Zerumbone, Zingiber Officinale Roscoe tropiskā ingvera seskviterpēns, mazina MSH izraisītu melanoģenēzi B16F10 šūnās, 1. daļa

Abstract:Ir pierādīts, ka zerumbone (ZER), aktīvā Zingiberaceae dzimtas sastāvdaļa, piemīt vairākas bioloģiskas aktivitātes, piemēram, pretiekaisuma, pretalerģiskas, pretmikrobu un pretvēža iedarbība; tomēr tas nav pētīts attiecībā uz anti-melanogēnām īpašībām. Šajā pētījumā mēs parādām, ka ZER un Zingiber ir oficiāli (ZO) ekstrakti, kas ievērojami mazina melanīna uzkrāšanos melanocītu stimulējošā hormona (-MSH) stimulētās peles melanogēnajās B16F10 šūnās. Turklāt, lai noskaidrotu molekulāro mehānismu, ar kuru ZER nomāc melanīna uzkrāšanos, mēs analizējām ar melanoģenēzi saistītā transkripcijas faktora, ar mikroftalmiju saistītā transkripcijas faktora (MITF) un tā mērķa gēnu, piemēram, tirozināzes, ar tirozināzi saistītā proteīna 1, ekspresiju ( TYRP1) un ar tirozināzi saistītais proteīns 2 (TYRP2) B16F10 šūnās, kuras stimulē -MSH. Šeit mēs noskaidrojām, ka ZER inhibē MITF mediētu melanogēno gēnu ekspresiju pēc -MSH stimulācijas. Turklāt šūnas, kas apstrādātas ar dažādām zerumbona un ZO koncentrācijām, uzrādīja pastiprinātu ekstracelulāro signālu regulēto kināžu 1 un 2 (ERK1/2) fosforilēšanos, kas ir iesaistītas MITF degradācijas mehānismā. ERK1/2 farmakoloģiskā inhibīcija, izmantojot U0126, pietiekami mainīja ZER anti-melanogēno iedarbību, kas liecina, ka tā anti-melanogēnajai aktivitātei ir nepieciešama pastiprināta ERK1/2 fosforilācija. Kopumā šie rezultāti liecina, ka ZER un ZO ekstraktus var izmantot kā aktīvās sastāvdaļas ādu balinošajā kosmētikā, jo tiem piemīt antimelanogēna iedarbība.

Saskaņā ar attiecīgiem pētījumiem cistanche ir izplatīts augs, kas pazīstams kā "brīnumaugs, kas pagarina dzīvi". Tās galvenā sastāvdaļa ircistanozīds, kam ir dažādi efekti, piemēram,antioksidants,pretiekaisuma, un imūnās funkcijas veicināšana. Mehānisms starpcistancheunādas balināšanaslēpjas cistanche antioksidanta iedarbībāglikozīdi. Melanīns cilvēka ādā veidojas, oksidējoties tirozīnam, ko katalizētirozināze, un oksidācijas reakcijā ir nepieciešama skābekļa līdzdalība, tāpēc skābekļa brīvie radikāļi organismā kļūst par svarīgu faktoru, kas ietekmē melanīna ražošanu. Cistanche satur cistanozīdu, kas ir antioksidants un var samazināt brīvo radikāļu veidošanos organismā, tādējādikavē melanīna ražošanu.

Noklikšķiniet uz Kā lietot Cistanche

Vairāk informācijas:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Atslēgvārdi:zerumbone; Zingiber officinal Roscoe; melanoģenēze; MITF; ERK1/2

