 2017; Yan et al., 2016). Līdzīgi kā šo ziņojumu rezultātos, šajā eksperimentā ievērojami palielinājās TNF, TNF-R1, TNF-R2 un TRADD relatīvās izpausmes F grupā. Turpretim šo gēnu ekspresija ievērojami samazinājās pēc 1 procentaKalcijspapildinājums, kas liecina par iejaukšanosKalcijsTNF ceļā.
TRAIL ir iesaistīts regulēšanāapoptoze, proliferācija, imūnsistēmas iekaisuma reakcija utt. Pašlaik tiek uzskatīts, ka TRAIL ir cieši saistīts ar rašanos un prognozinieresslimība (Candido, 2014). Arvien vairāk literatūras apstiprināja, ka TRAIL regulēapoptozenonierescauruļveida epitēlija šūnas ar HBV saistīta glomerulonefrīta unnieresapoptozear uromodulīnu saistītajā gadījumānieresslimība (Džonsons et al., 2017; Yang et al., 2018). Turklāt pētījums ziņoja, ka TRAIL ekspresija parasti tika mainīta homeostāzes un dažādu veidu laikānierestraumas (Devarapu et al., 2017). TRAIL pievienojas nāves receptoram DR5 un piesaista FADD, mijiedarbojoties ar DD, un pēc tam saistās ar pro-kaspāzi 8 caur FADD esošo nāves efekta domēnu, veidojot DISK (Yuan et al., 2018). Šis pētījums parādīja, ka F grupā ievērojami palielinājās TRAIL un DR5 ekspresija. Pēc papildināšanas arKalcijs, tika kavēta TRAIL un DR5 ekspresija. Tiek ierosināts, kaKalcijsinhibē TRAIL ceļu, lai samazinātu F izraisītoapoptoze.
Secinājums
100 mg/l NaF iedarbība aktivēja nāves receptoru starpniecībuapoptozeceļš (FAS/FASL, TNFR/TNF, DR5/TRAIL ceļi) un pēc tam inducētsnieresšūnaapoptozežurkām, izraisotnieresvielmaiņas traucējumi unnieresnepietiekamība, kā rezultātānieresasinsķermenīši bija atrofēti un deformētiniereskapsulas dobums paplašināts,niereskanāliņi veidoja ģipsi. Tomēr, pievienojot 1 procentuKalcijsUzturs samazināja fluora saturu asinīs, vēl vairāk atvieglojotnieresvielmaiņas traucējumi unnieresnepietiekamību, izmantojot nāves receptoru mediēto ceļu, un ievērojami samazinājanieresievainojums (detaļa 6. att.).
Atsauces
Avots ir Haojie Li, Veterinārmedicīnas koledža, Shanxi Lauksaimniecības universitāte, Taigu 030801, Shanxi, PR Ķīna utt.