1. Ievads

Melanoģenēzi, melanīna ražošanu epidermas melanocītos, stimulē -melanocītus stimulējošais hormons (-MSH), kas izdalās no keratinocītiem ultravioletā (UV) starojuma ietekmē [1,2]. Cilmes šūnu faktors (SCF) ir vēl viens melanogēns faktors, kas stingri kontrolē melanocītu migrāciju, proliferāciju un diferenciāciju, lai uzturētu pēcdzemdību ādas melanoģenēzi [3]. Ar mikroftalmiju saistītais transkripcijas faktors (MITF), kas ir melanogēns transkripcijas faktors, tiek aktivizēts caur cAMP-PKA-CREB (cikliskā adenozīna monofosfāta-proteīna kināzes A-cAMP atbildes elementu saistošā proteīna) signalizācijas ceļu pēc -MSH stimulācijas, izmantojot melanokortīna 1 receptoru. (MC1R) epidermas melanocītu citoplazmas membrānās [4]. Ir zināms, ka vairākas ķīmiskas vielas, piemēram, forskolīns un IBMX (3-izobutil-1-metilksantīns), aktivizē cAMP-PKA-CREB signālu ceļu, izraisot melanoģenēzes indukciju [5]. Vairāki pētījumi ir atklājuši, ka ilgstoša ārpusšūnu regulēto kināžu 1 un 2 (ERK1/2), kas ir iesaistīta onkoģenēzes molekulārajā mehānismā, aktivizēšana veicina MITF fosforilēšanos pie Ser73 un tās sekojošu degradāciju, izmantojot no ubikvitīna atkarīgu proteolīzi [6,7 ]. Patiešām, ir ziņots, ka U0126, selektīvs ERK1/2 ceļa inhibitors, palielina MITF ekspresiju un tirozināzes aktivitāti, izraisot melanīna veidošanos [6]. Stabilizēts un aktivizēts MITF palielina melanogēno gēnu, piemēram, tirozināzes, ar tirozināzi saistītā proteīna 1 (TYRP1) un ar tirozināzi saistītā proteīna 2 (TYRP2) ekspresiju. Tirozīna pārvēršanu par 3,4-dihidroksifenilalanīnu (L-DOPA), kas ir sākotnējais melanoģenēzes posms, katalizē tirozināze. Ar tirozināzi saistītie proteīni (TRP) katalizē turpmākas oksidācijas un tautomerizācijas reakcijas [8]. Pēc melanīna sintēzes nobriedis melanīns tiek transportēts no epidermas melanocītiem bazālo keratinocītu citoplazmā, lai aizsargātu šūnas no UV starojuma [2].

Neparasti palielināta melanoģenēze izraisa vairāku veidu ādas traucējumus, piemēram, ādas vēzi, hloazmu un vasaras raibumus [4]; tādējādi mazas molekulas vai dabiski produkti, kas ir vērsti vai nu uz tirozināzes katalītisko aktivitāti, vai melanoģenēzes signalizācijas ceļu regulatoriem, tostarp ERK1/2, vai MITF mediētā melanogēno gēnu transkripcija, ir identificētas kā aktīvās sastāvdaļas, kas izmantojamas kosmētikā. nozare. Vairākas mazas molekulas, piemēram, kojskābe, arbutīns un niacinamīds, tiek plaši izmantotas kā kosmētikas sastāvdaļas to anti-melanogēno aktivitāšu dēļ. Tomēr ziņojumi liecina, ka kojskābe izraisa vairākas blakusparādības, tostarp citotoksicitāti, dermatītu, ādas vēzi un hepatocelulāro karcinomu tās genotoksiskās aktivitātes dēļ [9]. Lai gan arbutīns, kas tika izolēts no lācenes auga, tika izmantots hiperpigmentācijas traucējumu ārstēšanai, pēdējā laikā tā kā kosmētikas sastāvdaļas lietošana ir ierobežota tā vairāku blakusparādību dēļ [9]. Ir ziņots, ka niacinamīdam ir anti-melanogēna aktivitāte, un šī aktivitāte tiek veikta, kavējot melanosomu pārnesi no melanocītiem uz apkārtējiem keratinocītiem [10]. Tādējādi tas ir plaši izmantots kā ādu balinošs savienojums kosmētikas rūpniecībā. Lai pārvarētu noteikto ādas balināšanas līdzekļu ierobežojumus, kuriem ir vairākas blakusparādības, ir svarīgi izstrādāt drošas ādas balināšanas sastāvdaļas, kas iegūtas no dabīgiem avotiem. Piemēram, -tujaplicīns, linderanolīds B, 4-butilrezorcīns un plumbagīns ir identificēti kā anti-melanogēni savienojumi to tirozināzes inhibējošās iedarbības dēļ [4,11]. Nobiletīnam, withaferīnam A, sesamolam un haetocīnam piemīt anti-melanogēnas īpašības, modulējot signālu starpproduktus melanoģenēzes ceļā [11].

Zerumbone (ZER) ir dabisks produkts, kas ir izolēts no Zingiberaceae dzimtas augu, piemēram, Zingiber zerumbet Smith un Zingiber officinal Roscoe, gaistošajām ēteriskajām eļļām [12]. Vairāki pētījumi ir parādījuši, ka ZER ir plašs bioloģisko aktivitāšu klāsts, tostarp pretmikrobu, antioksidantu, pretdiabēta, pretvēža, pretiekaisuma, pretalerģisku un antiangiogēnu darbību [12]. Interesanti, ka ir pierādīts, ka ZER aizsargā pret ultravioletā A (UVA) izraisītiem oksidatīviem bojājumiem ādas keratinocītos, pateicoties tā spējai attīrīt reaktīvās skābekļa sugas (ROS), aktivizējot kodolfaktoru-E {{8} }saistītais faktors-2 (Nrf2) [1,13]. Tas liecina, ka ZER var izmantot kā funkcionālu piedevu ādas kopšanas kosmētikā. Tomēr detalizēts ZER darbības anti-melanogēno īpašību mehānisms vēl nav pētīts.

Šajā pētījumā tika pētīta ZER un Zingiber officinal (ZO) ekstrakta inhibējošā ietekme uz -MSH stimulētu melanoģenēzi un to pamatā esošie mehānismi. Šeit mēs parādām, ka ZER ievērojami nomāc -MSH izraisīto melanoģenēzi, regulējot ERK1 / 2 fosforilāciju un kavējot MITF mediētu melanogēno gēnu ekspresiju.

2. Rezultāti

2.1. Zerumbone (ZER) nomāc -MSH izraisītu melanoģenēzi B16F10 peles melanomas šūnās

Lai izpētītu zerumbona (ZER) anti-melanogēno iedarbību, mēs sākotnēji novērtējām tā citotoksicitāti gan B16F10, gan HaCaT šūnās. ZER ķīmiskā struktūra ir parādīta 1A attēlā. Tika novērots, ka ZER koncentrācijās virs 20 µM uzrādīja spēcīgu citotoksisku efektu, savukārt zem 20 µM ZER neuzrādīja citotoksicitāti abās šūnu līnijās (1.B attēls). Pēc tam mēs pētījām ZER inhibējošo ietekmi uz melanocītus stimulējošā hormona (-MSH) izraisīto melanīna uzkrāšanos un sekrēciju B16F10 šūnās. Tika pierādīts, ka ZER spēcīgi nomāc -MSH izraisītu melanīna intracelulāro uzkrāšanos un tā sekrēciju kultivēšanas barotnē (1.C, D attēls). Turklāt mēs noskaidrojām, ka ZER efektīvāk vājina melanoģenēzi nekā 1 mM arbutīns vai 0, 2 mM kojskābe, labi zināmās ādas balināšanas kosmētikas aktīvās sastāvdaļas (1.D attēls). Lai noskaidrotu, vai ZER ir pietiekams, lai nomāktu melanoģenēzi cilvēka šūnās, mēs izmantojām melanīnu ražojošas G361 cilvēka melanomas šūnas. Kā parādīts 1E attēlā, ZER ievērojami samazina cilmes šūnu faktora (SCF) izraisīto ārpusšūnu un intracelulārā melanīna saturu. Šie rezultāti apstiprina ZER anti-melanogēno aktivitāti melanogēnās peles B16F10 un cilvēka G361 šūnās.

2.2. Zerumbone nomāc melanoģenēzes transkripcijas faktora, MITF un tā mērķa gēnu gēnu ekspresiju G361 cilvēka melanomas šūnās 

Ir ziņots, ka endotelīnam-1 un SCF signalizācijai ir būtiska loma cilvēka melanocītu un vairāku melanomas apakštipu melanoģenēzē [3,14–16]. Šajā pētījumā mēs noskaidrojām, ka ZER nomāc melanoģenēzi uz melanogēniem stimuliem, -MSH un SCF, peles B16F10 un cilvēka G361 melanomas šūnās (1. attēls).

Tādējādi mēs izmērījām izmaiņas ar melanoģenēzi saistīto gēnu un proteīnu ekspresijas līmeņos pēc SCF stimulācijas G361 cilvēka melanomas šūnās. Mēs noskaidrojām, ka ZER vājina SCF izraisīto MITF un tirozināzes proteīna ekspresiju attiecīgi 2–4 stundas un 24–48 stundas pēc SCF stimulācijas (2.A attēls). Turklāt ar melanoģenēzi saistīto gēnu, piemēram, MITF, tirozināzes un ar tirozināzi saistītā proteīna 1 (TYRP1) gēnu ekspresija tika nomākta ar ZER apstrādātajās G361 šūnās (2.B, C attēls). Šie rezultāti atklāja ar melanoģenēzi saistīto gēnu ekspresijas maksimālo laiku pēc SCF stimulācijas; maksimālā MITF mRNS indukcija tika novērota 1–2 stundu laikā, un tika novērots, ka tirozināzes un TYRP1 mRNS līmenis sasniedza maksimumu 24–48 stundas pēc SCF stimulācijas.

2.3. Zerumbons nomāc melanogēno gēnu un enzīmu ekspresiju peles B16F10 šūnās

Lai izpētītu molekulāro mehānismu, ar kuru ZER nomāc melanoģenēzi, mēs izmērījām melanoģenēzes transkripcijas faktora MITF un tā mērķa gēnu, piemēram, ar tirozināzi saistītā proteīna 1 (TYRP1), tirozināzes un ar tirozināzi saistītā proteīna 2 (TYRP2) gēnu ekspresiju. ZER neesamības vai klātbūtnes gadījumā. Tā kā ar melanoģenēzi saistīto gēnu ekspresijas maksimālais laiks pēc SCF un -MSH stimulācijas ir zināms attiecīgi cilvēka G361 (2. attēls) un peles B16F10 melanomas šūnām [4], mēs tālāk mērījām MITF, tirozināzes, TYRP1 un TYRP2 ekspresiju. ZER apstrādātās peles B16F10 melanomas šūnās pēc 2 vai 48 h inkubācijas ar -MSH. A attēlā parādīts, ka ZER ir pietiekams, lai vājinātu -MSH izraisīto MITF, TYRP1, TYRP2 un tirozināzes ekspresiju B16F10 šūnās. Līdzīgi, MITF, tirozināzes un TYRP2 proteīna ekspresijas līmenis tika samazināts pēc ārstēšanas ar ZER. Proteīnkināzes A (PKA) mediētā CREB fosforilācija ir galvenais signalizācijas ceļš, kas palielina MITF transkripcijas līmenī pēc -MSH stimulācijas [4]. Tādējādi šeit mēs analizējām, vai samazināta CREB fosforilācija ar ZER varētu būt starpnieks MITF nomākšanā. Mēs noskaidrojām, ka ārstēšana ar ZER neietekmēja -MSH izraisīto CREB fosforilāciju, kas liecina, ka ZER nomāc -MSH izraisītu MITF ekspresiju neatkarīgi no PKA-CREB signalizācijas ceļa ass (3.B attēls). Tā kā tirozināze ir ātrumu ierobežojošs enzīms, kas regulē melanīna sintēzi [2, 4, 11], mēs tālāk analizējām intracelulāro tirozināzes proteīna līmeni un tā fermentatīvo aktivitāti, ārstējot arbutīnu, kojskābi un ZER. C attēlā parādīts, ka ZER pietiekami samazina -MSH izraisīto tirozināzes proteīna līmeni B16F10 šūnās. Turklāt 3D attēlā redzams, ka 10 µM ZER efektīvāk nomāc L-DOPA oksidāciju nekā tirozināzes inhibitori, arbutīns un kojskābe, kas liecina, ka ar ZER apstrādātajās šūnās tiek nomākta L-DOPA oksidēšanās par dopahinonu, izmantojot tirozināzes fermentatīvo aktivitāti. . Šie rezultāti parāda, ka ZER vājina -MSH mediēto melanoģenēzi, nomācot MITF, ar melanoģenēzi saistītā transkripcijas faktora, un tā mērķa gēnu gēnu ekspresiju.

2.4. Zerumbona anti-melanogēnā iedarbība notiek, izmantojot ERK1/2 fosforilāciju

Ir zināms, ka proteīna kināzes B (AKT) un ekstracelulāro signālu regulēto kināžu (ERK1/2) aktivizēšana ar augšanas faktoriem vai melanogēniem stimuliem nomāc melanoģenēzi, samazinot MITF un tā mērķa gēnu ekspresiju [11]. MITF fosforilēšana pie Ser73 un Ser409, reaģējot uz ERK1/2 signalizācijas ceļu, veicina tā proteasomu atkarīgo degradāciju [17,18]. Tāpēc mēs pētījām, vai ZER regulē ERK1 / 2 fosforilāciju B16F10 peles un G361 cilvēka melanomas šūnās. Pēc ārstēšanas ar ZER tika novērota palielināta ERK1/2 (p-ERK1/2), bet ne kopējā ERK1/2 (T-ERK1/2) fosforilēšanās no laika un devas atkarīgā veidā (4.A, B attēls). Interesanti, ka peles B16F10 un cilvēka G361 melanomas šūnās tika novērots, ka ERK1 / 2 fosforilēšanās strauji palielinājās 10–30 minūšu laikā un 1–2 stundu laikā pēc ZER apstrādes (4.A attēls). Tomēr, ārstējot ar ZER, AKT un MEK fosforilācija netika novērota, kas liecina, ka ZER izraisīta ERK1/2 fosforilācija var nomākt MITF (4.B attēls). Tā kā ERK1 / 2 fosforilācija veicina MITF fosforilēšanos un proteasomu noārdīšanos [17, 18], mēs pētījām, vai proteasomu inhibitors neļauj samazināt MITF ar ZER. MG132 klātbūtnē netika novērota MITF nomākšana ar ZER, apstiprinot, ka ZER samazina MITF ekspresiju proteasomu degradācijas rezultātā (4.C attēls). Pēc tam mēs pētījām, vai ZER fosforilē MITF pie Ser73, kas ir ERK1 / 2 mērķa atlikums. Lai noteiktu fosforilētu MITF, šūnas tika pakļautas -MSH un MG132. Šeit mēs noskaidrojām, ka ZER ievērojami palielināja fosforilēto MITF (Ser73) -MSH un MG132 klātbūtnē (4.D attēls). U0126, selektīvs mitogēnu aktivētas proteīnkināzes (MAPK) inhibitors [19], atcēla ZER izraisīto MITF fosforilāciju (4.D attēls). Turklāt ZER un U0126 nemainīja kopējo MITF proteīna līmeni veselu šūnu lizātos (WCL) MG132 klātbūtnē (4D attēls). Šie rezultāti liecina, ka ERK1/2-mediētā MITF (Ser73) fosforilācija un proteasomu degradācija ir būtisks mehānisms ZER mediētajā MITF nomākšanā. Turklāt 4E attēlā parādīts, ka U0126 ievērojami atjaunoja samazinātu MITF proteīna līmeni ar ZER apstrādātajās šūnās. Konsekventi ZER samazināto intracelulārā melanīna saturu U0126 atjaunoja līdz aptuveni 40 procentiem (attēls 4F), kas liecina, ka ZER anti-melanogēnajai iedarbībai ir nepieciešama ERK1/2 aktivizēšana.

2.5. Zingiber Offificinale (ZO) ekstraktu anti-melanogēnā iedarbība

ZER ir fitoķīmiska viela, kas iegūta no vairākām Zingiberaceae dzimtas augu sugām, piemēram, Zingiber zerumbet un Zingiber officinal [12]. Tādējādi mēs sākotnēji izmērījām šūnu dzīvotspēju bez ZO ekstrakta vai tā klātbūtnē B16F10 un HaCaT šūnās. 5.A attēlā parādīts, ka apstrāde ar ZO ekstraktu nemainīja šūnu dzīvotspēju. Tālāk mēs analizējām Zingiber officinal (ZO) ekstrakta anti-melanogēno iedarbību. Tā kā ZER samazināja MITF un tā mērķa melanogēno gēnu ekspresiju, izmantojot aktivizēto ERK1 / 2 signalizācijas ceļu (2. un 3. attēls), mēs pārbaudījām, vai ZO ekstrakts nomāc -MSH izraisīto MITF un tā mērķa melanogēno proteīnu ekspresiju B16F10 šūnās. Līdzīgi kā ZER anti-melanogēnā iedarbība, ZO ekstrakts no devas atkarīgā veidā ievērojami samazināja -MSH izraisīto MITF, tirozināzi un TYRP2 (5.B attēls). Interesanti, ka ERK1 / 2 fosforilācija tika palielināta arī ar ZO ekstraktu apstrādātajās šūnās (5.B attēls). MITF un tā mērķa gēnu, piemēram, tirozināzes, TYRP1 un TYRP2, ekspresija tika ievērojami samazināta, apstrādājot ZO ekstraktu ar 5 µg/µL (5.C attēls). Turklāt gan ārpusšūnu, gan intracelulārā melanīna saturs tika ievērojami samazināts līdz aptuveni 40 procentiem, apstrādājot 5 µg/µL ZO ekstraktu (5D attēls). Turklāt samazināta tirozināzes aktivitāte tika novērota šūnās, kas tika apstrādātas ar ZO ekstraktu (5E attēls). Šie rezultāti liecina, ka Zingiber officinal (ZO) ekstrakts nomāc melanoģenēzi, mazinot MITF mediētu melanogēno gēnu ekspresiju.

Plašāka informācija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501